CN108018353B - 一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组及试剂盒 - Google Patents
一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组，具体由以下引物组成：1）扩增覆盖检测APC基因全外显子序列突变位点的58对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：001‑116所示；2）扩增覆盖检测CTNNB1基因全外显子序列突变位点的20对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：117‑156所示；3）扩增覆盖检测B‑raf基因全外显子序列突变位点的27对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：157‑210所示；4）扩增覆盖检测K‑ras基因全外显子序列突变位点的7对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：211‑224所示。本发明可以完整扩增四个基因全外显子，覆盖待检测的所有突变位点，保证了筛查检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查的引物组及试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床最常见的恶性肿瘤之一。我国每年结直肠癌新发病例超过25万，死亡病例约14万，新发和死亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的20％。然而目前我国结直肠癌的早期诊断率却非常低，相对于欧美国家来说，我国仍需大力普及结直肠癌早期筛查，提高我国结直肠癌早期诊断率、降低结直肠癌相关死亡率。
散发性结肠腺瘤被公认为癌前病变，恶变风险与息肉的大小、绒毛形态和外观等相关。因而，针对一般人群进行结直肠息肉和癌症常规筛查是可靠的措施，过去主要应用大便潜血试验检测，目前配合使用乙状结肠镜和结肠镜检查进行直观检查。这些检查手段都可以降低癌症的发病率和死亡率。然而，这些检测手段都存在着明显的不足，例如作为金标准的肠镜检查，其检出率虽高但不易为患者所接受，并且其检测要求严格，容易受到各种因素的影响；而潜血试验可以避免肠镜检查的有创伤害，容易被患者接受，但其假阳性检出率高，容易造成结果误诊，因而需要寻求更高效简便并且容易被患者所接受的检测方法。
众多研究发现，结直肠癌的发生发展与基因突变密切关联，多基因突变位点已证实与结直肠癌的高度相关性，例如APC、K-ras基因等。通过检测这些基因的热点突变，可以预测结直肠癌的发生发展，也可以筛查出结直肠癌的高危人群。与此同时，粪便游离DNA被发现可用来进行基因检测，尤其是结直肠癌的检测，其结果稳定高效，并且取材方便。相对于传统的结直肠癌筛查方法，基于粪便游离DNA进行的热点突变基因检测，不仅操作简单，减少了各种误差因素，提高了检测稳定性，而且利用粪便作为样本，取材方便，更易于为患者接受。
基于这些，国内已有厂家研究出结直肠癌基因突变测序检测试剂盒，只要检测到任一相应的基因存在一处或以上热点突变，即可诊断该患者为结直肠癌高风险人群。但这些检测试剂盒大多只是针对1或2个热点突变基因位点进行检测，检测序列仅限于基因局部序列，而目前已发现有多个热点突变基因与结直肠癌的发生发展密切关联，因而这些检测极容易造成检测假阴性的比例偏高，影响结果判断。
因此，本发明提供一种更高效全面的筛查检测试剂盒，采用粪便游离DNA作为检测样本，囊括与结直肠癌发生发展高度相关的4个热点突变基因APC、CTNNB1、B-raf和K-ras基因，对4个基因的全外显子序列进行二代测序检测。所涉及的热点突变位点包括覆盖4个基因目前所有的已知的55处热点突变，将测序结果和4个基因的野生型序列比对，只要检测到任一热点突变，即可诊断为结直肠癌高风险患者。
发明内容
本发明提供一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查的试剂盒和引物组，具体的为一组联合检测人类APC、CTNNB1、B-raf和K-ras基因全外显子序列突变位点的引物，并采用多重聚合酶链式反应技术结合二代测序进行检测。利用该试剂盒和引物可以准确检测四个基因的所有热点突变的情况，用于结直肠癌早期诊断筛查。
本发明的目的在于提供检测APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全外显子序列所有热点突变的引物，该组引物分为A、B组，可避免因扩增产物在基因组位置出现重叠交叉而导致的扩增子覆盖不完全的问题，引物对总共包括：扩增覆盖检测四个基因的全外显子突变的112对正、反向引物，其核苷酸序列为：
(1)扩增覆盖检测APC基因全外显子序列突变位点的58对正、反向引物，A组引物包括SEQ ID NO：001～058，B组引物包括SEQ ID NO：059～116，其核苷酸序列为：
(2)扩增覆盖检测CTNNB1基因全外显子序列突变位点的20对正、反向引物，A组引物包括SEQ ID NO：117～136，B组引物包括SEQ ID NO：137～156，其核苷酸序列为：
(3)扩增覆盖检测B-raf基因全外显子序列突变位点的27对正、反向引物，A组引物包括SEQ ID NO：157～184，B组引物包括SEQ ID NO：185～210，其核苷酸序列为：
(4)扩增覆盖检测K-ras基因全外显子序列突变位点的7对正、反向引物，A组引物包括SEQ ID NO：211～216，B组引物包括SEQ ID NO：217～224，其核苷酸序列为：
在检测中，用A、B组正、反向引物分别对覆盖APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全部外显子的DNA片段进行扩增，四个基因在同一个反应体系进行扩增得到A、B两组扩增产物，将获得的A、B两组扩增产物混合并连接上测序接头得到测序文库，对文库进行测序，获得扩增产物的基因序列。
本发明的目的还在于提供一种检测APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全外显子热点突变的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样本DNA，具体的为粪便样本DNA；
(2)利用SEQ ID NO:001-224所示的APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因对应的正反向扩增引物，对(1)中的DNA进行扩增，获得覆盖检测APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全外显子突变的A、B两组扩增产物；
(3)将(2)中的A、B两组扩增产物混合并连接上测序接头和Barcode得到测序文库；
