CN108251502B

CN108251502B - 一种外周血游离肿瘤dna的富集方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN108251502B
Application number: CN201711446648.1A
Authority: CN
Inventors: 宋炎; 刘磊; 叶明芝; 王晶晶; 刘继龙; 谭美华; 茅矛
Original assignee: Bgi Guangzhou Medical Laboratory Co ltd; Huada Biotechnology Wuhan Co ltd; Tianjin Medical Laboratory Bgi; BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: Bgi Guangzhou Medical Laboratory Co ltd; Huada Biotechnology Wuhan Co ltd; Tianjin Medical Laboratory Bgi; BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108251502A

Abstract

本申请公开了一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用。本申请的富集方法，包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，进行扩增；PAP探针从5’端到3’端由通用引物序列和特异识别序列组成，特异识别序列3’端包括至少30bp的与肿瘤DNA片段杂交互补的序列，PAP探针3’末端为双脱氧核苷酸。本申请的富集方法，通过PAP探针对靶标肿瘤DNA片段进行捕获，并利用PAP探针进行延伸；特异性好，捕获效率高；保证了富集产物的纯度，为后续的测序提供了保障。本申请的富集方法，为cfDNA的临床检测提供了一种新的游离肿瘤DNA富集方案。

Description

一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用

技术领域

本申请涉及肿瘤检测领域，特别是涉及一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用。

背景技术

恶性肿瘤的发生是一个多基因多事件积累的结果。在肿瘤克隆性演化的过程中，常积累一系列的基因突变，可能涉及不同染色体上多种基因的变化，如癌基因、抑癌基因、细胞凋亡基因、细胞周期调节基因及维持细胞基因组稳定性的基因等。通过高通量测序技术可研究上述基因及其表达mRNA的突变和表达水平的变化，从而揭示肿瘤发生和演化中信号和代谢通路的变化。

肿瘤机制的认识和科学技术的发展进一步促进肿瘤治疗理念的转变，个体化的靶向药物治疗模式在临床肿瘤治疗中占据越来越重要的地位。目前，精准医疗更多的集中在肿瘤的早期诊断及治疗领域，基于肿瘤基因检测的个体化治疗成为癌症治疗的重要发展趋势之一。

目前，针对高发病率的肺癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、乳腺癌等癌症，全世界已经开发出多款相应的抗肿瘤药物用于临床治疗。然而，临床用药数据统计结果表明，即使是使用了相应抗肿瘤药物的癌症患者，其预后效果却不尽如人意；这引起了临床医生、学者以科学家们进行了大量的研究和探索发现，目前已经上市的抗肿瘤药物疗效具有个体差异性，特别是在癌症患者的基因组研究方面，发现患者对药物是否敏感与其癌细胞的基因组突变直接相关。癌症患者一旦在部分药物靶向基因区段发生突变，可能会导致长期服用昂贵的抗肿瘤药物而病情却无法缓解的情况。也有研究结果表明，一些在药靶基因区段发生突变的癌症患者，对于相应药物的敏感性增强，而且有更好的预后。这提示，如果对癌症患者的药物靶向基因在其用药前期进行检测，获取其基因突变的具体情况，就可以大致预测患者使用相应抗肿瘤药物的疗效。

然而，对于单个药物靶点的检测，有时候并不能很好的预测药物的疗效，高通量测序技术的发展使得检测所有靶向药物的所有靶点基因成为可能，其检测结果可指导制定最佳肿瘤治疗方案。近期Science上发表了一篇利用基因组测序方法阐明Everolimus（依维莫司）治疗膀胱癌作用机制的研究，进一步证明了高通量测序在肿瘤治疗中实行个性化的重要性。华盛顿大学基因组研究所对一位患有白血病的患者进行全基因组和转录组测序，最终找到了导致其癌症细胞快速繁衍的“元凶”，一个名为FLT3的基因并恰好找到一种肾癌药物能够起效。近年来基于高通量的肿瘤个体化治疗已成为科学发现和临床转化的热点。高通量测序技术的发展使得癌症基因组测序成为可能。通过对患病组织多基因、多位点大规模并行测序，不仅可以一次性筛选各类靶药位点，提供精准治疗方案，更能明确癌症病因，实现个体化医疗。

近年来的一些研究显示，肿瘤病人血浆或血清中DNA的遗传变异与正常人存在较显著差异，有望成为一种有效的肿瘤治疗和监测手段。Dennis Lo近期在Clinchem上发表相关研究，在该研究中对4名肝癌患者和1名乳腺癌和卵巢癌并发患者的外周血浆DNA进行全基因组测序，进一步证明了利用癌症患者外周血浆DNA结合新一代高通量测序技术在癌症个体化治疗上的可行性。Rebecca J. Leary等在7名晚期结肠癌和3名乳腺癌患者中也进一步证实在血浆中检测来自肿瘤细胞的拷贝数变异和结构性变异的可行性，以及临床应用的前景。

