CN114085895B

CN114085895B - 快速检测msi的检测引物及其试剂盒

Info

Publication number: CN114085895B
Application number: CN202111448969.1A
Authority: CN
Inventors: 洪专; 潘文健
Original assignee: Prius New Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Prius New Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114085895A

Abstract

本发明涉及一种快速检测MSI的检测引物，包括分别检测30个微卫星位点的正向捕获引物和反向捕获引物；所述正向捕获引物由5’端的测序文库read1的公共序列和3’端的特异性正向引物序列组成，所述反向捕获引物由5’端的测序文库read2的公共序列、8个碱基的随机序列和3’端的特异性反向引物序列组成。本发明的快速检测MSI的检测引物及其试剂盒快速，高灵敏，减少误差，降低干扰。

Description

快速检测MSI的检测引物及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

微卫星是一种短的、重复的DNA序列，由重复的单核苷酸、二核苷酸或多核苷酸序列位点组成。微卫星不稳定性(MSI)是一种微卫星长度体细胞多态性的遗传现象，是由细胞分裂中DNA复制过程中DNA片段未校正的“滑移”引起的。这些区域在DNA复制过程中容易发生碱基对错配，但可以通过错配修复(MMR)蛋白来防止这些错误。MSI肿瘤可能是由一个或多个基因的种系突变失活引起的，包括MutL同源物1、结肠癌、非息肉病2型(大肠杆菌)(MLH1)、错配修复蛋白、MutS同源蛋白(MSH2)、错配修复内切酶PMS2(PMS2)和上皮细胞粘附分子(EPCAM)微卫星不稳定是由功能性MMR蛋白的缺失引起的。在几乎所有Lynch综合征患者和高达15％-20％的散发性结直肠癌中存在微卫星不稳定。MSI存在三种。分别为稳定型、高度不稳定型(MSI-H)或低(MSI-L)水平不稳定型。MSI-H定义为30％-40％检测位点存在不稳定性，MSI-L定义为低于30％的位点不稳定性，不存在不稳定位点的肿瘤被定义为微卫星稳定(MSS)。临床上，MSI-L肿瘤的行为方式与MSS肿瘤相似。结直肠肿瘤组织中MSI-H的存在提示MMR蛋白缺乏。MSI-H肿瘤对基于5-氟尿嘧啶的化疗反应较差。MSI阳性肿瘤患者更适合免疫增强治疗，在结直肠癌中对PD-1抑制剂派姆单抗更为敏感。

传统的MSI检测通常使用基于荧光多重PCR的方法，扩增的PCR产物在自动毛细管电泳分析仪上运行，然后使用genmeker分析软件对生成的片段进行分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有快速，高灵敏，减少误差，降低干扰的检测下线低的快速检测MSI的检测引物，以及试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种快速检测MSI的检测引物，包括分别检测30个微卫星位点的正向捕获引物和反向捕获引物；所述正向捕获引物由5’端的测序文库read1的公共序列和3’端的特异性正向引物序列组成，所述反向捕获引物由5’端的测序文库read2的公共序列、8个碱基的随机序列和3’端的特异性反向引物序列组成。

检测30个微卫星位点的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～30所示；检测30个微卫星位点的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.31～60所示。

上述正向捕获引物和反向捕获引物的使用浓度为10nM。

上述快速检测MSI的检测引物还包括正向通用引物和反向通用引物，正向通用引物的3’端连接有测序文库read1的公共序列，反向通用引物的3’端连接有测序文库read2的公共序列。

上述正向通用引物和反向通用引物的使用浓度为20uM。

本发明为解决上述技术问题还提出的一种技术方案是：一种采用上述检测引物的快速检测MSI的试剂盒。

本发明具有积极的效果：

(1)本发明的快速检测MSI的试剂盒所用于捕获特定区域的引物由本公司技术人员自行设计，不同于传统引物；一共30个MSI位点，均匀分布于整个基因组，采用30个位点评估样本微卫星不稳定，比传统的5个位点，结果更加稳定。

(2)本发明的快速检测MSI的试剂盒建库步骤只需一步PCR反应，省去了传统的片段化、加A、连接、捕获、多步扩增过程中对微量血浆DNA的损失，大大提高了血浆DNA的利用率。