(4)对(3)中的文库分别进行正、反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(5)将(4)中的基因序列与野生型APC、CTNNB1、B-raf和K-ras基因序列进行比较，对已确定的热点突变位点进行检测，确定是否发生突变，同时检测是否有新突变出现。若有任一基因任一位点发生突变，则可判定为结直肠癌；若无突变或出现新的突变，则为正常或有待进一步检测。
与其他结直肠癌筛查检测试剂盒相比，本试剂盒的创新点在于设计提供了一套引物组，该引物组由A、B两组引物构成，可以全面检测目前已知的与结直肠癌发生发展密切关联的55处热点突变，极大地降低了检测假阴性的比例，提高了检测的准确性和全面性。同时，该套引物组针对4个基因的全外显子序列设计，A、B两组引物所扩增区域相互交叉重叠，可以完整覆盖扩增全外显子序列，相较于其他检测试剂盒而言，本技术在保证已知的55处热点突变的基础上，更有利于发现新的热点突变。
本技术的难点在于该套引物组的设计复杂，引物组需完整扩增全外显子序列，而外显子序列长度较长并且基于聚合酶链式反应本身的限制，每个扩增产物的长度不能过长以及引物之间会相互影响降低扩增效率，因而在设计引物时既要保证扩增产物长度合理性以及降低引物之间的影响作用也要保证全外显子序列的完整扩增，相较于其他针对1或2个热点突变检测的试剂盒提供的引物，本引物组设计相对更复杂。
综合，所设计的扩增全外显子区域的引物组以及基于该套引物组所开发的筛查试剂盒，可以极大降低假阴性检测比例，提高检测结果的准确性；同时，多热点突变检测，进一步提高了检测的全面性，因而本试剂盒有望成为结直肠癌早期检测筛查的一种无创、高准确性、高特异性的诊断检测手段。
本发明设计提供了一组扩增覆盖APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全外显子序列的引物，分为A、B两组共112条引物，并设计了一种基于该套引物组的早筛检测试剂盒。该套引物组可以完整覆盖扩增全外显子，针对的热点突变位点囊括与结直肠癌密切相关的所有已知的55处热点突变，相比市场上已有的检测试剂盒，覆盖检测位点的全面性，极大地降低了现有检测试剂盒出现假阴性结果的比例，使检测结果更可靠准确。基于本套引物组设计的筛查试剂盒，采用多重聚合酶链式反应结合二代测序技术进行检测，保证了检测过程的高效、特异和准确性，确保了结直肠癌的检出率和筛查效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1检测APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因外显子突变的引物序列
(1)检测APC、CTNNB1、B-raf、K-ras基因全外显子突变位点的A组引物
APC、CTNNB1、B-raf、K-ras基因全外显子突变位点的A组引物，分别如下：
SEQ ID NO：001-058所示的序列，为扩增覆盖APC基因全外显子突变位点的正、反向引物；
SEQ ID NO：117-136所示的序列，为扩增覆盖CTNNB1基因全外显子突变位点的正、反向引物；
SEQ ID NO：157-184所示的序列，为扩增覆盖B-raf基因全外显子突变位点的正、反向引物；
SEQ ID NO：211-216所示的序列，为扩增覆盖K-ras基因全外显子突变位点的正、反向引物。
在检测中，先利用上述A组正、反向扩增引物在同一反应体系中对覆盖检测APC、CTNNB1、B-raf、K-ras基因全外显子的DNA片段进行扩增，获得A组扩增产物，然后和B组扩增产物混合，再引入测序接头和Barcode得到扩增产物文库，对文库进行正、反向测序，获得扩增产物的基因序列。
(2)检测APC、CTNNB1、B-raf、K-ras基因全外显子突变位点的B组引物
APC、CTNNB1、B-raf、K-ras基因全外显子突变位点的B组引物，分别如下：
SEQ ID NO：059-116所示的序列，为扩增覆盖APC基因全外显子突变位点的正、反向引物；
SEQ ID NO：137-156所示的序列，为扩增覆盖CTNNB1基因全外显子突变位点的正、反向引物；
SEQ ID NO：185-210所示的序列，为扩增覆盖B-raf基因全外显子突变位点的正、反向引物；
SEQ ID NO：217-224所示的序列，为扩增覆盖K-ras基因全外显子突变位点的正、反向引物。
在检测中，先利用上述B组正、反向扩增引物在同一反应体系中对覆盖检测APC、CTNNB1、B-raf、K-ras基因全外显子的DNA片段进行扩增，获得B组扩增产物，然后和A组扩增产物混合，再引入测序接头和Barcode得到扩增产物文库，对文库进行正、反向测序，获得扩增产物的基因序列。
实施例2检测APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全外显子热点突变的方法
(1)抽提粪便中的基因组DNA
1)取200mg的粪便于试管中(若粪便样本为液态，取200μL于试管中)，加入2mL PBS充分振荡混匀，3000g离心5分钟，收集上清；取收集的上清液1mL于1.5mL离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清后沉淀用1mL PBS重悬，振荡混匀后，12000rpm离心5分钟，收集沉淀。
2)加入200μL 1％SDS，悬浮沉淀，37℃放置30分钟。
3)加入200μL蛋白酶K，20μL消化液，充分振荡混匀，56℃水浴10分钟。
4)加入600μL 15％乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA的提取与后续实验。
5)将吸附柱放入收集管内，取上述溶液600μL转入吸附柱内，静置2分钟，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。
6)将剩余400μL液体转入上述吸附柱内，重复操作步骤7。
7)将吸附柱放回收集管内，加500μL 30％乙醇至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。
8)将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液。
9)取出吸附柱，放入新的1.5mL离心管内，加入30-100μL洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
(2)多重实时荧光聚合酶链式反应PCR扩增全外显子序列
1)采用
dsDNA HS Assay Kit对基因组进行定量。
2)PCR扩增，反应体系如下：
扩增设置：
3)PCR产物纯化：
