CN114395628B - 用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用 - Google Patents

用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用，所述标志物选自28个标志物的任一种。本发明使用所述的标志物，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测，并且，本发明所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。

Description

用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用。
背景技术
在中国，结直肠癌是发病率最高的癌症之一。据2018年国家癌症中心发布的最新数据显示，2014年我国的结直肠癌新发病例达到37万例，约占全世界的26％；发病率约为28/10万人，在所有的恶性肿瘤中排名第三。早期结直肠癌的治愈率在90％。目前临床上有效的筛查手段是肠镜，但这种侵入性的筛查方法客户依从性查。早期发现是提高患者生存率和治愈率的关键，但目前缺乏准确的非侵入性诊断方法。目前，DNA甲基化已被证明具有组织特异性,可用于早期癌症检测，并可根据循环肿瘤DNA(ctDNA)甲基化特征追踪到肿瘤原发部位。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测结直肠癌的标志物以及探针组合物，可以用于结直肠癌的筛查，所述的标志物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，以及癌症患者的预后检测，降低了侵入性检测造成的危害，并且具有更高的灵敏度和准确性。
本发明具体技术方案如下：
1.一种用于检测结直肠癌的标志物，所述标志物对应基因选自下述中的一种：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85。
2.根据项1所述的标志物，其中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:28所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
3.一种探针组合物，所述探针组合物包含靶向项1或2所述标志物甲基化的探针。
4.根据项3所述的探针组合物，其中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域杂交。
5.根据项4所述的探针组合物，其中，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域的正义链或反义链的每个核苷酸杂交；
优选的，所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域的正义链或反义链的每个核苷酸杂交。
6.根据项5所述的探针组合物，其中，n和m均是1-10中的任意整数。
7.根据项5或6所述的探针组合物，其中，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选的，x1为0-100中的任意整数；
优选的，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选的，x2为0-100中的任意整数。
8.根据项5-7中任一项所述的探针组合物，其中，所述第一探针组合物包括如SEQID NO:29-84中的一种或两种，所述第二探针组合物包括如SEQ ID NO:85-140中的一种或两种。
9.标志物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述标志物对应基因选自下述中的一种：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85。
10.根据项9所述的用途，其中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-28所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
11.探针组合物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述探针组合物用于靶向结直肠癌的甲基化后的标志物。
12.根据项11所述的用途，其中，所述探针组合物为项3-8中任一项所述的探针组合物。
13.一种用于结直肠癌检测的组合物，所述组合物包括用于检测选自下述标志物对应基因中任一种甲基化的核酸：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85。
14.根据项13所述的组合物，其中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:28所示的一种。
15.根据项13或14所述的组合物，其中，所述核酸包括项3-8中任一项所述的探针组合物。
16.根据项13或14所述的组合物，其中，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
17.根据项13-14以及16中任一项所述的组合物，其中，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
18.根据项13-14以及16-17中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂，优选的，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
19.一种试剂盒，其包含项1或2所述的标志物或者项3-8中任一项所述的探针组合物或者项13-18中任一项所述的组合物。
20.一种芯片，其包含项1或2所述的标志物或者项3-8中任一项所述的探针组合物或者项13或14所述的组合物。
发明的效果
本发明的发明人利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析结直肠癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与结直肠癌相关的甲基化基因，并确定了结直肠癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。
本发明所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
具体实施方式
下面对本发明做以详细说明。虽然显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本发明提供了一种检测结直肠癌的标志物，所述标志物对应基因选自下述中的一种：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85。
所述对应基因指的是标志物相对应的基因，在本发明中，所述标志物相对应的基因是选自下述中的一种：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85
在一个实施方案中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:28所示的一种，优选的，所述标志物为甲基化后的标志物。
其中，FBLIM1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；KIAA1522的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；AGBL4的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；VAV3的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；NGF-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；FAM72B的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；FAM72A的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；CD34的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；ARHGAP22的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；CEP164的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；B4GALNT1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；EVL的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；PTPRS的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；ZNF566的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；ZNF829的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；RTN4的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；PPP1R16B的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；PRRT3-AS1的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；FAM184B的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；TRAPPC11的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；PDE8B的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；RSPO3的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；CAHM的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；QKI的核苷酸序列如SEQ IDNO:25所示；AEBP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；NRCAM的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示；GPR85的核苷酸序列如SEQ ID NO:28所示。
其中，上述所述标志物的序列均是未经重亚硫酸盐转化的序列。
本发明提供了一种探针组合物，所述探针组合物包括靶向所述标志物甲基化的探针。
所述甲基化指的是发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
本发明所述的甲基化可以为甲基化水平、甲基化程度或甲基化状态，当分析这样的靶序列的甲基化时，本领域技术人员可以使用定量测定方法来确定甲基化。
所述探针为长度在几十到几百甚至上千碱基对的单链或双链DNA，其可利用分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，能与待测样本中互补的非标记单链DNA或RNA以氢键结合(杂交)，形成双链复合物(杂交体)。将未配对结合的探针洗去后，可用放射自显影或酶联反应等检测系统检测杂交反应结果。在本申请中，与探针互补结合或杂交的区域为特异性靶区域，多个探针组合成探针组合物。
在一个实施方案中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域杂交。
所述高甲基化指的是标志物经重亚硫酸盐转化后，碱基C变成碱基T，但是如果是碱基CG，则碱基C保持不变；
所述低甲基化指的是标志物经重亚硫酸盐转化后，所有的碱基CG都没有发生甲基化，碱基C均变成碱基T。
由于每个人的甲基化状态不同，标志物经重亚硫酸盐转化得到的序列也不同，在此示出了每个标志物的一种极端情况，即该区段所有的CG都处于高甲基化状态，并示出了其互补链的高甲基化状态序列：
SEQ ID NO:1的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:141所示；
SEQ ID NO:1互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:142所示；
SEQ ID NO:2的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:143所示；
SEQ ID NO:2互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:144所示；
SEQ ID NO:3的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:145示；
SEQ ID NO:3互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:146所示；
SEQ ID NO:4的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:147所示；
SEQ ID NO:4互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:148所示；
SEQ ID NO:5的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:149所示；
SEQ ID NO:5互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:150所示；
SEQ ID NO:6的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:151所示；
SEQ ID NO:6互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:152所示；
SEQ ID NO:7的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:153所示；
SEQ ID NO:7互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:154所示；
SEQ ID NO:8的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:155所示；
SEQ ID NO:8互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:156所示；
SEQ ID NO:9的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:157所示；
SEQ ID NO:9互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:158所示；
SEQ ID NO:10的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:159所示；
SEQ ID NO:10互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:160所示；
SEQ ID NO:11的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:161所示；
SEQ ID NO:11互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:162所示；
SEQ ID NO:12的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:163所示；
SEQ ID NO:12互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:164所示；
SEQ ID NO:13的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:165所示；
SEQ ID NO:13互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:166所示；
SEQ ID NO:14的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:167所示；
SEQ ID NO:14互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:168所示；
SEQ ID NO:15的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:169所示；
SEQ ID NO:15互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:170所示；
SEQ ID NO:16的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:171所示；
SEQ ID NO:16互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:172所示；
SEQ ID NO:17的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:173所示；
SEQ ID NO:17互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:174所示；
SEQ ID NO:18的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:175所示；
SEQ ID NO:18互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:176所示；
SEQ ID NO:19的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:177所示；
SEQ ID NO:19互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:178所示；
SEQ ID NO:20的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:179示；
SEQ ID NO:20互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:180所示；
