CN106399546B - 高通量测序检测人循环肿瘤dna egfr基因的捕获探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于高通量测序检测人循环肿瘤DNA EGFR基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人循环肿瘤DNA EGFR基因捕获探针是多种探针的混合物，所述多种探针分别能够捕获人EGFR基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中，所述多种探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNA EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。

Description

高通量测序检测人循环肿瘤DNA EGFR基因的捕获探针及试 剂盒

发明领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNAEGFR基因的捕获的探针及试剂盒。

背景技术

在血液中存在着游离的小片段DNA(cell-free DNA，cfDNA)，它们来自死亡的细胞。通常死亡的细胞会被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一个健康人的1ml血浆中含25ng cfDNA。而癌症患者的cfDNA的含量高出正常几倍，其中一部分是ctDNA(circulating tumor DNA)。ctDNA的相对含量与肿瘤的负荷和对治疗的反应是相关的，可用于鉴定驱动基因、指导临床治疗、监测临床治疗效果及癌症复发、揭示治疗抗性以及检测疾病进展。在有些方面ctDNA方法的灵敏度甚至高传统的手段。例如，与传统的影像学检测相比，追踪早期乳腺癌患者术后血液中的肿瘤DNA，可以提前7.9个月发现乳腺癌复发。在肺癌中检测cfDNA的EGFR突变对肺癌也有着重要的诊断价值。ctDNA在癌症早期就可以被检测到。因为cfDNA容易收集，在肺癌中已显示与组织中的变异高度一致，因此ctDNA的液体活检越来越受到关注。

血液中ctDNA含量，在癌症早期占cfDNA的比例是非常低，通常小于0.1％。ctDNA检测方法很多，如用数字化PCR(Digital PCR)，或下一代测序(Next GenerationSequencing,NGS)等。通过NGS优化ctDNA的深度测序(CAPP-seq)使突变检测的敏感度达到0.02％，特异性为100％。此方法结合降低背景噪声的iDES(integrated Digital ErrorSuppression)分析方法后，使检测频率的阈值进一步下降到0.004％。从而大大提高了分析CtDNA的检出率。

肺癌(lung cancer)是全球范围内最普遍和最致命的恶性肿瘤，5年生存率仅为17％左右，每年造成160万人的死亡。在中国吸烟和环境污染是两个最主要的肺癌致病因素。据统计2015年在中国有60万肺癌患者死亡，新增73万例。并有增长趋势，到2025年可能造成100万人死亡。肺癌根据组织病理学分类分为小细胞肺癌(small-cell lungcarcinomas,SCLC)与非小细胞肺癌(no-small-cell lung carcinomas,NSCLC)，非小细胞肺癌又分为肺腺癌(adenocarcinomas)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)和大细胞肺癌(large-cell carcinomas)。比例最大的是肺腺癌，占40％，其次为占30％的鳞状细胞癌，大细胞肺癌和小细胞肺癌各占15％。

全身性化疗一直是肺癌的主要治疗方式，缺乏特异性，副作用大。随着在NSCLC中一些重要基因变异的发现，针对这些基因变异的靶向药物被研制出来并已用于临床治疗。如吉非替尼是针对EGFR(epidermal growth factor receptor)变异的NSCLC靶向治疗药物。EGFR在细胞信号转导中起着重要作用，一旦被激活，可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和自身的磷酸化，从而使细胞增生、转移、血管生成和细胞凋亡的抑制。EGFR exon 19缺失和L858R突变激活EGFR，使对EGFR的抑制剂药物更敏感。在亚洲人中约50％NSCLC中含有EGFR，并且90％是上述激活型的突变。因此EGFR突变的鉴定对治疗NSCLC有着非常重要的作用。

通过对人循环肿瘤DNA EGFR基因的检测可筛检出肺癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。

耗资30亿美元历时10余年完成的人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)给基因组学研究带来了天翻地覆的变化，通过测定人类基因组DNA的序列，探寻基因在染色体上的位置，明确基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，人类第一次在分子水平上全面认识自我。在这期间，建立了两项非常重要的高通量技术：基因芯片和第二代测序技术。这两种技术进一步结合，就产生了一种新的解决方案：目标序列捕获测序技术。目标序列捕获是指通过某种方法有选择性的分离或者富集基因组的特定区域。一种重要的方法是根据核酸分子碱基互补杂交原理设计与目的区域互补的探针序列，而根据杂交时状态不同，目标序列捕获可以分为固相杂交法和液相杂交法。液相杂交是通过在溶液中，目标DNA片段和已带有生物素标记探针直接杂交，然后通过生物素亲和素反应使目标DNA片段锚定在带有亲和素的微珠上。洗去非目标DNA，洗脱后，富集的DNA用于测序。相较于固相杂交，液相杂交具有操作简便、易于自动化等优点。

常规的探针设计方式为探针间首尾相连，且不存在重叠部分，这样做的缺点是在基因文库中EGFR基因多数片段只能被单一探针捕获，且探针交界处的捕获效果差，造成捕获效率偏低。同时，常规探针设计方式对探针长度和Tm值无特殊要求，这就导致探针间差异较大，在相同的实验条件下绝大多数探针不能同时达到最佳的捕获效果。本发明基于CAPP-seq和数字信号技术，设计EGFR探针检测血液cfDNA中EGFR的变异。当测序深度达到10000×时，有效深度可达5000×，检测突变的敏感性达到0.02％。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人循环肿瘤DNA EGFR基因的捕获探针及试剂盒。本发明的人循环肿瘤DNA EGFR捕获探针是多条探针的混合物，所述多条探针分别能够捕获人EGFR基因上不同的目标区域。在优选的实施方案中，所述多条探针的集合能够捕获人循环肿瘤DNA EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域，减少非特异性捕获，同时杂交温度相近。

根据本发明的一个方面，提供用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间。

本发明中，目标区域是指包含人EGFR基因上的任何一个或多个变异的区域。

本发明中，全部目标区域优选为人EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域。

根据本发明的一个方面，提供用于人人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针混合物，所述捕获探针混合物至少包括具有SEQ ID NO:1-132所示序列的132条探针。

在一些实施方案中，所述捕获探针混合物由具有SEQ ID NO:1-132所示序列的132条探针组成。

在另一些实施方案中，所述捕获探针混合物还进一步包括一条或更多条具有选自SEQ ID NO:133-195的序列的探针。

在预选的实施方案中，所述捕获探针混合物为SEQ ID NO:1-195所示的195条探针的混合物。

在一些优选的实施方案中，捕获探针混合物中包含的探针按相同比例混合在一起。

优选地，本发明的捕获探针混合物中每条探针均具有标记，优选为生物素标记。

本发明的捕获探针混合物的工作浓度是0.1PM～6PM，优选1.5PM；其中PM＝皮摩尔/升。

根据本发明的另一个方面，提供人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测试剂盒，其中包含上述探针混合物。

本发明的人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测试剂盒还可以包含用于人EGFR基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中，所述人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阴性对照和阳性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。在特别优选的实施方案中，所述人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测试剂盒包含上述全部试剂。

根据本发明的又一方面，提供上述用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针在制备用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。

本发明针对当前新一代测序过程中捕获探针存在的缺陷，采用特殊的设计方式在EGFR基因外显子区域进行探针设计，解决了循环肿瘤DNA EGFR基因外显子测序数据质量较差的问题。本发明通过增加探针间的重叠区间，使文库中EGFR基因每个区域存在被两个或两个以上的捕获探针捕获的可能，提高了对目的片段的捕获能力。通过限制探针的长度和Tm值，降低了探针之间的差异性，使绝大多数探针在特定实验条件下均处于解链和二级结构充分打开的状态，可与目的区域充分结合，提高了对目的区域捕获的均一性。本发明的捕获探针具有杂交效果好，捕获效率高，目的区域测序数据质量好等优点。

