CN110791813B - 对单链dna进行处理的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
对单链DNA进行处理的方法及应用，本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种基于单链DNA构建文库的方法。所述方法包括：在所述单链DNA的3’末端连接第一接头，所述第一接头上连接有结合剂，所述第一接头包括两条部分互补的链，所述两条部分互补的链分别为第一条链和第二条链，其中，所述第二条链比所述第一条链多5～10个碱基；利用吸附剂对经过所述第一接头连接的单链DNA进行吸附，以便去除掉所述第二条链，从而获得含有所述单链DNA的双链DNA。通过本发明的方法构建基因文库，分子利用率高，建库用到的样本起始量低，而且最低检出限更低。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种对单链DNA进行处理的方法及应用。
背景技术
恶性肿瘤的发生是一个多基因多事件积累的结果。在这种克隆性演化的过程中，常积累一系列的基因突变，可以涉及不同染色体上多种基因的变化，如癌基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞周期调节基因及维持细胞基因组稳定性的基因等。通过高通量测序技术可研究上述基因及其表达mRNA的突变和表达水平的变化，从而揭示肿瘤发生和演化中信号和代谢通路的变化。而目前高通量测序的文库主要是利用双链DNA模板为起始，经过末端修复，加A，加接头等步骤来实现文库构建的。这种建库方法对于一些单链DNA或者说有片段缺刻的双链DNA来说，不能有效获得这部分DNA的信息。
因此，基于单链DNA构建文库的方法还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基于单链DNA构建文库的方法，该方法可以解决传统双链DNA文库构建过程中遗漏掉很多单链DNA，从而导致样本分子利用率低的缺陷。而且可以极大的节省基于单链DNA构建文库的成本，便于大规模应用。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种对单链DNA进行处理的方法，包括：在所述单链DNA的3’端连接第一接头，所述第一接头上连接有结合剂，所述第一接头包括两条部分互补的链，所述两条部分互补的链分别为第一条链和第二条链，其中，所述第二条链比所述第一条链多5～10个碱基；利用吸附剂对经过所述第一接头连接的单链DNA进行吸附，以便去除掉所述第二条链，从而获得含有所述单链DNA的双链DNA。本发明通过在3’端连接上第一接头，利用第一接头中第二条链比第一条链所多出的5～10个碱基，可以模拟双链DNA的连接，由此，在将第一接头序列连接到3’端时，可以利用双链连接的连接酶，而非专用于单链DNA连接的连接酶，由此，可以极大的降低DNA建库的成本，有利于单链DNA建库的大规模应用。而且，在第一接头上还连接有结合剂，在将第一接头连接到单链DNA的3’端时，结合剂一并连接到单链DNA上，后续再用吸附剂洗脱的过程中，由于吸附剂可以特异性吸附结合剂，从而可以避免在纯化洗脱等过程中丢失DNA样本的小片段，因此可以用来分析样本的变异信息，用来富集样本中的小片段，提高样本分子的利用率。
其中，所述“两条部分互补的链”的含义指的是：第二条链和第一条链上的碱基部分互补配对。根据本发明的实施例，所述两条部分互补的链可以为：除了第二条链比第一条链多出的5～10个碱基之外，第二条链的其他部分和第一条链碱基互补。
根据本发明的实施例，以上对单链DNA进行处理的方法可以进一步附加如下技术特征：
根据本发明的实施例，以上方法中，所述单链DNA的3’末端和5’末端均不含有磷酸基团。通过将样本DNA去磷酸化处理，去除所述样本DNA两端的磷酸基团后，变性得到所述单链DNA。
根据本发明的实施例，以上方法中，所述第一条链上连接有所述结合剂，所述第二条链上未连接有所述结合剂。通过第一条链上的结合剂与吸附剂作用，可以将第一条链固定，而第二条链上未连接有结合剂，这样可以通过洗脱或者其他方式去除掉第二条链，然后进行延伸，获得含有所述单链DNA的双链DNA。
根据本发明的实施例，所述结合剂为生物素，所述吸附剂为链霉亲和素标记的磁珠。借助于生物素和链霉亲和素之间的共价结合作用，能够有效去除第二条链。
根据本发明的实施例，所述第二条链比所述第一条链多出的5～10个随机碱基与所述单链DNA配对。所述随机碱基指的是碱基为A，T，C，G的随机排列，本发明中第二条链比第一条链多出5～10个连续的随机碱基，从而利用随机碱基与所述单链DNA进行随机配对。
根据本发明的实施例，所述第二条链比所述第一条链多出6个随机碱基与所述单链DNA配对。
根据本发明的实施例，所述第一条链和所述第二条链的浓度比为1：1.2～2。第二条链相比较于第一条链的浓度高，可以保证第一条链100％利用。从经济和实用的角度来说，第二条链的浓度是所述第一条链的浓度的1.2～2倍即可。
根据本发明的实施例，所述第一条链的核酸序列为SEQ ID NO:1，所述第二条链的核酸序列为SEQ ID NO：2。
