CN111763732A - Braf基因全外显子二代测序多重pcr引物组合物、试剂及多重pcr-打断控制系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR‑打断控制系统。所述用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：36所示的引物。本发明提供的所述用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR‑打断控制系统，解决了以下现有的技术问题:1.现有技术主要检测BRAF基因的点突变，检测范围有限；2.实时荧光定量PCR检测、基因芯片只能检测已知位点；3.Sanger测序检验长度小于800bp的范围；4.不能检测低频突变；5.检测多个位点时操作繁琐、费用高。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统。
背景技术
BRAF（B-raf）基因编码是一种属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的蛋白质，是RAS/RAF/MEK/ ERK/ MAP信号传导通路中重要的转导因子，参与调控MAPKinse/ERK信号传导途径，从而影响诸如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，BRAF基因也是重要致癌基因之—，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌（CRC）、非小细胞肺癌（NSCLC）、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌以及毛细胞性白血病等，均检出不同比例的BRAF基因突变。
BRAF基因的转录本NM_001354609.1全长2342bp，有18个外显子，已知最常见的突变形式主要是外显子15上第1860位（编码序列的第1799位）及附近的不同形式的点突变，导致第600位缬氨酸V突变为其他种氨基酸（谷氨酸E、天冬氨酸D、赖氨酸K、甲硫氨酸M、丙氨酸A），对于其他位点的研究较少。
现有技术的BRAF基因突变检测多为针对BRAF基因的外显子15上第1860位点进行检测，存在以下局限性：
1.实时荧光定量PCR检测和基因芯片检测，不能检测未知位点；2.Sanger测序的检测位点局限在800bp以内；3.不能检测低频突变；4.涉及多个位点检测时，原有技术操作繁琐、费用高。
专利“一种基于下一代测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的多重PCR引物和方法及应用”，解决的是同时检测EGFR/KRAS /BRAF基因突变的问题，针对于BARF，仍然只检测了外显子15上第1860位（编码序列的第1799位）的突变。
发明内容
为解决现有技术的的BRAF基因突变检测多为针对BRAF基因的外显子15上第1860位点进行检测，存在多种局限性的技术问题，本发明提供一种解决上述问题的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统。
用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO：01~ SEQID NO：46所示的全部引物。
用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂包括上述的多重PCR引物组合物以及多重PCR-打断测序所需试剂。
引物组合物先用多重PCR扩增目的片段、凝胶电泳对PCR产物进行质控后，调整打断程序，将PCR产物打断至适合Ion Proton测序仪后，再进行后续实验。
用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统包括：
检测模块，采用上文所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂进行多重PCR-打断的二代测序；
显示模块，将检测结果转换为可视化数据，并将可视化的数据于显示设备进行展示；
分析模块：基于预设的质控程序对检测结果进行验证，并将验证结果于同一显示设备进行展示。
其中，运行所述检测模块包括以下步骤：
步骤一：多重PCR扩增目的片段；
步骤二：凝胶电泳，对PCR产物进行质控；
步骤三：将PCR产物打断至适合Ion Proton测序仪的程度；
步骤四：文库构件，包括PCR产物纯化、末端修复、接头连接、片段筛选、文库PCR扩增、文库扩增产物纯化；
步骤五：测定DNA产物浓度；
步骤六：将扩增子碱基数*给定的深度，按计算结果将样品混合后稀释到上机浓度；
步骤七：油包水扩增、末班序列富集；
步骤八：基于Ion Proton测序仪进行测序，获得检测结果。
所述显示模块将步骤八中的检测结果转化为包括“7号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”三项数据的图表。
所述分析模块直接以所述显示模块转化得到的图表为原始数据，与预设的数据进行对比，并向所述显示模块输出检测结果。
相较于现有技术，通过采用本发明提供的所述用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，基于二代测序的平台，利用靶向扩增技术进行多重PCR，打断仪将PCR产物打断至合适的片段长度，实现了对BRAF基因的全外显子二代测序，具有以下优点：1.能够100%覆盖BRAF基因的全外显子区域，能够全面、准确的检测待测样本BRAF基因的突变情况；2.能够检测出Sanger测序、实时荧光定量PCR、基因芯片所不能检测出的低频突变，具有较高的学术价值，能更好地服务于临床。
在本发明中，引物序列的选择和打断，均经过了大量的实验和设计优化，最终形成了现有的引物组合。通过先扩增出目的片段，再用打断仪将PCR产物打断至合适的片段长度，使其处于最适合于进行后续的Ion Proton测序仪的状态。
附图说明
