CN110241212B - 一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用 - Google Patents

一种用于brca1和brca2基因扩增子测序检测的引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组及其应用，所述引物组包括两套PCR引物，第一套PCR引物为靶区域多重PCR扩增引物，包括如SEQ ID NO.1‑234所示的核苷酸序列，第二套引物为测序接头引物。通过本发明提供的引物组可以实现99％以上的捕获覆盖率和90％以上的均一性。

Description

一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组及其 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组及其应用。
背景技术
BRCA1和BRCA2基因与遗传性乳腺癌相关，是两种具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传复制DNA损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用，如果BRCA1和BRCA2基因的结构发生了某些改变，那么它所具有的肿瘤抑制功能就会受损，2013年已发现的突变有数百种之多，拥有这两个基因突变的家族倾向于具有高乳腺癌发生率，通常发生在较年轻时，病人的两侧乳房都确癌，同时患有卵巢癌。
BRCA1/2的突变主要分为两种。第一种是单个碱基的突变或少量碱基的缺失和插入，可以造成氨基酸序列的改变，翻译提前终止，或信使RNA加工的异常，进而影响蛋白的功能。第二种是大片段DNA重组，可以造成一个或多个外显子的缺失或重复，从而扰乱基因功能。这两种突变中，第一种占大部分，并且可通过基因片段PCR扩增和Sanger测序相结合的常规方法进行检测。第二种占少部分，需要通过Southern杂交，MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplification)，定量PCR或CGH(comparative genomichybridization)等较为复杂的方法来检测。第二代高通量测序技术也被运用到了BRCA1/2突变的检测中。通过高通量测序，两种类型的突变可以被同时检测。但是，利用二代测序技术进行大片段DNA重组的检测，对基因组目的区域的富集方式、测序深度和信息分析等都有特定的要求，对于很多实验室现有的检测平台来说都是非常大的挑战。所以，一种快速有效的BRCA1/2大片段重组检测技术，无论是作为独立的大片段重组检测项目，还是作为常规点突变检测的补充，都有非常重要的应用价值。
CN104531862A公开了一种检测人类BRCA1和BRCA2基因全外显子序列突变位点的方法和引物。所述特异性引物包括扩增覆盖BRCA1基因全部24个外显子的正、反向引物和扩增覆盖BRCA2基因全部27个外显子突的正、反向引物。该发明采用Sanger测序法检测BRCA1和BRCA2基因全外显子的突变，可以扩展整个BRCA1和BRCA2基因全外显子，覆盖待检测的所有突变位点。
CN105586427A公开了检测人类BRCA1和BRCA2基因突变的引物、试剂盒及方法。97对扩增引物，其中上游引物5’端加上通用引物Tag1；下游引物为5’端加上通用引物Tag2；还包括12对测序引物，其中上游引物带有P5序列；下游引物带有P7序列。能快速、准确、简便地检测BRCA1和BRCA2基因全外显子及其与内含子连接区和非翻译区和启动子区突变。
CN109402257A公开了一种用于人类BRCA1和BRCA2基因全编码序列突变位点检测的引物、方法和试剂盒。所述引物包括扩增覆盖BRCA1基因全部24个编码区的正、反向引物；扩增覆盖BRCA2基因全部27个外显子编码区的正、反向引物。所述基于NGS技术的检测方法包括：特异性引物与目标模板DNA序列结合、通用引物扩增待测样本目标区域，磁珠纯化文库，对得到的文库进行高通量测序并分析BRCA1和BRCA2基因的突变。
因此，提供一种针对BRCA1和BRCA2基因的突变应用灵活、价格低廉、分析简单，具有超高的测序深度，全面覆盖所有突变位点的测序引物及方法具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组及其应用，本发明首先利用多重PCR扩增、富集样品基因组中目标区域的DNA片段，再进行文库构建和高通量测序，最终实现低成本、高通量、高覆盖率和均一性的BRCA基因突变检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组，所述引物组包括两套PCR引物，第一套PCR引物为靶区域多重PCR扩增引物，包括如SEQ IDNO.1-234所示的核苷酸序列，第二套引物为测序接头引物；
