CN117344010B - 用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途 - Google Patents

用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于诊断胃癌的DNA甲基化生物标记物、试剂盒及用途。本发明提供了一种用于诊断胃癌的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包含等同于和/或互补于SEQ ID NO：1～42所示的靶序列中的至少一种、长度至少为15个寡核苷酸的片段，并且所述寡核苷酸的片段包含至少一个CG指示的甲基化位点。通过本发明提供的多基因甲基化联合检测的组合具有更佳的判别性能。本发明提供了对多个甲基化区域检测的试剂盒，其中的引物对及探针的设计及其组合方法对于同时并行检测多个甲基化区域的甲基化程度至关重要。本发明还为无创检测肿瘤疾病尤其是胃癌提供了一种快速有效地诊断和分级的手段。

Description

用于诊断胃癌的DNA甲基化生物标记物、试剂盒及用途
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及一种用于诊断胃癌的 DNA甲基化生物标志、试剂盒及用途。更具体而言，本发明涉及一种DNA 甲基化生物标记物的组合，提供了一种简便、无创且高灵敏度的多个基因甲基化的检测方法，该方法能够用于对受检个体肿瘤患病风险尤其是胃癌进行评估和分级。
背景技术
胃癌(Gastric cancer,GC)仍然是世界范围内的重要癌症。我绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略。实施早期胃癌筛查能将患者5年生存率提升至90％以上。因此，对胃癌进行筛查、对发现的早期胃癌及时治疗是降低胃癌死亡率、延长患者生存时间的重要手段。由于我国人口基数大，医疗资源分布不均衡，现有的医疗条件尚不能支持胃镜普查，寻求价格低廉、操作便捷的方案有助于筛查的普及，也适合我国国情。
功能基因启动子区域中CpG岛的高甲基化与多种肿瘤抑制基因的沉默相关。CpG岛甲基化是抑癌基因失活的重要机制，胃癌是表现出高频异常CpG 岛甲基化的肿瘤之一。通过寻找胃癌特异性的甲基化标记物，检测其甲基化程度可以有效区分癌/非癌，再联合其他筛查方法提高筛查的准确率。然而，迄今为止关于胃癌的甲基化分析报道十分有限。
申请号CN201410389895.2的专利文献公开了对于RNF180和Septin9基因在正常人、胃癌和胃炎患者检测的研究，其区分胃癌患者与健康人基因组 DNA的灵敏度和特异性分别为74％和87％，其区分胃炎患者与健康人基因组 DNA的灵敏度和特异性分别为62％和80％。申请号CN202010377370.2的专利文献公开了对于粪便中SDC2和TERT基因的检测，其区分胃癌(高风险)样本的灵敏度为81.5％，特异性为85.2％。另一项申请号CN201610510535.2的专利文献公开了对于胃癌与癌旁组织NDRG4基因的检测，其诊断灵敏度为 65.5％，特异性为77.3％。
然而，Septin9基因被发现是结直肠癌早期发生、发展过程中的特异性标记物(Grutzmann,R.,et al.,Sensitive detection of colorectal cancer in peripheralblood by septin 9DNA methylation assay.PLoS One,2008.3(11):p.e3759.)， SDC2基因也被认为是结直肠癌粪便检测的特异性标记物(Oh,T.J.,et al., Feasibility ofquantifying SDC2 methylation in stool DNA for early detection of colorectalcancer.Clin Epigenetics,2017.9:p.126.)。因此，这两个基因区分胃癌、结直肠癌的能力仍有待评估。单一基因的甲基化检测可能导致严重的漏检和误检，多基因甲基化联合检测可获得更好的检测效果。
此外，随着检测技术不断进步，新的生物标记物不断被发掘，非侵入性检测方法将向着高通量、低成本、自动化的方向发展。届时，非侵入性的检测方法依靠更高的灵敏度和特异性及易于接受的检测方式而逐步成为主流的胃癌筛查方法。
发明内容
发明要解决的问题
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了多个可用于鉴别胃癌发生、胃癌进展分期、胃癌Lauren分子分型及胃癌肿瘤分化程度的甲基化生物标记物(Biomarker)，通过检测多个肿瘤相关的特异性甲基化区域(即甲基化生物标记物)的甲基化状态的组合对胃癌的发生及相应的分期、分子分型及分化程度进行判别，其甲基化程度可以有效区分癌/非癌，和胃癌的不同分期、不同分子分型及不同分化程度。
用于解决问题的方案
在本发明的第一方面中，提供了一种用于诊断胃癌的甲基化生物标记物，其中，所述的甲基化生物标记物包含：
(i)等同于SEQ ID NO：1～42所示的靶序列中的至少一种、长度至少为 15个寡核苷酸的片段，并且所述寡核苷酸的片段包含至少一个CG指示的甲基化位点；和/或，
(ii)互补于SEQ ID NO：1～42所示的靶序列中的至少一种、长度至少为15个寡核苷酸的片段，并且所述寡核苷酸的片段包含至少一个CG指示的甲基化位点。
在一些实施方案中，其中所述的甲基化生物标记物包含：
(i)如SEQ ID NO:43～121所示的序列的至少一种；和/或，
(ii)与SEQ ID NO:43～121所示的序列互补的序列中的至少一种。
在一些实施方案中，其中所述的甲基化生物标记物为选自以下(i)～(vii) 组中的任一组：
(i)SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：81的组合；SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81和SEQ IDNO：84的组合；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：84的组合；SEQ ID NO：46、SEQ IDNO：81、SEQ ID NO：84和 SEQ ID NO：118的组合；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：116的组合；SEQ ID NO：76、SEQ ID NO： 80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：118 的组合；SEQ ID NO：46、81、84、118、116、111、98、58、105和57的组合；SEQ ID NO：46、81、84、118、116、111、98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、66、91、110和57的组合；或，SEQ ID NO：46、81、84、 118、116、111、98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、66、91、 110、57、43、45、49、62、89、93、96、102、103和113的组合中的任一组；
(ii)SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：105的组合；SEQ ID NO：54、105 和111的组合；SEQ ID NO：54、105、111和43的组合；SEQ ID NO：54、105、 111、43和88的组合；SEQ ID NO：54、105、111、43、88、45、46、58、98 和113的组合；SEQ ID NO：54、105、111、43、88、45、46、58、98、113、 57、62、68、80、84、91、93、96、109和118的组合；或，SEQ ID NO：46、 81、84、118、116、111、98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、 66、91、110、57、43、45、49、62、89、93、96、102、103和113的组合中的任一组；
(iii)SEQ ID NO：57和109的组合；SEQ ID NO：57、66和102的组合； SEQ ID NO：57、66、102和80的组合；SEQ ID NO：57、66、102、80和81 的组合；SEQ ID NO：57、66、102、80、81、62、76、105、109和113的组合；SEQ ID NO：57、66、102、80、81、62、76、105、109、113、45、46、 49、58、68、84、88、96、98和116的组合；或，SEQ ID NO：46、81、84、 118、116、111、98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、66、91、 110、57、43、45、49、62、89、93、96、102、103和113的组合中的任一组；
(iv)SEQ ID NO:46和102的组合；SEQ ID NO:46、102和84的组合；SEQ ID NO:46、102、84和62的组合；SEQ ID NO:46、102、84、62和54的组合； SEQ ID NO:46、102、84、62、54、57、80、81、88、113的组合；SEQ ID NO:46、102、84、62、54、57、80、81、88、113、61、66、68、76、89、 93、98、111和116的组合；或，SEQ ID NO:46、81、84、118、116、111、 98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、66、91、110、57、43、45、 49、62、89、93、96、102、103和113的组合中的任一组；
(v)SEQ ID NO:80、111、81和84的组合；SEQ ID NO：80、111、81、 84和85的组合；SEQ ID NO：80、111、81、84、85和72的组合；SEQ ID NO： 80、111、81、84、101、73、85和72的组合；SEQ ID NO：80、111、81、84、 85、72和114的组合；SEQ ID NO：80、111、81、84、76、118、85和72的组合；或，SEQ ID NO：80、111、81、84、76、118、101、73、85、72和114 的组合中的任一组；
(vi)SEQ ID NO：76和118的组合；SEQ ID NO：81和84的组合；SEQ ID NO：76、118和85的组合；SEQ ID NO：80、111、76、118和85的组合；SEQ ID NO：76、118、101、73和85的组合；SEQ ID NO：76、118、85和114 的组合；SEQ ID NO：76、118、81、84和85的组合；SEQ ID NO：80、111、 76、118、85和114的组合；SEQ ID NO：76、118、101、73、85和72的组合； SEQ ID NO：76、118、101、73、85和114的组合；SEQ ID NO：76、118、 81、84、85和114的组合；SEQ ID NO：76、118、101、73、85、114和72的组合；SEQ ID NO：76、118、80、111、81、84、101、73、85和114的组合； SEQ ID NO：76、118、81、84、101、73、85、114和72的组合；或，SEQ ID NO：80、111、81、84、76、118、101、73、85、72和114的组合中的任一组；
