CN112662763A - 一种检测常见两性癌症的探针组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了一种探针组合物。该组合物通过对TCGA数据库以及GEO数据库的甲基化数据荟萃分析，筛选出4.3Kbp的捕获区域，包括多达44个与癌症高度相关的甲基化变化基因与非编码DNA区域，该方法可以一次性检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌等5种常见两性癌症的甲基化水平改变。可用于无症状人群的早期筛查，以及癌症患者的预后检测，其检测基因的广度优于现有的技术和产品。

Description

一种检测常见两性癌症的探针组合物
技术领域
本文涉及一种癌症基因甲基化检测组合物，特别涉及一种特异性识别重亚硫酸盐(Bisulfite)处理后的DNA序列的探针组合物，以及基于高通量测序(NGS)方法检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌等5种常见两性癌症游离DNA甲基化水平变化的应用。
背景技术
高通量测序(NGS)技术是现代基因组学研究领域革命性的创新，该技术可以同时对几十到几百万条DNA分子进行序列分析，这标志着后基因组时代的到来。通过对测序深度的控制，可实现从头测序和重测序等不同的目标，也可以通过不同的前期处理，分析基因组、转录组和甲基化组的序列。
目前临床基因检测的技术主要是聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交(FISH)和基因芯片技术。PCR仪器设备价格低，灵敏性高，操作简单快速，在临床的普及度高，但是受技术限制，只能同时检测少数几个基因。FISH灵敏度高，但操作难度较大。基因芯片通量高于前两者，可以同时检测大量的基因。但局限在于只能检测已知的基因或变异，准确性低，假阳性高。而NGS技术具有通量高(同时检测大量已知和未知的基因及变异)，结果准确(准确率高于基因芯片)，检测速度较快，均摊到每个基因的检测成本低等特点，现在已经逐渐应用到临床疾病检测和监控等领域。随着未来测序费用的进一步降低，NGS必然会逐步取代基因芯片等其他高通量技术。
由于目前常规全基因组测序的总价比较高，如果为了检测稀有变异而增加测序深度，则最终价格让消费者难以承受。因此目标序列捕获测序成为比较主流的选择，该技术是根据检测的需求，针对感兴趣的基因组区域设计捕获探针，通过杂交互补的原理富集目标片段DNA，并在后续进行NGS检测。这种策略可以根据研究或检测的目的进行灵活定制，只选择少量的基因区域，加大测序深度，可以有效的发现目标区域变异的状况，具有很高的灵敏度和准确性。
在癌症的发生和进展过程中，遗传信息会产生一系列的变化，包括DNA的突变、插入/缺失，染色体结构变异，拷贝数变异，以及表观遗传信息的改变。在癌症的演进过程中，DNA序列的变异是随机发生的，仅当变异发生在关键的生长控制基因时，才可以导致恶性肿瘤的产生。而大多数的基因表达异常是源于表观遗传的改变，通常是DNA甲基化水平的改变。研究表明，基因甲基化水平的改变早于基因变异，跟踪检测基因甲基化的变化，可以较早的预测癌症产生。近年来，随着基因组学的发展，现在已经对超过30种癌症的表观基因组进行了研究。结果显示，尽管DNA甲基化并非在每种癌中都占主导地位，但毫无疑问的是，基因甲基化修饰模式的变化会改变细胞的发展倾向以及肿瘤的表型，从而对大多数癌症的发生发展起重要的影响。
2018年初癌症基因组图谱(TCGA)发表了27篇总结性的分析文章，对历时十多年的30多种癌症数据做了迄今为止最全面的泛癌基因组分析。在通过整合染色体变异、DNA甲基化、RNA和蛋白等多种数据进行分析后，发现，解剖学上的33中癌症可以根据分子特征分成28个亚型。在某种分子亚型会包括25种传统意义上的癌症。这个结果说明，来源于不同器官的癌症存在共同的分子特征。与此同时，来源于同一器官的癌症可能有不同的基因组图谱。由此可见，在不远的将来，癌症筛查和诊断标志物的开发必将引入更多泛癌的概念，不仅研究解剖学层次的癌症，更应在分子水平研究癌症，开发出可以覆盖某种分子分型的泛癌标志物。
液体活检是体外诊断的一种方式，采用非侵入性的血液检测，可以监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞(CTC)或循环肿瘤DNA(ctDNA)，该技术可以有效降低侵入性造成的危害，且能够实现对肿瘤各部分和所有转移灶的采样，克服肿瘤异质性(而目前采用的标准组织活检只能反映肿瘤某一部分的特征)，并实现实时监测，具有更高的灵敏度，甚至有可能通过基因组信息预测发生病变的部位，可以有效延长患者生存期。根据这些优点，液体活检可以用于肿瘤的早诊、辅助分期、预后和复发监测，用药指导等方面。目前最常用于的液体活检的游离DNA。
游离DNA(cfDNA)是存在于循环血中游离与细胞外的部分降解的内源性DNA。研究表明，肿瘤组织在发生发展的过程中，其肿瘤细胞凋亡后，会向血浆中释放DNA，经降解后，形成游离肿瘤DNA(ctDNA)。CtDNA的分子遗传特征(如基因突变，微卫星不稳定性和抑癌基因启动子甲基化等)与肿瘤组织DNA相一致。在多癌的早期筛查和检测中，采集外周血比其它临床检测手段更为简便、易于向基层推广，而且由于其无创的特点，更易于被无症状人群接受。因此通过检测血浆中的ctDNA甲基化水平改变，可以成为多癌早期筛查和诊断的重要手段之一。
利用目标序列捕获技术结合NGS监测cfDNA的变异以及甲基化水平变化，可以实现肿瘤早期筛查、易感基因监测、伴随诊断、个性化用药、预后监测等各方面的应用。目前国内外多个公司都推出了不同规模，针对不同应用场景的癌症检测panel，有部分panel已经获得了FDA或CFDA的批准文号。如Foundation Medicine推出的FoundationOne CDx覆盖324个基因，纪念斯隆·凯特琳癌症研究中心(MSK)推出的IMPACT覆盖468种癌症相关基因，燃石医学推出的“人EGFR/ALK/BRAF/KRAS基因突变联合检测试剂盒”，诺禾致源推出的“人EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、ALK、ROS1基因突变检测试剂盒”等。鹍远基因也于2018年推出了检测结直肠癌甲基化水平的产品“常乐思”。
发明内容
综上所述，针对目前多癌检测产品的缺乏和技术限制，本文提供了一种探针组合物，可用于前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌等5种常见两性癌症的早期筛查。该探针组合物可以：1)以非侵入性的方式用于无症状人群的早期筛查，以及癌症患者的预后检测，降低了侵入性检测造成的危害，2)加大了测序深度，使检测基因的广度优于现有的技术和产品，具有通量高，检测速度较快，均摊到每个基因的检测成本低等特点，3)能够实现对肿瘤各部分和所有转移灶的采样，克服肿瘤异质性，和4)具有更高的灵敏度和准确性，能够实现实时监测，甚至有可能通过基因组信息预测发生病变的部位有效延长患者生存期。
具体地，本文涉及如下内容：
1.一种探针组合物，其包括：靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意。
2.根据第1项所述的探针组合物，其还包括：靶向泛癌特异性区域的探针，所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意。
3.根据第1项所述的探针组合物，其还包括：靶向组织特异性区域的探针，所述组织特异性区域选自Seq ID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。
4.根据第3项所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：80、84、93、95是前列腺的组织特异性靶区域。
5.根据第3项所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：78、84-86是乳腺的组织特异性靶区域。
6.根据第3项所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：77、96、106是卵巢的组织特异性靶区域。
7.根据第3项所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：68-69、75、110是宫颈的组织特异性靶区域。
8.根据第3项所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：94、107、109是子宫内膜的组织特异性靶区域。
9.根据第1-8项中任一项所述的探针组合物，其包括：低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和；高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。
10.根据第9项所述的探针组合物，其中所述探针组合物中的每一个探针长度为40～60bp。
11.根据第10项所述的探针组合物，其中所述探针组合物中的每一个探针长度为45～56bp，优选50～56bp，进一步优选50bp。
12.根据第9项所述的探针组合物，其特征在于，所述低甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq IDNo.：216-217中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：221-222、228、231-232、234、238-240、247-250、261-262、264-265中的任意。
13.根据第9项所述的探针组合物，其特征在于，所述高甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq IDNo.：374-375中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：379-380、386、389-390、392、396-398、405-408、419-420、422-423中的任意。
14.一种试剂盒，其包括第1-13项中任一项所述的探针组合物。
15.一种第1-13项中任一项所述的探针组合物在制备检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌的试剂盒中的应用。
16.一种芯片，其上固定有包括第1-13项中任一项所述的探针组合物。
本文还提供了一种利用所述探针组合物检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌等5种常见两性癌症的方法。
本文同时也提供了一种利用所述试剂盒同时检测上述5种常见两性癌症的甲基化水平改变的方法。
由于现有癌症检测技术的局限性，因此，需要开发一种具有以下优势的探针组合物：
1液体活检属于无创肿瘤检测，对于无法获取组织样品的无症状人群和病人群体均能适用。
2可以同时检测5种常见两性癌症的甲基化水平改变，覆盖超过80％的癌症发病人群。
3为增加检测的准确性，对于每一种癌症，平均测序深度超过5000X。
4对于受检人，一次性可以完成所有高发癌症的筛查，提高了检测效率，每个标志物的平均价格低于市场现有单标志物的检测。
5对于企业，用一个Panel可以完成对主要癌症的筛选，节约了探针合成成本，可以简化实验流程，便于实验员操作。
6原则上也可以用于癌症患者预后的癌症监测。
附图说明
图1为本文的实施操作流程
具体实施方式
本文提供了一种癌症基因甲基化检测的探针组合物。基于高通量测序(NGS)方法检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌等5种常见两性癌症游离DNA甲基化水平变化。其可以以非侵入的方式同时检测5种常见癌症的甲基化水平改变，灵敏性和准确定高，测序深度深且成本低，适用于无法获取组织样品的无症状人群和病人群体，以及癌症患者预后的癌症监测。
定义
除非在本文的其他地方具体限定，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有本文所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，其可利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。在本文中，与探针互补结合或杂交的区域为特异性靶区域。多个探针组合成探针组合物。
癌症特异性区域是指在少部分癌症种类中，与正常的对照组织相比，该区域的甲基化水平存在显著差异。
泛癌特异性区域是指在大部分癌症种类中，与正常的对照组织相比，该区域的甲基化水平存在显著差异。
组织特异性区域是指该区域在特定组织中的甲基化水平与其他组织相比存在显著差异。
DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
在本文中，Panel是指本文中使用的探针组合物。
以下详细描述本文的技术方案。
在本文的一个具体的实施方案中，一种探针组合物，包括：靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意；靶向泛癌特异性区域的探针，所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意；和靶向组织特异性区域的探针，所述组织特异性区域选自SeqID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。在所述组织特异性区域中，Seq ID No.：80、84、93、95是前列腺的组织特异性靶区域。
在本文的一个具体的实施方案中，一种探针组合物，包括：靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意；靶向泛癌特异性区域的探针，所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意；和靶向组织特异性区域的探针，所述组织特异性区域选自SeqID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。在所述组织特异性区域中，Seq ID No.：78、84-86是乳腺的组织特异性靶区域。
在本文的一个具体的实施方案中，一种探针组合物，包括：靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意；靶向泛癌特异性区域的探针，所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意；和靶向组织特异性区域的探针，所述组织特异性区域选自SeqID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。在所述组织特异性区域中，Seq ID No.：77、96、106是卵巢的组织特异性靶区域。
