CN115094139B

CN115094139B - 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒

Info

Publication number: CN115094139B
Application number: CN202210735046.2A
Authority: CN
Inventors: 蔡迪; 董兰兰; 张良禄
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN115094139A

Abstract

本发明涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；目标区域包括如下定义的区域1或区域1的部分区域以及区域2或区域2的部分区域中的一个或者多个：以GRch38.p14为参考基因组，区域1为Chr11:129373212‑129373426，区域2为Chr1:63319773‑63319944。以GRch38.p14为参考基因组，膀胱癌患者癌组织样本中染色体位置为Chr11:129373212‑129373426和Chr1:63319773‑63319944区域的甲基化水平显著高于癌旁正常组织样本。基于该发现，发明人通过检测一个或者多个区域的甲基化水平能有效区分癌症患者和健康人。

Description

检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着生命健康。从组织病理学上讲，膀胱癌包括尿路上皮膀胱癌、鳞状细胞癌、腺细胞癌、脐尿管癌等。其中膀胱尿路上皮癌最为常见，约占膀胱癌的90％以上。根据肿瘤是否浸润膀胱肌层，膀胱癌分为非肌肉浸润性疾病(NMIBC)和肌肉浸润性疾病(MIBC)。几乎80％的膀胱癌表现为非肌肉浸润性疾病，其中约60％的疾病局限于膀胱粘膜，约30％的疾病侵入膀胱粘膜下层，约10％的疾病表现为原位癌。膀胱癌的5年生存率与确诊时的疾病分期有关，原位癌的5年生存率高达95.8％，而转移性膀胱癌的5年生存率低至4.6％，这说明准确、及时的诊断对于膀胱癌患者的预后是至关重要的。

尿液脱落细胞学检查和膀胱镜检查是目前用于诊断膀胱癌的两种主要方式。尿液脱落细胞学诊断膀胱癌尤其是低级别瘤变的灵敏性较低。膀胱镜检查及病理活检是膀胱癌诊断的金标准，也是术后复发监测的主要手段之一；然而，膀胱镜检查是一种侵入性手术，它存在造成尿道穿孔、出血或感染的风险。因此，目前急需高灵敏度、非侵入性的诊断早期膀胱癌的方法。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

基于此，本发明实施例的目的包括提供检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒。本发明实施例用特定目标区域的甲基化水平的检测试剂制备膀胱癌诊断试剂盒，采用该试剂盒能够实现无创、高灵敏度、高特异性的膀胱癌的诊断。

在本发明的第一方面，提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；

所述目标区域包括如下定义的区域1或区域1的部分区域以及区域2或区域2的部分区域中的一个或者多个：

以GRch38.p14为参考基因组，区域1为Chr11:129373212-129373426，区域2为Chr1:63319773-63319944。

在本发明的一些实施方式中，所述区域1的部分区域为Chr11:129373242-129373366；或/和，所述区域2的部分区域为Chr1:63319800-63319944。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括所述引物对对应的检测探针。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述区域1和所述区域2中的一个或者多个的甲基化引物对和非甲基化引物对；其中：

所述区域1对应SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的甲基化引物对，或/和，

所述区域1对应SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的非甲基化引物对，或/和，

所述区域2对应SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的甲基化引物对，或/和，

所述区域2对应SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的非甲基化引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂包括检测所述区域1的部分区域和所述区域2的部分区域中的一个或者多个的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；

所述区域1的部分区域对应SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的检测引物对和SEQ ID NO.21所示的检测探针，或/和，

所述区域2的部分区域对应SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的检测引物对和SEQ ID NO.24所示的检测探针。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针，所述内参基因包括ACTB基因，所述ACTB基因对应SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示的检测引物对和SEQ ID NO.27所示的检测探针。

在本发明的一些实施方式中，所述检测探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在本发明的一些实施方式中，检测的样本为组织样本或者尿液样本。

在本发明第二方面，提供一种膀胱癌诊断试剂盒，包括第一方面中定义的试剂。

在本发明的一些实施方式中，所述诊断试剂盒还包含扩增试剂、将未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或者多种。