(vii)SEQ ID NO：80和111的组合；SEQ ID NO：76和118的组合；SEQ ID NO：76、118、81和84的组合；SEQ ID NO：80、111、76、118、81和84的组合；SEQ ID NO：80、111、76、118、81、84和114的组合；SEQ ID NO： 80、111、76、118、81、84、114和85的组合；SEQ ID NO：80、111、76、 118、81、84、101、73、114和85的组合；或，SEQ ID NO：80、111、81、 84、76、118、101、73、85、72和114的组合中的任一组。
在一些实施方案中，其中，所述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌；和/或，
所述胃癌为来自受试者的胃癌，所述的受试者是哺乳动物；优选地，所述的哺乳动物是人；和/或，
待测样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平，相对于未患有胃癌的受试者的样本中所述甲基化生物标记物的甲基化水平存在差异，则指示所述待测样本对应的受试者存在胃癌。
在一些实施方案中，其中，所述甲基化生物标记物可以作为胃癌进展分期判断的生物标记物；或者，所述甲基化生物标记物可以作为胃癌Lauren分子分型判断的生物标记物；或者，所述甲基化生物标记物可以作为胃癌肿瘤分化程度分类判别的生物标记物。
在一些实施方案中，其中，通过以下方法中的一种或多种检测所述甲基化生物标记物的甲基化程度：荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、 DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、甲基化敏感性限制性内切酶 (MS-RE)-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 (Ms-SnuPE)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(MS DGGE)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)、甲基化敏感性解链曲线分析(MS-MCA)甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、甲基化特异性多连接依赖性探针扩增、重亚硫酸盐测序和焦磷酸测序；
优选的，所述方法荧光定量PCR法；
更优选的，所述荧光定量PCR法为单重荧光定量PCR法或多重荧光定量 PCR法；
最优选的，所述荧光定量PCR法为多重荧光定量PCR通道合并检测方法。
在本发明的第二方面中，提供了一种用于诊断胃癌的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中如本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化程度的试剂。
在一些实施方案中，其中，所述的试剂为选自以下的检测甲基化程度或者检测DNA多个甲基化区域的甲基化程度的方法中所使用的试剂：荧光定量 PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(MS DGGE)、甲基化特异性变性高效液相色谱 (MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)、甲基化敏感性解链曲线分析 (MS-MCA)甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、甲基化特异性多连接依赖性探针扩增、重亚硫酸盐测序和焦磷酸测序中的一种或多种；
优选的，所述检测甲基化程度或者检测DNA多个甲基化区域的甲基化程度的方法为荧光定量PCR法；
更优选的，所述荧光定量PCR法为单重荧光定量PCR法或多重荧光定量 PCR法；
最优选的，所述荧光定量PCR法为多重荧光定量PCR通道合并检测方法。
在一些实施方案中，其中，所述的试剂包括选自以下的至少一组引物和探针：
(1)如SEQ ID NO:122、203所示的引物，如SEQ ID NO:283所示的探针；
(2)如SEQ ID NO:123、204所示的引物，如SEQ ID NO:284所示的探针；
(3)如SEQ ID NO:124、205所示的引物，如SEQ ID NO:285所示的探针；
(4)如SEQ ID NO:125、206所示的引物，如SEQ ID NO:286所示的探针；
(5)如SEQ ID NO:126、207所示的引物，如SEQ ID NO:287所示的探针；
(6)如SEQ ID NO:127、208所示的引物，如SEQ ID NO:288所示的探针；
(7)如SEQ ID NO:128、209所示的引物，如SEQ ID NO:289所示的探针；
(8)如SEQ ID NO:129、210所示的引物，如SEQ ID NO:290所示的探针；
(9)如SEQ ID NO:130、211所示的引物，如SEQ ID NO:291所示的探针；
(10)如SEQ ID NO:131、212所示的引物，如SEQ ID NO:292所示的探针；
(11)如SEQ ID NO:132、213所示的引物，如SEQ ID NO:293所示的探针；
(12)如SEQ ID NO:133、214所示的引物，如SEQ ID NO:294所示的探针；
(13)如SEQ ID NO:134、215所示的引物，如SEQ ID NO:295所示的探针；
(14)如SEQ ID NO:135、216所示的引物，如SEQ ID NO:296所示的探针；
(15)如SEQ ID NO:136、217所示的引物，如SEQ ID NO:297所示的探针；
(16)如SEQ ID NO:137、218所示的引物，如SEQ ID NO:298所示的探针；
(17)如SEQ ID NO:138、219所示的引物，如SEQ ID NO:299所示的探针；
(18)如SEQ ID NO:139、220所示的引物，如SEQ ID NO:300所示的探针；
(19)如SEQ ID NO:140、221所示的引物，如SEQ ID NO:301所示的探针；
(20)如SEQ ID NO:141、222所示的引物，如SEQ ID NO:302所示的探针；
(21)如SEQ ID NO:142、223所示的引物，如SEQ ID NO:303所示的探针；
(22)如SEQ ID NO:143、224所示的引物，如SEQ ID NO:304所示的探针；
(23)如SEQ ID NO:144、225所示的引物，如SEQ ID NO:305所示的探针；
(24)如SEQ ID NO:145、226所示的引物，如SEQ ID NO:306所示的探针；
(25)如SEQ ID NO:146、227所示的引物，如SEQ ID NO:305所示的探针；
(26)如SEQ ID NO:147、228所示的引物，如SEQ ID NO:307所示的探针；
(27)如SEQ ID NO:148、229所示的引物，如SEQ ID NO:308所示的探针；
(28)如SEQ ID NO:149、230所示的引物，如SEQ ID NO:309所示的探针；
(29)如SEQ ID NO:150、151所示的引物，如SEQ ID NO:310所示的探针；
(30)如SEQ ID NO:151、231所示的引物，如SEQ ID NO:311所示的探针；
(31)如SEQ ID NO:152、232所示的引物，如SEQ ID NO:312所示的探针；
(32)如SEQ ID NO:153、152所示的引物，如SEQ ID NO:313所示的探针；
(33)如SEQ ID NO:154、233所示的引物，如SEQ ID NO:314所示的探针；
(34)如SEQ ID NO:155、234所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(35)如SEQ ID NO:155、235所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(36)如SEQ ID NO:156、236所示的引物，如SEQ ID NO:316所示的探针；
(37)如SEQ ID NO:157、237所示的引物，如SEQ ID NO:317所示的探针；
(38)如SEQ ID NO:158、238所示的引物，如SEQ ID NO:318所示的探针；
(39)如SEQ ID NO:159、239所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(40)如SEQ ID NO:159、240所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(41)如SEQ ID NO:160、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(42)如SEQ ID NO:161、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(43)如SEQ ID NO:162、242所示的引物，如SEQ ID NO:321所示的探针；
(44)如SEQ ID NO:163、243所示的引物，如SEQ ID NO:322所示的探针；
(45)如SEQ ID NO:164、244所示的引物，如SEQ ID NO:323所示的探针；
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(51)如SEQ ID NO:170、250所示的引物，如SEQ ID NO:329所示的探针；
(52)如SEQ ID NO:171、251所示的引物，如SEQ ID NO:330所示的探针；
(53)如SEQ ID NO:172、252所示的引物，如SEQ ID NO:331所示的探针；
(54)如SEQ ID NO:173、253所示的引物，如SEQ ID NO:332所示的探针；
(55)如SEQ ID NO:174、254所示的引物，如SEQ ID NO:333所示的探针；
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(57)如SEQ ID NO:176、256所示的引物，如SEQ ID NO:335所示的探针；
(58)如SEQ ID NO:177、257所示的引物，如SEQ ID NO:336所示的探针；
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(71)如SEQ ID NO:190、270所示的引物，如SEQ ID NO:349所示的探针；