(3)本发明的快速检测MSI的试剂盒快速检测MSI的试剂盒建库步骤只需一步PCR反应，省去了传统的片段化、加A、连接、捕获、多步扩增过程中，更加方便简洁，大大节省了人力和试剂成本。

(4)本发明的快速检测MSI的试剂盒建库步骤只需一步PCR反应，省去了传统的片段化、加A、连接、捕获、多步扩增过程中，更加快速，大大节省了检测过程的时间，更有利于临床的应用。

(5)本发明的快速检测MSI的试剂盒文库加入单分子标签(UMI)，在UMI处理过程中，实验过程中引入的假阳性突变被去除，提高检测灵敏度，降低检测下线，使得后续生物信息学分析过程中，低频突变可准确检出。其UMI加在特异性引物的反向引物R5的5’端，共8个碱基序列，相比于传统的的UMI加在文库的两端，简化了文库建构，使其后的数据分析更加的简单。

(6)本发明的快速检测MSI的试剂盒文库加入单分子标签(UMI)，大大的提高检测的灵敏度，减少了数据背景的干扰，降低检测的下限，对MSI的评估更加的精准。

附图说明

图1是本发明实施例的建库及分析流程示意图；

图2是本发明实施例样本测序MSI-11位点的数据图；

图3是本发明实施例样本测序MSI-1位点的数据图；

图4是本发明实施例样本测序MSI-12位点的数据图；

图5是本发明实施例样本测序MSI-13位点的数据图；

图6是本发明实施例样本测序MSI-14位点的数据图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

主要试剂：

本专利内容涉及所有实验所用试剂耗材均从正规试剂耗材生产厂商购买，用到主要试剂有(少数通用常规试剂不再列举)：QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)、Qubit^TM dsDNA HS Assay Kit(Q32854)、TaKaRa Taq Hot StartVersion(R007A)、Agencourt AMPure XP Reagent(BECKMAN A63880)、LibraryQuantification Kit(Illumina/Universal)(KAPA KK4824)等。

主要仪器：

DynaMag-2 Magnet 12321D磁力架(ThermoFisher 12321D)、漩涡震荡仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)、生物安全柜、水浴锅、移液枪、Agilent 2100生物分析仪(安捷伦)、NovaSeq6000(illumina)等。

实施例

一、试剂盒的组成

本实施例的用游离DNA检测肺癌基因的试剂盒包括分别用于检测30个微卫星位点的正向捕获引物和反向捕获引物。

本实施例中涉及的引物和质粒的设计均有普瑞斯新(上海)生物医疗科技有限公司实验室技术人员自行设计，合成单位是南京金斯瑞生物科技有限公司完成，引物的核苷酸序列如表1所示。

表1引物序列特征表

引物结构如下：

正向捕获引物F7的结构：

ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG(illumina测序文库read1的公共序列)+特异性正向引物序列。

反向捕获引物R5的结构：

TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(illumina测序文库read2的公共序列)+NNNNNNN(UMI)+特异性反向引物序列。

反向引物R5中的N代表随机的四种单核苷酸(A、T、C、G)，连续八个单核苷酸序列可随机产4⁸＝65536种随机引物，以P7和P5序列来自于Illumina公司测序的公共测序序列。

特异性正反向引物的5’端带有illumina测序文库的部分公共序列，用于文库的放大和测序。文库UMI位于特异性引物的反向引物R5的5’端，连接部分illumina测序文库的read2序列；文库捕获的正向引物F7的5’端,连接部分illumina测序文库的read1序列。

正向通用引物P7(illumina官方序列)：

GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC+[i7]+ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。

反向通用引物P5(illumina官方序列)：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC+[i5]+ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。

其中[i7]和[i5]分别代表文库P7、P5端用于识别不同样本的可变序列结构。

二、试剂盒的使用方法

本实施例的快速检测MSI的试剂盒采用已知鉴定具有已知MSI-H和MSI-L(癌旁组织加癌症组织)作为测试实施例,测试整个多重PCR引物和实验方案，最终用数据处理软件评估实施例的MSI水平。试剂盒的使用方法如下：