在本文的一个具体的实施方案中，一种探针组合物，包括：靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意；靶向泛癌特异性区域的探针，所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意；和靶向组织特异性区域的探针，所述组织特异性区域选自SeqID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。在所述组织特异性区域中，Seq ID No.：68-69、75、110是宫颈的组织特异性靶区域。
在本文的一个具体的实施方案中，一种探针组合物，包括：靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意；靶向泛癌特异性区域的探针，所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意；和靶向组织特异性区域的探针，所述组织特异性区域选自SeqID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。在所述组织特异性区域中，Seq ID No.：94、107、109是子宫内膜的组织特异性靶区域。
在本文的一个具体的实施方案中，上述探针组合物，包括低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。所述低甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：216-217中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：221-222、228、231-232、234、238-240、247-250、261-262、264-265中的任意。所述高甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：374-375中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：379-380、386、389-390、392、396-398、405-408、419-420、422-423中的任意。
如下表1所示，其中Seq ID No.119、Seq ID No.120和Seq ID No.121均是靶向SeqID No.1所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.277、Seq ID No.278和Seq ID No.279均是靶向Seq ID No.1所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.122和Seq ID No.123均是靶向Seq ID No.2所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.280和Seq ID No.281均是靶向SeqID No.2所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.124和Seq ID No.125均是靶向Seq IDNo.3所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.282和Seq ID No.283均是靶向Seq ID No.3所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.126是靶向Seq ID No.4所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.284是靶向Seq ID No.4所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.127和SeqID No.128均是靶向Seq ID No.5所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.285和Seq IDNo.286均是靶向Seq ID No.3所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.129是靶向Seq IDNo.6所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.287是靶向Seq ID No.6所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.130是靶向Seq ID No.7所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.288是靶向Seq ID No.7所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.131和Seq ID No.132均是靶向Seq ID No.8所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.289和Seq ID No.290均是靶向SeqID No.8所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.133、Seq ID No.134和Seq ID No.135均是靶向Seq ID No.9所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.291、Seq ID No.292和Seq IDNo.293均是靶向Seq ID No.9所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.136是靶向Seq IDNo.10所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.294是靶向Seq ID No.10所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.137是靶向Seq ID No.11所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.295是靶向Seq ID No.11所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.138是靶向Seq IDNo.12所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.296是靶向Seq ID No.12所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.139是靶向Seq ID No.13所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.297是靶向Seq ID No.13所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.140和Seq ID No.141均是靶向Seq ID No.14所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.298和Seq ID No.299均是靶向Seq ID No.14所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.142和Seq ID No.143均是靶向Seq ID No.15所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.300和Seq ID No.301均是靶向SeqID No.15所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.144和Seq ID No.145均是靶向Seq IDNo.16所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.302和Seq ID No.303均是靶向Seq IDNo.16所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.146和Seq ID No.147均是靶向Seq IDNo.17所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.304和Seq ID No.305均是靶向Seq IDNo.17所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.148是靶向Seq ID No.18所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.306是靶向Seq ID No.18所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.149和Seq ID No.150均是靶向Seq ID No.19所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.307和Seq ID No.308均是靶向Seq ID No.19所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.151是靶向Seq ID No.20所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.309是靶向Seq IDNo.20所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.152是靶向Seq ID No.21所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.310是靶向Seq ID No.21所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.153是靶向Seq ID No.22所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.311是靶向Seq IDNo.22所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.154、Seq ID No.155和Seq ID No.156均是靶向Seq ID No.23所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.312、Seq ID No.313和Seq IDNo.314均是靶向Seq ID No.23所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.157和Seq IDNo.158均是靶向Seq ID No.24所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.315和Seq IDNo.316均是靶向Seq ID No.24所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.159和Seq IDNo.160均是靶向Seq ID No.25所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.317和Seq IDNo.318均是靶向Seq ID No.25所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.161和Seq IDNo.162均是靶向Seq ID No.26所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.319和Seq IDNo.320均是靶向Seq ID No.26所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.163是靶向Seq IDNo.27所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.321是靶向Seq ID No.27所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.164和Seq ID No.165均是靶向Seq ID No.28所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.322和Seq ID No.323均是靶向Seq ID No.28所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.166和Seq ID No.167均是靶向Seq ID No.29所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.324和Seq ID No.325均是靶向Seq ID No.29所示靶区域的高甲基化探针。