具体实施方式

本文所述的“变异”是指一个或更多个核苷酸的插入、取代或缺失。

本文所述的“杂交捕获”是通过互补DNA序列与靶向DNA进行杂交，对待测核酸进行靶向富集的方法。

本文所述的“Tm值”是指DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构热变性过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。

本文所述的“新一代测序技术”又称大规模平行测序massively parallelsequencing(MPS)，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序、二代测序等。高通量测序的基本程序是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR扩增等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，Ion Torrent等测序仪进行测序。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。

实施例1：人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测质控品的制备

1.1.从ATCC购买获得六株常用的可稳定传代人肿瘤细胞系A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417。用数字PCR法对每个细胞系的基因组DNA进行测序，经Sanger法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点。经验证共含有12个阳性变异位点。

1.2.采用专用培养基培养这六株人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO₂，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清。

1.3.使用预冷PBS溶液重悬，5000rpm速度4℃离心5min，吸弃上清。重复本步骤一次。

1.4.吸弃上清，使用0.1％Triton X-100重悬沉淀，冰上孵育10min，5000rpm速度4℃离心10min。吸弃上清，加入1X MNase Buffer，重悬沉淀。

1.5.吸弃上清，加入1×MNase Buffer，重悬沉淀。加入1×BSA及MNase，37℃孵育5min。加入EDTA中止酶反应。2000g离心1min后取上清使用Life Tech MagMax试剂盒提取，最终将提取的六株人肿瘤细胞系核酸稀释至15±1ng/μL，并等比例混合，-20℃保存。

实施例2：人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测试剂盒的制备

2.1.设计并合成针对人循环肿瘤DNA EGFR基因上不同目标区域的多个捕获探针，所有捕获探针的集合能够覆盖人EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域；捕获探针上具有生物素标记；所述捕获探针的序列如序列表中SEQ ID NO:1-195所示。

2.2.将序列表中SEQ ID NO:1-195所示的全部捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。

2.3.将捕获探针混合物和实施例1中获得的质控品分别分装。

2.4.准备说明书、外包装，组装封口。

2.5.其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为5μL/3反应，10μL/6反应，20μL/12反应，40μL/24反应。

实施例3：人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的测序检测

本实施例中测序所使用的仪器为基因序列自动分析仪CN500。

质控品的制备方法同实施例1。

3.1.从15例阳性血浆样本中提取人cfDNA，质控品直接使用，无需提取。

3.2.文库构建

3.2.1.末端修复

0.2ml PCR反应管，加入30ng提取后的cfDNA样本或质控品，用Low EDTA TE补齐至50μL，震荡混匀，短暂离心。分别加入1μL末端修复酶混合物和6μL末端修复反应缓冲液，震荡混匀短暂离心后在37℃保温5min，随后在65℃保温30min，37℃保温5min，进行末端修复。反应结束后取出PCR反应管，将产物全部转移至新的1.5mL离心管中；在每个离心管中加入108μL核酸纯化磁珠，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。在每个离心管中分别加入30μLLow EDTA TE、18μL缓冲液、1μL修复酶G3、1μL修复酶G4，充分混匀后，于20℃孵育20min。取出离心管，分别加入50μL PEG NaCl，吹打混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清。重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。

3.2.2.接头连接

向干燥后的离心管中分别单独加入5μL接头，并做好标记；分别加入20μL LowEDTA TE、3μL接头缓冲液、2μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，25℃恒温孵育15min。加入49.5μL PEG NaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。分别加入30μL Low EDTA TE、16μL缓冲液、3μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，40℃恒温孵育10min。加入82.5μL PEG NaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留，室温干燥5min(不可使磁珠过度干燥)。加入20μL Low EDTA TE，室温孵育3min。将离心管转移至磁力架上，静置2min，小心吸取上清至新的1.5mL离心管中。

3.2.3文库扩增与纯化

分别加入25μL PCR扩增酶混合物、5μL引物混合物进行PCR扩增。向反应完成的离心管中，加入1.65倍的PEG NaCl溶液，并吹打混合均匀，室温孵育。孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置2-3min，待溶液澄清后，吸弃溶液，期间切忌接触磁珠。在离心管中加入新鲜的80％乙醇200μL，静置30s后，吸弃乙醇，切勿接触磁珠，重复操作一次。吸弃乙醇后，将磁珠晾干至表明呈磨砂状，切勿使磁珠过干，出现许多裂缝，磁珠晾干后，加入Low EDTA TEbuffer 20μL，并室温孵育。孵育完成后，置于磁力架上，静置2-3min，待溶液澄清后，吸取溶液，转移至新的1.5mL LoBind离心管中。

3.3.文库捕获

3.3.1.杂交

几个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mL LoBind离心管中成为一个样品池，样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μL DNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)、2.7μL杂交增强剂和3.8μL PCR-grade water，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mL PCR反应管中，95℃保温10min。取出PCR反应管，短暂离心后加入2μL实施例2获得的捕获探针混合物，震荡混匀3-5s，短暂离心后在68℃保温4h以上，热盖温度为78℃。

3.3.2.富集

取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2mL PCR反应管中。

将步骤3.3.1中的PCR反应管取出，短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL65℃预热的1×洗液Ⅰ，将全部悬液转移至1.5mL LoBind离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。

加入200μL 65℃预热的1×杂交洗液，震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。

再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μL Nuclease-free water，震荡重悬后全部转移至0.2mL PCR反应管中备用。

3.3.3.捕获文库扩增与纯化

向上述PCR反应管中分别加入25μL 2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，充分混匀短暂离心后按下述程序进行PCR扩增：95℃3min；10个循环，每个循环为98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。

将PCR反应管短暂离心后，将产物全部转移至1.5mL离心管中。加入75μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。加入200μL 80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μLNuclease-free water震荡重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μL上清至新的1.5mL LoBind离心管中备用。取2μL捕获文库或捕获的质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。

3.4.测序及数据分析

3.4.1.测序

按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。平均有效覆盖深度≥5000×。

3.4.2.数据分析

获得原始测序数据后，与参比数据库比对，进行变异分析和解读。

检测结果如下：

临床样本的突变位点及检测结果如表1所示。临床样本检测符合率：15/15＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。

表1临床样本突变位点及检测结果

质控品的变异位点检测结果如表2所示，其中参考突变频率为根据混合比例以及经数字PCR法测定的变异频率计算获得的理论检测值为高通量测序实验检测结果。

表2质控品变异位点及检测结果

由表2的结果可见，质控品中变异位点检测符合率为100％。

实施例4：可重复性实验

按照实施例1的制备方法制备质控品E-P2，与实施例1的不同之处在于六株细胞系DNA等比例混合制备而成。

使用质控品E-P2按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒，批号分别为20160314，20160315，20160316。

按照实施例3的检测方法进行高通量测序检测。同一批次试剂盒20160316，检测E-P2三次，检测结果见表3。不同批次试剂盒20160314，20160315，20160316，检测E-P2各三次，检测结果见表4。

表3批内差异

批号	样本名称	阳性变异符合率
			20160316	E-P2	100％(12/12)
20160316	E-P2	100％(12/12)
			20160316	E-P2	100％(12/12)

表4批间差异

批号	样本名称	阳性变异符合率
			20160314	E-P2	100％(12/12)
20160315	E-P2	100％(12/12)
			20160316	E-P2	100％(12/12)

检测结果：试剂盒可重复性满足要求。

实施例5：探针对比测试的性能分析指标

分别使用常规捕获探针和实施例2的捕获探针，按照与实施例3相同的实验步骤进行操作。其中常规捕获探针为107条探针的混合物，其中所包含的107条探针首尾相接覆盖EGFR的全部目标区域，每条探针长度随机，Tm值无限制，所有探针均具有生物素标记。