其中，所述SEQ ID NO.1-234中奇数编号所示的核苷酸序列为上游引物，偶数编号所示的核苷酸序列为下游引物。
扩增子测序是一种目标区域高通量测序技术，利用超高的测序深度，扩增子测序可以检测全基因组测序、外显子组测序不能涵盖的突变，特别适用于基因突变相关疾病的临床科研。本发明通过第一套多重PCR引物扩增目标区域，其中45对引物针对BRCA1基因设计，72对引物针对BRCA2基因设计，能够100％覆盖BRCA1和BRCA2基因的编码外显子区域，延伸覆盖外显子-内含子边界10nt，共29.2kb，在保证检测覆盖率和均一性的同时，降低总引物对数，进而降低测序成本。
本发明中，第一套引物中编号为奇数的序列为上游引物，例如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11…233，编号为偶数的序列为下游引物，例如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12…234。
本发明中，第一套引物的上游引物的5’端均包括通用接头序列A，下游引物的5’端均包括通用接头序列B。
所述通用接头序列A的核苷酸序列如SEQ ID NO.237所示，所述通用接头序列B的核苷酸序列如SEQ ID NO.238所示。
通用接头序列A的核苷酸序列(SEQ ID NO.237)如下所示：
5’-TACACGACGCTCTTCCGATCT-3’.
通用接头序列B的核苷酸序列(SEQ ID NO.238)如下所示：
5’-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’.
优选地，所述第二套引物包括如SEQ ID NO.235所示的上游引物和如SEQ IDNO.236所示的下游引物。
所述第二套引物上游引物的核苷酸序列(SEQ ID NO.235)如下所示：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’.
所述第二套引物下游引物的核苷酸序列(SEQ ID NO.236)如下所示：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index]GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’.
本发明中，第二套引物的下游引物包含index序列用于区分不同样本，其位于AAGCAGAAGACGGCATACGAGAT序列之后，GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT序列之前，所述index序列长度为6-10nt，优选为8nt。
第二方面，本发明提供一种BRCA1和BRCA2基因突变检测试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的引物组。
优选地，所述试剂盒还包括反应辅助试剂。
优选地，所述辅助试剂包括PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。
优选地，所述试剂盒还包括阴性质控和阳性质控。
第三方面，本发明提供一种用于非疾病诊断目的的检测BRCA1和BRCA2基因突变的方法，包括如下步骤：
(1)第一轮PCR扩增：以待检测样品作为模板，采用第一方面所述第一套PCR引物进行扩增；
(2)第二轮PCR扩增：以经纯化的第一轮PCR产物为模板，采用第一方面所述第二套PCR引物进行扩增；
(3)对第二轮PCR产物进行纯化，获得文库；
(4)测序与结果分析：将步骤(3)所得文库上机测序，并进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息。
优选地，步骤(1)所述待测样品包括新鲜血液、唾液、口腔拭子、组织或石蜡包埋组织中的任一种。
优选地，步骤(1)所述第一轮PCR扩增分为第一管反应和第二管反应进行。
优选地，所述第一管反应的引物包括如SEQ ID NO.1-90所示的核苷酸序列，第二管反应的引物包括如SEQ ID NO.91-234所示的核苷酸序列。
本发明中第一管反应引物包括检测BRCA1基因突变的45对引物，序列编号为SEQID NO.1-90所示核苷酸序列，第二管反应引物包括检测BRCA2基因突变的72对引物，序列编号为SEQ ID NO.91-234。
优选地，步骤(1)所述扩增的反应条件为95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火5min，3个循环，72℃延伸5min。
任选地，步骤(1)所述扩增的产物保存于10℃。
优选地，步骤(2)所述纯化的方法为磁珠纯化。
优选地，步骤(2)所述扩增的条件为95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，12个循环，72℃延伸5min。