根据本发明的实施例，利用引物SEQ ID NO:3对所述去除掉第二条链的单链DNA进行所述延伸，以便获得所述双链DNA。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：在所述双链DNA的5’末端连接上第二接头，以便建库获得测序文库。
根据本发明的实施例，以上方法中，所述第二接头包括两条至少部分互补的链，所述两条至少部分互补的链分别为第三条链和第四条链，所述第三条链和所述第四条链上均含有4～8个随机碱基。通过在5’末端连接上第二接头，使得双链DNA的5’末端分别连接上第三条链和第四条链，其中，这两条链中均含有4～8个随机碱基。通过随机碱基作为分子标签序列，在进行信息分析的过程中，可以利用该分子标签进行去重分析，从而可以用来区分PCR错误，区分测序错误与真正的变异，进而避免出现假阳性的结果，从而实现建库过程中的矫正功能。
任选地，所述第四条链上还含有PCR扩增引物互补序列。通过PCR扩增引物互补序列可以与后续的扩增引物互补配对，从而可以用于后续DNA序列的扩增，以便制备测序文库。
根据本发明的实施例，以上方法中，所述第三条链的核酸序列为SEQ ID NO:4，所述第四条链的核酸序列为SEQ ID NO：5。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库根据本发明的第一方面的基于单链DNA构建文库的方法构建而成。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种测序平台，所述测序平台利用根据本发明的第一方面的基于单链DNA构建文库的方法进行测序。
根据本发明的实施例，所述测序平台包括BGISEQ-500测序平台、Illumina测序平台和/或Ion Proton测序平台。
根据本发明的实施例，所述测序平台用于全基因组甲基化测序。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种测序文库在基因变异检测领域中的用途，所述测序文库为根据本发明的第二方面提供的测序文库。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述基因变异包括单核苷酸位点变异、缺失插入变异和/或基因融合变异。
根据本发明的实施例，以上用途中，所述用途包括用于肿瘤相关基因的基因变异的检测。应用本发明的测序文库，也就是基于单链DNA构建测序文库的方法，可以用于但不限于肺癌等恶性肿瘤患者的靶向药物的用药指导以及用药过程中疗效或耐药的动态监测，从而用来指示肿瘤相关基因的基因变异的情况。
根据本发明的实施例，所述肿瘤为肺癌，所述肺癌相关基因包括选自如下基因中的至少一种：AKT1，ALK，BRAF，EGFR，ERBB2，FGFR3，KRAS，MAP2K1，MET，NRAS，NTRK1，PIK3CA，RET，ROS1和TP53。应用本发明的测序文库，可以采用较少的DNA，就可以扩大检测的样本类型，用来检测人类15种非小细胞肺癌相关基因的低频突变，从而提高样本分子的利用率。
本发明所取得的有益效果为：通过本发明的方法构建基因文库，在以下几个方面具有明显的优势，主要表现在：第一，分子利用率提高：相较于传统的双链DNA文库构建方法，单链DNA文库构建能够显著增加同等质量DNA中转化成测序文库分子的数目；第二，建库起始量降低：由于对DNA模板的利用率提高，可以在降低建库起始量的情况下，达到同等的检测性能，从而扩大样本检测范围，例如穿刺样本；第三，最低检出限更低：由于本专利数据利用率高且有分子标签(UID)辅助，因此检出限较其它产品高。
附图说明
图1为根据本发明的实施例提供的基于单链DNA构建文库的流程图。
图2为根据本发明的实施例提供的SNV和InDel的检测原理图。
图3为根据本发明的实施例提供的基因融合的检测原理图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的发明人在研究过程中发现：现有针对单链DNA文库的构建技术的整个思路在于：首先DNA变性为单链DNA，进行末端修复，3’末端加尾后，利用特殊的连接酶将接头序列连接到单链DNA的3’端，从而实现两条单链DNA片段的直接连接；然后利用延伸引物延伸，获得双链DNA片段，利用磁珠纯化，去除反应体系中多余的小的核酸片段；再将另一接头序列连接到双链DNA的5’端，利用磁珠纯化，去除多余接头；最后利用引物进行PCR扩增，从而获得相应的测序文库。
基于以上测序过程，本发明人发现，其存在诸多问题，主要表现在：
首先，用来将两个单链DNA片段连接起来的Circligase连接酶比较贵，从而会导致建库的成本比较高；其次，在利用延伸引物延伸，从而获得双链DNA片段后，利用SPRI磁珠纯化的过程中，磁珠会优先选择吸附大片段DNA，从而会导致血浆游离DNA以及古生物DNA样本中，小片段DNA的丢失，从而会丢失一些可能比较重要的变异信息；再次，无论是连接在5’端还是连接在3’端的接头序列，其并未进行过任何处理，即没有连接有任何可以作为分子识别和鉴定的标签序列，导致无法在信息分析流程中区分PCR错误和测序错误，从而导致无法去除掉假阳性结果。
为此，导致基于单链DNA文库的构建方法的使用受到了限制，从而影响了其应用，所以导致目前的高通量测序文库的构建主要以比较完整的双链DNA模板为起始链，利用末端修复，加A，加接头等步骤实现文库的构建，这种比较传统的双链DNA文库的构建方法对于降解比较严重的DNA样本，或者是对某些缺刻的双链DNA来说，会导致样本中的很大一部分DNA分子无法有效利用，从而导致样本的分子利用率低。这种情况尤其会限制了对于某些与疾病相关的基因突变位点的检测和个性化治疗或者说是精准医疗的发展和使用。