经过测序和数据分析，两种探针的性能指标比较如表5和表6所示。

表5常规捕获探针性能指标验证分析

表6实施例2探针性能指标验证分析

样本	重复率(％)	目标区占比(％)	目标区边缘占比(％)	非目标区占比(％)
					1	0.12	69.33	19.20	11.47
2	0.13	68.97	19.90	11.13
					3	0.12	79.19	8.47	12.34
4	0.14	68.31	9.43	22.26
					5	0.09	78.49	11.85	9.67
6	0.09	74.50	12.01	13.48
					7	0.12	70.32	19.22	10.47
8	0.12	70.65	19.09	10.27
					9	0.10	70.14	18.53	11.32
10	0.10	68.66	17.02	14.32
					11	0.09	71.43	17.66	10.92
12	0.10	72.50	16.51	10.99
					13	0.10	67.21	15.68	17.12
14	0.10	68.29	15.21	16.49
					15	0.09	72.19	16.46	11.36
均值	0.11	71.35	15.75	12.91

其中

重复率：测序重复的数据量与测序得到的总数据量之比；

目标区占比：目标区域测序测得的数据量与测序得到的总数据量之比；

目标区边缘占比：目标区边缘区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比；

非目标区占比：非目标区域测得的数据量与测序得到的总数据量之比。

实施例6：利用132条探针组合对人循环肿瘤DNA EGFR基因变异进行测序检测

将序列表中SEQ ID NO:1-132所示的捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。上述132条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应。

对人循环肿瘤DNA EGFR基因变异进行测序检测，步骤与实施例3相同，除了在文库捕获步骤中使用上述制备的132条捕获探针混合物。

检测结果如下：

临床样本的突变位点及检测结果如表7所示。临床样本检测符合率：15/15＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。

表7 132条探针组合临床样本检测结果

利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的132条探针在65℃杂交条件下进行捕获，对比捕获后核酸得率如下表8所示：

表8捕获核酸得率比较

注：样本捕获总量1μg；理想得率在1％-4％之间。

实施例7：利用174条探针组合对人循环肿瘤DNA EGFR基因变异进行测序检测

将序列表中SEQ ID NO:1-174所示的捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。上述174条捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应。

对人循环肿瘤DNA EGFR基因变异进行测序检测，步骤与实施例3相同，除了在文库捕获步骤中使用上述制备的174条捕获探针混合物。

检测结果如下：

临床样本的突变位点及检测结果如表9所示。临床样本检测符合率：15/15＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。

表9 174条探针组合临床样本检测结果

利用实施例5中所述的常规捕获探针与本实施例的174条探针在65℃杂交条件下进行捕获，对比捕获后核酸得率如下表10所示：

表10捕获核酸得率比较

样本编号	常规捕获探针	本实施例的174条探针
			1	1.5％	2.1％
2	1.7％	1.7％
			3	1.4％	2.8％
4	0.6％	3.1％
			5	0.3％	3.7％
6	1.9％	3.1％
			7	0.4％	2.9％
8	0.3％	2.5％

注：样本捕获总量1μg；理想得率在1％-4％之间。

SEQUENCE LISTING

<110> 埃提斯生物技术（上海）有限公司

<120> 高通量测序检测人循环肿瘤DNA EGFR基因的捕获探针及试剂盒

<130> 2016

<160> 195

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

accggacgac aggccacctc gtcggcgtcc gcccgagtcc ccgcctcgcc gccaacgcca 60

caaccaccgc gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc 120

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaccaccgc gcacggcccc ctgactccgt ccagtattga tcgggagagc cggagcgagc 60

tcttcgggga gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct 120

<210> 3

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agatcatcag aggaaatatg tactacgaaa attcctatgc cttagcagtc ttatctaact 60

atgatgcaaa taaaaccgga ctgaaggagc tgcccatgag aaatttacag gaaatcctgc 120

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggctgcgctc tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaaggtaagg gcgtgtctcg 60

ccggctcccg cgccgccccc ggatcgcgcc ccggaccccg cagcccgccc aaccgcgcac 120

<210> 5

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccggctcccg cgccgccccc ggatcgcgcc ccggaccccg cagcccgccc aaccgcgcac 60

cggcgcaccg gctcggcgcc cgcgcccccg cccgtccttt cctgtttcct tgagatcagc 120

<210> 6

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggcgccgt gcggttcagc aacaaccctg ccctgtgcaa cgtggagagc atccagtggc 60

gggacatagt cagcagtgac tttctcagca acatgtcgat ggacttccag aaccacctgg 120

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctggaattga agtaaaatgg atagtgagcc tctgtgtatg tgaaggcccg catctggaac 60

atgaaagaac ctgtctgatg tgttctagtc aggaaagcag gtagccaata ctatttatag 120

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggcgcagtt tcagaaaacc attgggctgc acctgcgtga gcacagctgc aggagcaaaa 60

gtcagaaagg tcagcaaagg atttcaggag caaaggtcag aagaaaccct caaggtggtt 120

<210> 9

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttttggtaaa atgaaaccca ttgtctctgt tgattacttt gatgagtcaa gaagtaacat 60

cctgggaatg attggccagt ttaaatgagt gcctcaggtt tttggaatac aagaaatcaa 120

<210> 10

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agatagctct tggtctgtca tccacgcagc tgcctggtgc aagagccaag tttgtgcagc 60

ctgcagagca ctcttcctga gctgtgggct gccaggtcgg ggggcagggg gggcctcact 120

<210> 11

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgatatagtc actttatgct gcaggggtgc ccctttataa agtgcttgta caatggatgt 60

ttgcttttga ttttggattt ggagtctaat gaatgttcta aattattatt agaggagctt 120

<210> 12

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aggattattg taaaaacgcc aagcacattg cctacacaaa ctaaatattc agtcaatggc 60

tgctattttc atgagttcgt tttaacatat atttattgtc ctctactgga tttaagaagt 120

<210> 13

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcagctgcca aaagtgtgat ccaagctgtc ccaatgggag ctgctggggt gcaggagagg 60

agaactgcca gaaactgacc aaaatcatct gtgcccagca gtgctccggg cgctgccgtg 120

<210> 14

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caggaatggg tgagtctctg tgtggagaga gtgaagaaac tgctaccctt aatacctgga 60

ccttgaggga ttgttttatt ttagtttttc tgcatttctc agtatttcat gtgatatctg 120

<210> 15

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccttgaggga ttgttttatt ttagtttttc tgcatttctc agtatttcat gtgatatctg 60

tctttttctt ccagtttgcc aaggcacgag taacaagctc acgcagttgg gcacttttga 120

<210> 16

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gccccgctct cagccccggg aaaggccact ggaaaccacc tcacatggta gggccttgcg 60

ggagccagta ataaccttat ctccgtcaac atgttctgtc agattgaatg gggcagccag 120

<210> 17

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt gaggtggtcc ttgggaattt 60

ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc ttaaaggttg gtgactttga 120

<210> 18

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggaaattacc tatgtgcaga ggaattatga tctttccttc ttaaaggttg gtgactttga 60

ttttcctaca caaataaaat tggagaaaat ctaagtggag aaaggcctgg gcagaattcc 120

<210> 19

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttttcctaca caaataaaat tggagaaaat ctaagtggag aaaggcctgg gcagaattcc 60

acttgaagtg tgtttatttt tgctatggca atgacaagtc ttacagagct acaaacgaga 120

<210> 20

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agcactcgtg tgcattaggg ttcaactggg cgtcctaggg ctccctggac ccattttaga 60

ccttgagttc ttgagttcct caaaagagaa atcacgcatt tatgttttct cttcttagac 120

<210> 21

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ccttgagttc ttgagttcct caaaagagaa atcacgcatt tatgttttct cttcttagac 60