将2-50μl PCR产物加到1.5ml EP管中，加入400μl Lysis-Binding Buffer；加入10μl磁珠，在旋涡振荡器上混匀20-30s，然后在室温放置5-10min；放在磁架上1-2min待液体变清，吸弃上清；加入400μl Wash Buffer W1，放在旋涡振荡器上混匀10s，再放在磁架上吸附1-2min，吸弃上清，重复一次；加入500μl Wash Buffer W2，放在旋涡振荡器上混匀10s，再放在磁架上吸附1-2min，吸弃上清，重复一次；开盖，在室温下孵育10min；加入50μlElution Buffer，在旋涡振荡器上混匀20s，室温孵育10min，放在磁架上吸附1-2min，吸取上清于新的EP管。
4)引入测序接头和Barcode：
反应体系如下：
扩增程序如下：
5)PCR产物纯化：
将2-50μl PCR产物加到1.5ml EP管中，加入400μl Lysis-Binding Buffer；加入10μl磁珠，在旋涡振荡器上混匀20-30s，然后在室温放置5-10min；放在磁架上1-2min待液体变清，吸弃上清；加入400μl Wash Buffer W1，放在旋涡振荡器上混匀10s，再放在磁架上吸附1-2min，吸弃上清，重复一次；加入500μl Wash Buffer W2，放在旋涡振荡器上混匀10s，再放在磁架上吸附1-2min，吸弃上清，重复一次；开盖，在室温下孵育10min；加入50μlElution Buffer，在旋涡振荡器上混匀20s，室温孵育10min，放在磁架上吸附1-2min，吸取上清于新的EP管。
(3)高通量测序NGS：
测序体系如下：
| 试剂名称 | 用量 |
| DNA | 15ul |
| 测序引物 | 12ul |
| 测序酶混合液 | 3ul |
| 30ul |
在测序仪Ion PGMTM上测序。
(4)结果判断：将测序所得的基因序列使用相应的分析软件插件进行分析，根据分析结果得到的实际突变情况进行报告。
实施例3采用本发明设置的引物和方法检测临床样本
取医院临床粪便样本6份，6份样本都不确定是否为结直肠癌患者，检测该6份样本是否存在APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因外显子突变。按实施例2所述方法提取基因组DNA，配制试剂并检测。每份样本经测序后，与野生型基因组序列比对已知的55处热点突变情况，最后根据测序结果初步判断患者是否存在所述四个基因新的突变以及其是否为结直肠癌患者。
检测结果如下表所示：
| 样品编号 | 测序结果 | 是否结直肠癌患者 |
| 1 | 无突变 | 否 |
| 2 | 无突变 | 否 |
| 3 | K-ras G12D | 是 |
| 4 | 无突变 | 否 |
| 5 | K-ras G13D | 是 |
| 6 | 无突变 | 否 |
样品3的测序结果分析，显示位于染色体Chr12:25398284处发生错义突变：C>T，即K-ras基因G12D突变，提示患者为结直肠癌患者；
样品5的测序结果分析，显示位于染色体Chr12:25398281处发生错义突变：G>A，即K-ras基因G13D突变，提示患者为结直肠癌患者；
样品1的测序结果分析，显示4个基因均未检测到热点突变，提示患者为非结直肠癌患者；
样品2、4、6的测序结果分析同样品1，均未检测到热点突变，提示患者为非结直肠癌患者。
本例试验中6例样本的检测结果与实际诊断结果吻合，说明利用本发明的引物和检测方法可有效检测四个基因的外显子突变，用于结直肠癌早期筛查检测是可行的。本发明所述引物可以准确的扩展出APC、CTNNB1、B-raf和K-ras四个基因全外显子序列，所述检测方法可以准确检测四个基因55处热点突变情况。本发明检测方法操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，可有望应用于结直肠癌的临床早期筛查。
序列表
<110> 泰州达安达瑞医学检验有限公司
<120> 一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组及试剂盒
<160> 224
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
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tcttgcccat ctttcattct gtgaa 25
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<213> 人工序列(Unknown)
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acttatcctg tttatactga gagcactga 29
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<213> 人工序列(Unknown)
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gtctctcttc ttcttcatgc tgttct 26
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agcagtaaaa ccgaacatat gtcttca 27
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<213> 人工序列(Unknown)
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<213> 人工序列(Unknown)
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<213> 人工序列(Unknown)
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<213> 人工序列(Unknown)
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gcgagaagta cctaaaaata aagcacc 27
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gctctgattc tgtttcattc ccattg 26
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ggatgatatg ccacgggtgt at 22
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catgttctga atctggtctc tgtatatctt 30
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attccatcct ttccctgaaa tcagg 25
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attgaaggca tgtttgcttg aagg 24
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ggatgatgtc cttggaagtt gaga 24