(72)如SEQ ID NO:191、271所示的引物，如SEQ ID NO:350所示的探针；
(73)如SEQ ID NO:192、271所示的引物，如SEQ ID NO:350所示的探针；
(74)如SEQ ID NO:193、272所示的引物，如SEQ ID NO:351所示的探针；
(75)如SEQ ID NO:194、273所示的引物，如SEQ ID NO:352所示的探针；
(76)如SEQ ID NO:195、274所示的引物，如SEQ ID NO:353所示的探针；
(77)如SEQ ID NO:196、275所示的引物，如SEQ ID NO:354所示的探针；
(78)如SEQ ID NO:197、276所示的引物，如SEQ ID NO:355所示的探针；
(79)如SEQ ID NO:198、277所示的引物，如SEQ ID NO:356所示的探针；
(80)如SEQ ID NO:199、278所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针；
(81)如SEQ ID NO:199、279所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针；
(82)如SEQ ID NO:200、280所示的引物，如SEQ ID NO:358所示的探针；
(83)如SEQ ID NO:201、281所示的引物，如SEQ ID NO:359所示的探针；
(84)如SEQ ID NO:202、282所示的引物，如SEQ ID NO:360所示的探针。
在一些实施方案中，其中，所述的待测样本选自由细胞、组织样品、体液样品和排泄物组成的组中的任一种，或上述生物样本的任意组合；优选的，所述体液样品选自由血浆、唾液和血清组成的组中的任一种或其任意组合，所述排泄物选自由尿液、粪便和结肠流出物组成的组中的任一种或其任意组合；更优选的，所述待测生物样本选自血浆。
在本发明的第三方面中，提供了一种选自以下的引物和探针的组合中的至少一组在制备用于诊断患有胃癌的受试者的胃癌进展程度，和/或胃癌 Lauren分子分型，和/或胃癌肿瘤分化程度分类的试剂或试剂盒中的用途，其中，所述引物和探针的组合用于检测本发明的第一方面中所述的甲基化生物标记物的甲基化程度：
(1)如SEQ ID NO:122、203所示的引物，如SEQ ID NO:283所示的探针；
(2)如SEQ ID NO:123、204所示的引物，如SEQ ID NO:284所示的探针；
(3)如SEQ ID NO:124、205所示的引物，如SEQ ID NO:285所示的探针；
(4)如SEQ ID NO:125、206所示的引物，如SEQ ID NO:286所示的探针；
(5)如SEQ ID NO:126、207所示的引物，如SEQ ID NO:287所示的探针；
(6)如SEQ ID NO:127、208所示的引物，如SEQ ID NO:288所示的探针；
(7)如SEQ ID NO:128、209所示的引物，如SEQ ID NO:289所示的探针；
(8)如SEQ ID NO:129、210所示的引物，如SEQ ID NO:290所示的探针；
(9)如SEQ ID NO:130、211所示的引物，如SEQ ID NO:291所示的探针；
(10)如SEQ ID NO:131、212所示的引物，如SEQ ID NO:292所示的探针；
(11)如SEQ ID NO:132、213所示的引物，如SEQ ID NO:293所示的探针；
(12)如SEQ ID NO:133、214所示的引物，如SEQ ID NO:294所示的探针；
(13)如SEQ ID NO:134、215所示的引物，如SEQ ID NO:295所示的探针；
(14)如SEQ ID NO:135、216所示的引物，如SEQ ID NO:296所示的探针；
(15)如SEQ ID NO:136、217所示的引物，如SEQ ID NO:297所示的探针；
(16)如SEQ ID NO:137、218所示的引物，如SEQ ID NO:298所示的探针；
(17)如SEQ ID NO:138、219所示的引物，如SEQ ID NO:299所示的探针；
(18)如SEQ ID NO:139、220所示的引物，如SEQ ID NO:300所示的探针；
(19)如SEQ ID NO:140、221所示的引物，如SEQ ID NO:301所示的探针；
(20)如SEQ ID NO:141、222所示的引物，如SEQ ID NO:302所示的探针；
(21)如SEQ ID NO:142、223所示的引物，如SEQ ID NO:303所示的探针；
(22)如SEQ ID NO:143、224所示的引物，如SEQ ID NO:304所示的探针；
(23)如SEQ ID NO:144、225所示的引物，如SEQ ID NO:305所示的探针；
(24)如SEQ ID NO:145、226所示的引物，如SEQ ID NO:306所示的探针；
(25)如SEQ ID NO:146、227所示的引物，如SEQ ID NO:305所示的探针；
(26)如SEQ ID NO:147、228所示的引物，如SEQ ID NO:307所示的探针；
(27)如SEQ ID NO:148、229所示的引物，如SEQ ID NO:308所示的探针；
(28)如SEQ ID NO:149、230所示的引物，如SEQ ID NO:309所示的探针；
(29)如SEQ ID NO:150、151所示的引物，如SEQ ID NO:310所示的探针；
(30)如SEQ ID NO:151、231所示的引物，如SEQ ID NO:311所示的探针；
(31)如SEQ ID NO:152、232所示的引物，如SEQ ID NO:312所示的探针；
(32)如SEQ ID NO:153、152所示的引物，如SEQ ID NO:313所示的探针；
(33)如SEQ ID NO:154、233所示的引物，如SEQ ID NO:314所示的探针；
(34)如SEQ ID NO:155、234所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(35)如SEQ ID NO:155、235所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(36)如SEQ ID NO:156、236所示的引物，如SEQ ID NO:316所示的探针；
(37)如SEQ ID NO:157、237所示的引物，如SEQ ID NO:317所示的探针；
(38)如SEQ ID NO:158、238所示的引物，如SEQ ID NO:318所示的探针；
(39)如SEQ ID NO:159、239所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(40)如SEQ ID NO:159、240所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(41)如SEQ ID NO:160、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(42)如SEQ ID NO:161、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(43)如SEQ ID NO:162、242所示的引物，如SEQ ID NO:321所示的探针；
(44)如SEQ ID NO:163、243所示的引物，如SEQ ID NO:322所示的探针；
(45)如SEQ ID NO:164、244所示的引物，如SEQ ID NO:323所示的探针；
(46)如SEQ ID NO:165、245所示的引物，如SEQ ID NO:324所示的探针；
(47)如SEQ ID NO:166、246所示的引物，如SEQ ID NO:325所示的探针；
(48)如SEQ ID NO:167、247所示的引物，如SEQ ID NO:326所示的探针；
(49)如SEQ ID NO:168、248所示的引物，如SEQ ID NO:327所示的探针；
(50)如SEQ ID NO:169、249所示的引物，如SEQ ID NO:328所示的探针；
(51)如SEQ ID NO:170、250所示的引物，如SEQ ID NO:329所示的探针；
(52)如SEQ ID NO:171、251所示的引物，如SEQ ID NO:330所示的探针；
(53)如SEQ ID NO:172、252所示的引物，如SEQ ID NO:331所示的探针；
(54)如SEQ ID NO:173、253所示的引物，如SEQ ID NO:332所示的探针；
(55)如SEQ ID NO:174、254所示的引物，如SEQ ID NO:333所示的探针；
(56)如SEQ ID NO:175、255所示的引物，如SEQ ID NO:334所示的探针；
(57)如SEQ ID NO:176、256所示的引物，如SEQ ID NO:335所示的探针；
(58)如SEQ ID NO:177、257所示的引物，如SEQ ID NO:336所示的探针；
(59)如SEQ ID NO:178、258所示的引物，如SEQ ID NO:337所示的探针；
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(61)如SEQ ID NO:180、260所示的引物，如SEQ ID NO:339所示的探针；
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(75)如SEQ ID NO:194、273所示的引物，如SEQ ID NO:352所示的探针；
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(78)如SEQ ID NO:197、276所示的引物，如SEQ ID NO:355所示的探针；
(79)如SEQ ID NO:198、277所示的引物，如SEQ ID NO:356所示的探针；
(80)如SEQ ID NO:199、278所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针；
(81)如SEQ ID NO:199、279所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针；
(82)如SEQ ID NO:200、280所示的引物，如SEQ ID NO:358所示的探针；
(83)如SEQ ID NO:201、281所示的引物，如SEQ ID NO:359所示的探针；
(84)如SEQ ID NO:202、282所示的引物，如SEQ ID NO:360所示的探针。
发明的效果
本发明提供的DNA甲基化生物标志及其用途，相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明提供了多个可用于诊断胃癌发生、进展分期、Lauren分子分型及肿瘤分化程度分类的新的甲基化生物标记物，这些生物标记物的联合检测具有更佳的判别性能。