SEQ ID NO:21的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:181所示；
SEQ ID NO:21互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:182所示；
SEQ ID NO:22的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:183所示；
SEQ ID NO:22互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:184所示；
SEQ ID NO:23的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:185所示；
SEQ ID NO:23互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:186所示；
SEQ ID NO:24的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:187所示；
SEQ ID NO:24互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:188所示；
SEQ ID NO:25的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:189所示；
SEQ ID NO:25互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:190所示；
SEQ ID NO:26的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:191所示；
SEQ ID NO:26互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:192所示；
SEQ ID NO:27的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:193所示；
SEQ ID NO:27互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:194所示；
SEQ ID NO:28的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:195所示；
SEQ ID NO:28互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:196所示；
同理，由于每个人的甲基化状态不同，在此示出了一种极端的情况，即所有的CG都处于低甲基化状态，也示出了其互补链的低甲基化状态序列：
SEQ ID NO:1的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:197所示；
SEQ ID NO:1互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:198所示；
SEQ ID NO:2的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:199所示；
SEQ ID NO:2互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:200所示；
SEQ ID NO:3的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:201所示；
SEQ ID NO:3互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:202所示；
SEQ ID NO:4的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:203所示；
SEQ ID NO:4互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:204所示；
SEQ ID NO:5的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:205所示；
SEQ ID NO:5互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:206所示；
SEQ ID NO:6的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:207所示；
SEQ ID NO:6互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:208所示；
SEQ ID NO:7的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:209所示；
SEQ ID NO:7互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:210所示；
SEQ ID NO:8的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:211所示；
SEQ ID NO:8互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:212所示；
SEQ ID NO:9的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:213所示；
SEQ ID NO:9互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:214所示；
SEQ ID NO:10的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:215所示；
SEQ ID NO:10互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:216所示；
SEQ ID NO:11的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:217所示；
SEQ ID NO:11互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:218所示；
SEQ ID NO:12的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:219所示；
SEQ ID NO:12互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:220所示；
SEQ ID NO:13的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:221所示；
SEQ ID NO:13互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:222所示；
SEQ ID NO:14的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:223所示；
SEQ ID NO:14互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:224所示；
SEQ ID NO:15的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:225所示；
SEQ ID NO:15互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:226所示；
SEQ ID NO:16的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:227所示；
SEQ ID NO:16互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:228所示；
SEQ ID NO:17的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:229所示；
SEQ ID NO:17互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:230所示；
SEQ ID NO:18的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:231所示；
SEQ ID NO:18互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:232所示；
SEQ ID NO:19的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:233所示；
SEQ ID NO:19互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:234所示；
SEQ ID NO:20的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:235所示；
SEQ ID NO:20互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:236所示；
SEQ ID NO:21的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:237所示；
SEQ ID NO:21互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:238所示；
SEQ ID NO:22的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:239所示；
SEQ ID NO:22互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:240所示；
SEQ ID NO:23的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:241所示；
SEQ ID NO:23互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:242所示；
SEQ ID NO:24的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:243所示；
SEQ ID NO:24互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:244所示；
SEQ ID NO:25的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:245所示；
SEQ ID NO:25互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:246所示；
SEQ ID NO:26的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:247所示；
SEQ ID NO:26互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:248所示；
SEQ ID NO:27的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:249所示；
SEQ ID NO:27互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:250所示；
SEQ ID NO:28的一种极端情况的序列如SEQ ID NO:251所示；
SEQ ID NO:28互补链的极端情况的序列如SEQ ID NO:252所示。
在一个实施方案中，所述第一探针组合物包括n个探针，所述n个探针与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域的正义链或反义链的每个核苷酸杂交。
所述第二探针组合物包括m个探针，所述m个探针与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域的正义链或反义链的每个核苷酸杂交。
对于第一探针组合物和第二探针组合物中探针的个数，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，m和n可以为1-10中的任意整数，m和n既可以是相同的，也可以是不同的。
例如，m和n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的任意整数，优选的，m＝n＝2。
在一个实施方案中，第n-1个探针和第n个探针之间有x1个核苷酸重叠，优选的，x1为0-100中的任意整数；
优选的，第m-1个探针和第m个探针之间有x2个核苷酸重叠，优选的，x2为0-100中的任意整数。
其中，x1和x2可以是相同的，也可以是不同的，当x1为0时，表明第n-1探针的尾部与第n个探针的首部相连接，同理，当x2为0时，表明第m-1探针的尾部与第m个探针的首部相连接。
本发明通过将探针组合物与经过重亚硫酸盐转化的标志物进行杂交，其中，高甲基化的第一探针组合物与CG高甲基化的区域杂交，低甲基化的第二探针组合物与CG低甲基化的区域杂交，从而能够高效准确地检测靶序列的甲基化水平，进而能够用于结直肠癌筛查。
在一个实施方案中，所述高甲基化的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:29-84中的一种或两种。
所述低甲基化的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:85-140中的一种或两种。
其中，用于与FBLIM1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:29-30所示的核苷酸序列；
用于与KIAA1522甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:31-32所示的核苷酸序列；
用于与AGBL4甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:33-34所示的核苷酸序列；
用于与VAV3甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:35-36所示的核苷酸序列；
用于与NGF-AS1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:37-38所示的核苷酸序列；
用于与FAM72B甲基化序列杂交的第一探针组合物分别包括如SEQ ID NO:39-40所示的核苷酸序列；
用于与FAM72A甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:41-42所示的核苷酸序列；
用于与CD34甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:43-44所示的核苷酸序列；
用于与ARHGAP22甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:45-46所示的核苷酸序列；
用于与CEP164甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:47-48所示的核苷酸序列；
用于与B4GALNT1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:49-50所示的核苷酸序列；
用于与EVL甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:51-52所示的核苷酸序列；
用于与PTPRS甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:53-54所示的核苷酸序列；
用于与ZNF566甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:55-56所示的核苷酸序列；
用于与ZNF829甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:57-58所示的核苷酸序列；
用于与RTN4甲基化序列杂交的第一探针组合物分别包括如SEQ ID NO:59-60所示的核苷酸序列；
用于与PPP1R16B甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:61-62所示的核苷酸序列；
用于与PRRT3-AS1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:63-64所示的核苷酸序列；
用于与FAM184B甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:65-66所示的核苷酸序列；
用于与TRAPPC11甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:67-68所示的核苷酸序列；
用于与PDE8B甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:69-70所示的核苷酸序列；
用于与RSPO3甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:71-72所示的核苷酸序列；
用于与CAHM甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:73-74所示的核苷酸序列(用于与SEQ ID NO:23甲基化序列杂交)以及SEQ ID NO:75-76所示的核苷酸序列(用于与SEQ ID NO:24甲基化序列杂交)；
用于与QKI甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:77-78所示的核苷酸序列；
用于与AEBP1甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:79-80所示的核苷酸序列；
用于与NRCAM甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:81-82所示的核苷酸序列；
用于与GPR85甲基化序列杂交的第一探针组合物包括如SEQ ID NO:83-84所示的核苷酸序列。
用于与FBLIM1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:85-86所示的核苷酸序列；
用于与KIAA1522甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:87-88所示的核苷酸序列；