在本发明的一些实施方式中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或者多种。

相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：

发明人发现，以GRch38.p14为参考基因组，膀胱癌患者癌组织样本中染色体位置为Chr11:129373212-129373426和Chr1:63319773-63319944区域的甲基化水平显著高于癌旁正常组织样本。基于该发现，发明人通过检测尿液样本中Chr11:129373212-129373426和Chr1:63319773-63319944中的一个或者多个区域的甲基化水平能有效区分癌症患者和健康人，从而提供了一种非侵入性、高灵敏度、高特异性的膀胱癌诊断或辅助诊断的方法。

具体实施方式

下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。

本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代笔定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

术语“Taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。

膀胱癌的发生发展是复杂的、多因素、多步骤的病理变化过程，其中遗传因素包括表观遗传等在其中发挥了重要作用。DNA甲基化、组蛋白变异、染色质重塑和组蛋白翻译后修饰是影响基因表达的重要表观调控机制，而DNA甲基化又是被探究最多的一种表观遗传方式。现今，已经明确DNA甲基化是膀胱癌发展的一个贡献者，因此，异常的DNA甲基化可能作为膀胱癌检测、预后监测等的生物标志物。例如，一组包含HOXA9、PCDH17、POU4F2和ONECUT2基因的甲基化标志物，其在血尿患者样本中检测膀胱癌的灵敏度为90.5％，其在良性疾病患者尿液样本中的特异性为73.2％。在临床应用时，高灵敏度、高特异性的甲基化标志物对于提高早期膀胱癌的检出率是十分重要的，因而需要继续探索能满足临床需求的、诊断性能优异的甲基化标志物，特别是高特异性的甲基化标志物。

本发明的第一方面

本发明提供检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；

其中一个示例中，所述区域1的部分区域为Chr11:129373242-129373366。

其中一个示例中，所述区域2的部分区域为Chr1:63319800-63319944。

其中一个示例中，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

其中一个示例中，所述试剂包括检测所述区域1和所述区域2中的一个或者多个的甲基化引物对和非甲基化引物对；其中：

所述区域2对应SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的非甲基化引物对。

其中一个示例中，所述试剂包括检测所述区域1的部分区域和所述区域2的部分区域中的一个或者多个的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；

其中一个示例中，所述试剂还包含检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针，所述内参基因包括ACTB基因，所述ACTB基因对应SEQ ID NO.25和SEQ IDNO.26所示的检测引物对和SEQ ID NO.27所示的检测探针。

另外，需要说明的是，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.14、SEQID NO.16和SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示引物或者SEQ ID NO.18、SEQID NO.22、SEQ ID NO.25所示探针具有大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。

术语“％同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，％同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。

对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI BLAST(Altschul etal.,1990、J Mol Biol 215:3,403-410；Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res25:17,3389-402)确定百分比同一性。

引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。

碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。

其中一个示例中，所述检测探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述荧光报告基团例如FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE、Quasar 705等。所述荧光淬灭基团例如MGB、BHQ1、BHQ2及BHQ3等。

本发明检测的适用样本种类多样，包括唾液、尿液、血液等，在其中一些示例中，检测的样本为组织样本或者尿液样本。

本发明第二方面

本发明提供一种膀胱癌诊断试剂盒，包括第一方面中定义的试剂。

具体实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

发明人发现，以GRch38.p14为参考基因组，膀胱癌患者癌组织样本中染色体位置为Chr11:129373212-129373426和Chr1:63319773-63319944区域的甲基化水平显著高于癌旁正常组织样本。因此，发明人推测可以通过检测Chr11:129373212-129373426和Chr1:63319773-63319944中至少一个区域的甲基化水平来区分癌症患者和健康人，从而用于诊断或辅助诊断膀胱癌。在实施例1中，以SEQ ID NO.1(Chr11:129373212-129373426)和SEQID NO.4(Chr1:63319773-63319944)所示区域中至少一种区域作为分子标志物，通过亚硫酸氢盐测序的方法检测其甲基化水平，从而分析该方法诊断膀胱癌的性能。具体检测过程如下所示。

1.收集样本

1)于武汉和北京某医院收集96例经病理检测确诊为膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁组织样本96例，所有的组织样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。所有组织样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有组织样本均采用匿名化处理。