利用外周血游离肿瘤DNA（缩写ctDNA）进行肺癌多靶点基因的检测可解决目前临床面临的两大问题：（1）原发肿瘤反复，组织活检无论在伦理还是实际操作上均有一定难度，并且可能延误治疗和导致并发症的产生；（2）单点活检只能代表选择部位肿瘤的病理情况，而ctDNA可代表多个病灶的整体基因信息。基于高通量多基因测序平台的肿瘤无创检测是目前全球肿瘤研究的热门领域。

但是，ctDNA在外周血游离DNA中的含量极低，特别是在癌症早期，ctDNA的含量微乎其微，因此，需要对目标基因进行富集后才能达到基因测序平台的检测需求。现有的目标区域富集技术有以下4类：（1）常规建库后芯片杂交捕获富集，如罗氏公司Nimblegen系列芯片；（2）直接多重PCR富集目标区域，如Thermo Fisher公司的Ampliseq系列产品；（3）组合DNA文库构建和多重PCR，如AnchorDx；（4）环化PCR方法，如贝瑞和康公司的cSMART。

以上4类目标区域富集方法，其中，基于探针杂交的富集方法存在实验周期长、捕获效率低、成本高等缺点。多重PCR、环化PCR的方法对于基因融合（fusion）变异不支持或支持力度低。同向一段探针延伸捕获可以支持基因融合变异，但存在捕获时间长、捕获效率依旧不够或高成本等缺点，导致交付时间延长，有效数据损失以及产品成本过高。上述缺陷，限制了传统目标区域富集方法在临床检测，特别是液体活检领域的应用。故需要开发一种成本低、交付周期短、样本分子利用率高、能够兼容基因融合检测和低频SNV检测的新技术应用于临床检测。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法，包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，对捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，实现肿瘤DNA的富集；其中，PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，特异识别序列的3’端包括至少30bp的与所述肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，并且，PAP探针的3’末端最后一位碱基为与肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸。

需要说明的是，本申请的外周血游离肿瘤DNA的富集方法，创造性的将PAP探针用于外周血游离肿瘤DNA的杂交捕获，并将PAP探针作为引物，对其捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，其优点在于：（1）PAP探针的杂交捕获功能，PAP探针通过碱基互补特异的与目标区域进行结合，能够对肿瘤DNA片段进行特异性的捕获；（2）PAP探针作为引物，对于正确配对的探针可以进行焦磷酸解激活并延伸，对于错配的探针则不延伸，进一步确保了特异性；（3）正确形成测序文库功能，对于杂交且延伸的序列，探针提供测序所需要的通用引物序列，即PAP探针5’端的通用引物序列，而体系中残留的非目标序列文库则不含有此段通用序列，确保了用于测序序列的纯度。以上（1）和（2）两点大大提升了捕获效率，并极大的缩短了捕获时间。

优选的，本申请的富集方法还包括采用通用引物对PAP探针的扩增产物进行第二次扩增，进一步对肿瘤DNA片段进行富集；其中，通用引物包括PAP探针通用引物和cfDNA文库通用引物；PAP探针通用引物为针对PAP探针的通用引物序列设计的引物；cfDNA文库通用引物为cfDNA文库建库时从接头中引入的通用引物。

需要说明的是，第二次扩增实际上是对延伸的PAP探针进行的扩增，因为PAP探针是以肿瘤DNA片段为模板进行扩增延伸的，因此，第二次扩增实际上也是对肿瘤DNA片段的扩增富集。并且，由于PAP探针以肿瘤DNA片段为模板进行扩增延伸，而在事先构建好的cfDNA文库中，肿瘤DNA片段的两端是连接有接头序列和cfDNA文库通用序列的，因此，PAP探针延伸也会将cfDNA文库通用序列也一起扩增。所以，第二次扩增采用的通用引物实际上由PAP探针通用引物和cfDNA文库通用引物组成。

优选的，本申请的富集方法具体包括以下步骤，

（1）将PAP探针加入到cfDNA文库中，利用PAP探针对肿瘤DNA片段进行杂交捕获；

（2）采用磁珠纯化PAP探针的杂交捕获产物；

（3）利用焦磷酸解激活聚合酶反应，对步骤（2）的磁珠纯化产物进行扩增，其中，在焦磷酸解激活聚合酶的作用下，以所述PAP探针为引物，对杂交捕获的肿瘤DNA片段进行特异性扩增；

（4）采用磁珠纯化PAP探针的扩增产物；

（5）采用外切酶I对步骤（4）纯化的PAP探针扩增产物进行酶切处理；

（6）对步骤（5）的酶切产物进行磁珠纯化；

（7）采用通用引物对步骤（6）纯化的酶切产物进行扩增，获得富集的肿瘤DNA片段。

本申请的一种实现方式中，cfDNA文库通用引物为Seq ID No.1所示序列， PAP探针通用引物为Seq ID No.2所示序列，

Seq ID No.1：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’

Seq ID No.2：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTCCCTCTCTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGC-3’。

本申请的另一面公开了本申请的富集方法在ctDNA文库构建或ctDNA高通量测序中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的富集方法在肺癌ctDNA检测中的应用。

