CN106701956A - ctDNA的数字化深度测序技术 - Google Patents

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CN106701956A CN201710017802.7A CN201710017802A CN106701956A CN 106701956 A CN106701956 A CN 106701956A CN 201710017802 A CN201710017802 A CN 201710017802A CN 106701956 A CN106701956 A CN 106701956A
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汤先念
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Abstract

本发明涉及用于cfDNA建库的接头、cfDNA建库方法及试剂盒。本发明的接头中含有2‑9碱基随机序列，构成数字信号，可用于在构建文库时给不同来源的相同序列DNA分子加上含有不同数字信号的接头，从而区分测序结果中的不同来源的相同序列DNA分子。使用本发明的含有数字信号的接头可以在相同测序深度下增加有效测序深度，降低NGS检测过程中的错误底噪、提高检测下限，同时达到较高的灵敏度。

Description

ctDNA的数字化深度测序技术
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及ctDNA的测序技术。
背景技术
随着检测费用的降低，下一代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)，即大规模平行测序技术已被广泛的应用到实体瘤的基因突变诊断中，以辅助靶向药物的治疗。美国国立综合癌症网络(the National Comprehensive Cancer Network，NCCN)发布针对非小细胞肺癌临床实践指南中，因可以同时有效的检测多种基因突变，推荐使用NGS技术在微小组织样本平行检测多种基因突变(EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、ROS1及RET)以指导不同靶向治疗方案。
但肿瘤组织基因突变检测存在局限性，例如取样困难，肿瘤组织依赖手术或穿刺；取样次数有限，无法实时反应患者的突变情况；穿刺获得的少量样本很难全面的展示肿瘤的异质性信息等。自从cfDNA(cell-free DNA)与ctDNA(cell-free circulating tumorDNA)被发现，科学家就致力于通过无创方式检测肿瘤基因变化。相对于组织检测，cfDNA检测是非侵入式，可实时取样，监控治疗效果、复发及耐药情况等，另外，cfDNA也含有更丰富的信息，可解决肿瘤组织检测时的异质性问题。
ctDNA在cfDNA中的含量很低，通常小于0.1％，使得如果通过NGS检测ctDNA评估患者基因突变，就需要极低的检测下限。以目前NGS技术，这些极低的突变被测序底噪掩盖掉，导致假阴性；如果检测这些低频突变，则同时会将测序底噪当作阳性突变，造成假阳性。
NGS液体活检在检测肿瘤基因突变时需要极低的检测下限，较高灵敏度与特异性。现有Illumina NGS平台测序错误率在0.3％～0.5％，如果通过现有技术检测0.1％以下的突变，会有很多的假阳性，这限制了它在液体活检中的应用。cfDNA通过凋亡细胞中不被核小体区域的DNA经核酸酶剪切后释放到血液中，不同细胞来源的DNA会剪切成相同的DNA分子。现有技术在测序分析后这部分来源不同的相同DNA分子通过去重而除去，降低了有效测序深度，减弱了突变的分析。同时cfDNA含量低，从患者血液中只能分离到几十纳克的cfDNA，现有的方法对少量cfDNA建库困难。
发明内容
本发明通过在建库所使用的接头中加入数字信号区别不同来源的相同DNA分子，增加有效测序深度，可以降低NGS检测过程中的错误底噪、提高检测下限，同时达到较高的灵敏度。
根据本发明的一个方面，提供用于cfDNA建库的含有数字信号的接头，所述含有数字信号的接头包括两种接头序列，所述两种接头序列是在下述的P5和P7接头序列的基础上进行序列修饰得到的：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'P7：
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-index-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；
其中：
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是在上述P5接头序列的5'端第29位的C和第30位的A之间插入n碱基随机序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P7接头序列；或者
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是用n碱基随机序列取代上述P7接头序列中的index序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P5接头序列；
其中n是选自2-9的任一个数字。
应当理解，本发明中，n可以是2-9的任何一个数字，例如2、3、4、5、6、7、8、9。当两种接头序列中的一种是多种序列的混合物时，在组成混合物的每种序列中所含有的随机序列的碱基数目是相同的。