2)于武汉和北京某医院收集156例经病理检测确诊的膀胱癌患者及128例进行常规体检的健康人的尿液样本，此外，还收集了常见的泌尿系统良性疾病(包括腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本72例，泌尿系统其他恶性肿瘤(肾癌、前列腺癌等)患者的尿液样本45例，收集到的每份尿液样本的体积大于10mL。所有尿液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有尿液样本均采用匿名化处理。

2.提取样本DNA

使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。

利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体步骤如下所示。

1)裂解结合

准备洁净的5mL离心管，向其中加入100μL蛋白酶K。尿液样本混匀后取2mL至准备好蛋白酶K的离心管中，依次加入2mL裂解结合液和20μL磁珠，上下颠倒混匀后，置于混匀仪上于25℃裂解30min，保持磁珠处于悬浮状态。

2)洗涤

将离心管置于磁力架上，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。小心吸除废液，加入2mL洗涤液，涡旋混匀10次以上，使磁珠完全分散，再次吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。

3)漂洗

小心吸除废液，先加入500μL漂洗液将磁珠洗涤至底部后将磁珠悬浮液转移至新的2mL离心管中，再加入500μL漂洗液将5mL离心管管壁上残余的磁珠完全洗涤到底部，瞬时离心后转移全部磁珠悬浮液到2mL离心管中，涡旋混匀10次以上使磁珠完全分散，吸磁2min，至溶液澄清后，颠倒数次冲洗管盖上残留的磁珠，直至全部吸磁完成。重复漂洗一次。

4)洗脱

取下离心管短暂离心收集残余的液体，置于磁力架上吸磁完成后，用小枪头吸去残余的液体。将离心管开盖放置5min使磁珠表面无光泽。加入50μL洗脱液TE(Tris-EDTAbuffer solution，TE缓冲液)，轻轻震荡使磁珠分散，置于56℃洗脱10min，每隔3min取出轻轻震荡，使磁珠处于悬浮状态。

5)收集DNA溶液

取出离心管，离心收集管盖及管壁上的液体，置于磁力架上吸磁1min，小心吸取上清即得DNA溶液。

3.样本DNA转化

组织样本和尿液样本中DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤如下所示。

加入40μL上述DNA溶液到200μL PCR管，加入110μL转化混合液，混匀后置于PCR仪中，设置程序为：95℃10min，64℃90min，4℃1h。

4.样本DNA纯化

1)将转化产物转入2mL离心管，加入600μL结合液及10μL磁珠，混匀静置结合15min，期间每3min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。

2)加入600μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。

3)加入800μL脱硫剂，涡旋混匀20s分散磁珠，室温静置15min脱硫，期间每5min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态。

4)加入800μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。

5)重复步骤4)一次。

6)短暂离心将液体收集至管底，将离心管置于磁力架上，小心吸尽上清；开盖于25℃放置约5min至磁珠表面无光泽。

7)加入30μL洗脱液TE，涡旋使磁珠充分悬浮于洗脱液中，56℃孵育10min，期间每3min涡旋混匀一次促进核酸充分洗脱。

8)短暂离心，将离心管置于磁力架上静置2min，转移DNA溶液至新的离心管中。

5.PCR扩增及测序

对于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示片段，分别以完全甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列和完全未甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板(如表1所示)，设计甲基化的引物对和非甲基化的引物对，扩增相应的区域，并筛选最佳的甲基化引物对和非甲基化引物对的配比，以保证在一个PCR反应体系中同时加入甲基化引物对和非甲基化引物对时，当模板中存在大于等于1％的甲基化序列时，即可扩增得到甲基化的产物，仅当模板为非甲基化序列时，扩增产物为非甲基化产物。

分别以转化后的组织样本以及各类尿液样本的DNA为模板，采用表2中SEQ IDNO.7-10所示的检测引物对，扩增SEQ ID NO.1所示片段经亚硫酸氢盐转化后的片段；同理，采用SEQ ID NO.11-14所述的检测引物对，扩增SEQ ID NO.4所示片段经亚硫酸氢盐转化后的片段。按照表3中的配方配置PCR反应体系，体系中用到的DNA聚合酶为PrimeSTAR HS DNAPolymerase(Takara,Cat:R010A)。PCR扩增程序同表4，在PCR扩增结束后，使用混合引物(包含甲基化引物对和非甲基化引物对)对扩增产物进行桑格尔测序(送测序公司)，同时从5’端和3’端测序。