本申请的再一面公开了一种用于外周血游离肿瘤DNA富集的试剂盒，该试剂盒中包含有与肿瘤DNA杂交互补的PAP探针，PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，特异识别序列的3’端包括至少30bp的与肿瘤DNA特异性杂交的互补序列，并且，PAP探针的3’末端最后一位碱基为与肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸。

优选的，试剂盒中还包括通用引物，通用引物包括第一引物和第二引物，第一引物为Seq ID No.1所示序列，第二引物为Seq ID No.2所示序列，

Seq ID No.1：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’

Seq ID No.2：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTCCCTCTCTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGC-3’。

优选的，试剂盒中还包括cfDNA文库预扩增引物，其中，cfDNA文库预扩增引物为Seq ID No.6所示序列，

Seq ID No.6：5’-GCTGAACGACATGGCTACGA-3’。

需要说明的是，本申请的一种实现方式中，在将PAP探针加入到cfDNA文库之前，还包括对cfDNA文库进行预扩增，然后再加入PAP探针进行杂交捕获，其中，预扩增所采用的引物即Seq ID No.6所示序列的cfDNA文库预扩增引物。因此，本申请的富集方法中，也可以选择性的包括cfDNA文库预扩增的步骤，在此不做具体限定。

本申请的再一面公开了本申请的试剂盒在外周血肺癌游离肿瘤DNA富集中的应用。

需要说明的是，本申请的外周血游离肿瘤DNA富集方法，其关键在于采用PAP探针对肿瘤DNA片段进行捕获、延伸、扩增，因此，为了使用方便，完全可以将PAP探针，以及相关的试剂，例如本申请用于第二扩增的通用引物等，制成试剂盒。本申请的一种实现方式中，具体对肺癌的外周血游离肿瘤DNA进行了富集、建库和高通量测序，其中就采用了1276条用于肺癌肿瘤DNA片段杂交捕获的PAP探针，这1276条PAP探针可以制成试剂盒，以方便肺癌突变基因的检测。

本申请的有益效果在于：

本申请的外周血游离肿瘤DNA的富集方法，通过PAP探针对靶标肿瘤DNA片段进行捕获，并利用PAP探针对捕获的靶标肿瘤DNA片段进行延伸扩增；一方面，PAP探针的特异性好，捕获效率高；另一方面，只有和PAP探针的特异识别序列完全匹配的肿瘤DNA片段才能被扩增、富集，保证了富集产物的纯度，为后续的测序提供了保障。本申请的富集方法，不仅效率高、均一性好、成本低，而且时间短，可支持基因融合检测，为cfDNA的临床检测提供了一种新的游离肿瘤DNA富集方案。

附图说明

图1是本申请实施例中对照探针添加ddATP修饰前后的核酸质谱检测结果，a图为添加ddATP修饰前的结果，b图为添加ddATP修饰后的结果。

具体实施方式

本申请的外周血游离肿瘤DNA富集方法，其关键在于采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，然后将PAP探针作为引物，以其捕获的肿瘤DNA片段为模板进行延伸。其中，PAP探针就是在常规的杂交探针的基础上，于探针的5’端增加通用引物序列，于探针的3’末端增加一个双脱氧核苷酸，即ddNTP，ddNTP的具体类型根据探针杂交的模板而定，例如探针杂交的模板后一位碱基是“A”，则于探针的3’末端增加一个ddTTP，以此类推。本申请的一种实现方式中，对已经合成的包括通用引物序列和特异识别序列的探针，通过末端转移酶反应，将四种ddNTP加到探针3’末端。采用PAP探针的好处是，只有完全与肿瘤DNA片段模板配对的PAP探针才能通过焦磷酸解反应而激活，从而延伸，实现准确富集的目的；而部分配对的探针，虽然也可以进行杂交，但是无法被焦磷酸解反应激活，因此，不会延伸，也不会被后续的步骤富集。

相对于其他的捕获方法，本申请的富集方法具有以下优势：

a) 捕获时间短且可支持基因融合检测：传统基于序列杂交的捕获方法需要12-72小时的捕获时间。而基于PCR反应捕方法需要2小时的捕获时间，但是不支持/仅能支持几种常见融合基因检测。本申请的富集方法，捕获富集仅需要3小时，同时支持基因融合突变检测。

b) 富集效率高且均一性好：基于杂交方法捕获效率在20%-60%之间浮动，受捕获区域大小影响，区域越小捕获效率越低。本申请的富集方法可以在约27K的小范围区域内达到75%-80%的捕获效率，去除低质量reads，数据整体利用率高达72.53%。在均一性方面，本申请的一种实现方式中，在EGFR基因和KRAS基因上的均一性程度都优于单纯基于杂交捕获的方法或基于PCR捕获的方法。

c) 成本低：本申请的高效富集方法，样本的有效数据利用率较之前有很大提升，进而大幅度降低测序成本。

本申请的富集方法，不仅可以对外周血游离肿瘤DNA进行富集，同样可以适用于其它组织或体液中的靶标片段富集，包括血浆、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞、淋巴液等。进一步的，本申请的富集方法，也不只限于对肿瘤DNA进行富集，根据所设计的PAP探针，也可以适用于对gDNA中的目标区域或靶标基因进行捕获富集。本申请的富集方法原则上适用于各种测序平台和机型，尤其是BGISEQ500、MGISEQ200、MGISEQ2000等。