图1是多重PCR‐打断法 BRAF 二代测序结果概图；
图2是多重PCR‐打断法 BRAF 二代测序结果细节图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：
用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO：01~ SEQ IDNO：36所示的全部引物。
将36条引物按照每管100p的标准稀释，取一个新的1.5ml离心管，将每种引物分别加入2ul，补水至总体积为200ul。维持引物的终浓度是1pmol，震荡混匀，-20℃保存备用。
用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂包括上述引物组合物及多重PCR-打断测序所需的试剂，具体的内容在以下用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断测序方法中说明。
用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统为采用上述的试剂对BRAF基因全外显子进行二代测序，包括以下步骤：
1、多重PCR扩增，包括：
1.1、提供PCR扩增体系：
加入引物组合物5ul，及缓冲液等其他试剂。
1.2、进行PCR扩增程序：
2、凝胶电泳。
3、PCR产物纯化：从50 ul PCR反应体系中加入90 ul Agencourt AMPure XPbeads，混匀，室温孵育5min；
置于磁力架上2min，弃上清；
加入150.0 ul 80%乙醇，静置30 s，弃上清；
加入150.0 ul 80%乙醇，静置30 s，弃上清；
室温放置10 min，待磁珠干燥；
加入27.0 ul ddH2O，重悬磁珠；
室温静置2 min，磁力架上放置2min；
转移25.0 ul上清至新的EP管/96孔板中。
4、打断程序：
5、打断产物纯化：以1.8X的磁珠比例（磁珠：产物=90:50）进行混合，置于磁力架上，待吸附磁珠后用80%乙醇进行清洗，待乙醇干燥后加入40ulH20进行洗脱。
6、末端修复，包括：
6.1、提供末端修复体系：
6.2、PCR反应：
6.3、纯化：按照1.8X比例纯化，用25ul TE洗脱。
7、接头连接，包括：
7.1、提供接头连接体系：
7.2、接头连接程序：
7.3、纯化：按照1.8X比例纯化，用50ul TE洗脱。
8、片段筛选：采用Beckman A63881 AMPure XP磁珠进行筛选。以1X（磁珠：样本=50:50）的比例混合，5min后取上清加入含10u磁珠的EP管中混合，5min后去上清，加入80%的酒精清洗，用20ul TE溶液洗脱。
另在0.9X的磁珠管中加入80%的酒精清洗，用20ulTE溶液洗脱。
9、文库PCR扩增，包括：
9.1、提供文库PCR扩增体系：
9.2、文库PCR扩增程序：
10、文库扩增产物纯化：以1.8X的磁珠比例（磁珠：产物=90:50）进行混合，置于磁力架上，待吸附磁珠后用80%乙醇进行清洗，待乙醇干燥后加入50ulH20进行洗脱。
11、Qubit浓度测定，包括：
11.1、配置Qubit Mix：
分装到Qubit管中，每管199ul，标准品每管分装190ul。
11.2、测定：
每管对应加入1ul DNA产物，标准品每管分别加入10ul standard1、standard2标准品。接通Qubit® Fluorometer电源，选择dsDNA→dsDNA High Sensitivity选项，按提示顺序加入S1、S2测定管及样品管，记录数据。
12、计算和文库混合：
根据公式
ng/ul=nmol/l*650*size/1000000
故：nmol/l=(1000000*ng/ul)/(650*size)
数据量为4133（扩增子碱基数）*200（给定的深度）=826600bp =0.8M。
按照计算结果依次将样品混合后稀释到25pmol/L的上机浓度。
13、油包水扩增，包括：
13.1、配置扩增溶液：
震荡混匀微离心后转移到反应器中。
13.2、扩增程序：
分别在回收管内加入150ul破乳液Ⅱ；
将反应器、回收管以及扩增板放到OT仪上，启动仪器；
待运行完成，离心10min后，保留约100ul溶液；
用移液器反复吹打剩余溶液，充分混匀，将两个收集管中的液体全部转移到新的1.5ml低吸附管中；
往每个收集管加入200ul无核酸酶水吹吸混匀，再次转移到上部的1.5ml低吸附管中，直到低吸附管中达到1ml；
低吸附管按照15，500g，离心8min。保留20ul溶液。再加入重悬液重悬。
14、末班序列富集，包括：
14.1、配制洗脱液：
| 试剂 | 体积（ul） |
| 吐温溶液 | 280 |
| 1M NaOH | 40 |
| 总体积 | 320 |
14.2、Beads洗涤：取100ul C1 磁珠，上磁力架静置2min, 弃上清；加1000ul清洗液混匀，上磁力架静置2min，弃上清；加入130ul C1磁珠捕获液混匀备用。
14.3、富集
按照如上表所示加入对应的溶液，运行ES仪。
14.4、ES下机处理：15500g离心5min；留10ul；加200ul NF水混匀，15500g离心5min；留10ul，加90ul NF水混匀，4℃保存。
15、上机，包括：
15.1、准备上机文库：在样本微珠溶液中加入质控、退火缓冲液和测序引物，混匀后进行退火。程序：95℃2min，37℃2min,20℃ hold。待程序完成后往样本中加入10ul 上样缓冲液，混匀离心。
15.2、配制上样试剂：
| 试剂 | 配比 |
| 50% AB | 500μl 退火缓冲液+500μl NF 水 |
| 冲洗液 | 500ul 退火缓冲液+500ul异丙 |
| 发泡液 | 49ul 50% AB + 1ul 发泡液 |
| 酶反应液 | 60ul 50% AB+6ul 测序聚合酶 |
15.3、上样：
取出芯片，往槽内加入55ul ISP样本，离心10min；
用100ul移液枪吹打空气至发泡液中，直到出现致密的小泡；
依次匀速加入发泡液，55ul50%退火缓冲液至芯片内，吸走溢出液体。重复两次；