表1、核苷酸片段

表2、甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列

表3、PCR反应体系

组分	用量(μL)
		<![CDATA[10×buffer(Mg<sup>2+</sup>Free)]]>	5
<![CDATA[25mM Mg<sup>2+</sup>]]>	4
		dNTP Mix(10mM each)	1
甲基化上游引物(10μM)	1
		甲基化下游引物(10μM)	1
非甲基化上游引物(10μM)	0.5
		非甲基化下游引物(10μM)	0.5
DNA聚合酶	0.5
		模板DNA	10
超纯水	补至50

表4、PCR反应程序

6.结果分析

根据测序峰图对每个样本各个扩增子中的CpG位点的甲基化情况进行分析。一个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化情况分为两种，即非甲基化和甲基化，其中甲基化又分为完全甲基化和部分甲基化。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶，则其为非甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果仍然为胞嘧啶，则其为完全甲基化的。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰)，则其为部分甲基化的。

如果一个扩增子中95％以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的，则认为此样本在该基因区域是甲基化阳性的；否则认为此样本在该区域为甲基化阴性。计算各类样本在每个区域中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目。

当以单个区域作为标志物时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本；若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。当以SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.4所示区域作为标志物时，若某个样本在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示区域中的至少一个区域是甲基化阳性的，则认为该样本为癌症阳性样本；当某个样本在SEQ ID NO.1所示区域为甲基化阴性且在SEQ ID NO.4所示区域也为甲基化阴性，则认为该样本为癌症阴性样本。

利用亚硫酸氢盐测序的方法，通过检测SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本的灵敏度和癌旁组织样本的特异性的结果如表5所示。通过亚硫酸氢盐测序的方法，检测SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所示区域2在膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者的尿液样本中的甲基化状态、检测灵敏度和特异性的结果如表6所示。灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。

表5、SEQ ID NO.1所述区域1和SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平检测在组织样本诊断中的灵敏度和特异性

表6、SEQ ID NO.1所述区域1和SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平检测在尿液样本诊断中的灵敏度和特异性

由表5和表6的数据可以看出，利用亚硫酸氢盐测序的方法，通过检测SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平来诊断膀胱癌患者的效果良好。

在组织样本中，通过检测SEQ ID NO.1所示区域1的甲基化水平区分癌组织和癌旁正常组织的灵敏度为78.13％，特异性为93.75％；通过检测SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平区分癌组织和癌旁正常组织的灵敏度为72.92％，特异性为89.58％；而同时检测SEQID NO.1所示区域1和SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平从而区分癌组织和癌旁正常组织的灵敏度可达90％以上，且其特异性仍然高于88％。

在尿液样本中，SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所示区域2的诊断性能也十分优异。可以看出，单独检测SEQ ID NO.1所示区域1和单独检测SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平从而来诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度均高于73％，任一区域或者二者结合对应的诊断健康人尿液样本的特异性均高于96％，任一区域或者二者结合对应的诊断良性泌尿系统疾病患者尿液样本的特异性均为94.44％，任一区域对应的诊断其他泌尿系统恶性肿瘤患者尿液样本的特异性均高于93％；此外，同时检测SEQ ID NO.1所示区域1和SEQ ID NO.4所示区域2的甲基化水平从而来诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度为84.62％，其诊断健康人尿液样本的特异性为96.09％，其诊断良性泌尿系统疾病患者尿液样本的特异性为94.44％，其诊断其他泌尿系统恶性肿瘤患者尿液样本的特异性为91.11％。

实施例2

通过实施例1中的亚硫酸氢盐测序分析，发现SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ IDNO.4所示区域2中的CpG二核苷酸位点在膀胱癌的癌症患者的组织样本和尿液样本中几乎都处于甲基化状态，而其在健康人的样本中几乎都处于未甲基化的状态。因此，本发明的发明人认为检测SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所示区域2中的部分区域仍然具有诊断膀胱癌的效果。