本申请中的专业术语解释如下：

cfDNA，即外周血循环游离DNA，是cell-free DNA的缩写；

ctDNA，即外周血循环游离肿瘤DNA，是Circulating tumor DNA的缩写；

PAP探针，即焦磷酸解激活聚合酶反应（Pyrophosphorolysis-ActivatedPolymerization, 缩写PAP）探针。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例采用从Horizon公司购买的涵盖肺癌变异的三个cfDNA参考品进行试验，三个cfDNA参考品的样本编号为HD777、HD779、HD786；三个cfDNA参考品具体的肺癌变异信息参考Horizon官方网站，网址如下：

https://www.horizondiscovery.com/。

本例采用了1276条PAP探针，对cfDNA文库中的肺癌ctDNA进行富集，其中1276条PAP探针覆盖AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、FGFR3、KRAS、MAP2K1、MET、NRAS、NTRK1、PIK3CA、RET、ROS1和TP53等15个基因。详细步骤如下：

1.PAP探针的制备

（1）ddNTP修饰

本例的PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，特异识别序列的3’端包括40bp的与肺癌肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，通用引物序列是一段与肺癌肿瘤DNA片段没有杂交错配的序列。

首先根据探针与模板互补配对的40bp的序列与模板进行比对，查询探针3’末端延伸一碱基的种类，即第41bp的碱基。全部探针均用此方法查询，通过延伸碱基的种类将探针归为末端ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP四类。四类探针分别在末端添加相应的双脱氧核苷酸。添加双脱氧核苷酸的方法如下：

ddNTP原液在4℃解冻，震荡混匀，在新的EP管中，用水稀释10倍制成工作液，-20℃保存备用。其余试剂在4℃解冻，备用。使用NEB公司的末端转移酶试剂盒，每个反应的ddNTP修饰反应体系为30μL，包括：5×TdT buffer 6μL、100μM的探针5μL、1nmol/μL的ddNTP 12μL、15U/μL的TdT 6.7μL，补充DDW至30μL。

各组分添加完毕，移液器吹打混匀，短暂离心后，将体系置于37℃恒温孵育5h。反应完成，即获得PAP探针。

由于肺癌的PAP探针分子量超出核酸质谱分子量检测上限，因此，本例在制备PAP探针时，采用了一条小片段的已知分子量的对照探针作为质控品，用于ddNTP修饰反应的质控。

本例的对照探针为Seq ID No.3所示序列，按照以上ddNTP修饰反应体系在对照探针的末端添加ddATP。

Seq ID No.3：5’-AAAAACGACCTCTATCTAAACGT-3’

（2）PAGE纯化

采用7M，15% Urea-PAGE对ddNTP修饰反应产物进行纯化，获得纯化的PAP探针，用于后续的肺癌ctDNA富集。

7M，15% Urea-PAGE制备：

用超纯水清洗两块玻璃胶板，风干。将4℃保存的40%Acr-Bis(19:1)溶液平衡至室温。将玻璃胶板戳齐置于灌胶器上压好，向待灌胶位置注入10mL无水乙醇，待液面稳定后，观察页面是否下降，验漏。验漏结束，将胶板间的无水乙醇倒出，并将胶板倒置，控干残余的无水乙醇。控干过程中，取干净的50mL离心管，于天平称取10.5g尿素。向称好的尿素中加3.5mL超纯水，5mL 5×TBE buffer，虚掩冠盖，将管子连同离心管架置于微波炉中，加热10s。将管子从微波炉中拿出，拧紧管盖，震荡混匀至体系中无尿素晶体。将体系置于离心管架上，冷却至室温。向冷却后的体系中加入9.375mL的40%Acr-Bis(19:1)预混溶液，震荡混合均匀。向混合体系中加入125μL10%AP，震荡混合均匀。向混合体系中加入12.5μL TEMED，震荡混合均匀。将混合体系插入冰中，冷却5-10min。将控干的胶板正置，取10mL注射器，吸取冷却后的PAGE胶溶液加置玻璃板缝隙中，直至灌满。灌满后立即插入梳子，静置，等待胶凝固。凝固后的PAGE胶，若不立即使用，可用保鲜袋盛放，保鲜袋内加1×TBE，置于4℃保存过夜。用超纯水清洗两块玻璃胶板，风干。