任选地，步骤(2)所述扩增的产物保存于10℃。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物组、第二方面所述的试剂盒在非疾病诊断治疗目的的检测BRCA1和BRCA2基因突变中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的引物组可在一管中实现100重以上高度均一的PCR扩增反应，通常通过一管或两管引物即可完成目标区域捕获；
(2)相比于芯片杂交捕获样本起始量低，操作简单，对仪器设备要求最低化，可在几个小时内完成目标序列富集和测序文库构建；
(3)本发明提供的引物以及相应的检测方法可以实现99％以上的捕获覆盖率和90％以上的均一性，可以100％覆盖BRCA1和BRCA2基因的编码外显子区域，延伸覆盖外显子-内含子边界10nt，共29.2kb；
(4)本发明在保证覆盖率和均一性的同时，降低反应所需的总引物对数，降低测序成本；
(5)本发明的检测方法所用样本起始量少，灵敏度高，仅用20ng的样本DNA即可完成检测。
附图说明
图1为实施例1中样品基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为实施例2中文库构建过程示意图；
图3为实施例2中第一轮PCR产物纯化后的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为实施例2中第二轮PCR产物纯化后的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。
实施例1样品DNA的提取和质控
1、检测样本(包括新鲜血液、唾液、口腔试子、组织、石蜡包埋组织)的DNA的提取采用天根基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，具体步骤按试剂盒操作说明。
2、得到的样品分别使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260/OD280比值应在1.7-1.9之间。
3、将提取得到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图1，其中泳道1为Marker，泳道2-5为提取得到的样品基因组DNA的平行样。由图1可知，提取得到的基因组DNA完整，质量均一，满足后续操作要求。
实施例2文库制备
本发明的文库制备过程示意图见图2。
1、第一轮PCR扩增
使用南京诺唯赞科技有限公司的预混PCR反应液，以抽提出的待检测样品作为模板，进行扩增。
第一轮PCR扩增体系见表1，扩增条件见表2。
表1
组分 第一管 第二管
Genome DNA(～10ng/μl) 5μl 5μl
2×Phanta Turbo Master Mix 25μl 25μl
Primer pool(100μM) 5μl 5μl
ddH2O 15μl 15μl
表1中，Primer pool是指第一套PCR引物包括引物117对，其中上游引物如SEQ IDNO.1,3,5,7,9-233所示，下游引物如SEQ ID NO.2,4,6,8,10-234所示；其中第一管是45对引物(SEQ ID NO.1-90)，第二管是72对引物(SEQ ID NO.91-234)。
表2
2、第一轮PCR产物纯化
1)将切好的胶块转移到96孔深孔板中，加入溶胶液300ul，70℃加热10min；胶块完全溶解后，每孔中加入混匀的磁珠10ul(为提高回收效率，可增大磁珠的量)。
2)振荡器上进行混匀震荡，震荡吸附10min，速度以磁珠不震出为准。
3)吸附结束后，将96孔深孔板置于磁力架上磁吸1-2min，待磁珠完全沉淀至底部。
4)将96孔深孔板连同磁力架一起倒置，倒出所有的液体，注意动作要轻柔不要倒出磁珠，保持离心管倒置的状态置于吸水纸上，轻拍96孔深孔板，尽量吸取废液。
5)将96孔深孔板从磁力架上取下，用排枪再次加入200ul溶胶液，盖住盖子，充分混匀(震荡3min)，放回磁力架磁吸1-2min，之后连同磁力架一起倒置，倒出所有的液体，注意动作要轻柔不要倒出磁珠，保持离心管倒置的状态置于吸水纸上，轻拍96孔深孔板，尽量吸取废液。
注意：每次倒置或轻甩时要小心，速度要慢，速度过快会导致磁珠损失，从而影响纯化得率。
6)将96孔深孔板从磁力架上取下，用排枪再次加入200ul 80％乙醇，盖住盖子，充分混匀(震荡3min)，放回磁力架磁吸1-2min，之后连同磁力架一起倒置，倒出所有的液体，注意动作要轻柔不要倒出磁珠，保持离心管倒置的状态置于吸水纸上，轻拍96孔深孔板，尽量吸取废液。
7)重复步骤6一次。
8)将96孔深孔板从磁力架上取下，80℃干燥5-10min，使酒精挥发完全。