本领域技术人员应当理解，上述接头中的index序列是指用于区分不同样品的标签序列。
本文中“碱基”和“核苷酸”可以互换使用，指A、T、C或G中的任何一种。本文中所述的“n碱基随机序列”是指连续n个核苷酸的序列，其中每一个核苷酸都独立地随机选自A、T、C、G中的任何一个。本文中的“n碱基随机序列”构成数字信号，用于在构建文库时给不同来源的相同DNA分子加上含有不同数字信号的接头，从而区分测序结果中的不同来源的相同DNA分子。
本发明中，包含n碱基随机序列的混合物可以包含达4n种不同的序列。
本发明所述的术语“建库”又称文库构建，是指，对于血液、体液或粪便等样本中存在的cfDNA进行修复并连接到一段已知DNA片段即adapter序列(也称为接头)上，从而可以用于在illumina设备上进行高通量DNA测序的过程。本发明中所称“建库”是指用于高通量测序的建库。
本文所述的“高通量测序”又可以称为下一代测序技术、大规模平行测序(massively parallel sequencing(MPS))，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序、二代测序等。高通量测序的基本程序是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，Ion Torrent等测序仪进行测序。
本发明所述的术语“cfDNA”又称细胞游离DNA(cell free DNA)，是体内处于游离状态的DNA。
根据本发明的另一方面，提供上述接头在cfDNA建库中的应用。
根据本发明的另一个方面，提供cfDNA建库方法，包括下述步骤：
(1)末端修复；
(2)将含有数字信号的接头连接至经过末端修复的cfDNA片段的两端，所述含有数字信号的接头包括两种接头序列，所述两种接头序列是在下述的P5和P7接头序列的基础上进行序列修饰得到的：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
P7：
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-index-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；
其中：
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是在上述P5接头序列的5'端第29位的C和第30位的A之间插入n碱基随机序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P7接头序列；或者
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是用n碱基随机序列取代上述P7接头序列中的index序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P5接头序列；
其中n是选自2-9的任一个数字；
(3)文库扩增与纯化。
根据本发明的又一方面，提供一种cfDNA建库试剂盒，所述试剂盒包括含有数字信号的接头，所述含有数字信号的接头包括两种接头序列，所述两种接头序列是在下述的P5和P7接头序列的基础上进行序列修饰得到的：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
P7：
5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-index-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；
其中：
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是在上述P5接头序列的5'端第29位的C和第30位的A之间插入n碱基随机序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P7接头序列；或者
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是用n碱基随机序列取代上述P7接头序列中的index序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P5接头序列；
其中n是选自2-9的任一个数字。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包含cfDNA建库所需的一种或多种其它试剂。
利用本发明的建库方法，可以增加有效测序深度，突破illumina NGS平台0.1％的检测下限，检测0.1％以下癌症驱动基因突变，提高NGS在液体活检ctDNA中的灵敏度，降低因NGS实验过程中造成的假阳性。
附图说明
图1是含有数字信号的接头的工作原理图。
图2是用含有数字信号的接头和常规P5、P7结构分别进行建库、测序分析得到的有效测序深度对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。
实施例中所述的“LoBind离心管”是众所周知的，是一种具有低吸附性的离心管。
实施例中所述的“磁珠”是指超顺磁性纳米颗粒，能够帮助DNA产物核酸进行纯化。实施例中所使用的磁珠为Beckman Ampure XP Beads(来自Beckman)。
实施例
实施例1接头设计
测序文库构建中所使用的接头是加入特殊设计的数字接头。数字接头可以是包含数字信号的数字P5接头与普通含有index的P7接头(又可称为常规P7接头)的组合，或者可以是包含数字信号的数字P7接头与普通P5接头(又可称为常规P5接头)的组合。