为此，针对发明人发现的如上问题，本发明的发明人设计了一种新的基于单链DNA文库的构建方法，该方法的思路在于：在3’端连接接头序列的过程中，通过人工引入一段序列，模拟双链DNA的连接，从而使得在将接头序列连接到3’端时，可以利用双链连接的连接酶，如T4DNA连接酶，从而极大的降低DNA建库的成本。在此基础上，3’端接头做了生物素修饰，连接反应结束后与链霉素磁珠孵育结合，避免在后续的纯化过程中丢失DNA样本中的小片段，进而丰富样本的变异信息，可以用来富集样本中的小片段。另外，5’端接头上引入分子标签序列，在信息分析层次上可以根据分子标签进行去重分析，从而区分PCR错误，测序错误与真正变异，进而避免出现假阳性，从而实现建库过程中的校正功能。
基于以上思路，本发明的发明人提供了一种基于单链DNA构建文库的方法，包括如下步骤：在所述单链DNA的3’端连接第一接头，所述第一接头上连接有结合剂，所述第一接头包括两条至少部分互补的链，所述两条至少部分互补的链分别为第一条链和第二条链，其中，所述第二条链比所述第一条链多5～10个随机碱基；利用吸附剂对经过所述第一接头连接的单链DNA进行吸附，去除掉所述第二条链；然后进行延伸，从而获得含有所述单链DNA的双链DNA；在所述双链DNA的5’端连接上第二接头，扩增获得DNA文库。
利用以上方法可以构建测序文库，实现对于样本的测序文库的构建以及测序，从而获得样本的生物学信息。所述样本包括但不限于：组织或者体液，可以为血浆，癌组织，脑脊液，胸腔积液，唾液，腹水，脱落细胞，淋巴液，新鲜组织及FFPE石蜡包埋切片等。由于该方法对于DNA模板的利用率提高，可以在降低建库起始量的情况下，达到同等的检测性能，所以可以扩大样本的检测范围，例如所述样本还可以为古生物样本，穿刺样本。根据本发明的一种具体实施方式，本发明首先将样本DNA进行去磷酸化处理，去除两端的磷酸基团，从而从样本中获取得到单链DNA。
根据本发明的一种具体实施方式，所述结合剂为生物素，所述吸附剂为链霉亲和素标记的磁珠。
根据本发明的一种具体实施方式，在所述5’末端加第二接头，以便形成能够被通用引物进行PCR扩增的双链DNA分子。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1
实施例1提供了一种基于单链DNA构建测序文库的方法(技术路线如图1所示)，实验样本采用从Horizon公司购买的阳/阴性血浆标准品HD777与HD779(标准品编号匹配后面展示数据)。实验过程中用到的接头及序列引物见下表1所示。
表1 DNA文库构建过程中用到的引物序列
其中，表1中N代表随机序列，即可以为A，T，C，G中的任意一种。*代表硫代修饰，表示对*前面的碱基进行硫代修饰，以SEQ ID NO:3序列为例，从左向右(即5’端向3’端数)第一个*代表的是，对其前面的碱基进行硫代修饰。对碱基进行硫代修饰的目的是为了防止聚合酶的外切活性消化引物。dd代表双脱氧修饰。[C3Spacer]10可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，TEG为三乙二醇。AmC12和AmC7代表5’端和3’端的氨基修饰，能够封闭DNA序列两端，防止在接头处理过程中的降解。
基于单链DNA构建测序文库的方法具体如下：
1、去磷酸化
首先对样本DNA进行去磷酸化处理，去除样本DNA两端的磷酸基团，然后变性为DNA单链。
按照下表2中将组分混合均匀后，置于PCR仪中，运行反应条件：37℃，20min；95℃，3min；4℃hold，取出放冰上。其中“rxn”代表的是“reaction”的缩略，代表的是单次反应用量。
表2各组分用量
| 组分 | μL/rxn |
| 10x T4RNA ligation buffer(NEB，B0216L) | 8 |
| 2％Tween 20 | 2 |
| FastAP(1Μ/μL)(Thermo，EF0651) | 5 |
| DNA+NF-water | 38.5 |
| Total | 53.5 |
2、3’末端连接
将步骤1得到的去磷酸化产物的3’末端按照如下过程连接上接头。
按照下表3将组分混合均匀后，置于PCR仪中，运行反应条件：37℃，60min；95℃，3min；4℃，hold，取出放冰上。其中，所用到的连接接头序列ss-AD/Splinter来自于表1，ss-AD与Splinter的浓度比为1：2(即分别为10μM以及20μM)，由表1所示的DNA寡核苷酸链退火形成的。其中ss-AD上连接有[C3Spacer]10，其可为寡核苷酸标记提供必要的间隔，以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，而且在3’端连接有三乙二醇(TEG)以及生物素(biotin)。其中Splinter上的5’末端连接有AmC12，3’末端连接有AmC7，代表5’端和3’端的氨基修饰，能够封闭DNA序列两端，防止在连接处理过程中该接头序列的降解，其中6N代表为A、T、C或G的任意6个碱基的随机排列。
表3各组分用量
3、磁珠孵育及洗脱