SeqID No.168是靶向Seq ID No.30所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.326是靶向Seq IDNo.30所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.169和Seq ID No.170均是靶向Seq IDNo.31所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.327和Seq ID No.328均是靶向Seq IDNo.31所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.171是靶向Seq ID No.32所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.329是靶向Seq ID No.32所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.172和Seq ID No.173均是靶向Seq ID No.33所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.330和Seq ID No.331均是靶向Seq ID No.33所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.174是靶向Seq ID No.34所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.332是靶向Seq IDNo.34所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.175和Seq ID No.176均是靶向Seq IDNo.35所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.333和Seq ID No.334均是靶向Seq IDNo.35所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.177是靶向Seq ID No.36所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.335是靶向Seq ID No.36所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.178和Seq ID No.179均是靶向Seq ID No.37所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.336和Seq ID No.337均是靶向Seq ID No.37所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.180和Seq ID No.181均是靶向Seq ID No.38所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.338和Seq ID No.339均是靶向Seq ID No.38所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.182是靶向Seq ID No.39所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.340是靶向Seq IDNo.39所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.183和Seq ID No.184均是靶向Seq IDNo.40所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.341和Seq ID No.342均是靶向Seq IDNo.40所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.185是靶向Seq ID No.41所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.343是靶向Seq ID No.41所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.186是靶向Seq ID No.42所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.344是靶向Seq IDNo.42所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.187是靶向Seq ID No.43所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.345是靶向Seq ID No.43所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.188是靶向Seq ID No.44所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.346是靶向Seq IDNo.44所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.189和Seq ID No.190均是靶向Seq IDNo.45所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.347和Seq ID No.348均是靶向Seq IDNo.45所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.191是靶向Seq ID No.46所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.349是靶向Seq ID No.46所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.192是靶向Seq ID No.47所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.350是靶向Seq IDNo.47所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.193是靶向Seq ID No.48所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.351是靶向Seq ID No.48所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.194是靶向Seq ID No.49所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.352是靶向Seq IDNo.49所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.195是靶向Seq ID No.50所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.353是靶向Seq ID No.50所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.196和Seq ID No.197均是靶向Seq ID No.51所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.354和Seq ID No.355均是靶向Seq ID No.51所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.198是靶向Seq ID No.52所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.356是靶向Seq IDNo.52所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.199和Seq ID No.200均是靶向Seq IDNo.53所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.357和Seq ID No.358均是靶向Seq IDNo.53所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.201是靶向Seq ID No.54所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.359是靶向Seq ID No.54所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.202和Seq ID No.203均是靶向Seq ID No.55所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.360和Seq ID No.361均是靶向Seq ID No.55所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.204和Seq ID No.205均是靶向Seq ID No.56所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.362和Seq ID No.363均是靶向Seq ID No.56所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.206和Seq ID No.207均是靶向Seq ID No.57所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.364和Seq ID No.365均是靶向Seq ID No.57所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.208和Seq ID No.209均是靶向Seq ID No.58所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.366和Seq ID No.367均是靶向Seq ID No.58所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.210和Seq ID No.211均是靶向Seq ID No.59所示靶区域的低甲基化探针，Seq IDNo.368和Seq ID No.369均是靶向Seq ID No.59所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.212是靶向Seq ID No.60所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.370是靶向Seq IDNo.60所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.213和Seq ID No.214均是靶向Seq IDNo.61所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.371和Seq ID No.372均是靶向Seq IDNo.61所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.215是靶向Seq ID No.62所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.373是靶向Seq ID No.62所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.216是靶向Seq ID No.63所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.374是靶向Seq IDNo.63所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.217是靶向Seq ID No.64所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.375是靶向Seq ID No.64所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.221是靶向Seq ID No.68所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.379是靶向Seq IDNo.68所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.222是靶向Seq ID No.69所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.380是靶向Seq ID No.69所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.228是靶向Seq ID No.75所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.386是靶向Seq IDNo.75所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.231是靶向Seq ID No.77所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.389是靶向Seq ID No.77所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.232是靶向Seq ID No.78所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.390是靶向Seq IDNo.78所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.234是靶向Seq ID No.80所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.392是靶向Seq ID No.80所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.238是靶向Seq ID No.84所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.396是靶向Seq IDNo.84所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.239是靶向Seq ID No.85所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.397是靶向Seq ID No.85所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.240是靶向Seq ID No.86所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.398是靶向Seq IDNo.86所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.247是靶向Seq ID No.93所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.405是靶向Seq ID No.93所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.248是靶向Seq ID No.94所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.406是靶向Seq IDNo.94所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.249是靶向Seq ID No.95所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.407是靶向Seq ID No.95所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.250是靶向Seq ID No.96所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.408是靶向Seq IDNo.96所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.261是靶向Seq ID No.106所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.419是靶向Seq ID No.106所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.262是靶向Seq ID No.107所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.420是靶向Seq IDNo.107所示靶区域的高甲基化探针。