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tgagtctgcc tccaaaggac taa 23
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ccagcaaagc gccatgatat tg 22
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gctgctatgt tccctgagac at 22
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gcagactaaa aagctagcta tgtcattg 28
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tggtggttaa taaggctgca gtt 23
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ttttagcttc aagcattctg acatgtttt 29
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tttttcttct tcccagttca ccagt 25
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caatgctcca tgaaaaccac ataaagaata 30
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acctcctaag gctagaacag atatttagg 29
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tcctatggag ataaaaacag atggtcagta 30
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ctgccaagtg ggtggtatag ag 22
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ctgcaacaaa ggtaaattct actttgacaa 30
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ctttacagag gagaatgccc tgtt 24
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gtaaccctat tatggtccct aattttctga 30
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accaaagcct ttagcagatg tgt 23
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gtgttttgag aggaaagaac aagctg 26
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ggtgtgcctg tctgatggaa at 22
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ccatatccac cagagtgaaa agaacg 26
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ggttccctaa gggattaggt atttcatc 28
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ccagagtcca ggtaagactg ttg 23
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ctgaaagtca gaatgcagtt ttgagaac 28
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caaactgtgt agatgggatc tgcat 25
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tatcaagatg atgcagaact tgcca 25
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gtctggaagc ttccttttta gaaagc 26
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tgtacgtacc atgcagaata caaatgat 28
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tgtggagagt tgtaatggca taaaaca 27
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ataggttggt aatatggctc ttctcaga 28
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ttagaactgc agatgctata cacaagac 28
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gagtaaactg gtgccatggg aa 22
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gtcaccagcc cgaaggacag ta 22
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tggatttatg cattcctttt agatagcca 29
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gggcttgcca tgttttagct tt 22
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gttggagtta cttgttcctt ttgtaatctg 30
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attttgttga caccctgact cttctag 27
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ccaaactggc tttttaaaac ttcttaccta 30