PAGE纯化：

凝固的PAGE胶置于盛有1×TBE的垂直电泳槽中，拔出梳子，于250V恒压条件下，预电泳30min备用。预电泳结束，用200μL移液器吹打各样孔，将其中沉淀的碎胶及高浓度尿素吹出，备用。

ddNTP修饰反应产物每管样本30μL，向其中加入15μL切胶回收用甲基橙loadingbuffer，混合均匀。将混合液加入PAGE胶的样孔中，待样品沉入孔底，200V恒压电泳，约1h。电泳结束后，用胶铲小心撬开玻璃板。切断玻璃板与胶连接边界，将PAGE胶取下转移至EB染色液中，染色10min。染色过程中，用烧红的针头在Qbit管底部穿刺7个小孔。打好孔的Qbit管套在2mLEP管中备用。染色后的PAGE胶置于干净的PE手套上，于蓝光下切去所有可见条带。将回收的条带胶块置于打孔的Qbit管中。切胶前后用凝胶成像仪备案。将Qbit管连同2mL套管，全速离心1min。离心后检查Qbit管中是否有残余胶块，若有少量胶块，可直接倒入收集管中。向粉碎的胶块中加入600μL的1×NEB buffer2。将悬浮体系置于垂直混匀仪，最大转速，颠倒混匀4h。混匀后的混合体系倒入Spin-X离心过滤管中，全速离心1min。离心后弃滤膜及碎胶，保留收集管中的液体。用移液器测量流穿液体体积。测量后，向流穿液体中加3倍体积的无水乙醇，20μL 3M pH5.6的NaAc以及1μL 5mg/mL 的Glycogen，颠倒混匀，置于-20℃沉淀过夜。次日，离心机预冷至4℃备用。配置75%乙醇溶液，置于-20℃备用。醇沉过夜的引物溶液置于离心机中，全速离心10min。离心后小心倒掉上清，向管底沉淀加700μL75%乙醇溶液，颠倒混合后置于4℃全速离心10min，重复乙醇洗涤步骤一次。将EP管短暂离心，之后用中枪头套小枪头小心吸出管底残余乙醇，将管子开盖置于通风处晾干。晾干后，向管内加30μL的DNase free water回溶，即获得纯化的PAP探针。

纯化完成的PAP探针溶液，取1μL使用Nanodrop ssDNA测定浓度，并根据分子量计算摩尔浓度。本例将作为质控的对照探针的纯化PAP探针，取20μL用于核酸质谱检测，测定产物分子量，同时，取等体积的没有进行末端添加ddATP修饰的对照探针进行核酸质谱检测，评估TdT反应体系的效率。摩尔浓度结果显示，纯化回收获得的PAP探针浓度与ddNTP修饰反应体系中探针浓度相当，说明PAGE纯化能够有效的对探针进行回收纯化。对照探针的核酸质谱检测结果如图1所示，图1中a图为末端未添加ddATP修饰的对照探针的质谱图，b图为末端添加ddATP修饰的对照探针的纯化PAP探针的质谱图，图1的结果显示，未添加ddATP修饰之前，对照探针的分子量为7063.61Da，即图a，与Seq ID No.3所示序列的分子量相符；添加ddATP修饰之后的APA探针的分子量为7376.82Da，与Seq ID No.3所示序列在加上ddATP的分子量相符。可见，TdT反应体系能够有效的对探针的3’末端进行ddNTP修饰，从而获得本例的PAP探针。

2.cfDNA文库构建

2.1 末端修复

以40ng cfDNA为底物，每个末端修复反应的体系为100μL，包括：10×T4 PNKBuffer 10μL、10mM的dNTP4μL、5U/μL的T4 DNA Polymerase 5μL、10U/μL的T4 PNK 5μL、5U/μL的Klenow Fragment 1μL、cfDNA与Deionized water体积共75μL。反应条件为：20℃，30min；4℃，Hold。反应结束后用1.5倍Agencourt AMPure XP-Medium磁珠，约150μL，进行纯化，最后使用29μL Deionized water重悬磁珠，取上清得到末端修复后产物。

2.2 加A

每个加A反应的体系为35μL，包括：28.1μL的末端修复产物、10×Blue Buffer3.5μL、5mM的dATP 1.4μL、5U/μL的Klenow Fragment 3'-5'exo- 2μL。反应条件为：37℃，30min；4℃，Hold。

2.3 接头连接

文库接头和序列引物分别为Seq ID No.4所示序列和Seq ID No.5所示序列。其中，Seq ID No.4所示序列的5’端具有磷酸化修饰。

Seq ID No.4：5’- GTCTCAGTGAGTC -3’

Seq ID No.5：

5’-GCTGAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNGACTCACTGAGACT-3’

每个接头连接反应的体系为50μL，包括：35μL的加A反应体系、10×LigationBuffer1.5μL、10mM的ATP 3.5μL、600U/μL的T4 DNA Ligase 3μL、15μM的Anchor p13+1Adaptor 3μL、4μL Deionized water。反应条件为：16℃，过夜，过夜的时间为12-16h即可。反应结束后用1.5倍Agencourt AMPure XP-Medium磁珠，约75μL，进行纯化，最后使用40μLDeionized water重悬磁珠，取上清得到接头连接产物。