其中普通P5接头是标准的Illumina TruSeq High Throughput(HT)P5接头，序列如下：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'。
其中普通P7接头是标准Illumina TruSeq low throughput(LT)P7接头，其序列如下：
P7：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-index-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
包含数字信号的数字P5接头是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是在普通P5接头序列的5'端第29位的C和第30位的A之间插入n碱基随机序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同。
包含数字信号的数字P7接头是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是用n碱基随机序列取代普通P7接头序列中的index序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同。
其中n是选自2-9的任一个数字。
数字P5接头和数字P7接头均为合成的多种序列的混合物，在合成过程中使各种序列中的n碱基随机序列各不相同，每一个n碱基随机序列中的任一个碱基随机为A、G、C或T中的任何一个。
现有的下一代测序技术中，在对测序结果进行分析比对查找突变位点时，通常会去掉多余的、完全重复的reads(即序列完全相同的reads)，因为通常认为序列完全相同的reads是PCR扩增产生的，都来源于cfDNA样品中的同一个原始片段，对于有效测序深度没有贡献，因此计算有效测序深度时会对于序列完全相同的reads仅保留一个read。然而，同一个cfDNA样品中也可能包含来自于不同来源的序列完全相同的DNA分子，这些DNA分子虽然序列完全相同，但它们来自于不同来源，因此在对测序结果进行分析比对时均应当被纳入到有效测序深度中，但是在现有的测序技术中，这样的DNA分子也被去除了，这导致有效测序深度的减少，使得低频突变与测序底噪难以区分。
本发明使用含有n个随机碱基的数字接头混合物进行测序文库构建，碱基有ATCG四种，n个随机碱基有4n种可能的排列组合，因此在对cfDNA样品进行接头连接时，来自于不同来源的序列完全相同的DNA分子会被加上不同的数字接头(数字P5接头或数字P7接头，它们分别含有不同的n个随机碱基)。当测序分析得到的结果中包括相同的序列时，可以根据数字信号(即数字P5接头或数字P7接头中的n个随机碱基)区分是PCR扩增导致的，还是源于不同的DNA分子。经文库捕获、测序后，在数据分析过程中可将携带相同数字接头的片段归入一个家族，当某一突变在两个及更多个家族中出现，就可以认为是真阳性突变。这就可以将NGS实验过程中产生的底噪去除掉，凸显出真正的变异位点。例如，当n是9并且数字接头是包含数字信号的数字P5接头与普通含有index的P7接头的组合时，9个随机碱基有49种可能的排列组合，因此在对cfDNA样品进行接头连接时，来自于不同来源的序列完全相同的DNA分子会被加上不同的数字P5接头(即含有不同的9个随机碱基的接头)。当测序分析得到的结果中包括相同的序列时，可以根据数字信号(即数字P5接头中的9个随机碱基)区分是PCR扩增导致的，还是源于不同的DNA分子。经文库捕获、测序后，在数据分析过程中可将携带相同数字P5接头的片段归入一个家族，当某一突变在两个及更多个家族中出现，就可以认为是真阳性突变。这就可以将NGS实验过程中产生的底噪去除掉，凸显出真正的变异位点(如图1所示)。
实施例2测序方法
1.血液样本的分离。血液使用真空抗凝管收集后，经离心处理血液分三层：上层血浆，中层白细胞及下层红细胞。上层血浆吸出抽提cfDNA，中层白细胞吸出抽提gDNA(GenomeDNA，基因组DNA)。如为胸腹水和脑脊液等其他体液，先14000rpm离心15min，取上清分离cfDNA。cfDNA经NGS测序评估患者基因突变，gDNA经NGS测序做分析患者基因突变背景使用。
2.cfDNA文库构建。
2.1.末端修复
0.2ml PCR反应管，加入30ng提取后的cfDNA样本或质控品，用Low EDTATE(包含10mM Tris和0.1mM EDTA)补齐至50μL，震荡混匀，短暂离心。分别加入1μL末端修复酶混合物和6μL末端修复反应缓冲液，震荡混匀短暂离心后在37℃保温5min，随后在65℃保温30min，37℃保温5min，进行末端修复。反应结束后取出PCR反应管，将产物全部转移至新的1.5mL离心管中；在每个离心管中加入108μL核酸纯化磁珠，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。在每个离心管中分别加入30μL Low EDTA TE、18μL缓冲液、1μL修复酶G3、1μL修复酶G4(修复酶G3和修复酶G4的购自SWIFT)，充分混匀后，于20℃孵育20min。取出离心管，分别加入50μL PEG NaCl，吹打混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清。重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。