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attttccttt tgttgctact ctcctga 27
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gcttattgtg ttttcaatga gtgtgaagta 30
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ccttcaatga ctttctagta actcagca 28
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cttacctaaa ctcttcataa tgcttgctct 30
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attatttacc agccattagt tagcatcctt 30
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agttacaagc cttcaaaaat gaagtagga 29
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gcgaacagtg aatatttcct ttgatga 27
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cgtctccttc aaaatccatt ccaattc 27
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acattggaaa ggtttctaat taaccagga 29
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gaagcttctg ggttttgcac aa 22
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tcctaaagta cactttcaat tccctaggt 29
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aaaaatgtaa tttgctccct ttacctctt 29
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gtgccacatc tgtgggattt tg 22
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aaagtccgga ttgaatataa gtctgcttta 30
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gcagttactg tgatgtagtt gtctatgtta 30
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cactcacctc ctccggaatg 20
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agctctccgc ctccctt 17
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cacccagatt ttcattcttc tttctgtttt 30
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actggagcct tgtatataga cggt 24
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gcattgctct aggaattata gtaggttgtt 30
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gctgtggtat cctgctctcc ta 22
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tagatttcga ggccagagtc ctt 23
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gtttgtcgac atttaatgtt tactgtcaca 30
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gagtaaatct gtaaagctaa tagttgctac ca 32
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tgacacttgg agtaacaatt gcct 24
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attacatttg gctgtgactt ctaagaagaa 30
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cctgataaat taacatactt gctcctcctt 30
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gtcatcagag agaaaccaga agct 24
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caacgagacc gatcctcatc ag 22
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caaattgatt tcgatgatct tcatctgct 29
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gcagctttgg cagtattgga tttttaaatt 30
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ctgtatagct gaaccagcat tacaattt 28
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<211> 28
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ataaatttca ccagcgttgt agtacaga 28
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<400> 203
actgatttca actcaggtaa aatgtcagt 29
<210> 204
<211> 26
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aggtgtaata accaagaaag gcttgt 26