用于与AGBL4甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:89-90所示的核苷酸序列；
用于与VAV3甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:91-92所示的核苷酸序列；
用于与NGF-AS1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:93-94所示的核苷酸序列；
用于与FAM72B甲基化序列杂交的第二探针组合物分别包括如SEQ ID NO:95-96所示的核苷酸序列；
用于与FAM72A甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:97-98所示的核苷酸序列；
用于与CD34甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:99-100所示的核苷酸序列；
用于与ARHGAP22甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:101-102所示的核苷酸序列；
用于与CEP164甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:103-104所示的核苷酸序列；
用于与B4GALNT1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:105-106所示的核苷酸序列；
用于与EVL甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:107-108所示的核苷酸序列；
用于与PTPRS甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:109-110所示的核苷酸序列；
用于与ZNF566甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:111-112所示的核苷酸序列；
用于与ZNF829甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:113-114所示的核苷酸序列；
用于与RTN4甲基化序列杂交的第二探针组合物分别包括如SEQ ID NO:115-116所示的核苷酸序列；
用于与PPP1R16B甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:117-118所示的核苷酸序列；
用于与PRRT3-AS1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:119-120所示的核苷酸序列；
用于与FAM184B甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:121-122所示的核苷酸序列；
用于与TRAPPC11甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:123-124所示的核苷酸序列；
用于与PDE8B甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:125-126所示的核苷酸序列；
用于与RSPO3甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:127-128所示的核苷酸序列；
用于与CAHM甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:129-130所示的核苷酸序列(用于与SEQ ID NO:23的甲基化序列杂交)以及SEQ ID NO:131-132所示的核苷酸序列(用于与SEQ ID NO:24的甲基化序列杂交)；
用于与QKI甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:133-134所示的核苷酸序列；
用于与AEBP1甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:135-136所示的核苷酸序列；
用于与NRCAM甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:137-138所示的核苷酸序列；
用于与GPR85甲基化序列杂交的第二探针组合物包括如SEQ ID NO:139-140示的核苷酸序列。
本发明提供了标志物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述标志物对应基因选自下述中的一种：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85。
在一个实施方案中，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-28所示的一种，优选所述标志物为甲基化后的标志物。
本发明提供了探针组合物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述探针组合物用于靶向结直肠癌甲基化后的标志物。
在一个实施方案中，所述探针组合物为上述所述的探针组合物。
本发明提供了一种用于结直肠癌检测的组合物，所述组合物包括用于检测选自下述标志物对应基因中任一种甲基化的核酸：FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85，优选的，所述标志物的核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:28所示的一种。
在一个实施方案中，所述核酸包括上述所述的探针组合物。
在一个实施方案中，所述核酸包括：
引物，所述引物为所述标志物的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
其中，如果使用重亚硫酸盐对待测样本NDA进行转化，则用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸包括对标志物的靶序列进行重亚硫酸盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述核酸还包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下与所述标志物的靶序列中的至少15个核苷酸片段杂交，所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂，例如试剂可以为重亚硫酸盐等；优选的，所述用于检测标志物的靶序列甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
所述阻断剂是为了提高PCR扩增引物的扩增特异性，阻断剂核苷酸序列的5’端与正向或反向引物的3’端核苷酸序列有大于或等于5个核苷酸的重叠区域，阻断剂与正向或反向引物互补与目标基因靶序列DNA的同一条链，阻断剂的解链温度高于正向或者反向引物超过(包括)5℃，阻断剂的核苷酸序列包含至少一个CpG二核苷酸序列，并与重亚硫酸盐转化后的未发生甲基化的目标基因靶序列DNA的序列互补。因此，当所要检测的生物样本的基因组DNA是处于甲基化和非甲基化状态的混合物时，尤其是处于甲基化状态的DNA远远少于处于非甲基化状态的DNA的情况下，处于非甲基化状态的DNA经重亚硫酸盐转化后，会优先与阻断剂相结合，从而以及DNA模板与PCR义务结合，因而不发生PCR扩增，而处于甲基化状态的DNA不与阻断剂相结合，因而与引物集合，发生PCR扩增，之后直接或间接地检测通过扩增获得的片段。
本发明提供了一种试剂盒，其包括上述所述的标志物或者上述所述的探针组合物或者上述所述的组合物。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含用于容纳受试者生物样品的容器。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包括使用和解释检测结果的说明。
所述生物样品例如可以为外周血全血、血浆或血清。
本发明对于使用上述所述的试剂盒检测靶序列甲基化水平的方法，本发明不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如本发明提供了一种使用上述所述的试剂盒检测标志物靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
采集受试者样品；
提取纯化所述样品中的DNA；
针对纯化的DNA样品构建用于测序的DNA文库；
用重亚硫酸盐转化所述构建的DNA文库；
预PCR扩增所述经重亚硫酸盐转化的DNA文库；
利用探针组合物对经预PCR扩增的样品进行杂交捕获；
利用PCR扩增经杂交捕获后的产物；
对PCR扩增后的经杂交捕获后的产物进行高通量二代测序；
对测序数据进行分析，确定样本的甲基化水平；
基于已有样本的甲基化情况计算每个标志物的阈值，基于所述样本的某个标志物甲基化水平判读所述患者的患病情况，如果样本的某个标志物的甲基化水平超过阈值为癌症样本，如果低于阈值为健康人样本。
还例如，本发明提供了一种使用上述所述的试剂盒检测标志物的靶序列甲基化水平的方法，其包括下述步骤：
(1)抽取受试者外周血，分离血浆或血清；
(2)抽取血浆或血清中的游离DNA；
(3)使用试剂处理步骤(2)所得到的游离DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转为为尿嘧啶或其他碱基，即标志物的靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其他碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；
(4)将经步骤(3)处理过的游离DNA与DNA聚合酶和所述标志物的靶序列的引物接触，使得所述经处理的标志物的靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的标志物的靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的标志物的靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；
(5)用探针检测扩增产物；
(6)基于所述扩增产物是否存在，确定所述标志物的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态，从而确定标志物的靶序列的甲基化水平。
本发明提供了一种芯片，其包含上述所述的标志物或者上述所述的探针组合物或者上述所述的组合物。
所述芯片又称为基因芯片，其测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。
所述芯片的制备主要是以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。
本发明所述芯片是基于重亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测，重亚硫酸盐处理是将非甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，然后再将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶，最后进行芯片杂交；最后根据荧光颜色判断加入碱基的类型，进而确定该位点是否被甲基化。
本发明提供了一种结直肠癌筛查的方法，其包括：
检测标志物的甲基化水平，以及
基于所述甲基化水平来判断受试者罹患结直肠癌的风险，所述标志物对应基因选自下述中的一种：
FBLIM1、KIAA1522、AGBL4、VAV3、NGF-AS1、FAM72B、FAM72A、CD34、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、PTPRS、ZNF566、ZNF829、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、TRAPPC11、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85。
实施例
本发明对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1筛选标志物
1)样本搜集：下载TCGA中450k甲基化芯片癌组织数据，共涉及26种肿瘤7769个癌组织样本，其中包括肾上腺皮质癌(80)、膀胱尿路上皮癌(409)、急性髓细胞样白血病(140)、脑低级别胶质瘤(654)、乳腺癌(740)、宫颈癌(286)、结直肠癌(348)、食管癌(183)、葡萄膜黑色素瘤(80)、头颈鳞状细胞癌(527)、肾癌(660)、肝癌(377)、肺腺癌(425)、肺鳞癌(372)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(29)、卵巢浆液性囊腺癌(10)、胰腺癌(184)、间皮瘤(116)、前列腺癌(488)、皮肤黑色素瘤(104)、肉瘤(117)、胃癌(397)、睾丸癌(134)、胸腺癌(94)、甲状腺癌(506)、子宫内膜癌(309)。针对健康人群，博尔诚搜集38例健康人的血浆，进而进行全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS)。
2)候选标志物筛选：针对健康血浆样本，计算对应450K对应区域的每个探针β值第三四分位数(Q3)，又称"较大四分位数"，筛选Q3<0.02的位点，结果为List1。针对450K芯片组织数据，计算对应450K对应区域的每个探针β值第一四分位数(Q1)，Q1又称"较小四分位数"，筛选Q1>0.1的位点，结果为List2。取List1和List2交集得到65739个差异甲基化区域。
3)标志物选择：在上述标志物中选择结直肠癌特有的标志物，得到123个标志物。同时要求，TCGA中450k芯片结直肠癌组织(348)与癌旁组织(45)的甲基化水平的差值大于0.2，最终得到79个差异甲基化区域。
4)标志物验证：针对上述的79个差异甲基化区域设计探针捕获，利用博尔诚血浆样本数据(结直肠癌样本个数＝20,健康人样本个数＝38)进行验证，最终得到28个能区分开结直肠癌与健康人的标志物，其序列分别为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:28所示。
根据所得到的靶序列区域，定制探针组合物(panel)，其包括高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，其中，针对每个marker，第一探针组合物包括两个探针，对于SEQ ID NO:1，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:29-30所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:2，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:31-32所示的核苷酸序列；对于SEQ IDNO:3，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:33-34所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:4，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:35-36所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:5，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:37-38所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:6，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:39-40所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:7，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:41-42所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:8，其第一探针组合物包括如SEQID NO:43-44所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:9，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:45-46所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:10，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:47-48所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:11，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:49-50所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:12，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:51-52所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:13，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:53-54所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:14，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:55-56所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:15，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:57-58所示的核苷酸序列；对于SEQ IDNO:16，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:59-60所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:17，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:61-62所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:18，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:63-64所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:19，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:65-66所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:20，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:67-68所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:21，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:69-70所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:22，其第一探针组合物包括如SEQ IDNO:71-72所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:23，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:73-74所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:24，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:75-76所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:25，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:77-78所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:26，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:79-80所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:27，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:81-82所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:28，其第一探针组合物包括如SEQ ID NO:83-84所示的核苷酸序列；