将3’末端连接产物按照如下步骤进行磁珠孵育及洗脱，从而去除带有“6N”的Splinter序列。
(1)链霉素-生物素磁珠预处理：将50μL链霉素-生物素MyOne C1磁珠(Invitrogen，650-02)转移至新的1.5mL离心管中，之后再向离心管中加200μL结合缓冲液(Binding buffer)，室温震荡混匀。短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置1min。待溶液澄清后，吸弃上清。如上步骤重复3次，最后再用100μL Binding buffer重悬磁珠备用。
(2)将连接后的混合液加入到处理过的链霉素-生物素磁珠混合液中，室温孵育40min。
(3)孵育结束后，轻微离心，上磁力架，去除上清。加200μL缓冲液A(Wash bufferA)，混匀。上磁力架，去上清。加200μL Stringency wash buffer，混匀，45℃，5min，1500rpm。结束后离心，上磁力架，去上清。重复一次。加200μL缓冲液B(Wash buffer B)，上磁力架，去上清。
4、延伸
按照下表4中将组分混合均匀后，转移到PCR管中，置于PCR仪中，65摄氏度3min，立即放在冰上2-5min，然后放置室温。其中延伸引物500-Extension Primer来自于表1中。
表4各组分用量
| 组分 | μL/rxn |
| NF-water | 34.5 |
| 10×Klenow reaction buffer | 5 |
| dNTP(25mM) | 2 |
| 500-Extension Primer | 1 |
| 1％Tween-20 | 2.5 |
| Total | 45 |
待样本恢复至室温时，加5μL Klenow Fragment(10Μ/μL)，混匀后，置于PCR仪中，运行延伸反应条件：25℃，5min；35℃，25min。
5、延伸后洗脱
反应结束后，轻微离心，上磁力架，去除上清。加200μL Wash buffer A，混匀。上磁力架，去上清。加200μl Stringency wash buffer，混匀，45℃，5min，1500rpm。结束后离心，上磁力架，去上清。加200μl Wash buffer B，上磁力架，去上清。
6、5’末端连接
按照下表将组分混合均匀后，置于恒温金属浴中，运行反应条件：22℃，60min；每隔15min弹匀一次。其中连接接头(truncated-dsAD-3以及truncated-dsAD-4)如表1所示。
表5各组分用量
7、连接后洗脱
反应结束后，轻微离心，上磁力架，去除上清。加200μL Wash buffer A，混匀。上磁力架，去上清。加200μL Stringency wash buffer，混匀，45℃，5min，1500rpm。结束后离心，上磁力架，去上清。加200μL Wash buffer B，上磁力架，去上清。
8、DNA捕获前预扩增
按照下表6将组分混合均匀后，置于PCR仪中，按照下面设定程序(表7)进行PCR扩增反应，其中所用到的扩增引物500-Pre-R和500-Pre-L如表1所示。
表6各组分用量
表7设定程序
构建完成的DNA文库使用
3.0Flμorometer测定其浓度，使用Agilent DNA1000试剂盒(Agilent DNA 1000Kit，Agilent公司，5067-1505)检测文库片段分布及文库浓度。
实施例2文库靶向捕获
应用实施例1的基于单链DNA制备的文库，设计探针，进行文库靶向捕获，包括如下步骤：
1、PAP探针的设计
探针设计的靶区域覆盖与非小细胞肺癌用药相关的15个基因，AKT1，ALK，BRAF，EGFR，ERBB2，FGFR3，KRAS，MAP2K1，MET，NRAS，NTRK1，PIK3CA，RET，ROS1，TP53热点突变所在外显子及基因融合内含子。
针对SNV和InDel(插入缺失标记)变异类型的检测原理如图2，在检测热点两边设计两条对向探针，探针延伸方向会覆盖检测热点，从而尽量保证检测热点的最佳覆盖度。
针对基因融合变异类型的检测原理如图3，因为在肿瘤细胞中融合变异的原因在于功能基因获得了强启动子，所以在设计融合基因的探针时，在功能基因的断裂热点区逆转录方向设计层叠探针，向启动子方向延伸，融合变异的强启动子序列会被延伸出来，并被测序。最终统计测序数据中溯源到融合探针捕获的Reads分布，从而确定融合的类型和频率。
2、PAP探针的制备
(1)ddNTP修饰
本例的PAP探针从5’末端到3’末端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，特异识别序列的3’末端包括40bp的与肺癌肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，通用引物序列是一段与肺癌肿瘤DNA片段没有杂交配对的序列。其中，所用到的通用引物序列是一段能够与捕获后PCR引物互补配对的序列，其序列为SEQ ID NO:8：5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’。