2.2.接头连接
向干燥后的含有不同样本的离心管中分别单独加入5μL常规P7接头或包含2-9碱基随机序列的数字P7接头，并在离心管管盖或管壁上用记号笔做好标记；分别加入20μLLow EDTA TE、3μL接头缓冲液、2μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，25℃恒温孵育15min。加入49.5μL PEG NaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。分别加入30μL Low EDTA TE、16μL缓冲液、1μL连接酶，1μl Taq-B DNA聚合酶，1μl常规P5接头或包含2-9碱基随机序列的数字P5接头，充分混匀并重悬磁珠后，40℃恒温孵育10min。加入82.5μL PEG NaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留，室温干燥5min(不可使磁珠过度干燥)。加入20μL Low EDTA TE，室温孵育3min。将离心管转移至磁力架上，静置2min，小心吸取上清至新的1.5mL离心管中。
2.3文库扩增与纯化
分别加入25μL PCR扩增酶混合物、5μL引物混合物进行PCR扩增。向反应完成的离心管中，加入1.65倍的PEG NaCl溶液，并吹打混合均匀，室温孵育。孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置2-3min，待溶液澄清后，吸弃溶液，期间切忌接触磁珠。在离心管中加入新鲜的80％乙醇200μL，静置30s后，吸弃乙醇，切勿接触磁珠，重复操作一次。吸弃乙醇后，将磁珠晾干至表明呈磨砂状，切勿使磁珠过干，出现许多裂缝，磁珠晾干后，加入Low EDTA TEbuffer 20μL，并室温孵育。孵育完成后，置于磁力架上，静置2-3min，待溶液澄清后，吸取溶液，转移至新的1.5mL LoBind离心管中。
3目的区域捕获。
3.1.杂交
将3-4个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mLLoBind离心管中成为一个样品池，样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μL DNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)、2.7μL杂交增强剂和3.8μL PCR-grade water，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mL PCR反应管中，95℃保温10min。取出PCR反应管，短暂离心后加入2μL实施例2获得的捕获探针混合物，震荡混匀3-5s，短暂离心后在68℃保温4h以上，热盖温度为78℃。
3.2.富集
取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2mL PCR反应管中。
将步骤3.1中的PCR反应管取出，短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL 65℃预热的1×洗液Ⅰ，将全部悬液转移至1.5mL LoBind离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。
加入200μL 65℃预热的1×杂交洗液，震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。
再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μL Nuclease-free water，震荡重悬后全部转移至0.2mL PCR反应管中备用。
3.3.捕获文库扩增与纯化
向上述PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，充分混匀短暂离心后按下述程序进行PCR扩增：95℃3min；10个循环，每个循环为98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。
将PCR反应管短暂离心后，将产物全部转移至1.5mL离心管中。加入75μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μLNuclease-free water震荡重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μL上清至新的1.5mL LoBind离心管中备用。取2μL捕获文库或捕获的质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。
4.测序
Illumina Nextseq 500测序。按照仪器标准操作流程准备测序样本，设定双端测序，测序数据经去重，对比参考序列，突变位点分析等参数经特殊优化的分析流程分析后，获得患者基因突变信息。
实施例3有效测序深度检测
使用血液cfDNA样本，使用下述数字接头按实施例2的方法进行建库和测序：
P5-ID：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
P7:GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-GAGTGGA-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。