第二探针组合物包括两个探针，其中，对于SEQ ID NO:1，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:85-86所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:2，其第二探针组合物包括如SEQID NO:87-88所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:3，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:89-90所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:4，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:91-92所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:5，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:93-94所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:6，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:95-96所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:7，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:97-98所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:8，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:99-100所示的核苷酸序列；对于SEQ IDNO:9，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:101-102所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:10，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:103-104所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:11，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:105-106所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:12，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:107-108所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:13，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:109-110所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:14，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:111-112所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:15，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:113-114所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:16，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:115-116所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:17，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:117-118所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:18，其第二探针组合物包括如SEQID NO:119-120所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:19，其第二探针组合物包括如SEQ IDNO:121-122所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:20，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:123-124所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:21，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:125-126所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:22，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:127-128所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:23，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:129-130所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:24，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:131-132所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:25，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:133-134所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:26，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:135-136所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:27，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:137-138所示的核苷酸序列；对于SEQ ID NO:28，其第二探针组合物包括如SEQ ID NO:139-140所示的核苷酸序列；
然后在血浆样本中验证，其实验检测方法如下：
1.1.cfDNA提取纯化
1.1.1.血浆样本制备：
4℃、2000g离心血液样本10min,将血浆转移到一个新的离心管中。4℃、16000g离心血浆样本10min,根据使用的收集管类型，执行下一步,本实验中使用的收集管类型为其他。
表1
1.1.2.裂解和结合
1.1.2.1.按照下表准备结合溶液/珠子混合物，然后彻底混匀。
表2
加入适量体积的血浆样品。
1.1.2.2.彻底混匀血浆样品和结合溶液/珠子混合物。
1.1.2.3.在旋转混匀仪上充分地结合10min，使cfDNA结合到磁珠上。
1.1.2.4.将结合管放在磁力架上5min，直到溶液变得澄清，磁珠完全吸附在磁力架上。
1.1.2.5.用移液管小心地弃去上清，继续保持管子在磁力架上几分钟，用移液管移去残留上清。
1.1.3.洗涤
1.1.3.1.将珠子重悬在1ml洗涤溶液中。
1.1.3.2.将重悬液转移到新的无吸附1.5ml离心管中。保留结合管。
1.1.3.3.将含有珠子重悬液的离心管置于磁力架上，20s。
1.1.3.4.将分离得到的上清，吸出洗涤结合管，将清洗后的残留珠子再次收集到重悬液中，弃掉裂解/结合管。
1.1.3.5.管子置于磁力架上2min，直到溶液变得澄清，珠子聚集在磁力架，用1ml移液器移除上清。
1.1.3.6.管子留在磁力架上，用200μL移液器尽可能移除残留的液体。
1.1.3.7.将管子从磁力架取下来，加入1ml洗涤溶液，涡旋30s。
1.1.3.8.置于磁力架2min，直到溶液澄清，珠子聚集在磁力架上，用1ml移液管移除上清。
1.1.3.9.管子留在磁力架上，用200μL移液器彻底移除残留液体。
1.1.3.10.将管子从磁力架取下，加入1ml 80％乙醇，涡旋30s。
1.1.3.11.置于磁力架上2min，溶液变得澄清，用1ml移液器移去上清。
1.1.3.12.管子留在磁力架上，用200μL移液器移去残留液体。
1.1.3.13.用80％乙醇重复上述1.1.3.10.-1.1.3.12.步骤一次，尽可能除去上清。
1.1.3.14.管子留在磁力架上，空气中干燥珠子3～5分钟。
1.1.4.洗脱cfDNA
1.1.4.1.按照下表加入洗脱液。
表3
1.1.4.2.涡旋5min，置于磁力架上2min，溶液变得澄清，吸取上清液中的cfDNA。
1.1.4.3.纯化的cfDNA立即使用，或者将上清转移至新的离心管中，-20℃保存。
1.2.gDNA打断与纯化：
1.2.1.按照Qubit浓度，取2μg gDNA，加水补至125μl，加入到covaris130μl打断管中，设置程序：50W，20％，200个循环，250s。
1.2.2.打断结束后取1μl样品使用Agilent2100进行片段检测，正常打断后样品检测主峰约在150bp-200bp。
对于cfDNA样品，Agilent2100进行片段检测，直接Qubit用于后续的实验。
1.3.末端修复、3’端加“A”：
1.3.1.取20ng打断后的gDNA或cfDNA至PCR管中，用无核酸酶水补至50μl，加入以下试剂，涡旋混匀：
表4
组分 体积
gDNA/cfDNA 50μl
终止修复和A加尾缓冲液 7μl
终止修复和A加尾酶混合物 3μl
总体积 60μl
1.3.2.设置以下程序在PCR仪上进行反应：热盖温度85℃。
表5
温度 时间
20℃ 30min
65℃ 30min
4℃ ∞
1.4.接头连接及纯化：
1.4.1.参照下表将接头提前稀释成合适的浓度：
表6
每50μl ER和AT反应的片段化的DNA 接头浓度
1μg 10μM
500ng 10μM
250ng 10μM
100ng 10μM
50ng 10μM
25ng 10μM
10ng 3μM
5ng 5μM
2.5ng 2.5μM
1ng 625nM
1.4.2.按下表配制以下试剂，轻轻吸打混匀，短暂离心：
表7
1.4.3.设置以下程序在PCR仪上进行反应：无热盖。
表8
温度 时间
20℃ 30min
4℃ ∞
1.4.4.按照以下体系，加入纯化磁珠进行实验(Agencourt AMPure XP磁珠提前拿至室温震荡混合均匀备用)：
表9
组分 体积
接头连接产物 110μl
Agencourt AMPure XP珠子 110μl
总体积 220μl
1.4.4.1.轻轻吸打混匀6次。
1.4.4.2.室温静置孵育5-15min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.4.4.3.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
1.4.4.4.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
1.4.4.5.室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发。
1.4.4.6.加入22μl的无核酸酶水，把PCR管从磁力架取下，轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min。
1.4.4.7.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.4.4.8.用移液器吸取20μl上清液，转移到新的PCR管。
1.5重亚硫酸盐处理及纯化：
1.5.1.预先拿出所需要的试剂，并溶解。根据下表加入各试剂：
表10
1.5.2.DNA保护缓冲液加入液体变成蓝色。轻轻吸打混匀，然后分成两管置于PCR仪上。
1.5.3.设置以下程序，并运行：热盖105℃。
表11
温度 时间
95℃ 5min
60℃ 10min
95℃ 5min
60℃ 10min
4℃ ∞
1.5.4.简短离心将两管相同样本合并至同一个干净的1.5ml离心管中。
1.5.5.每个样本中加入310μl缓冲液BL(样本量少于100ng加入1μl的载体RNA(1μg/μl))，涡旋混匀，简短离心。
1.5.6.加入250μl无水乙醇到每个样本中，涡旋混匀15s，简短离心，将混合液加入到准备好的对应的离心柱中。
1.5.7.静置1min，离心1min，将收集管中的液体重新转移到离心柱中，离心1min，弃去离心管的液体。
1.5.8.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去废液。
1.5.9.加入500μl缓冲液BD(注意是否加入无水乙醇)，盖好管盖，室温放置15min。离心1min，弃去离心下的液体。
1.5.10.加入500μl缓冲液BW(注意是否加入无水乙醇)，离心1min，弃去离下来的液体，再重复一次，共2次。
1.5.11.加入250μl无水乙醇，离心1min，将离心柱放置到新的2ml收集管中，弃掉全部剩余液体。
1.5.12.将离心柱放置到干净的1.5ml离心管中，加入20μl无核酸酶水到离心柱膜中心，轻轻盖上管盖，室温放置1min，离心1min。
1.5.13.将收集管中的液体重新转移至离心柱中，室温放置1min，离心1min。
1.6.杂交前预扩增及纯化：
1.6.1.按下列表格配制反应体系，吹打混匀，短暂离心：
表12
1.6.2.设置以下程序并启动PCR程序：热盖105℃
表13
1.6.3.PCR循环数根据投入DNA的量不同进行调整，参考数据如下所示：
表14
1.6.4.向反应结束后的PCR管中加入50μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器吹打混匀，避免产生气泡(Agencourt AMPure XP提前室温混匀并平衡)。
1.6.5.室温孵育5-15min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.6.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μl80％乙醇溶液，静置30s。
1.6.7.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(建议使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)。
1.6.8.室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发。
1.6.9.加入30μl的无核酸酶水，将离心管从磁力架取下，使用移液器，轻轻吸打重悬磁珠。
1.6.10.室温静置2min，将200μl PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.6.11.用移液器将上清液转移到新的200μl PCR管中(置于冰盒上)，在反应管上标记好样本号，准备下一步反应。
1.6.12.取1μl样品使用Qubit进行文库浓度测定，记录文库浓度。
1.6.13.取1μl样品使用安捷伦2100进行文库片段长度测定，文库长度约在270bp-320bp之间。
1.7.样品与探针杂交：
1.7.1.按照以下体系将样品文库与各种Hyb阻断物混匀，标记为B：
表15
组分 体积
预扩增产物 750ng对应体积
Hyb人阻断物 5μl
接头阻断物 6μl
增强剂 5μl
1.7.2.将准备好的样品和Hyb阻断物混合物放入真空浓缩离心机，打开PCR管盖，启动离心机，打开真空泵开关，开始浓缩。
1.7.3.将抽干的样品重新溶在约9μl无核酸酶水中，总体积10μl，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为B。
1.7.4.将Hyb缓冲液置于室温融化，融解之后会有沉淀出现，混匀后置于65℃水浴锅内预热，完全溶解后(无沉淀及浑浊物)取20μl Hyb缓冲液置于新的200μl PCR管内，盖好管盖，标记为A，继续置于65℃水浴锅内孵育待用。