注意：干燥过程中请注意观察磁珠干燥状态，如磁珠可流动或表面光亮，表明磁珠未充分干燥，需继续干燥。待干燥至磁珠表面无光泽，表明磁珠已完全干燥。
9)加入30ul ddH2O,震荡混匀1-2min，使磁珠完全悬浮于水中。
10)震荡混匀后将将96孔深孔板置于磁力架上磁吸1-2min，取出纯化好的DNA溶液。
将第一轮扩增产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图3，其中泳道1-4为第一反应管的产物纯化后进行电泳，泳道5-8为第二反应管的产物纯化后进行电泳，泳道9为Marker。由图3可知，本发明设计的117对多重PCR扩增引物之间无交叉影响，体系稳定，特异性良好，可以扩增得到目的大小的片段，经磁珠纯化后的产物条带单一，可用于进行第二轮PCR扩增。
3、第二轮PCR扩增
使用南京诺唯赞科技有限公司的预混PCR反应液，以抽提出的待检测样品作为模板，进行扩增，扩增的体系见表3，扩增条件见表4。
表3
表3中，采用的上游引物和下游引物为第二套PCR引物，上游引物的5’端序列为Illumina公司的公开通用测序接头，3’端序列为通用接头序列A；下游引物的5’端序列为Illumina公司的公开通用测序接头，3’端序列为通用接头序列B，下游引物还包括用于区分不同样本的index序列，本实施例中下游引物共包含96条index序列，此处示例性地将下游引物序列列举如下(SEQ IDNO.239-250)，其中下划线部分为index序列，index序列通过随机碱基的组合实现对不同样本的区分。
TS-P7-D701(SEQ ID NO.239):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D702(SEQ ID NO.240):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCCGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D703(SEQ ID NO.241):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAATGAGCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D704(SEQ ID NO.242):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAATCTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D705(SEQ ID NO.243):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D706(SEQ ID NO.244):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAATTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D707(SEQ ID NO.245):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTTCAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D708(SEQ ID NO.246):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCATTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D709(SEQ ID NO.247):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAGCCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D710(SEQ ID NO.248):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGCGGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D711(SEQ ID NO.249):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCGAGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
TS-P7-D712(SEQ ID NO.250):
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATCGCTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’.