Seq ID No.264是靶向Seq ID No.109所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.422是靶向Seq ID No.109所示靶区域的高甲基化探针。Seq IDNo.265是靶向Seq ID No.110所示靶区域的低甲基化探针，Seq ID No.423是靶向Seq IDNo.110所示靶区域的高甲基化探针。表1中给出了探针所靶向的靶序列。
在本文的一个具体的实施方案中，上述探针组合物中每一个探针的长度为40～60bp，优选为45～56bp，优选为50～56bp，进一步优选为50bp。
本文还提供了一种试剂盒。
在本文的一个具体的实施方案中，所述试剂盒包括上述任一实施方案所述的探针组合物。
本文还提供了探针组合物的用途。
在本文的一个具体的实施方案中，上述探针组合物用于制备检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌的试剂盒。
本文还提供了一种芯片。
在本文的一个具体的实施方案中，所述芯片上固定有上述任一实施方案所述的探针组合物。
本文还提供了一种利用所述探针组合物检测前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌等5种癌症的方法。
在本文的一个具体的实施方案中，所述检测方法采用杂交捕获的方式富集cfDNA，并用NGS技术检测与癌症高度相关的甲基化位点。覆盖了我国发病率最高的5种常见两性癌症(前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)。最终，根据检测血浆cfDNA中基因甲基化变化水平，为多癌早筛和早诊提供信息。
本文同时也提供了一种利用所述试剂盒同时检测上述5种癌症的甲基化水平改变的方法。
具体来说，本申请涉及受试者5种癌症体外检测方法，包括以下步骤：采集受试者样品；提取纯化所述样品中的DNA；针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；基于所述样本的甲基化水平判读所述患者的患病情况。
具体来说，所述受试者疑似患有癌症。具体来说，采集受试者的样品为血浆样品。具体来说，所述转化为使用重亚硫酸盐处理。
具体来说，所述探针组合物包括：靶向泛癌特异性区域的2个探针，靶向癌症特异性区域的n个探针，和靶向组织特异性区域的m个探针。所述探针组合物包括：低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。所述探针组合物中的每一个探针的长度为40～60bp。例如，所述探针组合物中的每一个探针的长度为45～56bp，优选50～56bp，进一步优选50bp。
具体来说，所述探针组合物中的n个探针靶向癌症特异性区域，其中，n为选自1-192中的任意的整数；其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意。所述探针组合物中的m个探针靶向所述组织特异性区域，其中，m为选自1-116中的任意的整数；其中，所述组织特异性区域选自Seq ID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。所述低甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：216-217中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：221-222、228、231-232、234、238-240、247-250、261-262、264-265中的任意。所述高甲基化探针包括靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：374-375中的任意，和靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：379-380、386、389-390、392、396-398、405-408、419-420、422-423中的任意。
具体来说，所述判读包括以下步骤：(1)比对泛癌特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者是否患有癌症；(2)比对癌症特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者患有的癌症为几种疑似癌症中的一种；(3)比对组织特异性区域数据库，并进行判读以确认受试者患癌的部位。所述步骤(1)包括进行如下判读：判断所述泛癌特异性区域Seq ID No.：63的甲基化水平是否大于等于55％，并且所述泛癌特异性区域Seq ID No.：64的甲基化水平是否大于等于60％，则判读所述患者患有癌症。所述步骤(2)包括进行如下判读：如果在靶向所述癌症特异性区域的n个探针中，n1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，且n1/n≥20％，优选n1/n≥30％，则判读患者患有组织特异性癌症中的任意一种。所述步骤(3)包括进行如下判读：在靶向所述组织特异性区域的m个探针中m1个探针靶向的区域的甲基化水平大于等于各自阈值，则进一步分析大于等于各自阈值的m1个探针所靶向的组织并计数每一个组织大于等于阈值的探针的个数，判读认为患者罹患癌症的组织是甲基化水平大于等于阈值的探针个数最多的组织。下表1中也给出了各靶区域的甲基化的阈值。
表1本申请中涉及的序列
Figure BDA0002406207710000161
Figure BDA0002406207710000171
Figure BDA0002406207710000181
Figure BDA0002406207710000191
Figure BDA0002406207710000201
Figure BDA0002406207710000211
Figure BDA0002406207710000221
Figure BDA0002406207710000231
Figure BDA0002406207710000241
Figure BDA0002406207710000251
Figure BDA0002406207710000261
实施例
实施例1：
如图1所示，本申请的实施流程具体如下：
1.1.cfDNA提取纯化
1.1.1.血浆样本制备：
4℃、2000g离心血液样本10min,将血浆转移到一个新的离心管中。4℃、16000g离心血浆样本10min,根据使用的收集管类型，执行下一步,本实验中使用的收集管类型为其他。
表2
Figure BDA0002406207710000271
1.1.2.裂解和结合
1.1.2.1.按照下表准备结合溶液/珠子混合物，然后彻底混匀。
表3
Figure BDA0002406207710000272
加入适量体积的血浆样品。
1.1.2.2.彻底混匀血浆样品和结合溶液/珠子混合物。
1.1.2.3.在旋转混匀仪上充分的结合10min，使cfDNA结合到磁珠上。
1.1.2.4.将结合管放在磁力架上5min，直到溶液变得澄清，磁珠完全吸附在磁力架上。
1.1.2.5.用移液管小心的弃去上清，继续保持管子在磁力架上几分钟，用移液管移去残留上清。
1.1.3.洗涤
1.1.3.1.将珠子重悬在1ml洗涤溶液中。
1.1.3.2.将重悬液转移到新的无吸附1.5ml离心管中。保留结合管。
1.1.3.3.将含有珠子重悬液的离心管置于磁力架上，20s。
1.1.3.4.将分离得到的上清，吸出洗涤结合管，将清洗后的残留珠子再次收集到重悬液中，弃掉裂解/结合管。
1.1.3.5.管子置于磁力架上2min，直到溶液变得澄清，珠子聚集在磁力架，用1ml移液器移除上清。
1.1.3.6.管子留在磁力架上，用200μL移液器尽可能移除残留的液体。
1.1.3.7.将管子从磁力架取下来，加入1ml洗涤溶液，涡旋30s。
1.1.3.8.置于磁力架2min，直到溶液澄清，珠子聚集在磁力架上，用1ml移液管移除上清。
1.1.3.9.管子留在磁力架上，用200μL移液器彻底移除残留液体。
1.1.3.10.将管子从磁力架取下，加入1ml 80％乙醇，涡旋30s。
1.1.3.11.置于磁力架上2min，溶液变得澄清，用1ml移液器移去上清。
1.1.3.12.管子留在磁力架上，用200μL移液器移去残留液体。
1.1.3.13.用80％乙醇重复上述1.1.3.10.-1.1.3.12.步骤一次，尽可能除去上清。
1.1.3.14.管子留在磁力架上，空气中干燥珠子3～5分钟。
1.1.4.洗脱cfDNA
1.1.4.1.按照下表加入洗脱液。
表4
Figure BDA0002406207710000281
1.1.4.2.涡旋5min，置于磁力架上2min，溶液变得澄清，吸取上清液中的cfDNA。
1.1.4.3.纯化的cfDNA立即使用，或者将上清转移至新的离心管中，-20℃保存。
1.2.gDNA打断与纯化：
1.2.1.按照Qubit浓度，取2μg gDNA，加水补至125μl，加入到covaris 130μl打断管中，设置程序：50W，20％，200个循环，250s。
1.2.2.打断结束后取1μl样品使用Agilent2100进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
对于cfDNA样品，Agilent2100进行片段检测，直接Qubit用于后续的实验。
1.3.末端修复、3‘端加“A”：
1.3.1.取20ng打断后的gDNA或cfDNA至PCR管中，用无核酸酶水补至50μl，加入以下试剂，涡旋混匀：
表5
组分 体积
gDNA/cfDNA 50μl
终止修复和A加尾缓冲液 7μl
终止修复和A加尾酶混合物 3μl
总体积 60μl
1.3.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度85℃。
表6
温度 时间
20℃ 30min
65℃ 30min
4℃ ∞
1.4.接头连接及纯化：
1.4.1.参照下表将接头提前稀释成合适的浓度：
表7
每50ul ER和AT反应的片段化的DNA 接头浓度
1μg 10uM
500ng 10uM
250ng 10uM
100ng 10uM
50ng 10uM
25ng 10uM
10ng 3uM
5ng 5uM
2.5ng 2.5uM
1ng 625nM
1.4.2.按下表配制以下试剂，轻轻吸打混匀，短暂离心：
表8
Figure BDA0002406207710000291
Figure BDA0002406207710000301
1.4.3.设置以下程序在PCR仪上进行反应：无热盖。
表9
温度 时间
20℃ 30min
4℃ ∞
1.4.4.按照以下体系，加入纯化磁珠进行实验(Agencourt AMPure XP磁珠提前拿至室温震荡混合均匀备用)：
表10
组分 体积
接头连接产物 110μl
Agencourt AMPure XP珠子 110μl
总体积 220μl
1.4.4.1.轻轻吸打混匀6次。
1.4.4.2.室温静置孵育5-15min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.4.4.3.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
1.4.4.4.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
1.4.4.5.室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。
1.4.4.6.加入22μl的无核酸酶水，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min。
1.4.4.7.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.4.4.8.用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管。
1.5重亚硫酸盐处理及纯化：
1.5.1.预先拿出所需要的试剂，并溶解。根据下表加入各试剂：
表11
Figure BDA0002406207710000302
Figure BDA0002406207710000311
1.5.2.DNA保护缓冲液加入液体变成蓝色。轻轻吸打混匀，然后分成两管至于PCR仪上。
1.5.3.设置以下程序，并运行：热盖105℃。
表12
温度 时间
95℃ 5min
60℃ 10min
95℃ 5min
60℃ 10min
4℃ ∞
1.5.4.简短离心将两管相同样本合并至同一个干净的1.5ml离心管中。
1.5.5.每个样本中加入310μl缓冲液BL(样本量少于100ng加入1μl的载体RNA(1μg/μl))，涡旋混匀，简短离心。
1.5.6.加入250μl无水乙醇到每个样本中，涡旋混匀15s，简短离心，将混合液加入到准备好的对应的离心柱中。