其中NNNNNNNNN是9碱基随机序列。获得的测序深度为10000X以上，有效测序深度5000X以上。
实施例4有效测序深度比较
用同一从癌症患者血液中提取的cfDNA样本(30ng)分别用数字接头和常规P5和P7接头，通过实施例2所述方法进行建库，杂交捕获后进行三次测序。
其中数字接头按照实施例1所述设计，选用包含9碱基随机序列的数字P5接头和常规P7接头的组合，具体序列为：
P5-ID：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
P7：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-CGATGTA-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。
其中P5-ID接头是数字P5接头，为合成的多种序列的混合物，在合成过程中使各种序列中的9个随机碱基NNNNNNNNN各不相同且序列随机，即每一个N随机为A、G、C或T中的任何一个。
作为对照使用的常规P5和P7接头的序列为：
P5：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
P7：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-GTGAAAC-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
其中所有接头序列在连接反应之前先配制为浓度1μM的溶液。
三次测序的原始测序深度分别为7000X，10000X和15000X。从图2中可以看到，随着原始测序深度的提高，使用常规P5和P7接头的方法中，有效测序深度并没有提高，而使用本发明的数字接头非常有效地提高了有效测序深度。
实施例5建库所需cfDNA量的比较
从癌症患者血液中提取获得cfDNA，分别用5ng、10ng、20ng、30ng、60ng的cfDNA的量用数字接头通过实施例2所述方法进行建库、杂交捕获和测序，分析其原始测序深度和有效测序深度。用60ng cfDNA用常规P5和P7接头通过实施例2所述方法进行建库、杂交捕获和测序，分析其原始测序深度和有效测序深度。其中数字接头以及常规P5和P7接头的序列与实施例4相同。结果如下表1所示：
表1建库所需cfDNA量的比较
由表1可知，使用常规P5和P7接头，原始测序深度为11000X时，有效深度为2310X。而使用本发明的数字接头，用10ng cfDNA所建文库原始测序深度为11000X时，有效测序深度已经达到3000X。
实施例5检测敏感性比较
将细胞KYSE-270、NCI-H460和NCI-H1975分别用Mnase处理后用cfDNA抽提试剂盒抽提纯化得到模拟的cfDNA。以KYSE-270细胞的cfDNA为背景，加入1％的NCI-H460cfDNA和1％的NCI-H1975cfDNA。将此混合DNA分别用数字接头和常规P5和P7接头，通过实施例2所述方法进行建库测序，其中数字接头以及常规P5和P7接头的序列与实施例4相同，比较二者的敏感性和最低检测下限，结果如表2所示。
表2检测敏感性比较
数字接头 常规P5和P7接头
总突变位点数 74 74
阳性 70 36
阴性 4 38
敏感性 94.59％ 48.65％
最低检测下限(LOD) 0.03％ 0.50％
由表2可知，原始测序深度10000X，分析74个已知突变位点的检测情况。结果显示，使用本发明的数字接头比使用常规P5和P7的突变检出率提高了将近一倍，从48.65％提高到94.59％，最低突变频率检测下限则从0.5％提高到0.03％。

Claims (5)

1.用于cfDNA建库的含有数字信号的接头，所述含有数字信号的接头包括两种接头序列，所述两种接头序列是在下述的P5和P7接头序列的基础上进行序列修饰得到的：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
P7：5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACG-index-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'；
其中：
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是在上述P5接头序列的5'端第29位的C和第30位的A之间插入n碱基随机序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P7接头序列；或者
两种接头序列中的一种是多种序列的混合物，组成混合物的每种序列分别是用n碱基随机序列取代上述P7接头序列中的index序列得到的序列且每种序列中的n碱基随机序列各不相同，两种接头序列中的另一种是上述P5接头序列；
其中n是选自2-9的任一个数字。
2.权利要求1的含有数字信号的接头在cfDNA建库中的应用。
3.cfDNA建库方法，包括下述步骤：
(1)末端修复；
(2)将权利要求1的含有数字信号的接头连接至经过末端修复的cfDNA片段的两端；
(3)文库扩增与纯化。
4.cfDNA建库试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1的含有数字信号的接头。
5.权利要求4的试剂盒，还包括cfDNA建库所需的一种或多种其它试剂。
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