表4
4、第二轮PCR产物纯化，具体过程同步骤2。
将第二轮PCR扩增产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图4，其中泳道1-4为第二轮扩增产物纯化后平行上样进行，由图4可知，产物条带清晰单一，无杂带，大小正确，说明建库质量好，引物设计合理。
实施例3测序与结果分析
将二轮PCR的结果上机测序，并进行生物信息学分析。首先对测序数据进行质量评估，然后采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将质控后的数据(clean data)与全基因组进行比对，BWA是一款分析准确、分析效率高的比对软件。比对完成后生成SequenceAlignment Map(SAM)文件结果。然后采用picard软件除去SAM中的重复序列(PCR过程中产生的多余的信息)。最后，利用samtools软件将SAM的结果文件转成BAM文件，BAM格式就是SAM格式的压缩结果，SAM文件格式说明请参见http：//samtools.sourceforge.net/SAM1.pdf。检测结果见表5。
表5
由表5可知，本发明的扩增子测序引物特异性好，检测灵敏度高，减少多重PCR扩增引物对数的同时仍具有较高的检测覆盖率和均一性，均一性指的是读取在目标区域内的分布均一程度，覆盖越均匀，达到特定深度所需的测序就越少。本发明的引物组配合检测方法可以实现99％以上的捕获覆盖率和90％以上的均一性，可以100％覆盖BRCA1和BRCA2基因的编码外显子区域，延伸覆盖外显子-内含子边界10nt，共29.2kb。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 苏州泓迅生物科技股份有限公司
<120> 一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组及其应用
<130> 2019
<141> 2019-06-25
<160> 250
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 1
tacacgacgc tcttccgatc tggtcctgtg gctctgtacc 40
<210> 2
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 2
agacgtgtgc tcttccgatc taactcatac aaccaggacc ctg 43
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 3
tacacgacgc tcttccgatc ttgccaagaa ctgtgctact caa 43
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 4
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 6
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 11
tacacgacgc tcttccgatc taggaaagtg gtgcattgat gga 43
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<400> 17
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<213> 人工合成序列()
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agacgtgtgc tcttccgatc tcctctgcat tgaaagttcc cca 43
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<213> 人工合成序列()
<400> 20
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<211> 48
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<213> 人工合成序列()
<400> 21
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<213> 人工合成序列()
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tacacgacgc tcttccgatc tagctcctct tgagatgggt agt 43
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<211> 48
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
<400> 93
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
<400> 109
tacacgacgc tcttccgatc ttggcttata aaatattaat gtgcttctgt 50
<210> 110
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 110
agacgtgtgc tcttccgatc ttttcacatt catcagcgtt tgc 43
<210> 111
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 111
tacacgacgc tcttccgatc tagttgtaga tacctctgaa gaagatagt 49
<210> 112
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 112
agacgtgtgc tcttccgatc tcaaagacgg tacaacttcc ttgg 44
<210> 113
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 113
tacacgacgc tcttccgatc tatcagaagc cctttgagag tgg 43
<210> 114
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 114
agacgtgtgc tcttccgatc tggtaggcta gaaatacgtg gca 43
<210> 115
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 115
tacacgacgc tcttccgatc tagacctatt agacacagag aacaaaa 47
<210> 116
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 116
agacgtgtgc tcttccgatc tttgcattga aagtctcttt aggtgat 47
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 117
tacacgacgc tcttccgatc ttctccagtg gcttcttcat ttcag 45
<210> 118
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 118
agacgtgtgc tcttccgatc tttaaacctg cattcttcaa agctaca 47
<210> 119
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 119
tacacgacgc tcttccgatc tatacatact gtttgctcac agaagga 47
<210> 120
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 120
agacgtgtgc tcttccgatc tcatttgcaa atgtaagtgg tgcttca 47
<210> 121
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 121
tacacgacgc tcttccgatc ttgctataca tgatgaaaca tcttataaag g 51
<210> 122
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 122
agacgtgtgc tcttccgatc tacacagaag gaatcgtcat ctataaa 47
<210> 123
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 123
tacacgacgc tcttccgatc ttgtgattga tggtacttta attttgtcac 50
<210> 124
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 124
agacgtgtgc tcttccgatc tcagagaatc agcttctggg gtaataa 47
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 125
tacacgacgc tcttccgatc taatacagta atctctcagg atcttgatta t 51
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 126
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 127
tacacgacgc tcttccgatc tgcagcatgt cacccagtac aa 42
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 128
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 129
tacacgacgc tcttccgatc taaatgtcag acaagctcaa aggtaac 47
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 130
agacgtgtgc tcttccgatc ttgtctgaga aaagttcttc agagtct 47
<210> 131
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 131
tacacgacgc tcttccgatc taccaaaaca caaatctaag agtaatcca 49
<210> 132
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 132
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<210> 133
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 133
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 135
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 137
tacacgacgc tcttccgatc tagcttgtgt tgaaattgta aatacct 47
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 138
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<210> 139
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 139
tacacgacgc tcttccgatc ttaacaccta gccaaaaggc aga 43
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 140
agacgtgtgc tcttccgatc taaattgctt gctgctgtct acc 43
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 142
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 143
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 148
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 149