1.5.7.静置1min，离心1min，将收集管中的液体重新转移到离心柱中，离心1min，弃去离心管的液体。
1.5.8.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去废液。
1.5.9.加入500μl缓冲液BD(注意是否加入无水乙醇)，盖好管盖，室温放置15min。离心1min，弃去离心下的液体。
1.5.10.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去离下来的液体，在重复一次，共2次。
1.5.11.加入250μl无水乙醇，离心1min，将离心柱放置到新的2ml收集管中，弃掉全部剩余液体。
1.5.12.将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl无核酸酶水到离心柱膜中心，轻轻盖上管盖，室温放置1min，离心1min。
1.5.13.将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，离心1min。
1.6.杂交前预扩增及纯化：
1.6.1.按下列表格配制反应体系，吹打混匀，短暂离心：
表13
Figure BDA0002406207710000321
1.6.2.设置以下程序并启动PCR程序：热盖105℃
表14
Figure BDA0002406207710000322
1.6.3.PCR循环数根据投入DNA的量不同进行调整，参考数据如下所示：
表15
Figure BDA0002406207710000323
1.6.4.向反应结束后的PCR管中加入50μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器吹打混匀，避免产生气泡(Agencourt AMPure XP提前室温混匀并平衡)。
1.6.5.室温孵育5-15min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.6.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
1.6.7.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
1.6.8.室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发。
1.6.9.加入30μl的无核酸酶水，将离心管从磁力架取下，使用移液器，轻轻吸打重悬磁珠。
1.6.10.室温静置2min，将200μl PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.6.11.用移液器将上清液转移到新的200μl PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记好样本号，准备下一步反应。
1.6.12.取1μl样品使用Qubit进行文库浓度测定，记录文库浓度。
1.6.13.取1μl样品使用安捷伦2100进行文库片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp间。
1.7.样品与探针杂交：
1.7.1.按照以下体系将样品文库与各种Hyb阻断物混匀，标记为B：
表16
组分 体积
预扩增产物 750ng对应体积
Hyb人阻断物 5μl
接头阻断物 6μl
增强剂 5μl
1.7.2.将准备好的样品和Hyb阻断物混合物放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩。
1.7.3.将抽干的样品重新溶在约9μl无核酸酶水中,总体积10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为B。
1.7.4.将Hyb缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃水浴锅内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl Hyb缓冲液置于新的200μl PCR管内，盖好管盖,标记为A,继续置于65℃水浴锅内孵育待用。
1.7.5.通过艾吉泰康生物科技(北京)有限公司合成以下低甲基化探针：
a)靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：119-215中的任意，b)靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：216-217中的任意，和c)靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：218-276中的任意，
并且合成以下高甲基化探针：
d)靶向癌症特异性区域的探针Seq ID No.：277-373中的任意，e)靶向泛癌特异性区域的探针Seq ID No.：374-375中的任意，和f)靶向组织特异性区域的探针Seq ID No.：376-434中的任意。
并且以a:b:c:d:e:f＝1:1:1:1:1:1的比例制成探针组合物。
1.7.6.取5μl RNA酶阻断物与2μl探针组合物置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为C。
1.7.7.设置PCR仪参数，热盖100℃，95℃，5min；65℃，保持。
1.7.8.将PCR管B置于PCR仪上，运行以上程序。
1.7.9.PCR仪温度降至65℃时，将PCR管A置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖。
1.7.10.5min后，将C置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖。
1.7.11.将PCR管C放置入PCR仪2min后，把移液器调至13μl，从PCR管A中吸取13μlHyb缓冲液移至PCR管C中，吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(16-24h)。
1.8.捕获目标区域DNA文库：
1.8.1.捕获磁珠的准备
1.8.1.1.将磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠)从4℃取出，涡旋震荡重悬。
1.8.1.2.取50μl磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清。
1.8.1.3.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠。
1.8.1.4.置磁力架上1min，移除上清。
1.8.1.5.重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次。
1.8.1.6.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
1.8.2.捕获目标DNA文库
1.8.2.1.保持杂交产物PCR管C在PCR仪上，将准备好的200μL捕获磁珠加入到杂交后的产物PCR管C中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min(转速最好不要超过10转/min)。
1.8.2.2.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液。
1.8.2.3.向PCR管C内加入200μL的洗涤缓冲液1，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min(转速最好不要超过10转/min)，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清。
1.8.2.4.加入200μl的65℃预热后的洗涤缓冲液2，轻轻吸打6次混匀，置于混匀仪上65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗。
1.8.2.5.短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用洗涤缓冲液2再重复2次清洗，共计3次。最后一次彻底移除洗涤缓冲液2。
1.8.2.6.PCR管继续置于磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液，室温晾干2min。
1.8.2.7.向PCR管加入30μL无核酸酶水，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
1.9.捕获后扩增及纯化
1.9.1.根据下表配制反应体系进行捕获文库的富集，轻轻吹打混匀后，短暂离心：
表17
Figure BDA0002406207710000351
1.9.2.设置以下程序，将样品置于PCR仪中，运行程序：热盖105℃。
表18
Figure BDA0002406207710000352
1.9.3.PCR结束后向样品加入55μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器轻轻吸打混匀。
1.9.4.室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.9.5.移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200μl 80％无水乙醇，静置30s。
1.9.6.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％无水乙醇，静置30后彻底移除上清。
1.9.7.室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发。
1.9.8.加入25μl无核酸酶水，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min。
1.9.9.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.9.10.用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息。
1.9.11.取1μl文库使用Qubit进行定量，记录文库浓度。
1.9.12.取1μl样品使用Agilent2100进行文库片段长度测定。
1.9.13.使用Illumina高通量测序平台进行测序。
1.10.甲基化生信分析流程。大致如下：使用trimmomatic等质控软件查看测序质量，去除低质量的读段，然后采用Bismarker等比对软件将质控后的干净的数据比对到参考基因组上，采用methykit等R包提取相应的甲基化位点。最后，计算出Panel上的每个靶区域的甲基化比率。
实施例2
一例乳腺癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表19所示(表19显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。
表19
Figure BDA0002406207710000361
Figure BDA0002406207710000371
对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物TRIM15、RUNX3、TFAP2E、RASSF1、SFRP2、CCND2的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表19所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表19中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于乳腺组织特异性的3个靶区域Seq ID No.78、Seq ID No.85和Seq IDNo.86大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，乳腺组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有乳腺癌的样本。
患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。
实施例3
一例前列腺癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表20所示(表20显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。
表20
基因 CHR 起始 终止 甲基化比率 靶区域序列号
TBX15 1 119527108 119527157 0.61 Seq ID No.63
CRYGD 2 208989200 208989249 0.68 Seq ID No.64
CTBP1 4 1212491 1212540 0.43 Seq ID No.80:
EVX1 7 27283361 27283410 0.57 Seq ID No.93:
SND1 7 127484663 127484712 0.38 Seq ID No.95
RUNX3 1 25257457 25257588 0.79 Seq ID No.1
TFAP2E 1 36043585 36043634 0.66 Seq ID No.6
TBX15 1 119532116 119532196 0.57 Seq ID No.8
PAX3 2 223162875 223162930 0.48 Seq ID No.14
RASSF1 3 50378359 50378432 0.46 Seq ID No.15
SFRP2 4 154710475 154710536 0.43 Seq ID No.19
APC 5 112073300 112073439 0.38 Seq ID No.23
CCND2 12 4381740 4381801 0.41 Seq ID No.51
CCND2 12 4381834 4381883 0.51 Seq ID No.52