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<211> 24
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tcctgtatga catggatgcc tcta 24
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gcctttcagt gctaccttca tctc 24
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ggcaaagcta attctctctt cccaa 25
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aggccctatt ggacaaattt ggt 23
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<211> 24
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ccgcctcttt ccaaaataaa cacc 24
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<211> 22
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ccggctctcg gttataagat gg 22
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<211> 30
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acaaaaatta ccacttgtac tagtatgcct 30
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acacatgaag ccatcgtata tattcacatt 30
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aattttcaat gtagaaagaa accaaagcca 30
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ggacttagca agaagttatg gaattccttt 30
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aaaacaggga tattacctac ctcataaaca 30
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gatattctcg acacagcagg tcaa 24
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tctaaagtgg ttgccacctt gtt 23
<210> 218
<211> 22
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tgcacatggc tttcccagta aa 22
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tgttacttac ctgtcttgtc tttgctg 27
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gtaataatcc agactgtgtt tctccctt 28
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caaagaatgg tcctgcacca gta 23
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<213> 人工序列(Unknown)
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aggtactggt ggagtatttg atagtgtatt 30
Claims (2)
1.一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组，其特征在于，所述的引物组为检测人类APC、CTNNB1、B-raf和K-ras基因全外显子序列突变位点的特异性引物，具体由以下引物组成：
1）扩增覆盖检测APC基因全外显子序列突变位点的58对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：001-116所示；
2）扩增覆盖检测CTNNB1基因全外显子序列突变位点的20对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：117-156所示；
3）扩增覆盖检测B-raf基因全外显子序列突变位点的27对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：157-210所示；
4）扩增覆盖检测K-ras基因全外显子序列突变位点的7对正、反向引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO：211-224所示；
其中，
所述的扩增覆盖检测APC基因全外显子序列突变位点的58对正、反向引物组分为A、B两组，其中A组核苷酸序列如SEQ ID NO：001-058所示；B组核苷酸序列如SEQ ID NO：059-116所示；
所述的扩增覆盖检测CTNNB1基因全外显子序列突变位点的20对正、反向引物组分为A、B两组，其中A组核苷酸序列如SEQ ID NO：117-136所示；B组核苷酸序列如SEQ ID NO：137-156所示；
所述的扩增覆盖检测B-raf基因全外显子序列突变位点的27对正、反向引物组分为A、B两组，其中A组核苷酸序列如SEQ ID NO：157-184所示；B组核苷酸序列如SEQ ID NO：185-210所示；
所述的扩增覆盖检测K-ras基因全外显子序列突变位点的7对正、反向引物组分为A、B两组，其中A组核苷酸序列如SEQ ID NO：211-216所示；B组核苷酸序列如SEQ ID NO：217-224所示。
2.含有如权利要求1所述引物组的结直肠癌诊断试剂盒。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
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ID=62080453
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