(2)本发明提供了对多个甲基化区域检测的试剂盒，其中的引物对及探针的设计及其组合方法对于同时并行检测多个甲基化区域的甲基化程度至关重要，本发明提供的试剂盒利用生物信息学软件对靶基因序列SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.42及内参基因序列进行分析，利用序列分析软件，结合前期甲基化特异性引物对和探针的设计经验，同时考虑这些引物对和探针在多重PCR中的兼容性，设计出相对应的扩增引物及其探针及多重检测中的引物、探针组合。
(3)为了尽可能多的纳入特异性甲基化区域的甲基化位点，本发明对部分特异性甲基化区域的甲基化位点进行合并检测。考虑到多个甲基化生物标记物的引物对及探针组合之间的相互作用，模拟并测试了引物对和探针组合避免其错配造成的假阳性，使检测具有极低的底噪信号。
(4)本发明通过实时荧光定量PCR检测血浆样本游离DNA甲基化的方法，能实现针对2-42个特异性甲基化区域甲基化状态的并行检测，根据实时荧光定量PCR的相对循环阈值ΔCt能够便捷的判定检测生物样本的相应信息，为无创检测肿瘤疾病尤其是胃癌提供了一种快速有效地诊断和分级方法。
附图说明
图1示出了利用实施例6中所述多重荧光定量PCR对临床样本进行检测的胃癌特异甲基化标记物单个甲基化区域的诊断性能的ROC曲线。
图2示出了利用实施例7中所述安捷伦2100生物分析仪对多重荧光的通道合并检测产物进行验证的结果。
图3示出了利用实施例8中所述多重荧光定量通道合并检测方法以及多重荧光定量单个通道检测方法对临床样本进行检测的ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；寡聚核苷酸合成(M.J.Gait,1984)；分子生物学实验指南(F.M.Ausubel等，1987版)；PCR：聚合酶链式反应(Mullis等，1994版) 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义
为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在...... 中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
本说明书中，术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′ -A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
本说明书中，术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列，该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA 混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。
如本发明所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法。
如本发明所用，术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。
如本发明所用，术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
如本发明所用，术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。
如本发明所用，术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，使得在任何检测系统中可检测。
如本发明所用，术语“肿瘤疾病级别分期”表示根据检测结果确定DNA 甲基化标记物的甲基化的程度，从而进行分级。根据本发明，可以根据DNA 甲基化的程度区分正常、良性和癌症三个等级。优选地，根据本发明，可以根据DNA甲基化的程度区分正常、良性疾病、良性肿瘤和癌症四个等级。
如本发明所用，术语“肿瘤”表示并包括预后良好的良性肿瘤(benign tumor)和具备侵袭转移能力的恶性肿瘤(malignant tumor)，优选地，根据本发明，良性肿瘤为胃部非上皮性肿瘤，恶性肿瘤为胃癌。
如本发明所用，术语“胃癌(gastric cancer)”、“胃癌(gastric carcinoma)”和“胃癌(stomach cancer)”涵义相同，是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤。
如本发明所用，术语“胃癌分期”是指按照美国癌症联合会(AJCC) 第八版和国际抗癌联盟(UICC)联合制定的分期标准，将胃癌分为四期(即 I期、II期、III期和IV期)。根据以下TNM三个指标对肿瘤进行分期。TNM (Tumor Node Metastasis)是肿瘤学中对肿瘤的一种分期形式，其中T(Tumor) 指肿瘤原发灶的情况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1～T4来表示；N(Node)指区域淋巴结(regional lymph node)受累情况。淋巴结未受累时，用N0表示。随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1～N3表示；M(Metastasis)指远处转移(通常是血道转移)，没有远处转移者用M0表示，有远处转移者用M1表示。在此基础上，用TNM三个指标的组合划出特定的分期。常用分期符号如下：
/>
“Ⅰ期”指无淋巴结转移的表浅型胃癌，或肿瘤虽己经侵及肌层但尚无局部淋巴结转移者；“Ⅱ期”肿瘤浸润至粘膜或粘膜下层，但已有距原发灶3cm以外局部淋巴结转移者；肿瘤已浸润肌层、浆膜下层，但仅有距原发灶3cm以内淋巴结转移；或肿瘤已穿透浆膜层，但尚无淋巴结转移；“Ⅲ期”指有肿瘤浸润肌层或浆膜下，并有距原发灶3cm以外淋巴结转移；肿瘤已穿透浆膜外，但仅有3cm以内淋巴结转移；甚或肿瘤已侵及邻近组织、器官，但尚无淋巴结转移或3cm以内的淋巴结转移；而“Ⅳ期”指肿瘤已累及邻近组织、器官，并有距原发灶3cm以外淋巴结转移；或已有远处转移的T、N。
如本发明所用，术语“胃炎”是各种原因引起的胃黏膜炎症。按临床发病的缓急，一般可分为急性和慢性胃炎。慢性胃炎是指由不同病因引起的胃黏膜的慢性炎症或萎缩性病变，结合临床、内镜和病理组织学结果将慢性胃炎分为：非萎缩性(浅表性)、萎缩性和特殊类型胃炎。非萎缩性胃炎内镜下又分：浅表性胃炎和糜烂性胃炎。萎缩性胃炎，是胃黏膜上皮的腺体萎缩，胃黏膜变薄、老化，由胃黏膜长期慢性炎症所引起，又可以分为：萎缩伴肠化生和不伴肠化生。肠化生是胃黏膜上皮细胞反复炎症、坏死再修复，此过程中在某些因素的刺激下，胃黏膜上皮细胞发生改变，变成类似于小肠或大肠上皮细胞。萎缩性胃炎是癌前疾病，有可能发展成胃癌。不完全性大肠型化生是易发展成胃癌的癌前病变。
如本发明所用，术语“标记物”指的是诸如基因、蛋白、代谢物等，是可测量的分子。与疾病相关的变量测定，可用于诊断疾病，或指示疾病的严重程度。疾病的存在或风险可以从生物标记物这个参数推断出来，而不需要测定疾病本身。
如本发明所用，术语“实时荧光定量PCR”表示在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该PCR 技术中，循环阈值(Cycle threshold，Ct值)的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。例如，荧光阈值(threshold)的设定方法如下：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省(默认)设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
如本发明所用，术语“扩增效率”是评估PCR扩增效率稳定可靠的一种方法，使用一系列稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Ct值，最后根据各样品浓度(本发明中为各样本的甲基化率)及相应的Ct值绘制标准曲线，得到线性方程Ct＝-klgX0+b，扩增效率E＝10^(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时，要求扩增效率范围在90％-110％(3.6＞k＞3.1)。
如本发明所用，术语“cut off值”表示针对某一个生物标记物的判断样本阴阳性的一个临界Ct值。根据本发明的某些具体实施方式，“cut off值”(即阳性判断值)是根据一定数量的样本数据，基于统计学处理而得到的，该临界Ct值可以根据所需要的灵敏度或特异性的要求不同而不同。
如本发明所用，术语“灵敏度”表示从确诊阳性的样本中检测出阳性的比例，其计算公式为：灵敏度＝(检测到的阳性/真阳性)×100％，真阳性即采用公认的金标准确诊为阳性。而“特异性”表示一定正常人样本中检测出正常的比例，其计算公式为特异性＝(检测到的阴性/真阴性)×100％。
本说明书中，术语“受试者”可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本发明中，哺乳动物是指任何种类的哺乳动物，优选人(包括人、人受试者或人患者)。受试者和哺乳动物包括，但不限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫和啮齿类动物如小鼠和大鼠。
本说明书中，诊断包括受试者疾病状态或病症的检测或鉴定、确定受试者将患给定疾病或病症的可能性、确定患有疾病或病症的受试者将对治疗有反应的可能性、确定患有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)以及确定治疗对患有疾病或病症的受试者的效果。
如本发明所用，术语“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶 (Cytosine，简称为C)甲基化，腺嘌呤(Adenine，简称为A)的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此，如本发明所用，术语“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶(Thymine，简称为T) 在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
如本发明所用，甲基化状态可任选地由术语“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
如本发明所用，“甲基化频率”或“甲基化百分比(％)”是指分子或基因座为甲基化的实例数相对于分子或基因座为未甲基化的实例数。例如，在一些实施方案中，甲基化百分比是指甲基化胞嘧啶的百分比，以β值表示，即β＝携带甲基化胞嘧啶数量/(携带甲基化胞嘧啶数量+未携带甲基化胞嘧啶的数量)。
如本发明所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
本说明书中，术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
另一个方面，所述检测手段包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶捕获。