为了提升试剂盒在临床应用中的价值，本实施例提供了基于甲基化荧光定量PCR检测SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所述区域2的部分区域的甲基化水平的方法，可以根据Ct值来判断样本的甲基化状态，进而判断样本是否为癌症样本。其中，SEQ IDNO.15所示区域3为SEQ ID NO.1所示区域中的部分区域，SEQ ID NO.17所示区域4为SEQ IDNO.4所示区域中的部分区域。

1.样本的收集、样本DNA的提取、转化和纯化步骤同实施例1。

2.甲基化荧光定量PCR反应

为了提升扩增效率，甲基化荧光定量PCR检测的区域稍短于桑格尔测序所检测的区域，即区域1包含区域3，区域2包含区域4。分别以完全甲基化的且经亚硫酸氢盐转化后的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.18为模板，设计检测引物对和探针，进行甲基化荧光定量PCR反应。SEQ ID NO.15-18的核苷酸序列如表7所示，其检测引物对及探针可检测的胞嘧啶的甲基化位点如表7所示。

表7、核苷酸片段及检测引物对和探针识别的胞嘧啶核苷酸位点

检测SEQ ID NO.15所示区域3或SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平时，分别以转化后的组织样本和各类尿液样本的DNA为模板，采用表8中SEQ ID NO.19-20所示检测引物对和SEQ ID NO.22-23所示检测引物对，分别扩增目的区域。此时，每个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外，只加入单个区域的检测引物对和检测探针，还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。

若同时检测SEQ ID NO.15所示区域3和SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平，则需要采用表8中SEQ ID NO.19-20和SEQ ID NO.22-23所示的检测引物对，同时扩增目的区域。此时，每个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外，需加入两个区域(区域3和区域4)的检测引物对和检测探针，此外还需加入内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。

检测探针均为TaqMan探针，目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM或ROX，3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。区域3、区域4及ACTB基因的上下游检测引物及检测探针的序列如表8所示。

采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应体系的配置如表9所示(若检测单个区域，则不加入另一区域的检测引物对及探针，其体积用双蒸水补足)，按照表10展示的扩增程序进行PCR扩增。

表8、检测引物对及检测探针的核苷酸序列

表9、荧光定量PCR反应体系

表10、荧光定量PCR反应程序

阴性对照和阳性对照：在按照不同的组合方式检测样本时，阴性对照和阳性对照也应同时进行检测，阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将目标区域如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.18所示片段进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。若只检测单一区域(区域3或区域4)时，阳性对照DNA模板为10³拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、10³拷贝/微升的含SEQ IDNO.16或SEQ ID NO.18所示片段的人工合成质粒，二者1:1混合而成；若同时检测区域3和区域4，阳性对照DNA模板为10³拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、10³拷贝/微升的含SEQ ID NO.16所示片段的人工合成质粒、10³拷贝/微升的含SEQ ID NO.18所示片段的人工合成质粒，三者1:1:1混合而成。

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

3.PCR结果分析

根据SEQ ID NO.15所示区域3、SEQ ID NO.17所示区域4检测的Ct值来判断对应待测样本的甲基化水平。

对于组织样本，若扩增某一区域的Ct值≤38，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一区域的Ct值＞38，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。

对于尿液样本，若扩增某一区域的Ct值≤45，则认为该样本中此区域为甲基化阳性，若扩增某一区域的Ct值＞45，则认为该样本中此区域为甲基化阴性。

当以单个区域作为标志物时，若待测样本在该区域为甲基化阳性，则该样本为癌症阳性样本；若待测样本在该区域为甲基化阴性，则该样本为癌症阴性样本。当以SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.17所示区域作为标志物时，若待测样本在SEQ ID NO.15所示区域3和SEQ ID NO.17所示区域4中至少一区域为甲基化阳性，则认为该样本为癌症阳性样本；仅当待测样本在SEQ ID NO.15所示区域3为甲基化阴性且在SEQ ID NO.17所示区域3也为甲基化阴性，则认为该样本为癌症阴性样本，以组合物作为标志物的判断标准如表11所示。