catccaggag gtggctggtt atgtcctcat tgccctcaac acagtggagc gaattccttt 120

<210> 22

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

catccaggag gtggctggtt atgtcctcat tgccctcaac acagtggagc gaattccttt 60

ggaaaacctg cagatcatca gaggaaatat gtactacgaa aattcctatg ccttagcagt 120

<210> 23

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccccactcat gctctacaac cccaccacgt accagatgga tgtgaacccc gagggcaaat 60

acagctttgg tgccacctgc gtgaagaagt gtccccgtaa ttatgtggtg acagatcacg 120

<210> 24

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cttatctaac tatgatgcaa ataaaaccgg actgaaggag ctgcccatga gaaatttaca 60

gggtgagagg ctgggatgcc aaggctgggg gttcataaat gcagacagca gttccgatgg 120

<210> 25

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gggtgagagg ctgggatgcc aaggctgggg gttcataaat gcagacagca gttccgatgg 60

ctcccagcga gcttgtcact caattccacc tcggagaagg cttttatttt tacccagtac 120

<210> 26

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gctcgtgcgt ccgagcctgt ggggccgaca gctatgagat ggaggaagac ggcgtccgca 60

agtgtaagaa gtgcgaaggg ccttgccgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat 120

<210> 27

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggaatttaaa ggagctggaa agagtgctca ccgcagttcc attctcccgc agaaatcctg 60

catggcgccg tgcggttcag caacaaccct gccctgtgca acgtggagag catccagtgg 120

<210> 28

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

catggcgccg tgcggttcag caacaaccct gccctgtgca acgtggagag catccagtgg 60

cgggacatag tcagcagtga ctttctcagc aacatgtcga tggacttcca gaaccacctg 120

<210> 29

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cgggacatag tcagcagtga ctttctcagc aacatgtcga tggacttcca gaaccacctg 60

ggcagctgta agtgtcgcat acacactatc tctgcctcca gctcctatgg gggacagctc 120

<210> 30

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggcagctgta agtgtcgcat acacactatc tctgcctcca gctcctatgg gggacagctc 60

tacagcactg gggcagggga gagaagccat gtttagtaag tcacattaat cagaaacaaa 120

<210> 31

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ataagttgaa aagattgtct tcatttattg aatgtgctta actcaggccc gggaaagggc 60

gtcatcagtt tctcatcatt tcactgagat atgcatctat tacttttaca tttcaggcca 120

<210> 32

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gtcatcagtt tctcatcatt tcactgagat atgcatctat tacttttaca tttcaggcca 60

aaagtgtgat ccaagctgtc ccaatgggag ctgctggggt gcaggagagg agaactgcca 120

<210> 33

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ttaaagactc actctccata aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca 60

tcagtggcga tctccacatc ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc 120

<210> 34

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gaaacgtaag tcagtgaaca gcctcagacc catgtgtgac cgcccctctc ttccttcact 60

tgcttaggtg attggatttg ttttccctct gaagactcca aagagttact ttattacagg 120

<210> 35

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

cgttggaagc aaatgtgtct tcactttttc atgaaaaagt ctgcaagtgc tctgcgacat 60

ccctgggaaa tgatcctacc ctcactcttc agctcacagg gaacctttgc tctttttcag 120

<210> 36

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ctcctctgga tccacaggaa ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt 60

tgctgattca ggcttggcct gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa 120

<210> 37

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgaccaaaat catctgtgcc cagcagtgct ccgggcgctg ccgtggcaag tcccccagtg 60

actgctgcca caaccagtgt gctgcaggct gcacaggccc ccgggagagc gactgcctgg 120

<210> 38

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

actgctgcca caaccagtgt gctgcaggct gcacaggccc ccgggagagc gactgcctgg 60

taagatgccc ctccagcagc ctccctggag caggctgggg ctgcacccgc cccacccaca 120

<210> 39

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

taagatgccc ctccagcagc ctccctggag caggctgggg ctgcacccgc cccacccaca 60

ccaggacaga agacttcctg tgggggagct gtcaattagc atttgtcata acagacagga 120

<210> 40

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

cccacactag tggaacacta ggctgcaaag acagtaactt gggctttctg acgggagtca 60

acaccgtgct gcgcttcctc cgtgtgtggc gctgagtgta cttacctcac ttgcccagcg 120

<210> 41

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

acaccgtgct gcgcttcctc cgtgtgtggc gctgagtgta cttacctcac ttgcccagcg 60

tgtcctctct cctccatagg tctgccgcaa attccgagac gaagccacgt gcaaggacac 120

<210> 42

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tgtcctctct cctccatagg tctgccgcaa attccgagac gaagccacgt gcaaggacac 60

ctgcccccca ctcatgctct acaaccccac cacgtaccag atggatgtga accccgaggg 120

<210> 43

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

tcatacgcgg caggaccaag caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca 60

taacatcctt gggattacgc tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag 120

<210> 44

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

caaatacagc tttggtgcca cctgcgtgaa gaagtgtccc cgtgagtcct cctctgtggg 60

ccctctaact ggtcaggcat ccttgtcccg ctctgtctcc tgctgagccc tggagtatcc 120

<210> 45

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ccctctaact ggtcaggcat ccttgtcccg ctctgtctcc tgctgagccc tggagtatcc 60

catcttggag agtctttggg tggatgtgtt tgccttgctt ggaggaggcg accctgtgcc 120

<210> 46

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gaaacaaaaa tttgtgctat gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg 60

gtcagaaaac caaaattata agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg 120

<210> 47

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

tgtgtgaggc ccgagcacct ggtgccaccg tcatcacctt cctttcatgc tctcttcccc 60

aggtaattat gtggtgacag atcacggctc gtgcgtccga gcctgtgggg ccgacagcta 120

<210> 48

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

aggtaattat gtggtgacag atcacggctc gtgcgtccga gcctgtgggg ccgacagcta 60

tgagatggag gaagacggcg tccgcaagtg taagaagtgc gaagggcctt gccgcaaagg 120

<210> 49

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tgagatggag gaagacggcg tccgcaagtg taagaagtgc gaagggcctt gccgcaaagg 60

taggaagccc gccggtgtgc ggacgaggct tgttctcggc tgctgaggct gggctctcat 120

<210> 50

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

taggaagccc gccggtgtgc ggacgaggct tgttctcggc tgctgaggct gggctctcat 60

gccacctcca aaggaacaca tcttcctctt ctcattaaaa aacaactata catatcgttt 120

<210> 51

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

gcagtggcgg ttccggtgac cggaattcct tcctgcttcc ctctgcctgt ggatccctag 60

ctattcttaa tccaacaaat gtgaacggaa tacacgtctc tcttatctct gcagtgtgta 120

<210> 52

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

ctattcttaa tccaacaaat gtgaacggaa tacacgtctc tcttatctct gcagtgtgta 60

acggaatagg tattggtgaa tttaaagact cactctccat aaatgctacg aatattaaac 120

<210> 53

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

tctgccatgc cttgtgctcc cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct 60

cttgccggaa tgtcagccga ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg 120

<210> 54

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

acttcaaaaa ctgcacctcc atcagtggcg atctccacat cctgccggtg gcatttaggg 60

ggtgagtcac aggttcagtt gcttgtataa agaaaaacaa aatctgcctt tttaactggt 120

<210> 55

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ggtgagtcac aggttcagtt gcttgtataa agaaaaacaa aatctgcctt tttaactggt 60

agagattggt gatcaataat caccctgttg tttgtttcag tgactccttc acacatactc 120

<210> 56

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

agccaaggga gtttgtggag aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc 60

aggccatgaa catcacctgc acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact 120