1.样本抽提

血浆抽提使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)试剂盒进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的产品说明。

2.DNA(cfDNA)浓度测定

1)取3支定量管，向其中加入1ul Qubit dsDNA HS Reagent，其中1管加入199ulQubit dsDNA HS buffer，其中剩下管加入189ul Qubit dsDNA HS buffer漩涡混匀，作为标准品定量管；

2)分别向两支标准品定量管中，加入10ul的标准品1和标准品2，再向另一样品管中加入1ul的cfDNA，吹打混匀；

3)所有管在室温避光孵育2分钟；

4)选择3.0仪的，dsDNA High Sensitivity分析模式，先分别测定两标准品的荧光值；

5)将样本管放入定量仪，定量样本，记录样本浓度。

6)取1ul cfDNA核酸溶液用Agilent 2100生物分析仪质控，观察样本核酸降解情况。

3.引物混合液的准备

将所有合成的F7和R5引物混合液用1×TE溶解稀释到100uM，每管引物取1ul加入到一新的EP管中，再补入11ul 1×TE，振荡混匀，得到单条引物浓度为1uM的引物混合液panel1(P1)，将取1ul的P1加入99ul的1×TE中，振荡混匀，得到10nM的P1工作液；将P7和P5引物序列用1×TE溶解稀释到100uM，取10ul加入到40ul的1×TE中，得到20uM的P7和P5工作液。

4.一步式建库

1)取一个PCR反应管，加入表2所示成分，混匀。

表2建库反应体系组分表

在MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)反应28各循环。

表3为qPCR的反应程序

说明：一步式建库，PCR共分两部分，第一部分退火和延伸65℃，2min，此阶段，体系中含量极少特异性引物发生特异性捕获反应；第二部分退火60℃，30s，特异性引物消耗完，通用引物P7&P5继而反应形成完整文库。

2)文库纯化回收

a)将50μl的产物加入50ul dH₂O，体积调整到100ul；

b)向EP管中加入80ul AMPure XP Beads吹打7-8次混匀，静置5min；

c)将EP管至于磁力架上10min，至磁珠分离，弃溶液；

d)加入200μl新鲜配制的80％乙醇，弃液体，晾干；

e)重复上一步操作；

f)晾干后，50μl去离子水洗脱磁珠，静置5min，置于磁力架，待磁珠分离；

g)回收纯化后的文库。

3)文库质控

使用Agilent 2100生物分析仪质控，并3.0仪定量文库浓度。

4)上机测序

上机测序参照NovaSeq6000(illumina)标准上机流程。

5)下机数据预处理

下机原始数据质控保留测序质量达到Q30的序列，使用Trimmomaitic对原始数据进行处理，根据单分子标签(UMI)进行聚类分析，每一小类单分子标签数据纯度在90％的数据进行保留并选定强势数据作为最终数据。

6)生信分析

分析过程中，涉及的日常生物信息处理软件有：使用去bwa进行数据比对，参考基因组选择人类基因组hg19版本，samtools对比对数据进行处理，GATKtools对bam数据进行矫正和突变分析，使用MSIsensor软件评估MSI水平。

本实施例样本建库测序后可成功捕获30个微卫星位点，可准确判断出两实施例的MSI水平。本实施例各位点捕获情况如表4所示，其中位点MSI-11、MSI-1、MSI-12、MSI-13、MSI-14的数据图如图2至图6所示。

表4各位点捕获情况表

采用30个位点评估样本微卫星不稳定，比传统的5个位点，结果更加稳定。采用高灵敏单分子标签(UMI)去优化数据，可有效去除降低数据背景的干扰，是MSI的判断更加灵敏可靠。

本发明实施例的建库分析流程如图1所示。

本发明提供一种illumina二代测序(NGS)平台使用的快速高灵敏NGS检测MSI体系和试剂盒，单分子标签文库构建方案；一步法快速建库方法；高灵敏度单分子分析流程，减少实验过程引入的误差，降低了PCR过程中核酸复制“滑移”引起的背景干扰；为临床评估患者MSI水平提供了新的高灵敏解决途径。建库方案为自行开发，高效便捷；测序文库包含单分子标签，测序数据灵敏度高，并在后期通过优化体系进行试剂盒的开发。