1.7.5.通过艾吉泰康生物科技(北京)有限公司合成之前所述的甲基化探针序列：
1.7.6.取5μl RNA酶阻断物与2μl探针组合物置于200μl PCR管内，轻轻吸打混匀，短暂离心后置于冰上待用，标记为C。
1.7.7.设置PCR仪参数，热盖100℃，95℃，5min；65℃，保持。
1.7.8.将PCR管B置于PCR仪上，运行以上程序。
1.7.9.PCR仪温度降至65℃时，将PCR管A置于PCR仪上孵育，盖上PCR仪热盖。
1.7.10.5min后，将C置于PCR上孵育，盖上PCR仪热盖。
1.7.11.将PCR管C放置入PCR仪2min后，把移液器调至13μl，从PCR管A中吸取13μlHyb缓冲液移至PCR管C中，吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中，轻轻吸打10次，充分混匀，避免产生大量气泡，密封管盖，盖上PCR仪热盖，65℃孵育过夜(16-24h)。
1.8.捕获目标区域DNA文库：
1.8.1.捕获磁珠的准备
1.8.1.1.将磁珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1磁珠)从4℃取出，涡旋震荡重悬。
1.8.1.2.取50μl磁珠置于新的PCR管内，置于磁力架上1min使溶液澄清，移除上清。
1.8.1.3.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打数次混匀，重悬磁珠。
1.8.1.4.置磁力架上1min，移除上清。
1.8.1.5.重复步骤3-4两次，共清洗磁珠3次。
1.8.1.6.从磁力架上取下PCR管，加入200μL结合缓冲液轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
1.8.2.捕获目标DNA文库
1.8.2.1.保持杂交产物PCR管C在PCR仪上，将准备好的200μL捕获磁珠加入到杂交后的产物PCR管C中，用移液器吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上室温结合30min(转速最好不要超过10转/min)。
1.8.2.2.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液。
1.8.2.3.向PCR管C内加入200μL的洗涤缓冲液1(23.5ml无核酸酶水，1.25ml 20×SSC，250μl 10％SDS)，轻轻吸打6次混匀，置于旋转混匀仪上清洗15min(转速最好不要超过10转/min)，然后短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清。
1.8.2.4.加入200μl的65℃预热后的洗涤缓冲液2(24.6ml无核酸酶水，125μl 20×SSC，250μl 10％SDS)，轻轻吸打6次混匀，置于混匀仪上65℃孵育10min，转速800转/min进行清洗。
1.8.2.5.短暂离心，将PCR管放于磁力架上2min，移除上清。使用洗涤缓冲液2再重复2次清洗，共计3次。最后一次彻底移除洗涤缓冲液2。
1.8.2.6.PCR管继续置于磁力架上，向PCR管内加入200μl 80％乙醇，静置30s后彻底移除乙醇溶液，室温晾干2min。
1.8.2.7.向PCR管加入30μL无核酸酶水，从磁力架上取下PCR管，轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
1.9.捕获后扩增及纯化
1.9.1.根据下表配制反应体系进行捕获文库的富集，轻轻吹打混匀后，短暂离心：
表16
1.9.2.设置以下程序，将样品置于PCR仪中，运行程序：热盖105℃。
表17
1.9.3.PCR结束后向样品加入55μl Agencourt AMPure XP磁珠，用移液器轻轻吸打混匀。
1.9.4.室温孵育5min，把PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。
1.9.5.移除上清，PCR管继续置于磁力架上，加入200μl 80％无水乙醇，静置30s。
1.9.6.移除上清，再向PCR管内加入200μl 80％无水乙醇，静置30s后彻底移除上清。
1.9.7.室温放置5min，使得残留乙醇彻底挥发。
1.9.8.加入25μl无核酸酶水，将PCR管从磁力架拿下，轻轻吹打混匀重悬磁珠，室温放置2min。
1.9.9.将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。
1.9.10.用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管，标记样品信息。
1.9.11.取1μl文库使用Qubit进行定量，记录文库浓度。
1.9.12.取1μl样品使用Agilent2100进行文库片段长度测定。
1.9.13.使用Illumina高通量测序平台进行测序。
1.10.甲基化生信分析流程。大致如下：使用fastp质控软件查看测序质量，去除低质量的读段，然后采用Bismark比对软件将质控后的干净的数据比对到参考基因组上，采用Bismar_methylation_extractor软件提取相应的甲基化位点，最后，计算出每个标志物的甲基化水平。
1.11.基于从北京地区收集20例经临床诊断为结直肠癌的样本和从北京地区收集的38例健康人样本，利用实施例1所述甲基化建库方法，计算筛选到的28个甲基化生物标记物的甲基化水平，根据该28个甲基化生物标记物在结直肠癌样本和正常人样本数据集中的甲基化水平计算其阈值(以下简称位点或者marker)及独立区分的AUC值见表18；
其中甲基化水平阈值计算方法为：根据数据集(包含每个样本的类型和甲基化水平)用R包pROC绘制ROC曲线，ROC曲线上的最佳阈值点所对应的混淆矩阵将是计算敏感度(sensitivity)、特异度(specificity)以及准确度等指标的依据。通常情况下会通过约登指数(Youden index)进行选择。约登指数也称正确指数，是指敏感度和特异度之和减去1：Youden index＝Sensitivity+Specificity-1。约登指数指数范围取值介于0-1之间，代表分类模型发现真正病人与非病人的总能力。约登指数越大，表示分类模型性能越好，每个标志物的阈值、敏感度和特异度如表18所示。
从表18可以看出，本发明所述标志物的AUC值较高。
表18 28个甲基化标记物的具体表现数据
/>
实施例2
6例人样本(S1-3为健康人样本，S4-6为结直肠癌患者样本)，采用本申请的甲基化标志物检测方法，按实施例1的方法采集外周血；建库，并通过Illumina平台测序；测序数据经上述生物信息的分析流程，得到每个标志物的甲基化水平，根据每个标志物的阈值，预测所述患者的患病情况，如果超过阈值为癌症样本，如果低于阈值为健康人样本，具体结果如表19：
其中判读结果，0代表分类为正常，即健康；1代表分类为异常，即肿瘤。
表19样本的甲基化值以及判读结果
综上所述，本发明的发明人获得了与结直肠癌相关的甲基化基因，并确定了结直肠癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且，通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测，并且本发明所述的组合物能够实现实时监测，具有更高的灵敏度和准确度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表如表20：
表20
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
序列表
<110> 博尔诚(北京)科技有限公司
<120> 用于结直肠癌筛查的标志物、探针组合物及其应用
<130> PE02017
<160> 252
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 1
ggggaagggg cggcgcgggg cgcggccggg caggttgggg ggcaggtagg ggccgcttcc 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 2
ggcctggcca ttggccgcag agctcggggg cgtggtcgag ctggggctgg gggcgcccgc 60
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 3
ggaagcgcac tgccacttgc aaagtcagac ccgagcaatc acagccggag cgcgattcga 60
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 4
tgccgcgcac aggcttccga ctccagcgcc cggcccgcca ctgagcatgc ccagcacgcc 60
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 5
ctcacacagg cttcttgaat tcttagcccc tcctcccgta ctcctgagtc acacgctcca 60
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 6
aggaaaggga gaggcggctg ggtgctggct gcgctgcggt ccgtgagcca ggacggagtc 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 7
ttctacgcag atcggtgccc cagtccctgg aggagcctcc gccaactccg caggaccccg 60
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 8
ccgcgcggct cctagagaga cgcaccgagt ggaagacact actcggcttg gccaggacgc 60
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 9
ccccgcgcag cgggcatgcc ggcctccggg cagaccctgc taatcaatag gagaacgcgc 60
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 10
actctttcaa cctcttgcgg attcccatta tctatcttaa actacactcc catcgtgcaa 60
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 11
cccgaggcct ggcatcttaa tgctgaagac atttggatgc cgcggtttcg acgcggccgt 60
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 12
acaatgaggt gagtcggggc cggcgcctcg tgggaggtgg cagcggccag cgtcggaggg 60
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 13
ggcctgaatg ggggggcgcc aggcagcagc aggcccaagc tggccctgga gggcggccgg 60
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 14
cacacggtgt gagcgttgga aacacactca tcacaagggc agcctgtcac aatcgcgcga 60
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 15
cgaaacggct gctccctcaa ctctcaacat ccagccgagc ctcggagttg cgggtcgccg 60
<210> 16
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 16
acaaaagcac ctcctaaaaa tatctgggtg ccaaggcctt tccttcctca cctcgaagcc 60
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 17
ccgctggagc agctgcggct cggggaccca cagacacagc cggggtcggg agccgcccgg 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 18
gcttaactct ttccccttag gggtggactc ttctgtcaac cctgacttcc cctcgctcag 60
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 19
ccccgcacgt gccgctggcg atcagtctgc agttccccag ccagtgcagg tttcgtgtgc 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 20
gacagcgatt ggtgtagagc gcggtcactc aggcccagaa agtgcttcct gtgccggggg 60
<210> 21
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 21
ggctgcgccc ccagcatcca tgtctcgcag agcggcgtga tctactgccg ggactcggac 60
<210> 22
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 22
ccggacgtcc cccgcccgag ggttgaagac agcaaaaccc cagctgtggg gagccggagg 60
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 23
cccgacggcc aaggaaagcc caccagccct ccgcaccgtg ggcgacgggc caagacccgg 60
<210> 24
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 24
agacccggcc ctaaacggcc agacccagcc cctagtcggc tgccgccccc gccccacgca 60
<210> 25
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 25
cggcggtcac atttccgaga ggtcggcggg ggctgcgcgg actcggtggt cctcgccgag 60
<210> 26
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 26
gtgcgcgggg cgcccctgct cagctgcctc ctggcgttgc tggccctgtg ccctggaggg 60
<210> 27
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 27
ccaccgctaa gagcctgggc tgggaaagca atctttccag gcagccccca gcccggtgcg 60
<210> 28
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 28
gtttattgac tgccctgtcc aatccaactg gcagcattaa gcttttgtcc cttcgtggct 60
<210> 29
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 29
aaaaaaaaaa acgcgaaatt cccgccccgc gaaaacgacc cctacctacc ccccaaccta 60
cccgaccgcg ccccgcgccg ccccttcccc ctccctttat tccctaaacg acgcctcccc 120
<210> 30
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 30
aaaaaaacgt cgtccaaaaa acaaaaaaaa aaaaaaaaaa cgacgcgaaa cgcgaccgaa 60
caaattaaaa aacaaataaa aaccgcttcc gcgaaacgaa aatcccgcgc cccctccccc 120
<210> 31
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 31
aaaaaacaac gaaactcgcg aacgaacacc gcgaacgccc ccaaccccaa ctcgaccacg 60
cccccgaact ctacgaccaa taaccaaacc gaaaacgaac ccgaaaaaaa aacgaaacct 120
<210> 32
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 32
aaaccccgcc cctcctccga acccgccccc gacctaacca ttaaccgcaa aactcgaaaa 60
cgtaatcgaa ctaaaactaa aaacgcccgc gatacccgcc cgcgaatctc gctacctccc 120
<210> 33
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 33
ctaaatctct aaaccctttt ccctccccat tcgaatcgcg ctccgactat aattactcga 60
atctaacttt acaaataaca atacgcttcc aaacccccct catccgcccc tcgtccccct 120
<210> 34
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 34
aaaaaaacga aaaacgaata aaaaaaattt aaaaacgcac taccacttac aaaatcaaac 60
ccgaacaatc acaaccgaaa cgcgattcga ataaaaaaaa aaaaaaattc aaaaattcaa 120
<210> 35
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 35
aaaaacttac gaaccgcaac gaaaccgacc gacgtactaa acatactcaa taacgaaccg 60
aacgctaaaa tcgaaaacct atacgcgaca accgccgccg aaccgaccga aacgcacgaa 120