<210> 57

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

ctcctctgga tccacaggaa ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acaggtttga 60

gctgaattat cacatgaata taaatgggaa atcagtgttt tagagagaga acttttcgac 120

<210> 58

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gctgaattat cacatgaata taaatgggaa atcagtgttt tagagagaga acttttcgac 60

atatttcctg ttcccttgga ataaaaacat ttcttctgaa attttaccgt taatggctga 120

<210> 59

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

tcagagaaga tgataatgaa aaagaaagca aatccaattt tcccacttac tgttcatata 60

atacagagtc cctgagagtc tagagtaatg tctcatacaa aaaagaaact cctacgtggt 120

<210> 60

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

atacagagtc cctgagagtc tagagtaatg tctcatacaa aaaagaaact cctacgtggt 60

gtgtgtctga agtctttcat ctgccttaca gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa 120

<210> 61

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

gtgtgtctga agtctttcat ctgccttaca gggtttttgc tgattcaggc ttggcctgaa 60

aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa 120

<210> 62

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

aacaggacgg acctccatgc ctttgagaac ctagaaatca tacgcggcag gaccaagcaa 60

cagtaagttg accacagcca aagcctggta gattacattt gcctttttag ttggaaatt 120

<210> 63

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

acattgacgg cccccactgc gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca 60

ccctggtctg gaagtacgca gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca 120

<210> 64

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

tggtctggag aaacaaagtt ttcagggata cattgttttt ataatttttc accacatgat 60

ttttcttctc tccaatgtag tggtcagttt tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca 120

<210> 65

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

ttttcttctc tccaatgtag tggtcagttt tctcttgcag tcgtcagcct gaacataaca 60

tccttgggat tacgctccct caaggagata agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac 120

<210> 66

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

cctacggatg cactgggcca ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt 60

ccatcgccac tgggatggtg ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg 120

<210> 67

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag 60

aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa aacagctgca gtaagtcacc gctttctgtt 120

<210> 68

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

aaaaccaaaa ttataagcaa cagaggtgaa aacagctgca gtaagtcacc gctttctgtt 60

tagtttatgg agttggttct aatgggtcct ttatttgtat ttagaatatt gaagggctat 120

<210> 69

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

tagtttatgg agttggttct aatgggtcct ttatttgtat ttagaatatt gaagggctat 60

tcccatttaa attacttttt tcagttcctt aagaagcaaa ttaaaatctt aagattccta 120

<210> 70

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

ctgtgtcacc caaggtcatg gagcacaggg cccctcccgg gaaggtgccg tctcctccgg 60

cccctcgggt ccctgctctg tcactgactg ctgtgaccca ctctgtctcc gcagaggcca 120

<210> 71

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

cccctcgggt ccctgctctg tcactgactg ctgtgaccca ctctgtctcc gcagaggcca 60

caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg gagcccaggg 120

<210> 72

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg gagcccaggg 60

actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc 120

<210> 73

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

gcctcttcat gcgaaggcgc cacatcgttc ggaagcgcac gctgcggagg ctgctgcagg 60

agagggagct tgtggagcct cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga 120

<210> 74

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tggaggggta ggaggttatt tctttaatcc ccttgcgttg atcaaaaata aggctccagg 60

ttgttgttat agctttacag gcattctgtt tgattttctc ttccttttat tctttgccct 120

<210> 75

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

atattactat atagtcctgg agtcccaact ccttgaccat tacctcaagt tatttggaat 60

tttgaagagg tgatttgtgt tcctgcaata atgtctcagg ggtgggctga cgggtttcct 120

<210> 76

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

ggatcttgaa ggaaactgaa ttcaaaaaga tcaaagtgct gggctccggt gcgttcggca 60

cggtgtataa gggactctgg atcccagaag gtgagaaagt taaaattccc gtcgctatca 120

<210> 77

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

cttcctcctc tcagtgagcc aagggagttt gtggagaact ctgagtgcat acagtgccac 60

ccagagtgcc tgcctcaggc catgaacatc acctgcacag gacgggtaag agccccttgc 120

<210> 78

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

ccagagtgcc tgcctcaggc catgaacatc acctgcacag gacgggtaag agccccttgc 60

tgctatccac gtccatttca tgggaagggc cttcacagaa gccgaacagt gatgatggcc 120

<210> 79

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

tgctatccac gtccatttca tgggaagggc cttcacagaa gccgaacagt gatgatggcc 60

cagggcatcc tgtgtgggca ggacggccat cagagccact tcccagagga gacggcaggc 120

<210> 80

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

cctttaagaa tttttctatc atttggcttt ccccactcac acacactaaa tattttaagt 60

aaaaagttac ttccattttg aaagagaaaa gaaagagaca tgcatgaaca tttttctcca 120

<210> 81

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

aaaaagttac ttccattttg aaagagaaaa gaaagagaca tgcatgaaca tttttctcca 60

ccttggtgca gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac ggcccccact 120

<210> 82

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

ccttggtgca gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac ggcccccact 60

gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc tggaagtacg 120

<210> 83

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

aggaattaag agaagcaaca tctccgaaag ccaacaagga aatcctcgat gaagcctacg 60

tgatggccag cgtggacaac ccccacgtgt gccgcctgct gggcatctgc ctcacctcca 120

<210> 84

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacggg tgagtggaaa 60

gtgaaggaga acagaacatt tcctctcttg caaattcaga gatcaaaaat gtctcccaag 120

<210> 85

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

gtgaaggaga acagaacatt tcctctcttg caaattcaga gatcaaaaat gtctcccaag 60

ttttccggca acaaattgcc gaggtttgta tttgagtcag ttacttaagg tgttttggtc 120

<210> 86

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

ccgtgcagct catcacgcag ctcatgccct tcggctgcct cctggactat gtccgggaac 60

acaaagacaa tattggctcc cagtacctgc tcaactggtg tgtgcagatc gcaaagggca 120

<210> 87

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

atttaaatta aaaatgttag tggtcatttt tctaatgtct ttctattttt tcccaggtcc 60

taataaatct tcactgtctg actttagtct cccactaaaa ctgcatttcc tttctacaat 120

<210> 88

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

taataaatct tcactgtctg actttagtct cccactaaaa ctgcatttcc tttctacaat 60

ttcaatttct ccctttgctt caaataaagt cctgacacta ttcatttgac atatggaatt 120

<210> 89

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

cagtgtagag aacagagacc tggagagcag agatagaaac tgttaggatc agattatagt 60

gttacaccag ggctccccag gcctctcaca tattgaaatg tacttgtcca tctttctcca 120

<210> 90

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

gttacaccag ggctccccag gcctctcaca tattgaaatg tacttgtcca tctttctcca 60

ggccaggaaa tgagagtctc aaagccatgt tattctgcct ttttaaacta tcatcctgta 120

<210> 91

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

ggccaggaaa tgagagtctc aaagccatgt tattctgcct ttttaaacta tcatcctgta 60

atcaaagtaa tgatggcagc gtgtcccacc agagcgggag cccagctgct caggagtcat 120

<210> 92

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

atcaaagtaa tgatggcagc gtgtcccacc agagcgggag cccagctgct caggagtcat 60

gcttaggatg gatcccttct cttctgccgt cagagtttca gctgggttgg ggtggatgca 120

<210> 93

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

tgaactactt ggaggaccgt cgcttggtgc accgcgacct ggcagccagg aacgtactgg 60

tgaaaacacc gcagcatgtc aagatcacag attttgggct ggccaaactg ctgggtgcgg 120

<210> 94

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

gccacctcca tgcctggcct tctgcatctg tgatcatcac ggcctcctcc tgccactgag 60

cctcatgcct tcacgtgtct gttccccccg cttttccttt ctgccacccc tgcacgtggg 120

<210> 95

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

cctcatgcct tcacgtgtct gttccccccg cttttccttt ctgccacccc tgcacgtggg 60

ccgccaggtt cccaagagta tcctacccat ttccttcctt ccactccctt tgccagtgcc 120

<210> 96

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

taccatgcag aaggaggcaa agtgcctatc aagtggatgg cattggaatc aattttacac 60

agaatctata cccaccagag tgatgtctgg agctacgggg tgaccgtttg ggagttgatg 120

<210> 97

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

aaaaatctcc aaaatatatg ccaaagaagt agaatgagaa aaatgtatat ttctctttca 60

cttcctacag atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg taagtgttca 120