与肺癌基因DNA片段特异性杂交的互补序列是基于肺癌热点或融合区域，两端各延伸130bp后，通过开发软件，在对应区域内设计的特异性序列，长度为40bp。在设计特异性序列时，软件核心算法可以考虑探针的GC含量，在基因组上的特异性，以及探针与目标区域互补时的自由能等因素。并且根据目标区域，对热点进行正负链的双向覆盖，对融合区域进行逆转录方向的单向覆盖(因有效的融合模式为原癌基因上游与强启动子重排，故基于原癌基因设计的融合探针需逆着转录方向才可扩增出与启动子的断点位置)。依照此，设计一千多条与肺癌基因DNA片段特异性杂交的互补序列，然后与通用引物序列形成PAP探针。
首先将探针中能够与模板DNA链互补配对的40bp的序列与模板进行比对，从而查询出探针3’末端一延伸碱基的种类，即第41bp的碱基种类。用此方法确定全部的探针中延伸碱基的类型，通过这一延伸碱基的种类将探针归为末端ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP四类。然后四类探针分别在末端添加相应的双脱氧核苷酸。添加双脱氧核苷酸的方法如下：
ddNTP原液在4℃解冻，震荡混匀，在新的EP管中，用水稀释10倍制成工作液，-20℃保存备用。其余试剂在4℃解冻，备用。使用NEB公司的末端转移酶试剂盒，每个反应的ddNTP修饰反应体系为30μL，包括：5×TdT buffer 6μL、100μM的探针5μL、1nmol/μL的ddNTP 12μL、15U/μL的TdT 6.7μL，补充DDW至30μL。
各组分添加完毕，移液器吹打混匀，短暂离心后，将体系置于37℃恒温孵育5h。反应完成，即获得PAP探针。
同时，为了评估PAP探针制备过程中是否存在问题，由于用于肺癌的PAP探针分子量超出核酸质谱分子量检测的上限，因此会用一条小片段DNA且序列已知的核酸序列作为质控品，通过核酸质谱分子量检测，来确定PAP探针制备过程是否合适。本实施例利用对照探针序列为(SEQ ID NO:9)：5’-AAAAACGACCTCTATCTAAACGT-3’作为质控品，经检测PAP探针制备正常。
(2)PAGE纯化
采用7M，15％Urea-PAGE对ddNTP修饰反应产物进行纯化，获得纯化的PAP探针，用于后续的肺癌ctDNA富集。
其中，7M，15％Urea-PAGE的制备方法如下：
用超纯水清洗两块玻璃胶板，风干。将4℃保存的40％Acr-Bis(19:1)溶液平衡至室温。将玻璃胶板戳齐置于灌胶器上压好，向待灌胶位置注入10mL无水乙醇，待液面稳定后，观察页面是否下降，验漏。验漏结束，将胶板间的无水乙醇倒出，并将胶板倒置，控干残余的无水乙醇。控干过程中，取干净的50mL离心管，于天平称取10.5g尿素。向称好的尿素中加3.5mL超纯水，5mL 5×TBE buffer，虚掩冠盖，将管子连同离心管架置于微波炉中，加热10s。将管子从微波炉中拿出，拧紧管盖，震荡混匀至体系中无尿素晶体。将体系置于离心管架上，冷却至室温。向冷却后的体系中加入9.375mL的40％Acr-Bis(19:1)预混溶液，震荡混合均匀。向混合体系中加入125μL10％AP，震荡混合均匀。向混合体系中加入12.5μL TEMED，震荡混合均匀。将混合体系插入冰中，冷却5-10min。将控干的胶板正置，取10mL注射器，吸取冷却后的PAGE胶溶液加置玻璃板缝隙中，直至灌满。灌满后立即插入梳子，静置，等待胶凝固。凝固后的PAGE胶，若不立即使用，可用保鲜袋盛放，保鲜袋内加1×TBE，置于4℃保存过夜。用超纯水清洗两块玻璃胶板，风干。
PAGE纯化：
凝固的PAGE胶置于盛有1×TBE的垂直电泳槽中，拔出梳子，于250V恒压条件下，预电泳30min备用。预电泳结束，用200μL移液器吹打各样孔，将其中沉淀的碎胶及高浓度尿素吹出，备用。
ddNTP修饰反应产物每管样本30μL，向其中加入15μL切胶回收用甲基橙loadingbuffer，混合均匀。将混合液加入PAGE胶的样孔中，待样品沉入孔底，200V恒压电泳，约1h。电泳结束后，用胶铲小心撬开玻璃板。切断玻璃板与胶连接边界，将PAGE胶取下转移至EB染色液中，染色10min。染色过程中，用烧红的针头在Qbit管底部穿刺7个小孔。打好孔的Qbit管套在2mLEP管中备用。染色后的PAGE胶置于干净的PE手套上，于蓝光下切去所有可见条带。将回收的条带胶块置于打孔的Qbit管中。切胶前后用凝胶成像仪备案。将Qbit管连同2mL套管，全速离心1min。离心后检查Qbit管中是否有残余胶块，若有少量胶块，可直接倒入收集管中。向粉碎的胶块中加入600μL的1×NEB buffer2。将悬浮体系置于垂直混匀仪，最大转速，颠倒混匀4h。混匀后的混合体系倒入Spin-X离心过滤管中，全速离心1min。离心后弃滤膜及碎胶，保留收集管中的液体。用移液器测量流穿液体体积。测量后，向流穿液体中加3倍体积的无水乙醇，20μL 3M pH5.6的NaAc以及1μL5mg/mL的Glycogen，颠倒混匀，置于-20℃沉淀过夜。次日，离心机预冷至4℃备用。配置75％乙醇溶液，置于-20℃备用。醇沉过夜的引物溶液置于离心机中，全速离心10min。离心后小心倒掉上清，向管底沉淀加700μL75％乙醇溶液，颠倒混合后置于4℃全速离心10min，重复乙醇洗涤步骤一次。将EP管短暂离心，之后用中枪头套小枪头小心吸出管底残余乙醇，将管子开盖置于通风处晾干。晾干后，向管内加30μL的DNase free water回溶，即获得纯化的PAP探针。