<210> 36
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 36
tccgtacgcc ccgaccgact cgacgacgac taccgcgcac aaacttccga ctccaacgcc 60
cgacccgcca ctaaacatac ccaacacgcc gaccgatctc gctacgatcc gcaaatcccc 120
<210> 37
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 37
ataaaaaaaa aaaaaataaa aaccaaaatt taaaacgtat aactcaaaaa tacgaaaaaa 60
aaaactaaaa attcaaaaaa cctatataaa aacaactcga cgctccgaca caacaaaaaa 120
<210> 38
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 38
ctctctacta taccgaaacg ccgaactact ctcacacaaa cttcttaaat tcttaacccc 60
tcctcccgta ctcctaaatc acacgctcca aatcctaacc cccatccctc ccctccccac 120
<210> 39
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 39
aatctctccg cccatcacta tacaacctaa aactccgtcc taactcacga accgcaacgc 60
aaccaacacc caaccgcctc tccctttcct ccgcacacga acaaccgcga tccaccgtaa 120
<210> 40
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 40
ctacgataaa ccgcgactac ccgtatacga aaaaaaaaaa aaaacgacta aatactaact 60
acgctacgat ccgtaaacca aaacgaaatc ccaaactata caataataaa cgaaaaaact 120
<210> 41
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 41
attaataaaa aaataaactc tacttcccga cgaaatccta cgaaattaac gaaaactcct 60
ccaaaaacta aaacaccgat ctacgtaaaa acgaataacg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
<210> 42
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 42
ctctcctccc ctctcttccc cgccacccgt ttctacgcaa atcgataccc caatccctaa 60
aaaaacctcc gccaactccg caaaaccccg ccgaaaaata aaacccaccc ctttaccaat 120
<210> 43
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 43
cctctcccga acgaaaaaaa cgaaaaaaac gcgtcctaac caaaccgaat aatatcttcc 60
actcgatacg tctctctaaa aaccgcgcga aaaaaatact aatccgcaaa aacgcgcgcg 120
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 44
cgcgcgcgcc cctacgaacc aacatccttc ccgcgcgact cctaaaaaaa cgcaccgaat 60
aaaaaacact actcgactta accaaaacgc gctcttcccg ccccctccgc ccgaaaaaaa 120
<210> 45
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 45
aaacgaacaa taacgcgacg atcgcgatct acgcgttctc ctattaatta acaaaatcta 60
cccgaaaacc gacatacccg ctacgcgaaa ccgcgataaa atataaaaac ccgaaaaccg 120
<210> 46
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 46
cgactcccga accctcacac tccaccgcga ccccgcgcaa cgaacatacc gacctccgaa 60
caaaccctac taatcaataa aaaaacgcgc aaatcgcgac cgccgcgcca ctacccgctt 120
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 47
aatacacgca aaaactctat ccgttttccg ttacacgata aaaatataat ttaaaataaa 60
taataaaaat ccgcaaaaaa ttaaaaaaat ataatttaaa ataaataata aaaatccgca 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 48
tacgaattcc cattatctat cttaaactac actctttcaa cctcttacga attcccatta 60
tctatcttaa actacactcc catcgtacaa cgaaaaacga acaaaactcc tacgtacacc 120
<210> 49
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 49
cctaataaaa cgaaactttt ccgcttacgc acgaccgcgt cgaaaccgcg acatccaaat 60
atcttcaaca ttaaaatacc aaacctcgaa tatataaaaa aaccgaaata caaaaaaaaa 120
<210> 50
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 50
ccctctccta catctcgatt tcctcacaca cccgaaacct aacatcttaa tactaaaaac 60
atttaaatac cgcgatttcg acgcgaccgt acgtaaacga aaaaaccccg ctctatcaaa 120
<210> 51
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 51
ctcgaaaaca ccgcgaaccc ccaacccaac ccctccgacg ctaaccgcta ccacctccca 60
cgaaacgccg accccgactc acctcattat cgctaccgaa aacgaacgcg ccgaaccaaa 120
<210> 52
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 52
cctaacccga cgcgcccgtc cccgacaacg acaataaaat aaatcgaaac cgacgcctcg 60
taaaaaataa caacgaccaa cgtcgaaaaa actaaactaa aaacccgcga tacccccgaa 120
<210> 53
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 53
tccccacaac ccaacgcgaa cctaaccgta ccgaccgccc tccaaaacca acttaaacct 60
actactacct aacgcccccc cattcaaacc cgtcgcttac actttaaaaa actccaaacc 120
<210> 54
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 54
aatctaaaat tttccaaaat acaaacgacg aacctaaata aaaaaacgcc aaacaacaac 60
aaacccaaac taaccctaaa aaacgaccga cacgatcaaa cccgcgctaa actataaaaa 120
<210> 55
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 55
tacgtctata taaaaatata taataaataa tcgcgcgatt ataacaaact acccttataa 60
taaatatatt tccaacgctc acaccgtata caacacgacc tcgaaaacta taactactaa 120
<210> 56
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 56
ccaacaacca caatctccga aaccgtacta cacacgatat aaacgttaaa aacacactca 60
tcacaaaaac aacctatcac aatcgcgcga tcattcacca cacacctcca cacaaacgca 120
<210> 57
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 57
cgaaaaactc atctccatta cgcaacgcta cgacgacccg caactccgaa actcgactaa 60
atattaaaaa ttaaaaaaac aaccgtttcg aataaaccca aacgaaaaac taacaaaaat 120
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 58
attcctatca actcctcgcc taaacccacc cgaaacgact actccctcaa ctctcaacat 60
ccaaccgaac ctcgaaatta cgaatcgccg taacgctacg caataaaaat aaacctcccg 120
<210> 59
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 59
accaaaatta taaatttatc gaattaatta aacttcgaaa taaaaaaaaa aaaaccttaa 60
cacccaaata tttttaaaaa atacttttat ctacccgtct aaattactcc tttaaaaaaa 120
<210> 60
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 60
cttttccaaa aaaacaaccc aaacgaataa acaaaaacac ctcctaaaaa tatctaaata 60
ccaaaacctt tccttcctca cctcgaaacc caaccaaccc gataaatcca caaccctaac 120
<210> 61
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 61
aaaaactcac ccgctctccc gaaccctacc ccgaacgact cccgaccccg actatatcta 60
taaatccccg aaccgcaact actccaacga cgacaaaact aactctactc gaccgcgaac 120
<210> 62
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 62
actcgcgacc gaacaaaacc aactctatcg ccgctaaaac aactacgact cgaaaaccca 60
caaacacaac cgaaatcgaa aaccgcccga aacaaaactc gaaaaaacga ataaattccc 120
<210> 63
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 63
cctcgattcc actctaaacc ctaacaatcc ctaaacgaaa aaaaatcaaa attaacaaaa 60
aaatccaccc ctaaaaaaaa aaaattaaac aaaactacgc tcctataaac gaactcgcga 120
<210> 64
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 64
tcgcgaaccc gcccacaaaa acgcaaccct acttaactct ttccccttaa aaataaactc 60
ttctatcaac cctaacttcc cctcgctcaa aaattatcaa aactcaaaat aaaaccgaaa 120
<210> 65
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 65
acaactccta accgcgaaaa ctctcccctt acacacgaaa cctacactaa ctaaaaaact 60
acaaactaat cgccaacgac acgtacgaaa cgccgacgcc tcgccgcaaa atacgaatac 120
<210> 66
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 66
acacccgcac cctacgacga aacgtcgacg ccccgcacgt accgctaacg atcaatctac 60
aattccccaa ccaatacaaa tttcgtatac aaaaaaaaaa cttccgcgac taaaaactac 120
<210> 67
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 67
ccaacaaacg aaacttccct atacccacct cccccgacac aaaaaacact ttctaaacct 60
aaataaccgc gctctacacc aatcgctatc ccgaaacttt acgccgctcc tccaaacgtc 120
<210> 68
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 68
aacgcttaaa aaaacgacgt aaaattccga aacaacgatt aatataaaac gcgatcactc 60
aaacccaaaa aatacttcct ataccgaaaa aaataaatac aaaaaaatct cgcctattaa 120
<210> 69
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 69
actaataatc taacgaaacg aactaaactc gtccgaatcc cgacaataaa tcacgccgct 60
ctacgaaaca taaatactaa aaacgcaacc catccctcga ccgaactccc ccgcgcgccc 120
<210> 70
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 70
aaacgcgcga aaaaacccga ccgaaaaata aactacgccc ccaacatcca tatctcgcaa 60
aacgacgtaa tctactaccg aaactcgaac gaatccaact cgccccgcca aaccaccaac 120
<210> 71
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 71
tataacaaaa aaaaacctaa aaactccgca cctccgactc cccacaacta aaattttact 60
atcttcaacc ctcgaacgaa aaacgtccga caactctaca aacgcgcaaa cacgcgaacc 120
<210> 72
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 72
aattcgcgta tctacgcgtt tacaaaacta ccgaacgtcc cccgcccgaa aattaaaaac 60
aacaaaaccc caactataaa aaaccgaaaa tacgaaattt ccaaattctc tcttatcaca 120
<210> 73
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 73
cgactaaaaa ctaaatctaa ccgtttaaaa ccgaatctta acccgtcgcc cacgatacga 60
aaaactaata aactttcctt aaccgtcgaa cccgccacga cgcgaatctt aactacgaaa 120
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 74
ccccgcaacc aaaacccgcg ccgtaacgaa cccgacgacc aaaaaaaacc caccaaccct 60
ccgcaccgta aacgacgaac caaaacccga ccctaaacga ccaaacccaa cccctaatcg 120
<210> 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 75
ataaaaaaaa aaaaaacccc gaaacgcgcc tacgtaaaac gaaaacgaca accgactaaa 60
aactaaatct aaccgtttaa aaccgaatct taacccgtcg cccacgatac gaaaaactaa 120
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 76
ccaaccctcc gcaccgtaaa cgacgaacca aaacccgacc ctaaacgacc aaacccaacc 60
cctaatcgac taccgccccc gccccacgca aacgcgctcc gaaaccctcc cctcccccac 120
<210> 77
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 77