<210> 98

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

cttcctacag atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg taagtgttca 60

cagctctgtg tcacatggac ctcgtcaaga atgaccacac tgctgtgggt gaagatgctt 120

<210> 99

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

cagctctgtg tcacatggac ctcgtcaaga atgaccacac tgctgtgggt gaagatgctt 60

tcctgcattt ctgactgtcc tctgtcctga tcaagtttct atggctctgg gccagcctac 120

<210> 100

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 100

agaagctaca tagtgtctca ctttccaaga tcattctaca agatgtcagt gcactgaaac 60

atgcaggggc gtgttgagtg ccaaggccat ggaatctgtc agcaacctca cccttccttg 120

<210> 101

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 101

atgcaggggc gtgttgagtg ccaaggccat ggaatctgtc agcaacctca cccttccttg 60

ttcctccacc tcattccagg cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc 120

<210> 102

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 102

ttcctccacc tcattccagg cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc 60

tcctcttgct gctggtggtg gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg 120

<210> 103

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 103

tcctcttgct gctggtggtg gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg 60

ttcggaagcg cacgctgcgg aggctgctgc aggagaggga ggtgagtgcc agtcctgggt 120

<210> 104

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 104

ttcggaagcg cacgctgcgg aggctgctgc aggagaggga ggtgagtgcc agtcctgggt 60

gggctcagga gccctcgcac cccgacagga acaagggcca gccccgagaa cgggccatta 120

<210> 105

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 105

gggctcagga gccctcgcac cccgacagga acaagggcca gccccgagaa cgggccatta 60

gcagttgtgt atgttagata cataattgta ttatgatgca gaaagaatct ctgaatgtgc 120

<210> 106

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 106

cctggcaccc aagcccatgc cgtggctgct ggtccccctg ctgggccatg tctggcactg 60

ctttccagca tggtgagggc tgaggtgacc cttgtctctg tgttcttgtc ccccccagct 120

<210> 107

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 107

ctttccagca tggtgagggc tgaggtgacc cttgtctctg tgttcttgtc ccccccagct 60

tgtggagcct cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga ggatcttgaa 120

<210> 108

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 108

tgtggagcct cttacaccca gtggagaagc tcccaaccaa gctctcttga ggatcttgaa 60

ggaaactgaa ttcaaaaaga tcaaagtgct gggctccggt gcgttcggca cggtgtataa 120

<210> 109

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 109

ggaaactgaa ttcaaaaaga tcaaagtgct gggctccggt gcgttcggca cggtgtataa 60

ggtaaggtcc ctggcacagg cctctgggct gggccgcagg gcctctcatg gtctggtggg 120

<210> 110

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 110

ggtaaggtcc ctggcacagg cctctgggct gggccgcagg gcctctcatg gtctggtggg 60

gagcccagag tccttgcaag ctgtatattt ccatcatcta ctttactctt tgtttcactg 120

<210> 111

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 111

tgcggctcca cagccccagt gtccctcacc ttcggggtgc atcgctggta acatccaccc 60

agatcactgg gcagcatgtg gcaccatctc acaattgcca gttaacgtct tccttctctc 120

<210> 112

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 112

agatcactgg gcagcatgtg gcaccatctc acaattgcca gttaacgtct tccttctctc 60

tctgtcatag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa 120

<210> 113

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 113

tctgtcatag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa 60

ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg 120

<210> 114

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 114

ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg 60

ctttgctgtg tgggggtcca tggctctgaa cctcaggccc accttttctc atgtctggca 120

<210> 115

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 115

ctttgctgtg tgggggtcca tggctctgaa cctcaggccc accttttctc atgtctggca 60

gctgctctgc tctagaccct gctcatctcc acatcctaaa tgttcacttt ctatgtcttt 120

<210> 116

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 116

gcaaataaaa ccggactgaa ggagctgccc atgagaaatt tacaggaaat cctgcatggc 60

gccgtgcggt tcagcaacaa ccctgccctg tgcaacgtgg agagcatcca gtggcgggac 120

<210> 117

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 117

gcccctcctt ctggccacca tgcgaagcca cactgacgtg cctctccctc cctccaggaa 60

gcctacgtga tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc gcctgctggg catctgcctc 120