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 150
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 151
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<210> 152
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 152
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 153
tacacgacgc tcttccgatc tgttttcata cagctagcgg gaaaaa 46
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 154
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 155
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<213> 人工合成序列()
<400> 156
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<213> 人工合成序列()
<400> 157
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 158
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 159
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 160
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 161
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 162
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 164
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 165
tacacgacgc tcttccgatc tatttgccaa acgaaaatta tggca 45
<210> 166
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 166
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<211> 47
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<213> 人工合成序列()
<400> 167
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<213> 人工合成序列()
<400> 168
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<213> 人工合成序列()
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<211> 48
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<213> 人工合成序列()
<400> 170
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 171
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<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 172
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<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 173
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
<400> 179
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<213> 人工合成序列()
<400> 180
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 181
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 183
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<213> 人工合成序列()
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 191
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<213> 人工合成序列()
<400> 192
agacgtgtgc tcttccgatc tcacacaatc tttttgcata gagtacc 47
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<213> 人工合成序列()
<400> 193
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<213> 人工合成序列()
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<210> 195
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 195
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<210> 196
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 196
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<210> 197
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 197
tacacgacgc tcttccgatc tgtggaattc tagagtcaca cttcct 46
<210> 198
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 198
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<210> 199
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 199
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<210> 200
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 200
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<210> 201
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 201
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<210> 202
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 202
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<210> 203
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 203
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<210> 204
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 205
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<210> 206
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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<210> 207
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 207
tacacgacgc tcttccgatc tcctggcctg atacaattaa cttgaat 47
<210> 208
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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agacgtgtgc tcttccgatc tgtctctaag actttgttct catattagaa at 52
<210> 209
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 209
tacacgacgc tcttccgatc ttcccttctt tgggtgtttt atgct 45
<210> 210
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 210
agacgtgtgc tcttccgatc tgcaaagcac gaacttgctg t 41
<210> 211
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 211
tacacgacgc tcttccgatc taccatattt accatcacgt gcact 45
<210> 212
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 212
agacgtgtgc tcttccgatc tacagcttct caccttgaat aatcatcaa 49
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 213
tacacgacgc tcttccgatc ttttttgttc tgattgcttt ttattccaa 49
<210> 214
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 214
agacgtgtgc tcttccgatc taacaaagca tttacatact tacctgaat 49
<210> 215
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 215
tacacgacgc tcttccgatc tgttggaaat taggaaggcc atggaat 47
<210> 216
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 216
agacgtgtgc tcttccgatc ttctggattt ataatcattt tgttagtaag gt 52
<210> 217
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 217
tacacgacgc tcttccgatc taaatgataa tcacttcttc cattgcat 48
<210> 218
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 218
agacgtgtgc tcttccgatc tggagattcc ataaactaac aagcact 47
<210> 219
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 219
tacacgacgc tcttccgatc tagtgcttgt tagtttatgg aatctcc 47
<210> 220
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 220
agacgtgtgc tcttccgatc tccaactggt agctccaact aatcata 47
<210> 221
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 221
tacacgacgc tcttccgatc tagagtttcc tttcttgcat cttaaaat 48