本发明自行设计一套同时包含用于30个微卫星捕获的多重引物。在各扩增子引物的反向引物端加上8碱基的随机序列作为扩增产物的单分子标签(UMI),用于文库扩增后的独立标记。其中UMI有8个随机合成的碱基序列组成，其理论上组成碱基序列组合类型有4⁸＝65536种可能性，用于在文库数据分析单分子识别。将illumina文库的部分公共序列连接于扩增引物的两端，结构如(F7,F5)，将illumina测序文库的样本文库识别标签(index)和P5和P7序列部分连接于公共文库扩增引物上(P7,P5)，将四套引物同时至于同一多重PCR反应管中进行两步PCR反应，第一部分退火和延伸共65℃，2min，此阶段，体系中含量极少特异性引物发生特异性捕获反应；第二部分退火60℃，30S，延申，特异性引物消耗完,通用引物P7&P5继而反应形成完整文库。共31个循环即可生成带有样本标签(i7，i5)和单分子标签(UMI)的文库结构。测序文库于illumina测序仪Novaseq6000系统上机测序。测序下机数据先进行原始数据质控，保留原始测序质量在Q30的测序数据，根据单分子标签(UMI)进行聚类分析，每一小类单分子标签数据纯度大于90％的数据集将进行保留并选定强势数据作为最终数据。将预处理后得到的数据最终用MSIsensor软件分别对30个位点评估MSI水平,其中超过10个位点为微卫星不稳定，可定义此样本为MSI-H，小于等于10位点为微卫星不稳定，定义此样本为MSI-L样本。采用30个位点评估样本微卫星不稳定，比传统的5个位点，结果更加稳定。采用高灵敏单分子标签(UMI)去优化数据，可有效去除降低数据背景的干扰，使得MSI的判断更加灵敏可靠。

使用NGS技术检测样本的MSI状态的优点是，它允许大规模并行测序，并能够同时产生数百万个序列的，这通常转化为更好的效率，特别是在测试大量结直肠肿瘤样本的环境中。NGS在建库过程中存在PCR扩增过程，当聚合酶在扩增基因组上微卫星区段时，易发生“滑移”，这使得微卫星的区域会出现长短不一的重复，增强了数据的背景，降低了准确检测MSI的灵敏度。在这里，我们使用单分子标签(UMI)NGS技术的替代传统的多重荧光PCR检测MSI策略，大大提高了MSI评估准确度和灵敏度。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 普瑞斯新（上海）生物医疗科技有限公司

<120> 快速检测MSI的检测引物及其试剂盒

<130> 无

<160> 60

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 1

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttcagc cagtatatga aattggatat tgca 54

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 2

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttagag aaaggtattt agagccctgt ttaa 54

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 3

atctcgtatg ccgtcttctg cttgtccctg ggcaaaaacc tgtgaccaga g 51

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 4

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttaatt ttcaatggca gtcactacag aatc 54

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 5

atctcgtatg ccgtcttctg cttgcttgca gtgagccaag atcacaccac cgca 54

<210> 6

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 6

atctcgtatg ccgtcttctg cttgaactca gaccttctta gtgaacttaa gggc 54

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 7

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttcaca tgtgcaaagc acattttcaa 50

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 8

atctcgtatg ccgtcttctg cttgattgtt gaagaaagaa aagtacatct gga 53

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 9

atctcgtatg ccgtcttctg cttgtcatca tctaattctc tttttaccac cttg 54

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 10

atctcgtatg ccgtcttctg cttgctaaat tagtttcttg ttgattgctg ga 52

<210> 11

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 11

atctcgtatg ccgtcttctg cttggttgca gtgagccgag atcaagcaat tgc 53

<210> 12

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 12

atctcgtatg ccgtcttctg cttgtcactg taaataatct tcctggtggt gac 53

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 13

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttttcc ttccattaca tcttagctca aac 53