纯化完成的PAP探针溶液，取1μL使用Nanodrop ssDNA测定浓度，并根据分子量计算摩尔浓度。本例将作为质控的对照探针的纯化PAP探针，取20μL用于核酸质谱检测，测定产物分子量，评估TdT反应体系的效率。摩尔浓度结果显示，纯化回收获得的PAP探针浓度与ddNTP修饰反应体系中探针浓度相当，说明PAGE纯化能够有效的对探针进行回收纯化。
3、链霉素-生物素磁珠预处理
将50μL链霉素-生物素M280磁珠(Invitrogen，112.06D)转移至新的1.5mL离心管中，之后再向离心管中加200μL Binding buffer，室温震荡混匀。短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置1min。待溶液澄清后，吸弃上清。如上步骤重复3次，最后再用200μLBinding buffer重悬磁珠备用。
4、PAP探针杂交反应和磁珠捕获洗脱：
按照下表将组分混合均匀后，置于PCR仪中，利用步骤2制备的PAP探针，运行步骤2制备的PAP探针捕获反应条件：95℃，5min；1％速率降温至55℃；55℃，10min。
表8各组分用量
| 组分 | μL/rxn |
| PAP探针 | 1 |
| DNA文库 | 12.3 |
| 10×ExtaqBuffer | 2 |
| 100×Tween20Solμtion | 0.2 |
| DMSO | 0.5 |
| 5×Betaine Solution | 4 |
5、PAP探针杂交产物磁珠捕获
反应结束，将杂交体系短暂离心后迅速置于冰上。待杂交体系冷却，将其转移至已经洗好的链霉素-生物素磁珠中。震荡混匀后，置于翻转摇床上，室温颠倒孵育至少45min。
6、PAP探针磁珠捕获后洗脱
将恒温孵育器预热至58℃，将0.5x PCR buffer置于其中预热至58℃备用。将步骤5获得的杂交捕获体系短暂离心后置于磁力架上。待溶液澄清后吸弃上清，再向管中加500μL Wash bμffer#1震荡混匀，室温孵育15min。孵育结束后，短暂离心样品管，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。再向管中加500μL热至58℃的0.5x PCR buffer，震荡混匀，58℃，1000rpm震荡孵育10min。孵育结束后，趁热上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。重复上述步骤一次，将样品管从磁力架上取下，短暂离心，再上磁力架，待溶液澄清后吸弃残余上清。最后使用55μL Deionized water重悬磁珠。
7、PAP探针延伸：
按照下面表格在冰面上配置探针延伸反应液，使其最终体积为100μL/反应。配置完成放入PCR仪，热盖温度105℃，64℃反应10分钟，68℃反应10分钟，反应完成将反应体系置于冰面。
表9各组分用量
8、磁珠洗脱
恒温孵育器预热至65℃，将Wash buffer#2置于其中预热至65℃备用。捕获体系短暂离心后置于磁力架上。待溶液澄清后吸弃上清，再向管中加500μL Wash bμffer#1震荡混匀，短暂离心样品管，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。再向管中加500μL预热至65℃的Wash bμffer#2，震荡混匀，65℃，1000rpm震荡孵育10min。孵育结束后，趁热上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。将样品管从磁力架上取下，短暂离心，再上磁力架，待溶液澄清后吸弃残余上清。最后使用40μL Deionized water重悬磁珠。
9、外切酶I(NEB，M0293L)消化
按照下表配置外切酶I消化体系，终体积为50μL/反应。放置于恒温孵育器上，37℃反应45分钟。
表10各组分用量
| 组分 | μL/rxn |
| 延伸后纯化产物 | 40 |
| 10×Exonuclease I Buffer | 5 |
| Exonuclease I | 5 |
| 总体积 | 50 |
10、磁珠洗脱
恒温孵育器预热至65℃，将Wash bμffer#2置于其中预热至65℃备用。捕获体系短暂离心后置于磁力架上。待溶液澄清后吸弃上清，再向管中加500μL Wash bμffer#1震荡混匀，短暂离心样品管，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。再向管中加500μL预热至65℃的Wash bμffer#2，震荡混匀，65℃，1000rpm震荡孵育10min。孵育结束后，趁热上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。将样品管从磁力架上取下，短暂离心，再上磁力架，待溶液澄清后吸弃残余上清。最后使用40μL去离子水重悬磁珠。
11、PCR扩增
按照下表格在冰面配置PCR反应液，使其终体积为100μL/反应。配置完成后放入PCR仪中运行相应程序。
表11各组分用量
| 组分 | μL/rxn |
| 外切酶I(NEB，M0293L)消化产物纯化 | 40 |
| 2x KAPA HiFi HotStart Ready Mix | 50 |
| postPCR_R(10μM) | 5 |
| postPCR_L(10μM) | 5 |
| 总体积 | 100 |