对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物RUNX3，TFAP2E，TBX15，PAX3，RASSF1，SFRP2，APC和CCND2的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表21所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表20中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于前列腺组织特异性的3个靶区域Seq ID No.80，Seq ID No.93和Seq ID No.95大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，前列腺组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有前列腺癌的样本。
患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。
实施例4
一例卵巢癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表21所示(表21显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。
表21
基因 CHR 起始 终止 甲基化比率 靶区域序列号
TBX15 1 119527108 119527157 0.58 Seq ID No.63
CRYGD 2 208989200 208989249 0.63 Seq ID No.64
ITGB5 3 124554058 124554107 0.68 Seq ID No.77
LYN 8 56791576 56791625 0.74 Seq ID No.96
RNF121 11 71699167 71699216 0.33 Seq ID No.106
RUNX3 1 25257457 25257588 0.54 Seq ID No.1
RUNX3 1 25258133 25258195 0.47 Seq ID No.2
ELF3 1 201979499 201979616 0.18 Seq ID No.9
TRIM15 6 30131701 30131768 0.37 Seq ID No.31
TRIM15 6 30131971 30132020 0.31 Seq ID No.32
HOXA11AS 7 27225523 27225577 0.66 Seq ID No.34
C11orf21 11 2322618 2322667 0.81 Seq ID No.46
对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物RUNX3，ELF3，TRIM15，HOXA11AS和C11orf21的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表21所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表21中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于卵巢组织特异性的3个靶区域Seq ID No.77，Seq ID No.96和Seq IDNo.106大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，卵巢组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有卵巢癌的样本。
患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。
实施例5
一例宫颈癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表22所示(表22显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。
表22
基因 CHR 起始 终止 甲基化比率 靶区域序列号
TBX15 1 119527108 119527157 0.55 Seq ID No.63
CRYGD 2 208989200 208989249 0.60 Seq ID No.64
LOC100128071 1 32826921 32826970 0.43 Seq ID No.221
LOC100128071 1 32827102 32827151 0.37 Seq ID No.222
CXCR4 2 136875849 136875898 0.54 Seq ID No.228
SLC5A8 12 101604008 101604057 0.65 Seq ID No.265
TFAP2E 1 36043002 36043063 0.87 Seq ID No.5
ELF3 1 201979499 201979616 0.18 Seq ID No.9
PAX3 2 223162749 223162801 0.61 Seq ID No.13
CDO1 5 115152485 115152543 0.55 Seq ID No.25
HOXA11AS 7 27225428 27225497 0.57 Seq ID No.33
SGCE 7 94284526 94284588 0.49 Seq ID No.38
GFRA1 10 118032831 118032906 0.35 Seq ID No.40
SALL1 16 51184379 51184441 0.69 Seq ID No.58
对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物TFAP2E，ELF3，PAX3，CDO1，HOXA11AS，SGCE，GFRA1和SALL1的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表22所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表22中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于宫颈组织特异性的4靶区域Seq ID No.221，Seq IDNo.222，Seq ID No.228和Seq ID No.265大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，宫颈组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有宫颈癌样本。
患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。
实施例6
一例子宫内膜癌样本，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到甲基化水平，结果如下表23所示(表23显示了检测到的大于等于甲基化阈值的靶区域)。
表23
基因 CHR 起始 终止 甲基化比率 靶区域序列号
TBX15 1 119527108 119527157 0.55 Seq ID No.63
CRYGD 2 208989200 208989249 0.60 Seq ID No.64
PON3 7 95026049 95026098 0.84 Seq ID No.94
PAK1 11 77168466 77168515 0.21 Seq ID No.107
SOCS2 12 93966269 93966318 0.65 Seq ID No.109
TFAP2E 1 36042938 36042987 0.66 Seq ID No.4
TFAP2E 1 36043002 36043063 0.82 Seq ID No.5
ELF3 1 201979499 201979616 0.13 Seq ID No.9
RASSF1 3 50378359 50378432 0.59 Seq ID No.15
SFRP2 4 154710796 154710845 0.48 Seq ID No.22
CDO1 5 115152372 115152432 0.67 Seq ID No.24
HOXA11AS 7 27225428 27225497 0.53 Seq ID No.33
HOXA11AS 7 27225523 27225577 0.75 Seq ID No.34
GFRA1 10 118032831 118032906 0.42 Seq ID No.40
对检测样本进行模式识别分类鉴定，首先判读出泛癌特异性标志物TBX15和CRYGD基因的甲基化水平大于等于55％和60％，则初步判断该样本为患有癌症的样本；其次，判读出癌症特异性标志物TFAP2E，ELF3，RASSF1，SFRP2，CDO1，HOXA11AS和GRA1的甲基化水平均大于等于表1中所示的各自阈值(如上表23所示)，则进一步判断该样本为患有以下11种癌症(食管癌、胃癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌)中的任意癌症的样本；最后，判读组织特异性标志物，基于表23中大于等于各自阈值的靶区域，可以看出属于子宫内膜组织特异性的3个靶区域Seq ID No.94,Seq IDNo.107和Seq ID No.109大于等于各自的甲基化水平的阈值，没有其他的组织特异性标志物的甲基化大于等于其各自的阈值，因此在大于等于各自甲基化阈值的组织特异性标志物中，子宫内膜组织特异性标志物最多，则最终判断该样本为患有子宫内膜癌的样本。
患者术后48小时，再次抽血，采用本申请的Panel检测，按实施例1的方法采集外周血，建库，测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，通过模式识别的方法，分析所有测序数据，结果显示上表中的基因甲基化水平回归正常水平。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本申请权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 博尔诚（北京）科技有限公司
<120> 一种检测常见两性癌症的探针组合物
<130> PC00598
<141> 2020-03-10
<160> 316
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctctgctctc ccctcaaaac aagtttcagg atcttgcagg cctcgcggcg tcgttcttcg 60
ttgtggcggc ctgtggctct ttgaaaaaca cgacgaggcc tgcaaaatgc gtttttcttt 120
ttttccttta cg 132
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atccgacggt ggccgcaaga tctcatcatg gatctgaccc ctgctcagcg cgcgccattt 60
cgt 63
<210> 3
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
cgctccaggg gcgaaggact ctggactcac cccgaccacc gggagagctg gcccctaccc 60
a 61
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcactgcggg attcggcgtt gccgccagcc cagtggggag tgaattagcg 50
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cggcccttcc gacggcacga ggaactcctg tcctgcccca cagaccttcg gcctccgccg 60
ag 62
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agcttaacag gaatattttc cagcagtgag caggggctgt atgggacgcg 50
<210> 7
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gagcgcctga aatatacttg caaggccgca gcaatatact tgcaaggccg cag 53
<210> 8
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cgatcttcca gtcctagtgc cctggtcgag acggttctat ccttttgcaa agaagccgga 60
aagagctggg tcccgggggc g 81
<210> 9
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cgggatgaca gactctgaca atcattaaac cagccgggcc tgatttccca gcactgcctg 60
ctaagatccg ggccaagtgg cactgaatat gcaaatcacc tggggccagg agcccagt 118
<210> 10
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gggcctctgg tgtcccccat ggtgcagggg gatgacaagg tgtttcgccg 50
<210> 11
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
cgtggccacc aatgacccgc ggcgcccccg cgtgtccccg cagccactcc 50
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctggctgggc gcacggcggt gctgagctgg tggggcggcg gcgctgagcg 50
<210> 13
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
agaattctaa tttatttaat tattctaaaa attccaatca caatggcgcg gcg 53
<210> 14
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cgcagccggg acaatttcga gacaacttcg agacaatttc gaatggacaa attgcg 56
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