加入100ul冲洗液两次；
加入100ul50% AB 3次，避免产生气泡，吸走另一孔排出的液体；
加入65ul酶反应液，孵育5min后安装到Thermo的Ion Proton测序仪的芯片槽中。
16、分析数据：
请同时参阅图1、图2，分别是多重PCR‐打断法BRAF二代测序结果概图和细节图。测序结果经过去除接头、重复序列、低质量序列等生物信息学处理后，利用igv软件打开，结果如图1、图2所示。
图中由上至下表示的信息均依次为：“7号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”，由图示可以直观的看出本款引物有效。
实施例2：
通过用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统，控制专用设备来实施实施例1中所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 长沙金域医学检验所有限公司
<120> BRAF基因全外显子二代测序多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统
<130> 0003
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtttacgta ggaaggcgct g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagcgcggg tggttagaag 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgaggaacac tggcagttac tgtg 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctaatcccac ctcctaaaat aatcaag 27
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtcaggaca aagtccggat tg 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggatgcct ctatttgcat gac 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttgtatctga cctagtaacc catttgac 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcctaaagta cactttcaat tccctagg 28
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tagcccctcg ataaccaatt ttc 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaactcagg taaaatgtca gttcc 25
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggggtggga aataaatatg tg 22
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgggagagaa atactgtcca ttcc 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tatgaagctt ctgggttttg cac 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaaagaaag cggttcaagt agc 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gatagttcct ggagggccta cttg 24
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cagagtgact gtataacctg gagtcag 27
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ataggtttac attggcaagt gcttc 25
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaagcaattg cagtttcctt gag 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgaattctgg accagccttt tc 22
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aacatacttg ctcctcctta atgtataca 29
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctcttcctg tatccctctc agg 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgaacagtga atatttcctt tgatg 25
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctatcagcca taccatataa cattgc 26
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggagttagg gctatgataa ttagtg 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acctctcttg cttagctcaa tcactg 26
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgacagacta ctttggttct cttttg 26