cgacgcgacg taaacctact ctcgaaaaaa ctcgacgaaa accaccgaat ccgcgcaacc 60
cccgccgacc tctcgaaaat ataaccgccg aaactaaaaa aaccgcaaaa ctcaccccgc 120
<210> 78
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 78
acgaaataaa ccctacgacc cctctaactt cgacgatcac atttccgaaa aatcgacgaa 60
aactacgcga actcgataat cctcgccgaa ccctcccgaa aacaaaccca cgccgcgccg 120
<210> 79
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 79
ctcgtcgtcg atcaacaccg tctacgaacg ccctccaaaa cacaaaacca acaacgccaa 60
aaaacaacta aacaaaaacg ccccgcgcac gaccgccata accgcgacac gcgcgaaaaa 120
<210> 80
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 80
ccccccgcgc gtaccgcgac cataacgacc gtacgcgaaa cgcccctact caactacctc 60
ctaacgttac taaccctata ccctaaaaaa cgcccgcaaa cgatactaac cgacgacgaa 120
<210> 81
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 81
cctccgaaaa ctaaaactta tcgaaaccga cgcaccgaac taaaaactac ctaaaaaaat 60
tactttccca acccaaactc ttaacgataa aatctaacat ccgctccgcc cgaaatacta 120
<210> 82
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 82
caacatcccg aacgaaacga ataccaaatc ccaccgctaa aaacctaaac taaaaaaaca 60
atctttccaa acaaccccca acccgatacg ccgaccccga caaatcccaa ccctcgaaaa 120
<210> 83
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 83
acaaatacga aaaaaaaaaa attcaaaaac aaccacgaaa aaacaaaaac ttaatactac 60
caattaaatt aaacaaaaca atcaataaac ccaaccaact ctaaaatcaa ataaaaattc 120
<210> 84
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 84
aaacccctac ctaactccaa aactaactaa atttattaac taccctatcc aatccaacta 60
acaacattaa acttttatcc cttcgtaact acttctaaac ttttccctcc ccgcatttat 120
<210> 85
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 85
aaaaaaaaaa acacaaaatt cccaccccac aaaaacaacc cctacctacc ccccaaccta 60
cccaaccaca ccccacacca ccccttcccc ctccctttat tccctaaaca acacctcccc 120
<210> 86
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 86
aaaaaaacat catccaaaaa acaaaaaaaa aaaaaaaaaa caacacaaaa cacaaccaaa 60
caaattaaaa aacaaataaa aaccacttcc acaaaacaaa aatcccacac cccctccccc 120
<210> 87
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 87
aaaaaacaac aaaactcaca aacaaacacc acaaacaccc ccaaccccaa ctcaaccaca 60
cccccaaact ctacaaccaa taaccaaacc aaaaacaaac ccaaaaaaaa aacaaaacct 120
<210> 88
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 88
aaaccccacc cctcctccaa acccaccccc aacctaacca ttaaccacaa aactcaaaaa 60
cataatcaaa ctaaaactaa aaacacccac aatacccacc cacaaatctc actacctccc 120
<210> 89
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 89
ctaaatctct aaaccctttt ccctccccat tcaaatcaca ctccaactat aattactcaa 60
atctaacttt acaaataaca atacacttcc aaacccccct catccacccc tcatccccct 120
<210> 90
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 90
aaaaaaacaa aaaacaaata aaaaaaattt aaaaacacac taccacttac aaaatcaaac 60
ccaaacaatc acaaccaaaa cacaattcaa ataaaaaaaa aaaaaaattc aaaaattcaa 120
<210> 91
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 91
aaaaacttac aaaccacaac aaaaccaacc aacatactaa acatactcaa taacaaacca 60
aacactaaaa tcaaaaacct atacacaaca accaccacca aaccaaccaa aacacacaaa 120
<210> 92
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 92
tccatacacc ccaaccaact caacaacaac taccacacac aaacttccaa ctccaacacc 60
caacccacca ctaaacatac ccaacacacc aaccaatctc actacaatcc acaaatcccc 120
<210> 93
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 93
ataaaaaaaa aaaaaataaa aaccaaaatt taaaacatat aactcaaaaa tacaaaaaaa 60
aaaactaaaa attcaaaaaa cctatataaa aacaactcaa cactccaaca caacaaaaaa 120
<210> 94
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 94
ctctctacta taccaaaaca ccaaactact ctcacacaaa cttcttaaat tcttaacccc 60
tcctcccata ctcctaaatc acacactcca aatcctaacc cccatccctc ccctccccac 120
<210> 95
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 95
aatctctcca cccatcacta tacaacctaa aactccatcc taactcacaa accacaacac 60
aaccaacacc caaccacctc tccctttcct ccacacacaa acaaccacaa tccaccataa 120
<210> 96
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 96
ctacaataaa ccacaactac ccatatacaa aaaaaaaaaa aaaacaacta aatactaact 60
acactacaat ccataaacca aaacaaaatc ccaaactata caataataaa caaaaaaact 120
<210> 97
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 97
attaataaaa aaataaactc tacttcccaa caaaatccta caaaattaac aaaaactcct 60
ccaaaaacta aaacaccaat ctacataaaa acaaataaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
<210> 98
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 98
ctctcctccc ctctcttccc caccacccat ttctacacaa atcaataccc caatccctaa 60
aaaaacctcc accaactcca caaaacccca ccaaaaaata aaacccaccc ctttaccaat 120
<210> 99
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 99
cctctcccaa acaaaaaaaa caaaaaaaac acatcctaac caaaccaaat aatatcttcc 60
actcaataca tctctctaaa aaccacacaa aaaaaatact aatccacaaa aacacacaca 120
<210> 100
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 100
cacacacacc cctacaaacc aacatccttc ccacacaact cctaaaaaaa cacaccaaat 60
aaaaaacact actcaactta accaaaacac actcttccca ccccctccac ccaaaaaaaa 120
<210> 101
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 101
aaacaaacaa taacacaaca atcacaatct acacattctc ctattaatta acaaaatcta 60
cccaaaaacc aacataccca ctacacaaaa ccacaataaa atataaaaac ccaaaaacca 120
<210> 102
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 102
caactcccaa accctcacac tccaccacaa ccccacacaa caaacatacc aacctccaaa 60
caaaccctac taatcaataa aaaaacacac aaatcacaac caccacacca ctacccactt 120
<210> 103
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 103
aatacacaca aaaactctat ccattttcca ttacacaata aaaatataat ttaaaataaa 60
taataaaaat ccacaaaaaa ttaaaaaaat ataatttaaa ataaataata aaaatccaca 120
<210> 104
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 104
tacaaattcc cattatctat cttaaactac actctttcaa cctcttacaa attcccatta 60
tctatcttaa actacactcc catcatacaa caaaaaacaa acaaaactcc tacatacacc 120
<210> 105
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 105
cctaataaaa caaaactttt ccacttacac acaaccacat caaaaccaca acatccaaat 60
atcttcaaca ttaaaatacc aaacctcaaa tatataaaaa aaccaaaata caaaaaaaaa 120
<210> 106
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 106
ccctctccta catctcaatt tcctcacaca cccaaaacct aacatcttaa tactaaaaac 60
atttaaatac cacaatttca acacaaccat acataaacaa aaaaacccca ctctatcaaa 120
<210> 107
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 107
ctcaaaaaca ccacaaaccc ccaacccaac ccctccaaca ctaaccacta ccacctccca 60
caaaacacca accccaactc acctcattat cactaccaaa aacaaacaca ccaaaccaaa 120
<210> 108
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 108
cctaacccaa cacacccatc cccaacaaca acaataaaat aaatcaaaac caacacctca 60
taaaaaataa caacaaccaa catcaaaaaa actaaactaa aaacccacaa tacccccaaa 120
<210> 109
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 109
tccccacaac ccaacacaaa cctaaccata ccaaccaccc tccaaaacca acttaaacct 60
actactacct aacacccccc cattcaaacc catcacttac actttaaaaa actccaaacc 120
<210> 110
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 110
aatctaaaat tttccaaaat acaaacaaca aacctaaata aaaaaacacc aaacaacaac 60
aaacccaaac taaccctaaa aaacaaccaa cacaatcaaa cccacactaa actataaaaa 120
<210> 111
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 111
tacatctata taaaaatata taataaataa tcacacaatt ataacaaact acccttataa 60
taaatatatt tccaacactc acaccatata caacacaacc tcaaaaacta taactactaa 120
<210> 112
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 112
ccaacaacca caatctccaa aaccatacta cacacaatat aaacattaaa aacacactca 60
tcacaaaaac aacctatcac aatcacacaa tcattcacca cacacctcca cacaaacaca 120
<210> 113
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 113
caaaaaactc atctccatta cacaacacta caacaaccca caactccaaa actcaactaa 60
atattaaaaa ttaaaaaaac aaccatttca aataaaccca aacaaaaaac taacaaaaat 120
<210> 114
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 114
attcctatca actcctcacc taaacccacc caaaacaact actccctcaa ctctcaacat 60
ccaaccaaac ctcaaaatta caaatcacca taacactaca caataaaaat aaacctccca 120
<210> 115
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 115
accaaaatta taaatttatc aaattaatta aacttcaaaa taaaaaaaaa aaaaccttaa 60
cacccaaata tttttaaaaa atacttttat ctacccatct aaattactcc tttaaaaaaa 120
<210> 116
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 116
cttttccaaa aaaacaaccc aaacaaataa acaaaaacac ctcctaaaaa tatctaaata 60
ccaaaacctt tccttcctca cctcaaaacc caaccaaccc aataaatcca caaccctaac 120
<210> 117
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 117
aaaaactcac ccactctccc aaaccctacc ccaaacaact cccaacccca actatatcta 60
taaatcccca aaccacaact actccaacaa caacaaaact aactctactc aaccacaaac 120
<210> 118
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 118