<210> 14

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 14

atctcgtatg ccgtcttctg cttgaggttg cagtgagcca agattgcgcc attg 54

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 15

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttaaca acccaaagag aaggcatcaa taat 54

<210> 16

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 16

atctcgtatg ccgtcttctg cttgcacatt tgtaattgtt catttccttg gat 53

<210> 17

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 17

atctcgtatg ccgtcttctg cttgtgactg aaaaagccat ttgtttaaaa agg 53

<210> 18

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 18

atctcgtatg ccgtcttctg cttggacaat gtagtctctg cttttagtca cta 53

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 19

atctcgtatg ccgtcttctg cttggaagaa tcaacccaca aatgacctaa ccga 54

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 20

atctcgtatg ccgtcttctg cttgcaaaaa aaaacacttg gttcatttac cat 53

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 21

atctcgtatg ccgtcttctg cttggttttt attttgattt cttttgctta ccag 54

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 22

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttgcta tttacttaca gtgccactta tcat 54

<210> 23

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 23

atctcgtatg ccgtcttctg cttgcactgg ggccttctcc acaactttgt tttc 54

<210> 24

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 24

atctcgtatg ccgtcttctg cttgataaca agtctgtggc ttcgaggcct cata 54

<210> 25

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 25

atctcgtatg ccgtcttctg cttgttgaaa ccattcattt tgtaatccag gca 53

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 26

atctcgtatg ccgtcttctg cttgcatcag ggctaaaata aaaaacacat a 51

<210> 27

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 27

atctcgtatg ccgtcttctg cttgaaaact gaaatatact ttaaccctga aatc 54

<210> 28

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 28

atctcgtatg ccgtcttctg cttgtgatgt caggatttga cgctaatttg at 52

<210> 29

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 29

atctcgtatg ccgtcttctg cttgtaaaat tcttccagca ggagcgtcat tatg 54

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 30

atctcgtatg ccgtcttctg cttgagatga aaagatgaga cagggaggct 50

<210> 31

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 31

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntaagctt cttcagtata tgtcaatgaa 60

<210> 32

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 32

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnatgagag acttatttta gaagctctta 60

aac 63

<210> 33

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 33

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnagagtat gaagtggaat gaatgctcct 60

gt 62

<210> 34

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 34

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnttggtct ttcatcggtt gttgataaga 60

ctg 63

<210> 35

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 35

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntcacatt cgtaattgtt catttccttg 60

gat 63

<210> 36

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 36

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnnattgctg gcattctcaa aggcagggca 60

gag 63

<210> 37

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 37

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<211> 63

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<213> 人工序列(无)

<220>

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<223> n is a, c, g, or t

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<212> DNA

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<400> 52

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tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnncaaaacc caatttagat ccaatctgaa 60

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<212> DNA

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<221> misc_feature

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<213> 人工序列(无)

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<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 59

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnngctggga aaattgttaa tttttaaaat 60

atc 63

<210> 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(无)

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<221> misc_feature

<222> (26)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 60

tccctacacg acgctcttcc gatctnnnnn nnntaaggag agaagttgtc tagttacctc 60

ct 62

Claims

1.一种快速检测MSI的检测引物，其特征在于：包括分别检测30个微卫星位点的正向捕获引物、反向捕获引物、正向通用引物和反向通用引物；所述正向捕获引物由5’端的测序文库read1的公共序列和3’端的特异性正向引物序列组成，所述反向捕获引物由5’端的测序文库read2的公共序列、8个碱基的随机序列和3’端的特异性反向引物序列组成；检测30个微卫星位点的正向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1～30所示；检测30个微卫星位点的反向捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.31～60所示；所述正向捕获引物和反向捕获引物的使用浓度为10nM；正向通用引物的3’端连接有测序文库read1的公共序列，反向通用引物的3’端连接有测序文库read2的公共序列；测序文库read1的公共序列为ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG，测序文库read2的公共序列为TCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。

2.根据权利要求1所述的快速检测MSI的检测引物，其特征在于：所述正向通用引物和反向通用引物的使用浓度为20μM。

3.一种采用如权利要求1所述的检测引物的快速检测MSI的试剂盒。