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgttctgtag atttcgaggc cag 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaccaaaagc aggctgtggt atc 23
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cttacctaaa ctcttcataa tgcttgc 27
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctttctagta actcagcagc atctcag 27
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctggcaatga tggtattttc tgc 23
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcttctaatt gtgcgatggt caag 24
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggtttcccac catctatgat gtg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttctaggtgt gccactgctc aac 23
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gatttatacc acccagattt tcattc 26
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccacacaagt gttctttggt tcac 24
Claims (7)
1.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：包括SEQID NO：01至 SEQ ID NO：36所示的引物。
2.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂，其特征在于：包括权利要求1所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物及打断、二代测序所需试剂。
3.根据权利要求1或2所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：
所述多重PCR引物组合物通过如下处理方法获得：
先用多重PCR扩增目的片段、凝胶电泳对PCR产物进行质控后，调整打断程序，将PCR产物打断至适合测序仪后，再进行后续实验。
4.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统，其特征在于，包括：
检测模块，采用权利要求2所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂进行多重PCR-打断的二代测序；
显示模块，将检测结果转换为可视化数据，并将可视化的数据于显示设备进行展示；
分析模块：基于预设的质控程序对检测结果进行验证，并将验证结果于同一显示设备进行展示。
5.根据权利要求4所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统，其特征在于：
运行所述检测模块，包括以下步骤：
步骤一：多重PCR扩增目的片段；
步骤二：凝胶电泳，对PCR产物进行质控；
步骤三：将PCR产物打断至适合测序仪的程度；
步骤四：文库构件，包括PCR产物纯化、末端修复、接头连接、片段筛选、文库PCR扩增、文库扩增产物纯化；
步骤五：测定DNA产物浓度；
步骤六：将扩增子碱基数*给定的深度，按计算结果将样品混合后稀释到上机浓度；
步骤七：油包水扩增、末班序列富集；
步骤八：置于序仪进行测序，获得检测结果。
6.根据权利要求5所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统，其特征在于：
所述显示模块将步骤八中的检测结果转化为包括“7号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”三项数据的图表。
7.根据权利要求6所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统，其特征在于：
所述分析模块直接以所述显示模块转化得到的图表为原始数据，与预设的数据进行对比，并向所述显示模块输出检测结果。
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| CN105695606A (zh) * | 2016-04-07 | 2016-06-22 | 昆明理工大学 | 用于非治疗目的的肥厚型心肌病相关致病基因突变的筛查方法 |
| CN107447258A (zh) * | 2016-06-01 | 2017-12-08 | 大连医科大学 | 循环肿瘤dna靶向基因高通量检测文库及其检测方法和应用 |
| CN108018353A (zh) * | 2017-11-08 | 2018-05-11 | 泰州达安达瑞医学检验有限公司 | 一种基于4个基因的结直肠癌早期筛查引物组及试剂盒 |
-
2019
- 2019-04-01 CN CN201910257077.XA patent/CN111763732A/zh active Pending
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| CN107447258A (zh) * | 2016-06-01 | 2017-12-08 | 大连医科大学 | 循环肿瘤dna靶向基因高通量检测文库及其检测方法和应用 |
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