表11、荧光定量法中以组合物作为标志物来判断样本的标准

利用甲基化荧光定量PCR检测的方法，通过检测SEQ ID NO.15所示区域3和/或SEQID NO.17所示区域4的甲基化水平诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性的结果如表12所示，其诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者、泌尿系统其他恶性肿瘤患者的尿液样本的灵敏度和特异性的结果如表13所示。

表12、SEQ ID NO.15所示区域3和SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平检测在组织样本诊断中的灵敏度和特异性

表13SEQ ID NO.15所示区域3和SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平检测在尿液样本诊断中的灵敏度和特异性

由以上2个表格的数据可以看出，利用甲基化荧光定量PCR的方法，通过检测SEQID NO.15所示区域3和/或SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平来诊断膀胱癌患者的效果良好。

从表12可以看出，在组织样本中，通过检测SEQ ID NO.15所示区域3的甲基化水平区分癌组织和癌旁正常组织的灵敏度为86.46％，特异性为92.71％；通过检测SEQ IDNO.17所示区域4的甲基化水平区分癌组织和癌旁正常组织的灵敏度为82.29％，特异性为87.50％；同时检测SEQ ID NO.15所示区域3和SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平从而区分癌组织和癌旁正常组织的灵敏度为94.79％，其特异性为85.42％。

从表13可以看出，在尿液样本中，单独检测SEQ ID NO.15所示区域3的甲基化水平来诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度为79.49％，其诊断健康人尿液样本的特异性为95.31％，其诊断良性泌尿系统疾病患者尿液样本的特异性为93.06％，其诊断其他泌尿系统恶性肿瘤患者尿液样本的特异性为93.33％；单独检测SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平来诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度略高，其为82.05％，其诊断健康人尿液样本的特异性为93.75％，其诊断良性泌尿系统疾病患者尿液样本的特异性为91.67％，其诊断其他泌尿系统恶性肿瘤患者尿液样本的特异性为91.11％；此外，同时检测SEQ ID NO.15所示区域3和SEQ ID NO.17所示区域4的甲基化水平从而来诊断膀胱癌患者尿液样本的灵敏度高达91.67％，其诊断健康人尿液样本的特异性为92.19％，其诊断良性泌尿系统疾病患者尿液样本的特异性为90.28％，其诊断其他泌尿系统恶性肿瘤患者尿液样本的特异性为91.11％。

综上，利用不同的方法，通过检测SEQ ID NO.1所示区域1和/或SEQ ID NO.4所示区域2的全长或部分区域(SEQ ID NO.15所示区域3和/或SEQ ID NO.17所示区域4)的甲基化水平，可以有效地提高膀胱癌的检出率，且其可以通过检测高危人群的尿液样本达到辅助诊断或诊断的目的，为膀胱癌的早期诊断提供了一种无创、便捷的途径。

以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

序列表

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 215

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

cgctgcgggt gagatcgccc gcaagcactc agtttactgg cggctgccta ccagcggctc 60

actttcctcg gggcgcctaa agctccccgc ccggcattgc cccgggagcg aacgctgagc 120

ccctgggacc cagccccgac tcggcgcagc ggtttccctc tcggcttgcg cccgggagaa 180

ccccctccgt cgtggcgtcg gacggcgatg ccagg 215

<210> 2

<211> 215

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttgcgggt gagatcgttc gtaagtattt agtttattgg cggttgttta ttagcggttt 60

atttttttcg gggcgtttaa agtttttcgt tcggtattgt ttcgggagcg aacgttgagt 120

ttttgggatt tagtttcgat tcggcgtagc ggtttttttt tcggtttgcg ttcgggagaa 180

tttttttcgt cgtggcgtcg gacggcgatg ttagg 215

<210> 3

<211> 224

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gttggtgttg tgggtgagat tgtttgtaag tatttagttt attggtggtt gtttattagt 60

ggtttatttt ttttggggtg tttaaagttt tttgtttggt attgttttgg gagtgaatgt 120

tgagtttttg ggatttagtt ttgatttggt gtagtggttt tttttttggt ttgtgtttgg 180

gagaattttt tttgttgtgg tgttggatgg tgatgttagg gttg 224

<210> 4

<211> 172

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ggagggagaa agccggcggc cggttcctga gccgagagcg gccgcggaaa aatcctctgc 60