本发明的对上述甲基化区域的检测，包括如下主要步骤：(1)采用DNA 提取试剂盒，提取待测生物样本的基因组DNA和/或游离DNA；(2)对所述 DNA进行亚硫酸氢盐转化；(3)对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行多个甲基化区域的甲基化检测。
在一些实施方案中，通过本领域中的任何标准手段，包括使用可商购的试剂盒，来分离DNA(例如，基因组DNA，如提取的基因组DNA或经处理的基因组DNA)。
在一些实施方案中，待检测的生物样品由细胞、组织样品、体液样品和排泄物组成的组中的任一种，或上述生物样本的任意组合；在一些情况下，所述体液样品选自由血浆、唾液和血清组成的组中的任一种或其任意组合，所述排泄物选自由尿液、粪便和结肠流出物组成的组中的任一种或其任意组合；在另外一些情况下，所述待测生物样本选自血浆。
如本文所用的术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其指接收者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是对于诊断测试的不同可能的块割点而言真阳性比率相对于假阳性比率的曲线图。其表明根据所选的切割点在灵敏性与特异性之间的折衷(灵敏性的任何增加将伴随特异性的下降)。 ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试的准确度的度量(面积越大越好；最佳为1；随机测试将具有面积为0.5的处于对角线上的ROC曲线；参见： J.P.Egan.(1975)Signal Detection Theory and ROC Analysis，Academic Press， NewYork)。
在一些具体的实施方案中，多种不同的方法可用于检测DNA多个甲基化区域的甲基化。检测DNA甲基化的方法包括如：甲基化特异性PCR(MSP)、 DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR及荧光定量PCR、甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 (COBRA)、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(MS DGGE)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)、甲基化敏感性解链曲线分析(MS-MCA)甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、甲基化特异性多连接依赖性探针扩增、重亚硫酸盐测序和/或焦磷酸测序。
优选的，本发明使用荧光定量PCR法
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分，目的在于对本发明的技术方案进行描述，而不是对本发明的限制。可以理解，考虑到上文所提供的一般性描述，可以实施多种其他的实施方式。
实施例
实施例1
本实施例公开了用于对个体生物样本进行检测、诊断、分类或预测、治疗监测肿瘤疾病检测的DNA甲基化标记物区域，选自等同或互补于表1所列甲基化区域中由[CG]指示的至少一个甲基化区域的靶序列。
表1 DNA甲基化区域的靶序列
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SEQ ID NO：1-42的具体序列参见附表1。
实施例2
本实施例公开了用于肿瘤疾病检测的DNA甲基化标记物组合，包含等同于或互补于SEQ ID NO.43至SEQ ID NO.121的核酸序列的至少15个寡核苷酸长片段及其互补序列，所述核酸序列选自包含等同于或互补于SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO.42的至少一个靶序列，所述寡核苷酸包含至少一个[CG]指示的甲基化位点。
表2 DNA甲基化区域的甲基化组成
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例如，表1中所述SEQ ID NO.3提供了RPRM基因多个甲基化位点区域的甲基化。SEQID NO.3序列如下(对应染色体位置 chr2:154335199-154335536)：
RPRM(reprimo)是一个受p53调控激活继而参与调控细胞周期的抑癌基因，通过引发细胞周期阻滞、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等多重机制参与调控细胞生长和肿瘤细胞迁移，在调节细胞和组织的动态平衡包括增殖、迁移、细胞存活等的信号通路中起着重要作用。研究表明RPRM可抑制CDC2 的表达从而抑制细胞周期蛋白Cyclin B1的核转运，引发细胞周期G2/M期阻滞。在包括胃癌、乳腺癌、垂体腺癌、结直肠癌等众多癌症中，由于RPRM 启动子的高度甲基化，导致其在肿瘤组织中低表达甚至缺失，从而促进肿瘤细胞增殖和迁移。
用于检测RPRM基因及其片段中至少一个甲基化位点区域内是否存在甲基化的核酸序列包括选自等同于SEQ ID NO.3的连续序列的至少15个寡核苷酸长片段。例如，SEQ IDNO.3中双下划线所示的SEQ ID NO.48代表的核苷酸序列，以及SEQ ID NO.3中底纹所示的SEQ ID NO.49代表的核苷酸序列。
进一步的，用于检测RPRM基因及其片段中至少一个甲基化位点区域内是否存在甲基化的核酸序列包括如下的选自互补于SEQ ID NO.3(其具体的序列如SEQ ID NO.369所示)的连续序列的至少15个寡核苷酸长片段，例如， SEQ ID NO.369中双下划线所示的SEQID NO.50代表的核苷酸序列。
SEQ ID NO.369：
因此，可以基于等同于或互补于SEQ ID No.3的序列设计引物和探针，用于检测RPRM基因及其片段中至少一个甲基化位点区域内是否存在甲基化。其中适用于作为PCR扩增的引物和探针的序列，可以包括任何合适的长度，例如可以包括至少13个的核苷酸，或者可以包括至少20，25，30个或者多于 30个的核苷酸。
优选的，用于检测RPRM基因及其片段中至少一个甲基化位点区域内是否存在甲基化的核酸序列包括等同于或互补于选自SEQ ID NO.48至SEQ ID NO.50的连续序列的至少15个寡核苷酸长片段。
进一步优选的，可以基于包括等同于或互补于SEQ ID NO.48至SEQ ID NO.50的连续核酸序列，设计引物和探针。其中适用于作为PCR扩增的引物和探针的序列，可以包括任何合适的长度，例如可以包括至少13个的核苷酸，包括至少一个[CG]指示的甲基化区域的甲基化。或为与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
实施例3：
本实施例公开了一种用于胃癌检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价胃癌的多个甲基化区域的甲基化测试试剂盒，包括多个甲基化区域甲基化的特异性引物对及探针，具体的引物和探针序列如表3所示：
表3 79个甲基化区域甲基化检测的引物及探针序列
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例如：SEQ ID NO.127、SEQ ID NO.208和SEQ ID NO.288分别是基于包含在靶序列SEQ ID NO.3中的如SEQ ID NO.48所示的DNA甲基化区域的序列设计的正向引物、反向引物和探针；SEQ ID NO.128、SEQ ID NO.209和 SEQ ID NO.289分别是基于包含在靶序列SEQID NO.3中的如SEQ ID NO.49 所示的甲基化区域的序列设计的另一组正向引物、反向引物和探针；而SEQ ID NO.129、SEQ ID NO.210和SEQ ID NO.290则是分别是基于包含在靶序列SEQ ID NO.3的反向互补序列(即SEQ ID NO：369)中的如SEQ ID NO.50 所示的DNA甲基化区域的序列设计的正向引物、反向引物和探针。
事实上，根据本发明，对同一甲基化位点区域可以设计多套引物和探针的组合，每套引物和探针可能存在性能上的差异。在实际应用中，将根据特异性甲基化区域的组合进行选择相应的合适的引物和探针。
典型的，甲基化区域的检测组合还包含对应的内参引物和探针以及内参序列，例如如下文所示的内参1～内参2：
【内参1】
内参序列1(SEQ ID NO.364): AAAACCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAAAAACCACAACC TAATAAAAAAAATAACCACCACCCAACACACAATAACAAACACAAATT CACAATCCAAAAAACTTACTAAACCTCCTCCATCAC；该内参序列1对应的引物和探针为：
内参序列2(SEQ ID NO.368): GTAGTTTTAGATGGTTTTTTGAGTTGGATGATTTTAGG TTTTTAGATATTTAGGGATTAGAGTAGGTTTGGGAATATAGAGGGAAGAT AGGATGGGAGTG；
该内参序列2对应的引物和探针为：
本实施例提供的试剂盒需包括PCR扩增引物及探针组(探针可采用FAM、 VIC、NED或CY5等荧光基团修饰)。
本实施例中所述引物和探针均购于生工生物工程(上海)股份有限公司，多重荧光定量PCR试剂购于Takara公司。
实施例4
利用实施例3中所述引物、探针的单重荧光定量PCR检测方法
使用商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品 (购自QIAGEN公司)对79个DNA甲基化区域(SEQ ID NO.43～121)进行单一甲基化区域的甲基化检测。
具体流程如下：
1、标准曲线的配制
商业化完全甲基化的标准品(经过亚硫酸氢盐转化后的序列，作为阳性对照)和非甲基化标准品(经过亚硫酸氢盐转化后的序列，作为阴性对照) 使用无核酸酶水均配制成5ng/μL，稀释后的商业化完全甲基化的标准品使用稀释后非甲基化标准品进行再稀释，比例依次为1:0、1:9、1:19、1:39、1： 99、1:199、0:1，对应的甲基化率分别为100％、10％、5％、2.5％、1％、0.5％和0％。
3、单重荧光定量PCR检测
采用79个DNA甲基化区域(SEQ ID NO.43-121)的引物对和探针(SEQ ID NO：122-360)，分别进行单重荧光定量PCR(引物和探针序列具体参见表3)，扩增目标区域的目标序列，通过扩增阈值Ct评估检测结果。
1)配制单个引物浓度(即表3中所述正向引物或反向引物)为10μM的 PCR引物，同时配制相应的10μM的PCR探针；
2)单重荧光定量PCR反应液配置：根据表4配制单重荧光定量PCR反应液。
表4单重荧光定量PCR反应液配置方案
试剂 终浓度 体积(μL)
DEPC水 / 16.15
10×PCR Buffer 1× 2.50
25mM MgCl2 2mM 2.00
25mM dNTP混合物 0.2mM 0.20
10μM正向引物 0.2μM 0.50
10μM反向引物 0.2μM 0.50
10μM探针 0.1μM 0.25
5U/μl Taq酶 2Unit 0.40