actcacaacc aaacaaaacc aactctatca ccactaaaac aactacaact caaaaaccca 60
caaacacaac caaaatcaaa aaccacccaa aacaaaactc aaaaaaacaa ataaattccc 120
<210> 119
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 119
cctcaattcc actctaaacc ctaacaatcc ctaaacaaaa aaaaatcaaa attaacaaaa 60
aaatccaccc ctaaaaaaaa aaaattaaac aaaactacac tcctataaac aaactcacaa 120
<210> 120
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 120
tcacaaaccc acccacaaaa acacaaccct acttaactct ttccccttaa aaataaactc 60
ttctatcaac cctaacttcc cctcactcaa aaattatcaa aactcaaaat aaaaccaaaa 120
<210> 121
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 121
acaactccta accacaaaaa ctctcccctt acacacaaaa cctacactaa ctaaaaaact 60
acaaactaat caccaacaac acatacaaaa caccaacacc tcaccacaaa atacaaatac 120
<210> 122
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 122
acacccacac cctacaacaa aacatcaaca ccccacacat accactaaca atcaatctac 60
aattccccaa ccaatacaaa tttcatatac aaaaaaaaaa cttccacaac taaaaactac 120
<210> 123
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 123
ccaacaaaca aaacttccct atacccacct cccccaacac aaaaaacact ttctaaacct 60
aaataaccac actctacacc aatcactatc ccaaaacttt acaccactcc tccaaacatc 120
<210> 124
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 124
aacacttaaa aaaacaacat aaaattccaa aacaacaatt aatataaaac acaatcactc 60
aaacccaaaa aatacttcct ataccaaaaa aaataaatac aaaaaaatct cacctattaa 120
<210> 125
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 125
actaataatc taacaaaaca aactaaactc atccaaatcc caacaataaa tcacaccact 60
ctacaaaaca taaatactaa aaacacaacc catccctcaa ccaaactccc ccacacaccc 120
<210> 126
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 126
aaacacacaa aaaaacccaa ccaaaaaata aactacaccc ccaacatcca tatctcacaa 60
aacaacataa tctactacca aaactcaaac aaatccaact caccccacca aaccaccaac 120
<210> 127
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 127
tataacaaaa aaaaacctaa aaactccaca cctccaactc cccacaacta aaattttact 60
atcttcaacc ctcaaacaaa aaacatccaa caactctaca aacacacaaa cacacaaacc 120
<210> 128
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 128
aattcacata tctacacatt tacaaaacta ccaaacatcc cccacccaaa aattaaaaac 60
aacaaaaccc caactataaa aaaccaaaaa tacaaaattt ccaaattctc tcttatcaca 120
<210> 129
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 129
caactaaaaa ctaaatctaa ccatttaaaa ccaaatctta acccatcacc cacaatacaa 60
aaaactaata aactttcctt aaccatcaaa cccaccacaa cacaaatctt aactacaaaa 120
<210> 130
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 130
ccccacaacc aaaacccaca ccataacaaa cccaacaacc aaaaaaaacc caccaaccct 60
ccacaccata aacaacaaac caaaacccaa ccctaaacaa ccaaacccaa cccctaatca 120
<210> 131
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 131
ataaaaaaaa aaaaaacccc aaaacacacc tacataaaac aaaaacaaca accaactaaa 60
aactaaatct aaccatttaa aaccaaatct taacccatca cccacaatac aaaaaactaa 120
<210> 132
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 132
ccaaccctcc acaccataaa caacaaacca aaacccaacc ctaaacaacc aaacccaacc 60
cctaatcaac taccaccccc accccacaca aacacactcc aaaaccctcc cctcccccac 120
<210> 133
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 133
caacacaaca taaacctact ctcaaaaaaa ctcaacaaaa accaccaaat ccacacaacc 60
cccaccaacc tctcaaaaat ataaccacca aaactaaaaa aaccacaaaa ctcaccccac 120
<210> 134
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 134
acaaaataaa ccctacaacc cctctaactt caacaatcac atttccaaaa aatcaacaaa 60
aactacacaa actcaataat cctcaccaaa ccctcccaaa aacaaaccca caccacacca 120
<210> 135
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 135
ctcatcatca atcaacacca tctacaaaca ccctccaaaa cacaaaacca acaacaccaa 60
aaaacaacta aacaaaaaca ccccacacac aaccaccata accacaacac acacaaaaaa 120
<210> 136
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 136
ccccccacac ataccacaac cataacaacc atacacaaaa cacccctact caactacctc 60
ctaacattac taaccctata ccctaaaaaa cacccacaaa caatactaac caacaacaaa 120
<210> 137
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 137
cctccaaaaa ctaaaactta tcaaaaccaa cacaccaaac taaaaactac ctaaaaaaat 60
tactttccca acccaaactc ttaacaataa aatctaacat ccactccacc caaaatacta 120
<210> 138
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 138
caacatccca aacaaaacaa ataccaaatc ccaccactaa aaacctaaac taaaaaaaca 60
atctttccaa acaaccccca acccaataca ccaaccccaa caaatcccaa ccctcaaaaa 120
<210> 139
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 139
acaaatacaa aaaaaaaaaa attcaaaaac aaccacaaaa aaacaaaaac ttaatactac 60
caattaaatt aaacaaaaca atcaataaac ccaaccaact ctaaaatcaa ataaaaattc 120
<210> 140
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 140
aaacccctac ctaactccaa aactaactaa atttattaac taccctatcc aatccaacta 60
acaacattaa acttttatcc cttcataact acttctaaac ttttccctcc ccacatttat 120
<210> 141
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 141
ggggaagggg cggcgcgggg cgcggtcggg taggttgggg ggtaggtagg ggtcgttttt 60
<210> 142
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 142
ggaagcggtt tttatttgtt ttttaatttg ttcggtcgcg tttcgcgtcg tttttttttt 60
<210> 143
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 143
ggtttggtta ttggtcgtag agttcggggg cgtggtcgag ttggggttgg gggcgttcgt 60
<210> 144
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 144
gcgggcgttt ttagttttag ttcgattacg ttttcgagtt ttgcggttaa tggttaggtt 60
<210> 145
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 145
ggaagcgtat tgttatttgt aaagttagat tcgagtaatt atagtcggag cgcgattcga 60
<210> 146
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 146
tcgaatcgcg tttcggttgt gattgttcgg gtttgatttt gtaagtggta gtgcgttttt 60
<210> 147
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 147
tgtcgcgtat aggttttcga ttttagcgtt cggttcgtta ttgagtatgt ttagtacgtt 60
<210> 148
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 148
ggcgtgttgg gtatgtttag tggcgggtcg ggcgttggag tcggaagttt gtgcgcggta 60
<210> 149
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 149
tttatatagg ttttttgaat ttttagtttt ttttttcgta tttttgagtt atacgtttta 60
<210> 150
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 150
tggagcgtgt gatttaggag tacgggagga ggggttaaga atttaagaag tttgtgtgag 60
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列说明：人工合成的序列
<400> 151
aggaaaggga gaggcggttg ggtgttggtt gcgttgcggt tcgtgagtta ggacggagtt 60
<210> 152
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<212> DNA
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<223> 人工序列说明：人工合成的序列
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<223> 人工序列说明：人工合成的序列
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ttgttggagt agttgtggtt tggggattta tagatatagt tggggttggg agttgtttgg 60
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Claims (10)

1. 用于检测标志物甲基化水平的探针组合物在制备用于检测结直肠癌的试剂盒中的用途，所述标志物为TRAPPC11基因，所述TRAPPC11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述探针组合物用于靶向甲基化后的基因。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中，所述标志物还包含选自下述中的一种：AGBL4、NGF-AS1、FAM72A、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、ZNF566、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85，所述标志物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、5、7、9-12、14、16-19和21-28所示。
3. 根据权利要求2所述的用途，其中，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域杂交，所述第一探针组合物分别如SEQ ID NO: 33-34、37-38、41-42、45-52、55-56和59-84所示，所述第二探针组合物分别如SEQ ID NO: 89-90、93-94、97-98、101-108、111-112和115-140所示。
4. 一种用于结直肠癌检测的组合物，所述组合物包括用于检测TRAPPC11基因甲基化的核酸，所述TRAPPC11基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；
所述核酸包括探针组合物，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域杂交，所述第一探针组合物分别如SEQ ID NO:67-68所示；
所述第二探针组合物分别如SEQ ID NO:123-124所示。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包括用于检测选自下述标志物中任一种甲基化的核酸： AGBL4、NGF-AS1、FAM72A、ARHGAP22、CEP164、B4GALNT1、EVL、ZNF566、RTN4、PPP1R16B、PRRT3-AS1、FAM184B、PDE8B、RSPO3、CAHM、QKI、AEBP1、NRCAM和GPR85，所述标志物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 3、5、7、9-12、14、16-19和21-28所示。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中，所述核酸包括探针组合物，所述探针组合物包含高甲基化的第一探针组合物和低甲基化的第二探针组合物，所述第一探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG高甲基化的区域杂交，所述第二探针组合物用于与经重亚硫酸盐转化的CG低甲基化的区域杂交，所述第一探针组合物分别为SEQ ID NO:33-34、37-38、41-42、45-52、55-56、59-66和69-84所示，所述第二探针组合物分别为SEQ ID NO:89-90、93-94、97-98、101-108、111-112、115-122和125-140所示。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述组合物还包括将标志物的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述用于检测标志物甲基化的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
9.一种试剂盒，其包含权利要求4-8中任一项所述的组合物。
10.一种芯片，其包含权利要求4-6和8中任一项所述的组合物。
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