表12程序设定
PCR引物如下：
表13 PCR扩增引物序列
12、标准品测试QC及变异检出
试验体系稳定后对标准品进行了测试，标准品为购买的Horizon ctDNA参考品，样本编号为HD777，HD779；具体变异信息可通过Horizon官方网站进行查询，官方网站地址：https://www.horizondiscovery.com/。芯片捕获区域bed范围包含27.4K区域，共涉及15个基因。
测试的2个样本，3次重复的QC质控信息如下表14所示。
表14测试结果
其中，表14中样本类型代表的是标准品(即购买的商业标准品)，Clean data指的是测序数据经过碱基质量值过滤后的数据量；探针还原率指的是基于测试所用的肺癌ctDNA产品特性，能还原到探针的reads条数占所有reads的比例；On target率是指在能够还原探针的reads中，落在捕获区域中的碱基比例；bed区域覆盖度是指测序数据在bed区间内>＝1*的区域占比；数据利用率是指最终落在目标区域中的碱基占Clean data的比例。
从表14给出的数据可以看出，针对本实施例中使用的两个标准品，在数据利用率上均较高，平均72.53％，bed区域覆盖度>99％。并且在本套技术中，捕获测序数据可还原到每个捕获探针上，极大的提升了后续优化的可操作性。
而且由于HD777，HD779标准品变异类型为SNP和INDEL，所能够检测的变异位点及频率列表如下表15所示。针对利用本发明的建库方法所构建的测序文库，对于所获得的测序数据的变异检出灵敏性如下表16所示。
表15本产品可检测的标准品变异位点及频率列表
| *基因 | 变异位点 | HD777(频率％) | HD779(频率％) |
| EGFR | L858R | 0.1 | 5 |
| EGFR | ΔE746-A750 | 0.1 | 5 |
| EGFR | T790M | 0.1 | 5 |
| EGFR | V769-D770insASV | 0.1 | 5 |
| KRAS | G12D | 0.13 | 6.3 |
| PIK3CA | E545K | 0.13 | 6.3 |
从表15可以看出，以临床比较高发的EGFR和KRAS以及PIK3CA等基因为例，证实了采用本发明的方法可以检测出基因上的相应的变异位点。
表16测序数据的变异检出灵敏性
其中，表16中阳性位点个数为所有检测标准品(即HD777和HD779)中阳性位点的和，灵敏性以所检出的阳性位点的个数占标准品阳性位点个数的百分比来表示。其中括号中代表的是变异频率，(～0.1％)指的是存在低频的变异频率，(～5％)指的是存在高频的变异频率。阳性检出个数指的是检测出阳性位点的个数；阴性检出个数指的是将阳性位点检测为阴性的个数。
从表16给出的数据可以看出，本技术下变异检测灵敏性在深度满足的检出限条件下，灵敏性可达到100％，但对于低频变异(～0.1％)在数据量不足情况下，灵敏度会降低，给出的测序数据中灵敏度仅为25％。
由此，根据本发明提供的方法，可以检出大部分的高频率的变异信息，而且由于人体基因组中所存在的大量的变异信息中90％以上的变异信息均是高频率(5％及以上)的，由此就可以筛选出相应的基因突变位点和缺失插入突变。对于低频变异可以通过提高测序深度，提高检测的灵敏度。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (21)
1.一种对单链DNA进行处理的方法，其特征在于，包括：
在所述单链DNA的3’末端连接第一接头，所述第一接头上连接有结合剂，所述第一接头包括两条部分互补的链，所述两条部分互补的链分别为第一条链和第二条链，其中，所述第二条链比所述第一条链多5~10个随机碱基；
利用吸附剂对经过所述第一接头连接的单链DNA进行吸附，以便去除掉所述第二条链，然后进行延伸，从而获得含有所述单链DNA的双链DNA，所述吸附剂可以特异性吸附所述结合剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单链DNA的3’末端和5’末端均不含有磷酸基团。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一条链上连接有所述结合剂，所述第二条链上未连接有所述结合剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述结合剂为生物素，所述吸附剂为链霉亲和素标记的磁珠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二条链比所述第一条链多出的5~10个随机碱基与所述单链DNA配对。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二条链比所述第一条链多出6个随机碱基与所述单链DNA配对。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一条链和所述第二条链的浓度比为1：1.2~2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一条链的核酸序列为SEQ ID NO:1，所述第二条链的核酸序列为SEQ ID NO：2。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用引物SEQ ID NO:3对所述去除掉第二条链的单链DNA进行延伸，以便获得所述双链DNA。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括：