ROX(50×) 1× 0.50
PCR反应液体积[μl] / 23.00
3)加入DNA样本：加23μL荧光定量PCR反应液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量10ng，PCR反应总体积25μL。涡旋震荡和离心。每个甲基化区域及内参基因对应的每个标准品浓度检测2个复孔。
4)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃15秒，60℃40秒，15 个循环；95℃15秒，62℃40秒(采集荧光)，45个循环。
5)结果处理
记录下荧光定量PCR相应的荧光通道下的扩增阈值Ct，按照所述的“扩增效率”的评估方法，计算检测结果的最佳线性范围、扩增效率和线性相关系数。
典型地，所述的大部分的引物探针的单重检测其结果的最佳线性范围在 1％-100％甲基化率内，或扩增效率在80％-120％之间，或线性相关系数大于 0.98。
对比同一个基因区域内的多套引物探针组合，例如：用于检测同一个靶序列SEQID NO.(即表5中的第2列)及其片段中至少一个甲基化位点区域内是否存在甲基化的两个或以上核酸序列(检测区域SEQ ID NO.，即表5中第1 列)其对应的结果如下表5所示，其结果表明，所设计的同一个基因区域内的多套引物、探针组合均能实现对目标区域的多个甲基化位点的检测。
表5：单重荧光定量PCR检测结果
本实施例表5中所述“最佳线性范围”是指在以完全非甲基化标准品为背景的情况下，对应百分比质量含量的全甲基化标准品在此范围内呈现良好的线性关系。“线性相关系数”用于反应甲基化百分比和Ct值之间的相互关系，其越接近1，表示甲基化百分比和Ct值之间的相关程度就越强。“扩增效率”是评估PCR扩增效率稳定可靠的一种方法，使用一系列稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Ct值，最后根据各样品浓度(本发明中为各样本的甲基化率)及相应的Ct值绘制标准曲线，得到线性方程Ct＝-klgX0+b，扩增效率E＝10^(-1/k)-1。
因此，如本实施例所述，实施例3中所设计针对同一个基因区域内的多套引物、探针组合均可用于对目标基因区域的单重荧光定量甲基化检测。
实施例5
利用实施例3中所述的引物、探针的多重荧光定量PCR检测方法
使用商业化的完全甲基化(经过亚硫酸氢盐转化后的序列，作为阳性对照)及非甲基化(经过重亚硫酸氢盐转化后的序列，作为阴性对照)标准品 (购自QIAGEN公司)对实施例3中提供的的甲基化区域进行多个甲基化区域的甲基化同时检测。
具体流程如下：
1、标准曲线的配制
具体操作同实施例4。
3、多重荧光定量PCR检测
采用实施例3中提供的甲基化区域和内参基因的引物对和探针，将每3～4 个目标基因的引物、探针组合在一起，进行多重荧光定量PCR，扩增目标区域的目标序列，通过扩增阈值Ct评估检测结果。具体操作如下：
1)利用实施例3所述的甲基化区域的探针，根据特异性甲基化区域的组合选择合适的荧光基团修饰，每个甲基化区域的引物、探针至少参与一个组合的多重荧光定量PCR检测。
例如，用于检测RPRM基因的甲基化位点区域SEQ ID NO.49是否存在甲基化的引物和探针SEQ ID NO.128、SEQ ID NO.209和SEQ ID NO.289，包含在如下组合A和B中进行检测：
类似上文组合A和B，列举多组甲基化区域多重荧光定量的组合(即组合C～组合Q)的具体引物、探针、荧光修饰如表7所示。
2)配制单个引物浓度为10μM的PCR引物，配制相应的10μM的PCR探针；
3)多重荧光定量PCR反应液配置：根据表6配制多重荧光定量PCR反应液。
表6多重荧光定量PCR反应液配置方案
试剂 终浓度 体积(μL)
DEPC水 / 补至23.00
10×PCR Buffer 1× 2.50
25mM MgCl2 2mM 2.00
25mM dNTP混合物 0.2mM 0.20
10μM每条正向引物 0.2μM 0.50
10μM每条反向引物 0.2μM 0.50
10μM每条探针 0.1μM 0.25
5U/μl Taq酶 3Unit 0.60
ROX(50×) 1× 0.50
PCR反应液体积[μl] / 23.00
3)加入DNA样本：具体操作同实施例4。
4)荧光定量PCR反应程序：具体操作同实施例4。
5)结果处理
多重荧光定量PCR的结果，选取每个检测组合的每个荧光通道，记录下相应的荧光通道下的扩增阈值Ct，按照所述方法计算各目标基因与内参基因的相对扩增阈值ΔCt。列举一些组合，其对比各基因在单重检测体系和多重检测体系中的结果如下表7所示：
表7：各基因在单重检测体系和多重检测体系中的结果
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如上述列举的组合方案所示，任意3～4个目标基因甲基化区域的引物、探针组合进行的多重荧光定量PCR所得的ΔCt值与单重荧光定量PCR的ΔCt 值相近，没有显著差异。由此判断，多重荧光定量的组合方案，其对所述甲基化区域的扩增效率并不造成相互干扰，定量性能与单个区域定量等同，可实现3～4个甲基化区域的同时定量检测。
实施例6多重荧光定量PCR对临床样本的多个甲基化区域的并行检测
对58例胃癌(病例组)及59例非胃癌(对照组)临床血浆样本，根据实施例5中的检测技术进行多个甲基化区域的甲基化并行检测。测试样本的临床信息统计如下表8所示：
表8：测试样本的临床信息
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具体流程如下：
1)样本提取
血浆游离DNA提取试剂盒购买于LIFE公司，提取方法依照试剂盒说明书执行。
2)DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于ZYMO RESEARCH公司，按照试剂盒说明书进行操作。
3)多重荧光定量PCR检测
采用实施例5中的多重荧光定量PCR检测组合，对每个临床样本进行多个甲基化区域及内参基因的共甲基化并行检测，样本DNA转化前上样量10ng，扩增方法及反应程序同实施例5。
4)结果处理
以临床样本的内镜及病理结果作为标准，根据每个SEQ ID在胃癌病例组及非胃癌对照组中的ΔCt值分布，制作ROC曲线，并计算其AUC值及Youden Index下的检测灵敏度及特异性，其中AUC>0.7或灵敏度>60％或特异性>90％的甲基化区域的检测结果列举如下表9所示，其ROC曲线如图1所示：
表9多个甲基化区域使用多重荧光定量PCR检测117例临床样本的诊断性能
SEQ ID NO. AUC 灵敏度(％) 特异性(％)
68 0.672 86.21 44.07
57 0.660 63.79 64.41
98 0.722 62.07 79.66
96 0.682 68.97 64.41
54 0.746 94.83 55.93
89 0.629 36.21 91.53
111 0.632 63.79 66.1
76 0.618 29.31 93.22
105 0.644 67.24 57.63
118 0.701 41.38 98.31
88 0.710 58.62 83.05
43 0.626 63.79 57.63
109 0.665 37.93 94.92
91 0.661 36.21 98.31
93 0.614 24.14 98.31
102 0.714 79.31 59.32
46 0.743 68.97 74.58
110 0.592 20.69 98.31
81 0.767 56.9 89.83
80 0.620 75.86 55.93
116 0.718 84.48 55.93
62 0.628 74.14 54.24
49 0.668 39.66 94.92
103 0.588 22.41 96.61
58 0.688 65.52 74.58
84 0.760 68.97 81.36
上述数据显示，所述的甲基化区域对于血浆样本中的胃癌与非胃癌组别的判别有较好的判别能力。
实施例7：多重荧光的通道合并检测方法
单一基因甲基化检测可能导致严重的漏检和误检，多基因甲基化联合检测可能获得更好的检测效果(Olkhov-Mitsel,E.,et al.,Novel multiplex MethyLight protocolfor detection of DNA methylation in patient tissues and bodily fluids.SciRep,2014.4:p.4432.)。本发明为了尽可能多的纳入特异性甲基化区域的甲基化位点，对部分特异性甲基化区域的甲基化位点进行合并检测。考虑到多个甲基化生物标记物引物及探针对组合之间的相互作用，模拟并测试了引物对和探针组合避免其错配造成的假阳性，通过优化检测体系和扩增程序，使检测具有极低的底噪信号，同时保持良好的扩增效率和线性相关性。本实施例使用的多重荧光的通道合并检测组合方式(组合1-9)如下所示：
使用商业化的完全甲基化标准品(作为阳性对照)及非甲基化标准品(作为阴性对照)对上述组合1-9中所示的11-12个甲基化区域进行每5-7个甲基化区域的甲基化检测。
具体流程如下：
1、标准曲线的配制
具体操作同实施例4。
2、多重荧光的通道合并检测
如上所述配备1-3个甲基化区域合并通道的引物探针混合物，扩增出目标区域的目标序列，产物大小在70～130bp左右。
1)配制单个引物浓度为10μM的PCR引物，配制相应的10μM的PCR探针。
2)PCR反应液配置：根据表10配制PCR反应液。
表10 PCR反应液配置方案
试剂 终浓度 体积(μL)
DEPC水 / 补至23.00
10×PCR Buffer 1× 2.50
25mM MgCl2 3mM 3.00
25mM dNTP混合物 0.4mM 0.40
10μM Primer混合物 0.05μM-0.2μM 0.125-0.500
10μM Probe 0.025μM-0.1μM 0.0625-0.250
5U/μl PCR酶 3Unit 0.60
ROX(50×) 1× 0.50
PCR反应液体积[μl] / 23.00
3)加入DNA样本：具体操作同实施例3。
4)PCR反应程序：
本发明中涉及的甲基化区域较多，引物探针退火温度难以保证一致，因此，采用了前阶段降落PCR的方式，以保证扩增的特异性。具体的：95℃5 分钟；95℃15秒，64.5℃起每循环降温0.3℃，40秒，15个循环；95℃15秒， 62℃40秒(采集荧光)，45个循环。
5)实验结果
以本实施例上文所述组合1和2为例，经过调整各甲基化区域对应的检测引物探针浓度，测试结果与多重荧光定量PCR甲基化区域单通道检测相比，其技术性能如下表11所示：
表11合并通道检测和单通道检测的结果
本实施例表11中所述“线性范围”是指在以完全非甲基化标准品为背景的情况下，对应百分比质量含量的全甲基化标准品在此范围内呈现良好的线性关系。表11中所述“线性相关系数”用于反应甲基化百分比和Ct值之间的相互关系，其越接近1，表示甲基化百分比和Ct值之间的相关程度就越强。表11中所述“CV”即变异系数，用于反映几组检测数据的离散程度，CV越小，数据波动越小，重复性越好。表11中所述“扩增效率”是评估PCR扩增效率稳定可靠的一种方法，使用一系列稀释样品，采用标准qPCR程序进行扩增获得Ct值，最后根据各样品浓度(本发明中为各样本的甲基化率)及相应的Ct值绘制标准曲线，得到线性方程Ct＝-klgX0+b，扩增效率E＝10^(-1/k)-1。