<210> 222
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 222
agacgtgtgc tcttccgatc tctcttttgg actagcagaa aacaca 46
<210> 223
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 223
tacacgacgc tcttccgatc tagtggcgac cagaatccaa atc 43
<210> 224
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 224
agacgtgtgc tcttccgatc tagctatttc cttgatactg gactgt 46
<210> 225
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 225
tacacgacgc tcttccgatc ttgggtttgc aatttataaa gcagc 45
<210> 226
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 226
agacgtgtgc tcttccgatc tcaacagaat atacgatggc ctcc 44
<210> 227
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 227
tacacgacgc tcttccgatc ttgttactac ataattatga taggctacgt t 51
<210> 228
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 228
agacgtgtgc tcttccgatc tggagaaaca aatgtacaaa tgggact 47
<210> 229
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 229
tacacgacgc tcttccgatc tattgatgac caaaagaact gcaaaaa 47
<210> 230
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 230
agacgtgtgc tcttccgatc tgagcttggg tatttatcaa tgcaagt 47
<210> 231
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 231
tacacgacgc tcttccgatc tgcaccaaat acgaaacacc cataa 45
<210> 232
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 232
agacgtgtgc tcttccgatc tggcctggga actctcctgt 40
<210> 233
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 233
tacacgacgc tcttccgatc ttctcagact gaaacgacgt tgt 43
<210> 234
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 234
agacgtgtgc tcttccgatc ttgtgcaaca taagtactaa tgtgtgg 47
<210> 235
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 235
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atagcctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccgatct 70
<210> 236
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(32)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 236
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 237
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 237
tacacgacgc tcttccgatc t 21
<210> 238
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 238
agacgtgtgc tcttccgatc t 21
<210> 239
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 239
caagcagaag acggcatacg agatcgagta atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 240
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 240
caagcagaag acggcatacg agattctccg gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 241
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 241
caagcagaag acggcatacg agataatgag cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 242
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 242
caagcagaag acggcatacg agatggaatc tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 243
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 243
caagcagaag acggcatacg agatttctga atgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 244
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 244
caagcagaag acggcatacg agatacgaat tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 245
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 245
caagcagaag acggcatacg agatagcttc aggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 246
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
<400> 246
caagcagaag acggcatacg agatgcgcat tagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
<210> 247
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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caagcagaag acggcatacg agatcatagc cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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caagcagaag acggcatacg agatttcgcg gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66
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<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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caagcagaag acggcatacg agatgcgcga gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatc 65
<210> 250
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工合成序列()
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caagcagaag acggcatacg agatctatcg ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatct 66

Claims (14)

1.一种用于BRCA1和BRCA2基因扩增子测序检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括两套PCR引物，第一套PCR引物为靶区域多重PCR扩增引物，包括如SEQ ID NO.1-234所示的核苷酸序列，第二套引物为测序接头引物；
所述第二套引物包括如SEQ ID NO.235所示的上游引物和如SEQ IDNO.236所示的下游引物。
2.一种BRCA1和BRCA2基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的BRCA1和BRCA2基因突变检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应辅助试剂；
所述辅助试剂包括PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的BRCA1和BRCA2基因突变检测试剂盒，所述试剂盒还包括阴性质控和阳性质控。
5.一种用于非疾病诊断目的的检测BRCA1和BRCA2基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)第一轮PCR扩增：以待检测样品作为模板，采用权利要求1所述第一套PCR引物进行扩增；
(2)第二轮PCR扩增：以经纯化的第一轮PCR产物为模板，采用权利要求1所述第二套PCR引物进行扩增；
(3)对第二轮PCR产物进行纯化，获得文库；
(4)测序与结果分析：将步骤(3)所得文库上机测序，并进行生物信息学分析，得到检测样本的突变信息。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品包括新鲜血液、唾液、口腔拭子、组织或石蜡包埋组织中的任一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一轮PCR扩增分为第一管反应和第二管反应进行。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一管反应的引物包括如SEQ IDNO.1-90所示的核苷酸序列，第二管反应的引物包括如SEQ IDNO.91-234所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述扩增的反应条件为95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火5min，35个循环，72℃延伸5min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述扩增的产物保存于10℃。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纯化的方法为磁珠纯化。
12.根据权利要求5-11任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增的条件为95℃预变性2min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，12个循环，72℃延伸5min。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增的产物保存于10℃。
14.一种如权利要求1所述的引物组、权利要求2-4中任一项所述的试剂盒在非疾病诊断治疗目的的检测BRCA1和BRCA2基因突变中的应用。
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