ctgaggagag ccgcgcaatg gaaacctggg tgcagggact gtggggcccg aaggcggggc 60
tgggcgcgct ctcg 74
<210> 16
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
cggccagtgc ctccgcgccc cggctccggt ccccaccgtc cccgccccag atttccggag 60
gagca 65
<210> 17
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cgctgcagac tcctgacctg ccgactgcgg atcccgagtc cccggatccc ggacccatcc 60
tgtggagccc actcctg 77
<210> 18
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ttgcaggaac tgtatccctg cctgcgacgg gggcgagata gatgattccg 50
<210> 19
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
cgcccccaca gtgagcgagc agggcgcggg ctgcgggagt ggggggcacg cagggcaccc 60
cg 62
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
cgggcttgtt ttgccccagt ccgaagtttc tgctgggttg ccaggcatga 50
<210> 21
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gttggggggc tgcgtccctg gtagccgcgt gtgccctgtg atggagcccg 50
<210> 22
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
cgaatctcca gccaccgttc agcagcctgt cggtgtgctc cccaatgccg 50
<210> 23
<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
tatgcgtgtc aactgccatc aacttccttg cttgctgggg actggggccg cgagggcata 60
cccccgaggg gtacggggct agggctaggc aggctgtgcg gttgggcggg gccctgtgcc 120
ccactgcgga gtgcgggtcg 140
<210> 24
<211> 61
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gggccccttt taagcgcttg gagtcactag gaatgtacca acggccctcg gagggaggac 60
g 61
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
cggctcacgc gcacatcccc ggcttccccg ggctccgcgc cttcccaaga gccccgttg 59
<210> 26
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cgggcctaaa atgcattagc tggtttttac tgaatttacg cttagcagag acctacagaa 60
aaatgagatc cagctcgccg 80
<210> 27
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
cgcgaggctg gagtgatttt tttgataatc ctgctagaga cagaatgggt aa 52
<210> 28
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
cggggctcca gccaggcgtc accttccaca gcgaacctgc gaaccacagc gtcccctggg 60
ggtctccgtc cgcgtggccg cttcctctt 89
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
cgcgccccgc ctgctggacc acttcatctg tgagctgccg gcgttgctca agctggc 57
<210> 30
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
cggagacact accgagaacc agatgttcgc cgcccgcgtg gtcatcctgc 50
<210> 31
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
aacttactgc gaggagcacg gcgagaagat ctacttcttc tgcgagaacg atgccgagtt 60
cctctgtg 68
<210> 32
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
cgaggcattc ccagactgaa ggcagatagg gctccacttg gatgtgtggt 50
<210> 33
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tcggggccag agtttgaagc cgtggatgtg cctgcctggt ggcttgtccg atttgcacgg 60
tgacttgatt 70
<210> 34
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
cgaagcgctt tagtgccttc cgtccctaaa ccgccaacag ccagaacggc ttctc 55
<210> 35
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ttccttcctc ctgctggcca gagacacatt ttgcatctgc aaggcatccg gagatcagcc 60
gcg 63
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
agaaagcgag gcttggaggg cgcctacacg gggccccatg gcccgctgcg 50
<210> 37
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
agagaagctc ctggagcggc cagatacctg ttggctcctg agcagcatcg cccagtgcag 60
cctccg 66
<210> 38
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
cgccaccaaa agtcggtagc tgggagcctt caaagcccgc caaacacact ggaagcatcc 60
aca 63
<210> 39
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
cgcactcggt acggcagcat ctctggcctc cagccggggt taaccctgac ctgaac 56
<210> 40
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
cggtaatctt cgagagctcg aagggccgag ttgggccagg acgatttccg agcagagccc 60
tcggctcgga tgctcg 76
<210> 41
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
cgtgttccga ggccagattt cttctggcca gaggaccctc ggcctgctcc 50
<210> 42
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
cgagctacgt ggtgctcttg gcagaccttg actaggttct ttttacagcg 50
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
catttcaaag ctacacaatg cgggcggtcc cggcgaggcg ggaggggccg 50
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
gagcccgcga tggagctttg tgaagatgca ggcgttgggg ctgctcggcg 50
<210> 45
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
cccccttgat gaggtcctga ccaaatgcag gaggagcaat tccagcaccg aggggcg 57
<210> 46
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
cggaaaccct gcctgtactg gggccgcagc gctgccccca cccatacgta 50
<210> 47
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
cgggaaaaac aaactccaag tcgagtttaa cagccgaaac gctccgtgcc 50
<210> 48
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
cggcggacaa gaaggagaca gaacagatcc cttggctccc tcgcagcgat 50
<210> 49
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
gcagggggct gtattggaag ccgccgggct ggctgcaggc gccaaagtcg 50
<210> 50
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
cgagttgagg gaataatcag aaagagagct ccctctggaa gtcgcagtcc 50
<210> 51
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
tgtaaagaca gccttgactc aagcatgcgt tagagcacgt gtcagggccg accgtgctgg 60
cg 62
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
agcctggcga gtgaggcgcg aaaccggagg ggtcggcgag gatgcgggcg 50
<210> 53
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
tggcttcagc ttcaatccca gaaaagtgga tcaaaacgac aggttccacg aacaaacact 60
gcgccg 66
<210> 54
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
cgcctctact ttggagaaaa ggaaaagggc gtgaggtttc ggtcattttt 50
<210> 55
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
aaaataaagt tcgattattt cacctggctt gtcagtcacc tatgcaggcg tctgagcccc 60
cg 62
<210> 56
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
cgcccggccc ccagcccgga gagctgccac cgaccccctc aacgtcccaa gccccagctc 60
tgtcgc 66
<210> 57
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
cggagattcg gaaacccgca gagacttctc aagtcagcag gaacttggaa accgctgttc 60
cctcca 66
<210> 58
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
cgtccgtttg caccgtctcc ggaacaactg gcggccagca gcactctcca ccccggccgc 60
aac 63
<210> 59
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 59
tgctgaccgc ctcgcagcgc tggccgggct ccgggaggag ggccccggcg ggtggcg 57
<210> 60
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 60
ggcgggggcg gcgggggtgg tggcggaggc ggcgggggcc cagggtcccg 50
<210> 61
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 61
cgggagggag tcggaggcgc cagcccactg gggaggtggc gctgggcgcg cgggatgcgc 60
ggggagcctt ctctgcagga gccg 84
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 62
cggtctgacg ccccctgctc attcgccagg cagccttgat tggcatgacc 50
<210> 63
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