<210> 118

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 118

gcctacgtga tggccagcgt ggacaacccc cacgtgtgcc gcctgctggg catctgcctc 60

acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct ggactatgtc 120

<210> 119

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 119

acctccaccg tgcagctcat cacgcagctc atgcccttcg gctgcctcct ggactatgtc 60

cgggaacaca aagacaatat tggctcccag tacctgctca actggtgtgt gcagatcgca 120

<210> 120

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 120

cgggaacaca aagacaatat tggctcccag tacctgctca actggtgtgt gcagatcgca 60

aaggtaatca gggaagggag atacggggag gggagataag gagccaggat cctcacatgc 120

<210> 121

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 121

aaggtaatca gggaagggag atacggggag gggagataag gagccaggat cctcacatgc 60

ggtctgcgct cctgggatag caagagtttg ccatggggat atgtgtgtgc gtgcatgcag 120

<210> 122

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 122

actaacgttc gccagccata agtcctcgac gtggagaggc tcagagcctg gcatgaacat 60

gaccctgaat tcggatgcag agcttcttcc catgatgatc tgtccctcac agcagggtct 120

<210> 123

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 123

gaccctgaat tcggatgcag agcttcttcc catgatgatc tgtccctcac agcagggtct 60

tctctgtttc agggcatgaa ctacttggag gaccgtcgct tggtgcaccg cgacctggca 120

<210> 124

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 124

tctctgtttc agggcatgaa ctacttggag gaccgtcgct tggtgcaccg cgacctggca 60

gccaggaacg tactggtgaa aacaccgcag catgtcaaga tcacagattt tgggctggcc 120

<210> 125

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 125

gccaggaacg tactggtgaa aacaccgcag catgtcaaga tcacagattt tgggctggcc 60

aaactgctgg gtgcggaaga gaaagaatac catgcagaag gaggcaaagt aaggaggtgg 120

<210> 126

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 126

aaactgctgg gtgcggaaga gaaagaatac catgcagaag gaggcaaagt aaggaggtgg 60

ctttaggtca gccagcattt tcctgacacc agggaccagg ctgccttccc actagctgta 120

<210> 127

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 127

ctttaggtca gccagcattt tcctgacacc agggaccagg ctgccttccc actagctgta 60

ttgtttaaca catgcagggg aggatgctct ccagacattc tgggtgagct cgcagcagct 120

<210> 128

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 128

tgatctggct cgtctgtgtg tgtcactcgt aattaggtcc agagtgagtt aactttttcc 60

aacagaggga aactaatagt tgtctcactg cctcatctct caccatccca aggtgcctat 120

<210> 129

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 129

aacagaggga aactaatagt tgtctcactg cctcatctct caccatccca aggtgcctat 60

caagtggatg gcattggaat caattttaca cagaatctat acccaccaga gtgatgtctg 120

<210> 130

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 130

caagtggatg gcattggaat caattttaca cagaatctat acccaccaga gtgatgtctg 60

gagctacggt gagtcataat cctgatgcta atgagtttgt actgaggcca agctggcttt 120

<210> 131

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 131

gagctacggt gagtcataat cctgatgcta atgagtttgt actgaggcca agctggcttt 60

tattgttagt taatttacat tatatcctct gacatgcaag tattttcttt cgagataatg 120

<210> 132

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 132

aagactacag aaatgtaggt ttctaaacat caagaaacag taaccagtaa tgatgactaa 60

agcaagggat tgtgattgtt cattcatgat cccactgcct tcttttcttg cttcatcctc 120

<210> 133

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 133

agcaagggat tgtgattgtt cattcatgat cccactgcct tcttttcttg cttcatcctc 60

tcaggggtga ctgtttggga gttgatgacc tttggatcca agccatatga cggaatccct 120

<210> 134

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 134

tcaggggtga ctgtttggga gttgatgacc tttggatcca agccatatga cggaatccct 60

gccagcgaga tctcctccat cctggagaaa ggagaacgcc tccctcagcc acccatatgt 120

<210> 135

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 135

gccagcgaga tctcctccat cctggagaaa ggagaacgcc tccctcagcc acccatatgt 60

accatcgatg tctacatgat catggtcaag tgtgagtgac tggtgggtct gtccacactg 120

<210> 136

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 136

accatcgatg tctacatgat catggtcaag tgtgagtgac tggtgggtct gtccacactg 60

cctagctgag ccttggtggc tgctcttagc caaacagctg aggcctttgc atccctggag 120

<210> 137

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 137

cctagctgag ccttggtggc tgctcttagc caaacagctg aggcctttgc atccctggag 60

aaatgtcatc acattactta aggcaggcac acaaatccag aaacatctgt aaatacccct 120

<210> 138

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 138

acaaagactt ggttctttca tcacttattt gactggaagt gtcgcatcac caatgccttc 60

tttaagcaat gccatcttta tcatttcttc cagtgttcta attgcactgt tttttctcat 120

<210> 139

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 139

tttaagcaat gccatcttta tcatttcttc cagtgttcta attgcactgt tttttctcat 60

tccttcccca ggctggatga tagacgcaga tagtcgccca aagttccgtg agttgatcat 120

<210> 140

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 140

tccttcccca ggctggatga tagacgcaga tagtcgccca aagttccgtg agttgatcat 60

cgaattctcc aaaatggccc gagaccccca gcgctacctt gtcattcagg tacaaattgc 120

<210> 141

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 141

cgaattctcc aaaatggccc gagaccccca gcgctacctt gtcattcagg tacaaattgc 60

agtctgtgct tccattggga agagtccctc taatgagcat ctcatgtcac tgtgttctgt 120

<210> 142

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 142

agtctgtgct tccattggga agagtccctc taatgagcat ctcatgtcac tgtgttctgt 60

cacatgccag cctggcctcc ctgtgtccca gatcgcatta ttaaaccctc cagcgcatta 120

<210> 143

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 143

gatttcatta taacaaaatt ggcaaacaca caggcacctg ctggcaatag acccctgctc 60

ctatagccaa gaagtggaat agcatctcta cgggccattc taatagcctc aaaatctctg 120

<210> 144

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 144

ctatagccaa gaagtggaat agcatctcta cgggccattc taatagcctc aaaatctctg 60

caccaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 120

<210> 145

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 145

caccaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc 60

ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 120

<210> 146

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 146

ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag 60

cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctggtatga 120

<210> 147

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 147

cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctggtatga 60

aatctctgtc tctctctctc tctcaagctg tgtctactca tttgaacaaa ttgaatttta 120

<210> 148

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 148

aatctctgtc tctctctctc tctcaagctg tgtctactca tttgaacaaa ttgaatttta 60

gggaaaataa ccatctagtg aaactcacat ggatatgaag tcaattttaa ccaaatggta 120

<210> 149

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 149

acgattaaga caaaaattaa acaccttcac aatataccct ccatgaggca caccacctgc 60

attcaggaaa agtggatgag atgtggtaca agcattccat gggcaacttc tctgtttctt 120

<210> 150

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 150

attcaggaaa agtggatgag atgtggtaca agcattccat gggcaacttc tctgtttctt 60

tttcagagtg caaccagcaa caattccacc gtggcttgca ttgatagaaa tggggtatgt 120

<210> 151

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 151

tttcagagtg caaccagcaa caattccacc gtggcttgca ttgatagaaa tggggtatgt 60

atgaacacct tataagccag aatttacagc tctccactat ggctctattt tacatggaaa 120

<210> 152

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 152

atgaacacct tataagccag aatttacagc tctccactat ggctctattt tacatggaaa 60

atgccttaac ctaaataatt ttaacccaga taatcttgag ttttcttcct gtgtgggttt 120

<210> 153

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 153

agactctcag gcctgcccaa cctactaatc agaaccagca tctcaaggag atctcgggtg 60

atttttgcaa acactgaagt tggggcagcc ctgaccggag taaccttccc tcatttcctc 120

<210> 154

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 154

atttttgcaa acactgaagt tggggcagcc ctgaccggag taaccttccc tcatttcctc 60

ctgcagctgc aaagctgtcc catcaaggaa gacagcttct tgcagcgata cagctcagac 120

<210> 155

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 155

ctgcagctgc aaagctgtcc catcaaggaa gacagcttct tgcagcgata cagctcagac 60

cccacaggcg ccttgactga ggacagcata gacgacacct tcctcccagt gcctggtgag 120

<210> 156

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 156

cccacaggcg ccttgactga ggacagcata gacgacacct tcctcccagt gcctggtgag 60

tggcttgtct ggaaacagtc ctgctcctca acctcctcga cccactcagc agcagccagt 120

<210> 157

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 157

tggcttgtct ggaaacagtc ctgctcctca acctcctcga cccactcagc agcagccagt 60

ctccagtgtc caagccaggt gctccctcca gcatctccag agggggaaac agtggcagat 120

<210> 158

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 158

ctcctgctcc ctgtcataag tctccttgtt gaggacattc acagggttca gaacccaggg 60

atcctgcatg ggatggtgct ttgctgatta cttcacctct gatttctttc cactttcaga 120

<210> 159

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 159