ctccgctgga aatcgatatt aggccggcgc gggcgcggga cgtcggggcc gcagccagta 120

ggttgtgcac gtctcatcat ttagctaatc gagtcgaaaa gtttctgtaa gg 172

<210> 6

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggagggagaa agtcggcggt cggtttttga gtcgagagcg gtcgcggaaa aattttttgt 60

tttcgttgga aatcgatatt aggtcggcgc gggcgcggga cgtcggggtc gtagttagta 120

ggttgtgtac gttttattat ttagttaatc gagtcgaaaa gtttttgtaa gg 172

<210> 6

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tttggaggga gaaagttggt ggttggtttt tgagttgaga gtggttgtgg aaaaattttt 60

tgtttttgtt ggaaattgat attaggttgg tgtgggtgtg ggatgttggg gttgtagtta 120

gtaggttgtg tatgttttat tatttagtta attgagttga aaagtttttg taagggt 177

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgttgcggg tgagatcg 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcctaacatc gccgtccg 18

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttggtcttg tgggtgagat tg 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caacgctaac atcaccatcc a 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggagggagaa agtcggcg 18

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccttacaaa aacttttcga ctcg 24

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttggaggga gaaagttggt g 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acccttacaa aaacttttca actga 25

<210> 15

<211> 125

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

agtttactgg cggctgccta ccagcggctc actttcctcg gggcgcctaa agctccccgc 60

ccggcattgc cccgggagcg aacgctgagc ccctgggacc cagccccgac tcggcgcagc 120

ggttt 125

<210> 16

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agtttattgg cggttgttta ttagcggttt atttttttcg gggcgtttaa agtttttcgt 60

tcggtattgt ttcgggagcg aacgttgagt ttttgggatt tagtttcgat tcggcgtagc 120

ggttt 125

<210> 17

<211> 145

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

tgagccgaga gcggccgcgg aaaaatcctc tgcctccgct ggaaatcgat attaggccgg 60

cgcgggcgcg ggacgtcggg gccgcagcca gtaggttgtg cacgtctcat catttagcta 120

atcgagtcga aaagtttctg taagg 145

<210> 18

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgagtcgaga gcggtcgcgg aaaaattttt tgttttcgtt ggaaatcgat attaggtcgg 60

cgcgggcgcg ggacgtcggg gtcgtagtta gtaggttgtg tacgttttat tatttagtta 120

atcgagtcga aaagtttttg taagg 145

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

agtttattgg cggttgttta ttagc 25

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaaccgttac gccgaatcg 19

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggagcgaacg ttgagttttt ggga 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgagtcgaga gcggtcacg 19

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tccttacaaa aacttttcga ctcg 24

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cgtcggggtc gtagttagta ggttg 25

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggagtggttt ttgggtttg 19

Claims

1.检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用；

所述目标区域选自如下定义的区域1或区域1的部分区域以及区域2或区域2的部分区域中的一个或者多个：

以GRch38.p14为参考基因组，

区域1为Chr11:129373212-129373426，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

区域2为Chr1:63319773-63319944，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述区域1的部分区域为Chr11:129373242-129373366，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，

所述区域2的部分区域为Chr1:63319800-63319944，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测：甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，或者还包括所述引物对对应的检测探针。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述区域1和所述区域2中的一个或者多个的甲基化引物对和非甲基化引物对；其中：

所述区域2对应SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的非甲基化引物对。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述区域1的部分区域和所述区域2的部分区域中的一个或者多个的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针；

所述区域1的部分区域对应SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的检测引物对和SEQ IDNO.21所示的检测探针，或/和，

所述区域2的部分区域对应SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的检测引物对和SEQ IDNO.24所示的检测探针。

6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括检测内参基因的检测引物对和所述检测引物对对应的检测探针，所述内参基因包括ACTB基因，所述ACTB基因对应SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的检测引物对和SEQ ID NO.27所示的检测探针。

7.根据权利要求1或者2、4至6任一项所述的应用，其特征在于，检测的样本为组织样本或者尿液样本。