3.cfDNA文库预扩增

每个样本取50μL 2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix，置于PCR仪中，设置程序：95℃，3min；4℃，hold进行预激活。激活结束体系置于冰盒中并在5min内加入接头连接产物38μL，10μM的cfDNA文库预扩增引物12μL。吹打混匀置于PCR仪中，设置程序：72℃，5min；95℃，1min；然后进入13个循环：98℃，20s、55℃，30s、72℃，40s；循环结束后72℃，5min；4℃，Hold。其中，cfDNA文库预扩增引物为Seq ID No.6所示序列。

Seq ID No.6：5’-GCTGAACGACATGGCTACGA-3’

反应结束后用1.0倍Agencourt AMPure XP-Medium磁珠，约100μL，进行纯化，最后使用100μL Deionized water重悬磁珠，取上清得到PCR产物。将PCR产物用1.0倍AgencourtAMPure XP-Medium磁珠，约100μL，进行纯化，最后使用35μL Deionized water重悬磁珠，取上清得到最终纯化PCR产物。

构建完成的cfDNA文库使用Qubit® 3.0 Fluorometer测定其浓度，使用AgilentDNA 1000 Kit检测文库片段分布及文库浓度。

4.PAP探针捕获

（1）链霉素-生物素磁珠预处理

将60μL链霉素-生物素磁珠转移至新的1.5mL离心管中，之后再向离心管中加200μL Binding buffer，室温震荡混匀。短暂离心后，将离心管置于磁力架上静置1min。待溶液澄清后，吸弃上清。如上步骤重复3次，最后再用200μL Binding buffer重悬磁珠备用。

（2）PAP探针捕获

每个PAP探针捕获的反应体系为30μL，包括：纯化的PAP正链探针0.855μL（或负链探针0.285μL）、cfDNA文库预扩增产物800ng，用 Deionized water稀释成26.145μL（或26.715μL）、10×ExTaq Buffer (Mg²⁺ plus) 3μL。

探针捕获反应条件为：95℃ 5min；1%速率降温至55℃；55℃恒温10min。

（3）磁珠纯化

探针捕获反应结束，将产物短暂离心后迅速置于冰上，待其冷却，将其转移至已经洗好的链霉素-生物素磁珠中。震荡混匀后，置于翻转摇床上，室温颠倒孵育至少45min。然后进行洗脱，具体的洗脱方法如下：

恒温孵育器预热至58℃，将0.5×ExTaq Buffer (Mg²⁺ plus)置于其中预热至56℃备用。探针捕获反应产物和链霉素-生物素磁珠短暂离心后置于磁力架上。待溶液澄清后吸弃上清，再向管中加320 μL常温0.5×ExTaq Buffer (Mg²⁺ plus)，移液器轻轻吹匀5次，上磁力架吸除上清；加320μL预热至56℃的0.5×ExTaq Buffer (Mg²⁺ plus)，移液器轻轻吹匀，56℃，1000rpm震荡孵育5min；孵育结束后，短暂离心样品管，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。最后使用100μL 探针延伸混合液重悬磁珠。其中，磁珠上吸附有PAP探针，而PAP探针杂交捕获有靶标片段，即重悬磁珠获得带磁珠的杂交捕获体系。

5.PAP探针延伸

以PAP探针为引物，对其捕获的靶标片段进行延伸，每个延伸反应的体系为100μL，包括：10×ExTaq Buffer (Mg²⁺ plus) 10μL、50mM的MgSO₄1μL、100×Tween20 1μL、2.5mMeach的dNTPs 8μL、100×Na₄PPi 1μL、DMSO 2.5μL、Betaine 20μL、10U/μL的KlenTaq-S 1μL、Deionized water 55.5μL。

配置完成放入PCR仪，热盖温度105℃，64℃反应5分钟，68℃反应10分钟，反应完成将反应体系置于冰面。获得PAP探针延伸产物。

因为整个延伸过程中，磁珠是连接在PAP探针上的，因此，延伸产物可以采用磁珠洗脱纯化，详细如下：

恒温孵育器预热至65℃，将Wash buffer#2置于其中预热至65℃备用。PAP探针延伸产物短暂离心后置于磁力架上。待溶液澄清后吸弃上清，再向管中加320μL Washbuffer#1 震荡混匀5s，短暂离心样品管，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。再向管中加320μL预热至65℃的Wash buffer#2，震荡混匀5s，65℃，1000rpm震荡孵育5min。孵育结束后，趁热上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。将样品管从磁力架上取下，短暂离心，再上磁力架，待溶液澄清后吸弃残余上清。最后使用100μL ExoⅠ消化混合液重悬磁珠。

6.酶切处理

采用外切酶I消化PAP探针延伸回收产物中的单链DNA片段，酶切反应体系为100μL，包括：Deionized water 80μL、10×Exonuclease I Buffer 10μL、Exonuclease I 10μL。