gagcgcctga aatatacttg caaggccgca gcaatatact tgcaaggccg cag 53
<210> 64
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 64
ctggctgggc gcacggcggt gctgagctgg tggggcggcg gcgctgagcg 50
<210> 68
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 68
attttaaaat gtgcatcatt gtctcgtgct cggcgcatgc gacctcagcg 50
<210> 69
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 69
tcaggcagtg gcatccaggg cagcgacgaa gcggcctggg gaaattgacg 50
<210> 75
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 75
gggcggagag gtgcgcggct tgggaagccc aggggaccct gctgtttgcg 50
<210> 77
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 77
cgctcaaccc agaacagcag ctgtcggtgg ggctgcggag cccacaacac 50
<210> 78
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 78
ggagcggttc catggcattt gccagtgaca tgacattctg caggaaagcg 50
<210> 80
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 80
ctggacgagt cttcacaggt tatgctgggt ggcagtgagt tatgaaggcg 50
<210> 84
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 84
cgcctcagag ccagaagttt atggctccca cctgctcaat ctgacaggaa 50
<210> 85
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 85
cggggtgctt ctggagcctg cctcccaggg agcaggctga ggagctggcg 50
<210> 86
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 86
cggggctgtg gtcacagtaa agcaaggcga tcttcgcaca cagcaagtgc 50
<210> 93
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 93
actgctcggg gaatgcttca attgctcggg gaagacactt tccccaggcg 50
<210> 94
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 94
acttctgcaa ggccagacgt gaggcgacac tgaattgctc ccgagacgcg 50
<210> 95
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 95
cgtatacttt cattattgta gttatttaag atttattggg ctctgtgtgc 50
<210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 96
cggtgcccga gcctaatctt acatcttgga tttgtaagtg gcatttattg 50
<210> 106
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 106
cgctgctctg ttgcttccta agggtgcatt cctagggatg gaattttggc 50
<210> 107
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 107
ggtgctttga aggctgcggc tctgcagttc ttattcactg gctgggaccg 50
<210> 109
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 109
atcttggatc tctgctctct ttatcttttc tctagagctg ggccagggcg 50
<210> 110
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 110
gttttgttca agtggtaccc gaggggacgc accatttaaa taagcaggcg 50
<210> 119
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 119
cataaaaaaa aaaaaaaaaa acacatttta caaacctcat catatttttc 50
<210> 120
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 120
aaaaaaccac aaaccaccac aacaaaaaac aacaccacaa aacctacaaa 50
<210> 121
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 121
caaaacctac aaaacaaaat cctaaaactt attttaaaaa aaaaacaaaa 50
<210> 122
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 122
acaaaataac acacactaaa caaaaatcaa atccataata aaatcttaca 50
<210> 123
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 123
cactaaacaa aaatcaaatc cataataaaa tcttacaacc accatcaaat 50
<210> 124
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 124
taaataaaaa ccaactctcc caataatcaa aataaatcca aaatccttca 50
<210> 125
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 125
caactctccc aataatcaaa ataaatccaa aatccttcac ccctaaaaca 50
<210> 126
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 126
cactaattca ctccccacta aactaacaac aacaccaaat cccacaataa 50
<210> 127
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 127
ctcaacaaaa accaaaaatc tataaaacaa aacaaaaatt cctcatacca 50
<210> 128
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 128
caaaaatcta taaaacaaaa caaaaattcc tcataccatc aaaaaaacca 50
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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cgctaaacaa aaatcaaatc cataataaaa tcttacgacc accgtcgaat 50
<210> 282
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 282
taaataaaaa ccaactctcc cgataatcga aataaatcca aaatccttcg 50
<210> 283
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 283
caactctccc gataatcgaa ataaatccaa aatccttcgc ccctaaaacg 50
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<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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taaaaaatca aacccgacta atttaataat tatcaaaatc tatcatcccg 50
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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caaaaataaa ctccacaaaa taaatccgaa atccgaaaac tcgaaatccg 50
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gaaatccgaa aactcgaaat ccgcaatcga caaatcaaaa atctacaacg 50
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gctataattc gcaaattcgc tataaaaaat aacgcctaac taaaaccccg 50
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tataaatact tccaatatat ttaacgaact ttaaaaactc ccaactaccg 50
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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caataaatac cacttacaaa tccaaaatat aaaattaaac tcgaacaccg 50
<210> 419
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 419
accaaaattc catccctaaa aatacaccct taaaaaacaa caaaacaacg 50
<210> 420
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 420
cgatcccaac caataaataa aaactacaaa accgcaacct tcaaaacacc 50
<210> 422
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 422
cgccctaacc caactctaaa aaaaaaataa aaaaaacaaa aatccaaaat 50
<210> 423
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 423
cgcctactta tttaaataat acgtcccctc gaataccact taaacaaaac 50

Claims (10)

1.一种探针组合物，其包括：
靶向前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的任意癌症的特异性区域的探针，
其中，所述癌症特异性区域选自Seq ID No.：1-62中的任意。
2.根据权利要求1所述的探针组合物，其还包括：
靶向泛癌特异性区域的探针，
所述泛癌特异性区域选自Seq ID No.：63-64中的任意。
3.根据权利要求1所述的探针组合物，其还包括：
靶向组织特异性区域的探针，
所述组织特异性区域选自Seq ID No.：68-69、75、77-78、80、84-86、93-96、106-107、109-110中的任意。
4.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：80、84、93、95是前列腺的组织特异性靶区域。
5.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：78、84-86是乳腺的组织特异性靶区域。
6.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：77、96、106是卵巢的组织特异性靶区域。
7.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：68-69、75、110是宫颈的组织特异性靶区域。
8.根据权利要求3所述的探针组合物，其特征在于，在所述组织特异性区域中，Seq IDNo.：94、107、109是子宫内膜的组织特异性靶区域。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的探针组合物，其包括：
低甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的不含CG甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交，和
高甲基化探针，其与经重亚硫酸盐转化的CG全部甲基化的所述癌症特异性区域、泛癌特异性区域、以及组织特异性区域杂交。
10.根据权利要求9所述的探针组合物，其中所述探针组合物中的每一个探针的长度为40～60bp。
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