atcctgcatg ggatggtgct ttgctgatta cttcacctct gatttctttc cactttcaga 60

atacataaac cagtccgttc ccaaaaggcc cgctggctct gtgcagaatc ctgtctatca 120

<210> 160

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 160

atacataaac cagtccgttc ccaaaaggcc cgctggctct gtgcagaatc ctgtctatca 60

caatcagcct ctgaaccccg cgcccagcag agacccacac taccaggacc cccacagcac 120

<210> 161

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 161

caatcagcct ctgaaccccg cgcccagcag agacccacac taccaggacc cccacagcac 60

tgcagtgggc aaccccgagt atctcaacac tgtccagccc acctgtgtca acagcacatt 120

<210> 162

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 162

tgcagtgggc aaccccgagt atctcaacac tgtccagccc acctgtgtca acagcacatt 60

cgacagccct gcccactggg cccagaaagg cagccaccaa attagcctgg acaaccctga 120

<210> 163

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 163

cgacagccct gcccactggg cccagaaagg cagccaccaa attagcctgg acaaccctga 60

ctaccagcag gacttctttc ccaaggaagc caagccaaat ggcatcttta agggctccac 120

<210> 164

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 164

ctaccagcag gacttctttc ccaaggaagc caagccaaat ggcatcttta agggctccac 60

agctgaaaat gcagaatacc taagggtcgc gccacaaagc agtgaattta ttggagcatg 120

<210> 165

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 165

agctgaaaat gcagaatacc taagggtcgc gccacaaagc agtgaattta ttggagcatg 60

accacggagg atagtatgag ccctaaaaat ccagactctt tcgataccca ggaccaagcc 120

<210> 166

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 166

accacggagg atagtatgag ccctaaaaat ccagactctt tcgataccca ggaccaagcc 60

acagcaggtc ctccatccca acagccatgc ccgcattagc tcttagaccc acagactggt 120

<210> 167

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 167

tcttcgggga gcagcgatgc gaccctccgg gacggccggg gcagcgctcc tggcgctgct 60

ggctgcgctc tgcccggcga gtcgggctct ggaggaaaag aaaggtaagg gcgtgtctcg 120

<210> 168

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 168

gtgaggatag cctcataccc ctcagtgagc tcttcatgga gtgatgcagt agacagcaag 60

cctcacactt ctatgctcac ggaagaccaa atttgccttg aaaaatcttt atagtctct 120

<210> 169

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 169

tctttttctt ccagtttgcc aaggcacgag taacaagctc acgcagttgg gcacttttga 60

agatcatttt ctcagcctcc agaggatgtt caataactgt gaggtggtcc ttgggaattt 120

<210> 170

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 170

gcaagtcccc cagtgactgc tgccacaacc agtgtgctgc aggctgcaca ggcccccggg 60

agagcgactg cctggtctgc cgcaaattcc gagacgaagc cacgtgcaag gacacctgcc 120

<210> 171

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 171

ggaaaacctg cagatcatca gaggaaatat gtactacgaa aattcctatg ccttagcagt 60

cttatctaac tatgatgcaa ataaaaccgg actgaaggag ctgcccatga gaaatttaca 120

<210> 172

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 172

ttcgcaccat ggcatctctt tagcagaaca taaatgcgaa gagcacatgc atccttcatg 60

ggaatttaaa ggagctggaa agagtgctca ccgcagttcc attctcccgc agaaatcctg 120

<210> 173

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 173

aaagtgtgat ccaagctgtc ccaatgggag ctgctggggt gcaggagagg agaactgcca 60

gaaacgtaag tcagtgaaca gcctcagacc catgtgtgac cgcccctctc ttccttcact 120

<210> 174

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 174

ccctgggaaa tgatcctacc ctcactcttc agctcacagg gaacctttgc tctttttcag 60

tgaccaaaat catctgtgcc cagcagtgct ccgggcgctg ccgtggcaag tcccccagtg 120

<210> 175

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 175

ctgcccccca ctcatgctct acaaccccac cacgtaccag atggatgtga accccgaggg 60

caaatacagc tttggtgcca cctgcgtgaa gaagtgtccc cgtgagtcct cctctgtggg 120

<210> 176

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 176

taaataaagc caaaggagga tggagccttt ccatcacccc tcaagaggac ctggaccgcc 60

tgtgtgaggc ccgagcacct ggtgccaccg tcatcacctt cctttcatgc tctcttcccc 120

<210> 177

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 177

acggaatagg tattggtgaa tttaaagact cactctccat aaatgctacg aatattaaac 60

acttcaaaaa ctgcacctcc atcagtggcg atctccacat cctgccggtg gcatttaggg 120

<210> 178

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 178

agagattggt gatcaataat caccctgttg tttgtttcag tgactccttc acacatactc 60

ctcctctgga tccacaggaa ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acaggtttga 120

<210> 179

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 179

tgtgtgcctc ccacagcatg acctaccatc attggaaagc agtttgtagt caatcaaagg 60

tggtctggag aaacaaagtt ttcagggata cattgttttt ataatttttc accacatgat 120

<210> 180

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 180

tccttgggat tacgctccct caaggagata agtgatggag atgtgataat ttcaggaaac 60

aaaaatttgt gctatgcaaa tacaataaac tggaaaaaac tgtttgggac ctccggtcag 120

<210> 181

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 181

actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag tgcaaccttc 60

tggaggggta ggaggttatt tctttaatcc ccttgcgttg atcaaaaata aggctccagg 120

<210> 182

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 182

tttgaagagg tgatttgtgt tcctgcaata atgtctcagg ggtgggctga cgggtttcct 60

cttcctcctc tcagtgagcc aagggagttt gtggagaact ctgagtgcat acagtgccac 120

<210> 183

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 183

gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc tggaagtacg 60

cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacggg tgagtggaaa 120

<210> 184

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 184

atacacttac tttgtataag aaatagtttg ccaaatatag aaagagggga tttagtcaag 60

atttaaatta aaaatgttag tggtcatttt tctaatgtct ttctattttt tcccaggtcc 120

<210> 185

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 185

gcttaggatg gatcccttct cttctgccgt cagagtttca gctgggttgg ggtggatgca 60

gccacctcca tgcctggcct tctgcatctg tgatcatcac ggcctcctcc tgccactgag 120

<210> 186

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 186

acacatagtg attttaatta tttaagagta gtttagcata tattgcttta tgatttaatt 60

aaaaatctcc aaaatatatg ccaaagaagt agaatgagaa aaatgtatat ttctctttca 120

<210> 187

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 187

acctttggat ccaagccata tgacggaatc cctgccagcg agatctcctc catcctggag 60

aaaggagaac gcctccctca gccacccata tgtaccatcg atgtctacat gatcatggtc 120

<210> 188

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 188

aagtgctgga tgatagacgc agatagtcgc ccaaagttcc gtgagttgat catcgaattc 60

tccaaaatgg cccgagaccc ccagcgctac cttgtcattc agggggatga aagaatgcat 120

<210> 189

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 189

ttgccaagtc ctacagactc caacttctac cgtgccctga tggatgaaga agacatggac 60

gacgtggtgg atgccgacga gtacctcatc ccacagcagg gcttcttcag cagcccctcc 120

<210> 190

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 190

agtacgtatt ttgaaactca agatcgcatt catgcgtctt cacctggaag gggtccatgt 60

gcccctcctt ctggccacca tgcgaagcca cactgacgtg cctctccctc cctccaggaa 120

<210> 191

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 191

aatgggagct gctggggtgc aggagaggag aactgccaga aactgaccaa aatcatctgt 60

gcccagcagt gctccgggcg ctgccgtggc aagtccccca gtgactgctg ccacaaccag 120

<210> 192

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 192

gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt gactccttca 60

cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta aaggaaatca 120

<210> 193

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 193

tttctcttgc agtcgtcagc ctgaacataa catccttggg attacgctcc ctcaaggaga 60

taagtgatgg agatgtgata atttcaggaa acaaaaattt gtgctatgca aatacaataa 120

<210> 194

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 194

actctgagtg catacagtgc cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca 60

caggacgggg accagacaac tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg 120

<210> 195

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 195

gccagcgtgg acaaccccca cgtgtgccgc ctgctgggca tctgcctcac ctccaccgtg 60

cagctcatca cgcagctcat gcccttcggc tgcctcctgg actatgtccg ggaacacaaa 120

Claims (10)

1.用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间，其中所述捕获探针为SEQ ID NO:1-132所示的132条探针的混合物。

2.用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间，其中所述捕获探针为SEQ ID NO:1-174所示的174条探针的混合物。

3.用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的捕获探针，所述捕获探针为多条探针的混合物；所述多条探针能覆盖全部目标区域；所述多条探针之间存在重叠区，使得所有目标区域均被两条以上探针覆盖；所述多条探针的长度均为90-130bp；所述多条探针的Tm值在65-75℃之间，其中所述捕获探针为SEQ ID NO:1-195所示的195条探针的混合物。

4.权利要求1-3任一项的捕获探针，其中混合物中包含的探针按相同比例混合在一起。

5.权利要求1-3任一项的捕获探针，其中每条探针均具有生物素标记。

6.权利要求4的捕获探针，其中每条探针均具有生物素标记。

7.人循环肿瘤DNA EGFR基因变异检测试剂盒，其中包含权利要求1-6任一项的捕获探针。

8.权利要求7的试剂盒，所述试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阳性对照和阴性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。

9.权利要求7的试剂盒，所述试剂盒进一步包含末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、阳性对照和阴性对照、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠。

10.权利要求1-6任一项的捕获探针在制备用于人循环肿瘤DNA EGFR基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。