酶切反应体系放置于恒温孵育器上，37℃反应45分钟。

酶切反应产物磁珠洗脱：恒温孵育器预热至65℃，将Wash buffer#2置于其中预热至65℃备用。捕获体系短暂离心后置于磁力架上。待溶液澄清后吸弃上清，再向管中加320μL Wash buffer#1 震荡混匀5s，短暂离心样品管，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。再向管中加320μL预热至65℃的Wash buffer#2，震荡混匀5s，上磁力架，待溶液澄清后吸弃上清。将样品管从磁力架上取下，短暂离心，再上磁力架，待溶液澄清后吸弃残余上清。最后使用100μL PostPCR反应混合液重悬磁珠。

7.PAP探针PCR扩增

以PAP探针延伸、酶切后的产物为模板，PCR扩增引物为：PCR扩增第一引物为SeqID No.1所示序列，即cfDNA文库通用引物；第二引物为Seq ID No.2所示序列，即PAP探针通用引物。并且，Seq ID No.1所示序列的引物的5’端具有磷酸化修饰。

Seq ID No.1：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’

Seq ID No.2：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTCCCTCTCTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGC-3’。

PAP探针PCR扩增的反应体系为100μL，包括：Deionized water 38μL、2×KAPAHiFi HotStart Ready Mix 50μL、10μM的第一引物6μL、10μM的第二引物6μL。

PCR反应条件为：98℃ 5min，然后进入23个循环：98℃ 15s、58℃ 30s、72℃ 30s，循环结束后72℃ 5min，最后4℃待机。

PAP探针PCR扩增产物可以直接用于后续的高通量测序。

8.高通量测序

按照以上试验方法，测试了9例参考品及3例临床样本。9例参考品样本中，编号为PETE120、PETE121、PETE49、HD786-1、HD786-2 的5例样本为Horizon公司购买的cfDNA参考品；编号为PETE50、PETE115、PETE112、PETE51的4例样本是利用从Horizon公司购买的突变频率为5%的cfDNA参考品与野生型标准品，其中，野生型标准品为YH细胞系基因组打断成160bp制备而成，YH细胞由华大基因提供和保存；PETE50、PETE115、PETE112为0.2%突变的样本重复检测3次；参考品样本对应突变基因位点和频率信息如表1所示。3例临床样本为含有组织检测结果的临床血浆样本，对应样编号分别为：PETE80，PETE81，PETE84。对应获得12个PAP探针PCR扩增产物。

表1 参考品样本及基因变异位点频率信息

基因	变异	PETE120 (频率%)	PETE121 (频率%)	PETE49 (频率%)	PETE50 (频率%)	PETE115 (频率%)	PETE112 (频率%)	PETE51 (频率%)	HD786-1 (频率%)	HD786-2 (频率%)
											EGFR	L858R	0	0	0.1	0.20	0.20	0.20	0.50	﹣	﹣
EGFR	ΔE746- A750	0	0	0.1	0.20	0.20	0.20	0.50	﹣	﹣
											EGFR	T790M	0	0	0.1	0.20	0.20	0.20	0.50	﹣	﹣
EGFR	V769 -D770insASV	0	0	0.1	0.20	0.20	0.20	0.50	﹣	﹣
											KRAS	G12D	0	0	0.13	0.25	0.25	0.25	0.63	﹣	﹣
NRAS	Q61K	0	0	0.13	0.25	0.25	0.25	0.63
											NRAS	A59T	0	0	0.13	0.25	0.25	0.25	0.63	﹣	﹣
PIK3CA	E545K	0	0	0.13	0.25	0.25	0.25	0.63	﹣	﹣
											ROS1	SLC34A2/ROS1	0	0	﹣	﹣	﹣	﹣	﹣	5.6	5.6
RET	CCDC6/RET	0	0	﹣	﹣	﹣	﹣	﹣	5	5

采用BGISEQ-500测序平台对12个PAP探针PCR扩增产物进行高通量测序。

对测序结果进行QC质控信息分析，结果如表2所示

表2 QC质控信息

样本编号	样本类型	Cleandata	探针还原率	Mapping率	On target率	bed区域coverage	数据利用率
								PETE120	Standard	6.8G	89.48%	95.29%	96.22%	100%	82.04%
PETE121	Standard	8.5G	88.53%	94.88%	94.06%	100%	79.00%
								PETE49	Standard	4.7G	87.87%	100%	90.11%	100%	79.19%
PETE50	Standard	5.2G	88.13%	100%	91.10%	100%	80.28%
								PETE115	Standard	9.3G	88.99%	94.51%	94.98%	100%	79.89%
PETE112	Standard	7.5G	89.58%	94.59%	96.01%	100%	81.35%
								PETE51	Standard	5.2G	88.00%	100%	91.50%	99.99%	80.52%
HD786-1	Standard	3.2G	76.83%	94.64%	92.82%	99.60%	67.49%
								HD786-2	Standard	5.8G	89.13%	98.96%	97.49%	99.47%	85.99%
PETE80	临床样本	6.8G	88.82%	92.41%	95.74%	100%	78.58%
								PETE81	临床样本	5.2G	89.18%	94.12%	95.45%	100%	80.11%
PETE84	临床样本	5.5G	88.46%	93.95%	95.43%	100%	79.30%