在所述双链DNA的5’末端连接上第二接头，以便建库获得测序文库。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二接头包括两条少部分互补的链，所述两条少部分互补的链分别为第三条链和第四条链，所述第三条链和所述第四条链上均含有4~8个随机碱基。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第四条链上还含有PCR扩增引物互补序列。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述第三条链的核酸序列为SEQ ID NO:4，所述第四条链的核酸序列为SEQ ID NO：5。
14.一种测序文库，其特征在于，按照权利要求1~13中任一项所述的方法构建而成。
15.一种测序平台，其特征在于，所述测序平台利用权利要求1~13中任一项所述的方法进行测序。
16.根据权利要求15所述的测序平台，其特征在于，所述测序平台包括BGISEQ-500测序平台、Illumina测序平台和/或Ion Proton测序平台。
17.根据权利要求15所述的测序平台，其特征在于，所述测序平台用于全基因组甲基化测序。
18.权利要求14所述的测序文库或权利要求15~17中任一项所述的测序平台在基因变异检测领域中的用途，所述用途用于非疾病诊断和治疗目的。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述基因变异包括单核苷酸位点变异、缺失插入变异、DNA甲基化变异和/或基因融合变异。
20.根据权利要求18所述的用途，其特征在于，所述用途包括用于肿瘤相关基因的基因变异的检测。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌，所述肺癌相关基因包括选自如下基因中的至少一种：AKT1，ALK，BRAF，EGFR，ERBB2，FGFR3，KRAS，MAP2K1，MET，NRAS，NTRK1，PIK3CA，RET，ROS1和TP53。
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Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102061335A (zh) * | 2010-11-15 | 2011-05-18 | 苏州众信生物技术有限公司 | 一种二代高通量测序的不对称dna双链接头及其应用 |
| CN105463585A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-04-06 | 清华大学 | 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用 |
| WO2016049929A1 (zh) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | 天津华大基因科技有限公司 | 构建测序文库的方法及其应用 |
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| CN106715713A (zh) * | 2014-09-12 | 2017-05-24 | 深圳华大基因科技有限公司 | 试剂盒及其在核酸测序中的用途 |
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Patent Citations (9)
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|---|---|---|---|---|
| CN102061335A (zh) * | 2010-11-15 | 2011-05-18 | 苏州众信生物技术有限公司 | 一种二代高通量测序的不对称dna双链接头及其应用 |
| CN105463585A (zh) * | 2014-09-12 | 2016-04-06 | 清华大学 | 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用 |
| CN106715713A (zh) * | 2014-09-12 | 2017-05-24 | 深圳华大基因科技有限公司 | 试剂盒及其在核酸测序中的用途 |
| WO2016049929A1 (zh) * | 2014-09-30 | 2016-04-07 | 天津华大基因科技有限公司 | 构建测序文库的方法及其应用 |
| WO2016082130A1 (zh) * | 2014-11-26 | 2016-06-02 | 深圳华大基因研究院 | 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂 |
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