表2的结果显示，在数据利用率上，12个PAP探针PCR扩增产物的测序数据的平均数据利用率为79.48%，bed区域覆盖度>99%，高于现有的富集方法的数据利用率。并且在本例的富集方法中，测序数据可还原到每个捕获探针上，极大的提升了后续优化的可操作性。

测序结果显示样本PETE49，PETE50，PETE115，PETE112，PETE51，变异类型为SNP和INDEL，HD786为Fusion，均与参考品实际情况相符。对应样本的变异分析结果如表3所示。根据9例参考品计算的变异检测性能总结如表4所示。

表3 参考品变异检测结果

基因

变异

PETE120(WT)

PETE121(WT)

PETE49(0.1%)

PETE50(0.2%)

PETE115(0.2%)

PETE112(0.2%)

PETE51(0.5%)

HD786-1(Fusion)

HD786-2(Fusion)

EGFR

L858R

NEG

0.03%

0.06%

0.18%

0.47%

﹣

EGFR

ΔE746- A750

NEG

0.02%

0.78%

0.42%

﹣

EGFR

T790M

NEG

0.49%

0.11%

0.69%

1.03%

﹣

EGFR

V769 -D770insASV

NEG

0.02%

0.89%

0.05%

﹣

KRAS

G12D

NEG

0.07%

0.47%

0.92%

﹣

NRAS

Q61K

NEG

0.02%

1.52%

0.21%

NRAS

A59T

NEG

1.08%

0.11%

0.83%

0.05%

﹣

PIK3CA

E545K

NEG

0.17%

0.18%

2.43%

0.65%

﹣

ROS1

SLC34A2/ROS1

NEG

﹣

CX

RET

CCDC6/RET

NEG

﹣

CX

备注：NEG：阴性检测结果；CX：阳性检测结果。

表4 参考品变异检测性能

3例临床样本检测结果与组织对照检测结果一致，并且得到置信度较高的额外检出变异位点一个，如表5所示。

表5 测序数据的变异检出灵敏性

基于本例的富集方法的高通量测序，变异检测灵敏性在深度满足的检出限条件下，灵敏性可达到100%，但对于低频变异在数据量不足情况下，灵敏度会降低。HD777、HD779和HD786参考品的变异位点检测情况与参考品的实际情况相符。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大基因股份有限公司

广州华大基因医学检验所有限公司

天津华大医学检验所有限公司

华大生物科技（武汉）有限公司

<120> 一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法、试剂盒及其应用

<130> 17I25164

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaacgacatg gctacga 17

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtgagccaa ggagttgtcc ctctctattg tcttcctaag accgcttggc 50

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaaaacgacc tctatctaaa cgt 23

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtctcagtga gtc 13

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(34)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

gctgaacgac atggctacga tccgacttnn nnnngactca ctgagact 48

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctgaacgac atggctacga 20

Claims

1.一种外周血游离肿瘤DNA的富集方法，其特征在于：包括采用PAP探针对cfDNA文库进行肿瘤DNA片段捕获，并以PAP探针为引物，以捕获的肿瘤DNA片段为模板，对捕获的肿瘤DNA片段进行扩增，实现肿瘤DNA的富集；

所述PAP探针从5’端到3’端依序由通用引物序列和特异识别序列两部分组成，所述特异识别序列的3’端包括至少30bp的与所述肿瘤DNA片段特异性杂交的互补序列，并且，所述PAP探针的3’末端最后一位碱基为与所述肿瘤DNA片段特异性杂交互补的双脱氧核苷酸；

还包括采用通用引物对所述PAP探针的扩增产物进行第二次扩增，进一步对肿瘤DNA片段进行富集；

所述通用引物包括PAP探针通用引物和cfDNA文库通用引物；

所述PAP探针通用引物为针对PAP探针的通用引物序列设计的引物；

所述cfDNA文库通用引物为cfDNA文库建库时添加接头引入的通用引物；

具体包括以下步骤，

（1）将所述PAP探针加入到cfDNA文库中，利用PAP探针对肿瘤DNA片段进行杂交捕获；

（2）采用磁珠纯化PAP探针的杂交捕获产物；

（4）采用磁珠纯化PAP探针的扩增产物；

（6）对步骤（5）的酶切产物进行磁珠纯化；

（7）采用所述通用引物对步骤（6）纯化的酶切产物进行扩增，获得富集的肿瘤DNA片段。

2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：所述cfDNA文库通用引物为Seq IDNo.1所示序列，所述PAP探针通用引物为Seq ID No.2所示序列，

Seq ID No.1：5’-GAACGACATGGCTACGA-3’

Seq ID No.2：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTCCCTCTCTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGC-3’。

3.根据权利要求1或2所述的富集方法，其特征在于：在将PAP探针加入到cfDNA文库之前，还包括对cfDNA文库进行预扩增，然后再加入PAP探针进行杂交捕获。

4.权利要求1-3任一项所述的外周血游离肿瘤DNA的富集方法在cfDNA文库构建中的应用。