在本实施例中，列举了部分避免错配的组合。
在某些其他的实施例中，包括但不限于上述组合。
进一步的，本发明人使用了安捷伦2100生物分析仪对多重荧光的通道合并检测产物进行了验证。结果如图2所示。扩增产物的理论大小为78～108bp，内参大小约为125bp。安捷伦2100生物分析仪的分析结果与理论结果一致，且非甲基化标准品除内参外无其他产物。证明该组合特异性好。
实施例8多重荧光的通道合并检测方法对临床样本的多个甲基化区域的并行检测
使用实施例7中所述的通道合并组合对59例胃癌(病例组)及110例非胃癌(对照组)临床血浆样本进行多个甲基化区域的并行检测。测试样本的临床信息统计如下表12所示：
表12测试样本的临床信息
/>
具体检测流程如下：
1)样本提取
血浆游离DNA提取试剂盒购买于LIFE公司，提取方法依照试剂盒说明书执行。
2)DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化的具体操作同实施例6。
3)多重应该荧光定量PCR通道合并检测
使用实施例7中所述的通道合并组合，对每个临床样本进行多个甲基化区域及内参基因的并行检测。样本DNA转化前上样量10ng。扩增方法及反应程序同实施例7。
4)结果处理
以临床样本的内镜及病理结果作为标准，根据每个荧光通道(合并或单个SEQ ID)在病例组及对照组中的ΔCt值分布，制作ROC曲线，并计算其 AUC值及Youden指数下的检测灵敏度及特异性，对比使用实施例6多重荧光定量PCR单个通道多重检测中两个甲基化区域Youden指数cut-off合并判别的 AUC、灵敏度及特异性的结果如下表13所示，其ROC曲线对比如图3所示：
表13多个甲基化区域使用多重荧光定量PCR通道合并检测169例临床样本的诊断性能
上述数据显示，使用多重荧光定量PCR通道合并检测与单通道多重检测相比，所述使用的甲基化区域对于血浆样本中的胃癌与非胃癌组别的判别均有较好的判别能力，其诊断性能相近，无显著差异，多个通道合并检测可实现不牺牲诊断性能的情况下，较低样本投入量下的多甲基化区域并行检测。
实施例9利用多个甲基化区域对判别胃癌
使用实施例6中所述的检测方法对所述117例临床血浆样本的多个甲基化区域的甲基化检测数据进行分析。其中，使用每个甲基化区域的Ct值或者每个甲基化区域的ΔCt值(即ΔCt(甲基化区域1)＝Ct(甲基化区域1)-Ct(内参))作为数据输入单元进行相应的预测模型构建分析。
分别使用LASSO、随机森林、递归特征消除算法及标记物相互相关性等特征选择方法对所述多个甲基化区域进行模型特征优化，对选取的甲基化区域使用基于单个甲基化区域阈值的迭代组合逻辑回归建模方法，构建预测胃癌发生的模型，得到多个甲基化区域预测模型(多个甲基化区域组合)，其模型预测性能(包括AUC、Youden cut-off下的灵敏度及特异性、Youden指数) 与实施例6中所述的单个甲基化区域判断模型相比，其预测性能列举如下表 14所示：
表14：用于判别胃癌发生的甲基化区域组合的判别性能
/>
表14的结果表明，相对于单个甲基化区域的胃癌发生预测性能，多个甲基化区域的组合得到的预测模型具有更优越的诊断性能。同时，在这些模型中，胃癌人群相较于非胃癌人群其模型的风险评分显著提高，表明这些甲基化区域的组合可以用于作为基于血浆DNA的胃癌发生的普通筛查的生物标记物。
实施例10多个甲基化区域对判别胃癌进展程度(分期)的判别性能
使用实施例6中所述的检测方法对所述58例胃癌临床血浆样本的多个甲基化区域的甲基化检测数据进行分析。以早期胃癌(I期)作为对照组，进展期及晚期胃癌(II-IV期)作为病例组进行分析。其中，使用每个甲基化区域的Ct值或者每个甲基化区域的ΔCt值(即ΔCt(甲基化区域1)＝Ct(甲基化区域1)-Ct(内参))作为数据输入单元，对可用于进展程度判别的甲基化区域进行评估，并同时对多个甲基化区域组合进行相应的进展程度(分期)判别模型构建分析。
分别使用LASSO、随机森林、递归特征消除算法及标记物相互相关性等特征选择方法对所述多个甲基化区域进行模型特征优化，对选取的甲基化区域使用基于单个甲基化区域阈值的迭代组合逻辑回归建模方法，构建胃癌进展程度(分期)判别模型，得到多个甲基化区域判别模型(多个甲基化区域组合)，其模型判别性能(包括AUC、Youden cut-off下的灵敏度及特异性以及Youden指数)与列举的可用于进展程度判别的单个甲基化区域判断模型相比，其判断性能列举如下表15所示：
表15：用于判别胃癌进展程度的甲基化区域组合的判别性能
/>
表15的结果表明，所述的单个甲基化区域其评分在早期胃癌及进展期和晚期胃癌中有显著差异，可以作为胃癌进展程度及预后的提示。而相对于单个甲基化区域，多个甲基化区域的组合得到的判别模型具有更优越的诊断性能，表明这些甲基化区域的组合可以用于作为基于血浆DNA的胃癌进展程度判别的生物标记物。
实施例11多个甲基化区域对胃癌Lauren分型的判别性能
使用实施例6中所述的检测方法对所述58例胃癌临床血浆样本的多个甲基化区域的甲基化检测数据进行分析。以早期胃癌(I期)作为对照组，进展期及晚期胃癌(II-IV期)作为病例组进行分析。其中，使用每个甲基化区域的Ct值或者每个甲基化区域的ΔCt值(即ΔCt(甲基化区域1)＝Ct(甲基化区域1)-Ct(内参)) 作为数据输入单元，对可用于进展程度判别的甲基化区域进行评估，并同时对多个甲基化区域组合进行相应的进展程度(分期)判别模型构建分析。
分别使用LASSO、随机森林、递归特征消除算法及标记物相互相关性等特征选择方法对所述多个甲基化区域进行模型特征优化，对选取的甲基化区域使用基于单个甲基化区域阈值的迭代组合逻辑回归多分类建模方法，构建胃癌进展程度(分期)判别模型，得到多个甲基化区域判别模型(多个甲基化区域组合)，其模型判别性能(单个类型判出的敏感度、总体准确率和总体AUC)与列举的可用于进展程度判别的单个甲基化区域判断模型相比，其判断性能列举如下表16所示：
表16：用于判别胃癌分子分型的甲基化区域组合的判别性能
表16的结果表明，所述的单个甲基化区域在判别三种类型的胃癌肿瘤均具有一定的灵敏度，可以作为胃癌不同分子分型分类的提示。而相对于单个甲基化区域，多个甲基化区域的组合得到的判别模型具有更优越的诊断性能，表明这些甲基化区域的组合可以用于作为基于血浆DNA的胃癌Lauren分子分型分类判别的生物标记物。
实施例12多个甲基化区域对胃癌分化程度的判别性能
使用实施例6中所述的检测方法对所述58例胃癌临床血浆样本的多个甲基化区域的甲基化检测数据进行分析。分别将低分化肿瘤、中低分化肿瘤、中高分化肿瘤作为3个分类组别，使用每个甲基化区域的Ct值或者每个甲基化区域的ΔCt值(即ΔCt(甲基化区域1)＝Ct(甲基化区域1)-Ct(内参))作为数据输入单元，对可用于3中分类判别的甲基化区域进行评估，并同时对多个甲基化区域组合进行相应的三分类胃癌分化判别模型构建分析。
分别使用LASSO、随机森林、递归特征消除算法及标记物相互相关性等特征选择方法对所述多个甲基化区域进行模型特征优化，对选取的甲基化区域使用基于单个甲基化区域阈值的迭代组合逻辑回归多分类建模方法，构建三分类胃癌分化判别模型，得到多个甲基化区域判别模型(多个甲基化区域组合)，其模型判别性能(单个类型判出的敏感度、总体准确率和总体AUC) 与列举的可用于胃癌肿瘤分化程度判别的单个甲基化区域判断模型相比，其判断性能列举如下表17所示：
表17：用于判别胃癌分化程度的甲基化区域组合的判别性能
表17的结果表明，所述的单个甲基化区域其在判断不同分化程度的胃癌肿瘤均具有一定的灵敏度，可以作为胃癌肿瘤不同分化程度分类的提示。而相对于单个甲基化区域，多个甲基化区域的组合得到的判别模型具有更优越的诊断性能，表明这些甲基化区域的组合可以用于作为基于血浆DNA的胃癌肿瘤分化程度分类判别的生物标记物。
实施例13多个甲基化区域的多重荧光定量PCR通道合并检测方法在判别胃癌的发生、胃癌进展程度(分期)、Lauren分子分型及胃癌分化程度判别中的应用
使用实施例8中所述的检测方法对所述59例胃癌及110例非胃癌临床血浆样本的多个甲基化区域的甲基化检测数据进行分析。在胃癌的发生判别中，以胃癌作为病例组，非胃癌样本作为对照组。胃癌进展程度判别中，以早期胃癌(I期)作为对照组，进展期及晚期胃癌(II-IV期)作为病例组进行分析。在Lauren分子分型中，构建肠型、混合型及弥漫性胃癌的多分类器进行分析。其中，使用每个甲基化区域的Ct值或者每个甲基化区域的ΔCt值(即ΔCt(甲基化区域1)＝Ct(甲基化区域1)-Ct(内参))作为数据输入单元，对可用于所述应用的甲基化区域进行评估，并同时对多个甲基化区域组合进行相应的判别模型构建分析。
分别使用LASSO、随机森林、递归特征消除算法及标记物相互相关性等特征选择方法对所述多个甲基化区域进行模型特征优化，对选取的甲基化区域使用基于单个甲基化区域阈值的迭代组合逻辑回归建模方法，构建所述的相应判别模型，得到多个甲基化区域判别模型(多个甲基化区域组合)，其模型判别性能(包括AUC、Youden cut-off下的灵敏度及特异性、Youden指数) 与列举的可用于所述应用的单个甲基化区域判断模型相比，其判断性能列举如下表18～20：
表18：作为胃癌发生的判别模型标记物组合的预测性能
/>
表19：作为胃癌进展程度(分期)的判别模型标记物组合的预测性能
/>
/>
表20：作为胃癌Lauren分子分型的判别模型标记物组合
/>
表18～20的结果表明，所述的单个甲基化区域其评分在所述诊断判别的应用对比组中有显著差异，可以作为胃癌发生、进展程度及分子分型判断的提示。而相对于单个甲基化区域，多个甲基化区域的组合得到的判别模型具有更优越的诊断性能，表明这些甲基化区域的组合可以用于作为基于血浆 DNA的胃癌发生、进展程度判别及分子分型判别的生物标记物。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
附表1(示出了表1中SEQ ID NO：1-42的具体序列)
SEQ ID NO.1：
CTCTTTGCAGCTCGCACAGCTAAGGGCGAGGGCGCCCTTCGGCAG AAGCAGCAAACCGCCGGCAAGCCCAGCGAGGAGGGCTGCCGGGGTCT GGGCTTGGGAATTGGCTGGCACCCAGCGGAAAGGGACGTGAGCTGAG CGGCGGGGGAGAAGAGTGCGCAGGTCAGAGGGCGGCGCGCAGCGGC GCTCCGCGAGGTCCCCACGCCGGGCGATATGGGGTGCCTGCTGTTTCT GCTGCTCTGGGCGCTCCTCCAGGCTTGGGGAAGCGCTGAAGGTGGGT GGAACGAGGGCGCTTGAGTGCACTCGCGGGAGGGCGGAGAGAGGGA GCTGGGTAGGGACGGGGAGGGCAACGCCTGATGGGGACTGGTGAGAC CCGGGACGCACTGGCGCGATCTAGGTAGAAAACTC
SEQ ID NO.2:
GGATTTTTCCCTCAAGAACCGAGTCTGGACGCGGAGATGGAGCCA AGTGTGGCTGCATTTTCGGACCCGGAAATCCGTTGGGCACTGAAGGAC TTTTCGAACCCTGTAGCGCTGTTGCTTCGCGGTCCATCGTCGCCGCTGCAGACGGATGCGCTCCCCGGCGGCTCTACGCCCTCCAGTCCCGGCCAGG CCTCTGGGCTGGGAGCCGAGCCGTCTCGGGCCCTCCGGCGCCGCGTTT TCTAGAGAACCGGGTCTCAGCGATGCTCATTTCAGCCCCGTCTTAATGC AACAAACGAAACCCCACACGAACGAAAAGGAACATGTCTGCGCTCTC TGCGCAGCGCTTGGGCGGCGCGGTCCCGGCGCGCGGGGAAGCGGCGT CTCCGCTAACCGAGGCGCTGGAAGGGGAAAAGCGAATGCGGAAT
SEQ ID NO.3：
GCTCTGCTTTCGAAAGTCCCTGGGCCGTGGGAGTTTCCCAGGAGC CTCTCCGACGCGCGCAGCAGCTAGGCTCTTCTAAAGCCGTCCGCTCCA GCCCTGGTGGTGCTCGTTCCCGGCGCTCGCTCGAGGGGGGGCTGTTGGAACTTGGCGGGGCTGGACCAGCCCGGCCGTGGGAGGTGCGGGCCGCG GCGGCTGCAGCGGCGGGGTGGCTGCGCTGAGCAAACAGCGGCCCCTT CCGGCCGCACCGCCGCGCTGCGCGCTGCTCTTGGGAGGTGGAGGAAG CAAAGGGGCGAACCTGGTCTTGCTTTTTATTGCTTGCTTCTTTTGCAAA CTCCAA
SEQ ID NO.4:
GGGCAGCCGATCCGCCCCCAGCGCGCGCGTCTCGGCGCCAGGAG CCGTCCCGGGGCGTGTTGGCGAGCGTTGATATAGATATAAGGACATTTC TCTTCATGGCGTCACGTGACATAATTACCACCAGAATCAATCAAGATGAATTGCACGTCAGCGCCCGGTGGGGATTTTTGCTTAGTTGATCCTGGCCC AAGCCTCTTGTGCAATCGATGGCTCAGGTTGGCTGCGCGGGGAGCGGC CAGAGGCTCGCTGGCGCGCACGCCGCGGAGTCATGAACGACTTTGAC GAGTGCGGCCAGAGCGCAGCCAGCATGTACCTGCCGGGCTGCGCCTAC TATGTGGCCCCGTCTGACTTCGCTAGCAAGCCTTCGTTCCTTTCCCAAC CGTCGTCCTGCCAGATGACTTTC
SEQ ID NO.5:
CGCGGGGCTCCTCGTCCCCGTCACGCTGACTTTCCGTGCAGTGCT GTGGTGCGAAAATGCCTCGCCGGTGCGCACCGGGTCGGCAGCCTCGG CGGCGGGGGCGAGATTGGCGGGAGGGGGGCGCGGGGGGGGCGCGGT AAGAGGTGGCGGCGGGCAGAGGGTGTTTTTTTTCTTTTCCCTCCAGAG CCGGGGTTTGTAAACCGAGGCCAGAGTGTCCCCGTGGGCCGAGCGCA CTTTTTTCTTGTCCGGGTGCGCTCAGTCACTGGTGCCTGAGAGGAAACAGTGGAGGCAGCGGGGCA
SEQ ID NO.6:
TCCCCCCACCTCGCCCAATACCTGTCCGAGAGCAGGCGTTCTGCC CTCTCGCCCCGCCCTTGCCCAGGCAGCCCCCGGTCGCGACGGCTCTCC TCGGGGCTCGGGGGCGCTGGGCGGCGGCCCTGGGCTGCTTTGGCTAA CTTGGCTGCGGGGCAGGCGCGAGGAGCGGCGCGCCGACCGGGCCGAG CGGAGAGGCCGCCCATTGGCCGGCCAGCGCCACGTGGCCGCCCCCGC CGGTATATTAGGCCACTATTTACCTCCGGCTCACTCGCCATGGGTTGGA GAGGGCAGCTCGGGTAGAGAGGGCTGGCGGAGCGGCGCAGACGGCG GCAGTCCTGCTCAGCCTCTGCCCGGCTCCGTACTCCGGCCC
SEQ ID NO.7:
ACTTAGAGGGCTTCCCGAGCTGGCGCCTCGCCTGTTTTCTCGGTAT CACGAATCCCCTCGGACACCGTTTCAGTCCGTCAAGACCTTGGCCTCC GGGAAAGGCCCAAGTGACTGTGACGGCGGCGACTCGGGCTCAGTTCTCCCCCACCCCGTGGTGCCTTCCCTCCCCGCCCTACAGCCAAGCCCAGA GGAACAGGGCATCGCCTCGCGCGGTCCCGGAGCCACATCCGGACTTG GGAACCCCGTGTCGGGCTTAGAGGACTTCACTGGGCGGGTTGGGGTTT ATTTTCAATAAATTCAGCTGTTCACATACACCCCCACCACCATTTCCAC GCGCGCGCGCGCACACACACACACACACACACAGAGGGACTTGTCAA CTATTGAGACAGCGACCCAG
SEQ ID NO.8:
GGCGCCTCCGGCCCCGAAGAGCCCCTTGCCGGGCTGGAAGTGCG CGGGCGGCGGCCGGAAGGGCCTCTTCATGCGGCGGCGGCGCCGGTAG TTGCCCTTCTCGAACATGTCTTCGCAGGCCGGGTCCAGCGTCCAGTAG TTGCCCTTGCGCTCGCCGCCGCCCTCGCGCGGCACCTTGATGAAGCAC TCGTTGAGGCTGAGGTTGTGGCGGATGCTATTTTGCCAGCCCTTCTTAT TCTTCTCGTAGAACGGGAACTTCGCGATGATGTACTGGTAGATGCCGG ACAGCGTGAGCCTCTTCTCCGCGCTCTCGCGG
SEQ ID NO.9:
AGTTTCCCTTGACCTCGCTGCGCCTCTGGCGCGCTCTGCAGCGCG GACCCGCGGCCCCTCGGGAAAGCGCAGTCGGAAAGTTATCCGCGGCG GTTCCCTGCGCGCCCTGTTGTGTAAGCTCGGCGTTGCCAGCGGACGGA GAAGTTGCTGGCTTGCCCGATAGCCCAGTTCGGTGGCGGCCCGGGGCG GATTTCATGGCCCGCGGCGAACGCGGGGCCAGAGCTGGCGTGGGCGA GCCCCTGCGCGCCCCCTCCCGCGGGGATCCAGTTCGCCTGCTCCCTTC CGCTCGCTGGCTTTTCCGATGCTTGCTGCGCCCCTGGCCGCCGCTGCCC TCTCGCCGCCTCCTACCCCTCGGAGCCGCCGCCTAAGTCGAGGAGGAG AGAATGACCGAGGTGCTGTGGCCGGCTGTCCCCAACGGGACGGACGC TGCCTTCCTGGCCGGTCCGGGTTCGTCCTGGGGGAACAGCACGGTCGC CTCCACTGCCGCCGTCTCCTCGTCGTTCAAATGCGCCTTGACCAAGAC GGGCTTCCAGTTTTACTACCTGCCGGCTGTCTACATCTTGGTATTCATCA TCGGCTTCCTGGGCAACAGCGTGGCCATCTGGATGTTCG
SEQ ID NO.10:
AGGACCTGCTCCTCCAGGGTCCCCATCTGGGTCTCCAGCGGTCCT TCCTCTCTGCCTTCTCCTCGCAGAGCACCCCGTGGGCCTAGTCTAAACG AGGGCACCACTGGTCCGGAGTTGCACTTGTTCGCTCCCTCCTGGGCTCTGGCAGCGCTGCATCCCCGGGGTTGCTTCGGGTTCGGGCCCAATAGCA GAGTCAGAGCCGAGACGCATGTCCCCTGCACCGGCCAAGGGTGCCGC TGGGGCTCGCGCCAAGGAGGCAAAGGCGGGGACCAGAGGCGCCGGA GGCGGCGCAACGCGCACAGGTGGCGCCCGGCCTGGCCAGGCTCTGGC AGGCGAGGCTGGGTGTGGTCG
SEQ ID NO.11:
GGAGTGGGAGAGATTGGCTGAGGACTCTACAGATCAGCTAGAGA GCGAAAGAACTAAGTCTCTCTCTCTCATACACACACACACACGCACAC ACGCGCGCGCGCGCGCGCACACACACACACACGTACACTAAAAAACT CGGACCAGCCGCGCCGCAGCTGCTCCAATCCCTGGAAAAGGCAATCG AGCGCCCTCCGGACCGCTGCGCACAGCCCCGGCTCCGACCTGGCGCC CAAAACAGAGCTAGTCCTAGTCCCTCGCGCGGCCAGTTTGGCCGGGTG TTCCCAAAAATAAAGCGAGGAGGGAAGGTACAGACAGATCTTGAAAA CACCCGGGCCACACACGCCGCGACCTACAGCTCTTTCTCAGCGTTGGA GTGGAGACGGCGCCCGCAGCGCCCTGCGCGGGTGAGGTCCGCGCAGC TGCTGGGGAAGAGCCCACCTGTCAGGCTGCGCTGGGTCAGCGCAGCA AGTGGGGCTGGCCGCTATCTCGCTGCACCCGGCCGCGTCCCGGGCTCC GTGCGCCCTCGCCCCAGCTGGTTTGGAGTTCAACCCTCGGCTCCGCCG CCGGCTCCTTGCGCCTTCGGAGTGTCCCGCAGCGACGC
SEQ ID NO.12:
AGCAGCCGCTGCAGCCACGACGCGGCCCTCTGAGCGCACCCTCC GCAACGCGCACACGCACACCCCTCGGGCGGTCGAACAGGAGCCGGGC CTTGCCGCAGCTCAGCTCCAGGCACCCAGGCGAGCGACGGACCAGAT CTGCGGCTCCGCGCTTCCCTGTTGGCCTAACATCTTAAAACCAGAGGC GGGCTTCCTGGTGCCGAGACGTCACTCCGCCGCGGCCCTCCCCAGCCC TCTCCGCCTCCGCCTCCTCCCAGACCCTTCTCCGGGTGCGACTGACGT GGCTCCGCACCAATCAGGACGCCCCGAGCCGCGGTGGAGGGACTGTC CTGCCTGCACCTATCAGCAGTGCGGGGCCGGGCTACTGCCTCGCCGTG CGCACTGGGTCTACACAGGCAAGCTCCCGGGAATTCAGCTCCTGCCCA GCCCAAGGCGATCC
SEQ ID NO.13:
CTCATCCCAGACACGAACAATGACTGTAGTGCTCACATTTTGCAA GAATCCGTCCTCGGGGATCCAAGCAAACACTCTAAAATTATATGTTTGG GTGGATTCATAGTCAAACTGTCGCCGCAAATAAATCCAGCCCGTGTAAGGGCGGATTCCAAACATAGCAGAGTCTACGCTGGGTTCCAGCGAGTAC CTAAGAGGCGAGGCTGCACGCTGGGGGCCAAGTGGGTGCGCCTGTGT TTGCAGCATTTGTGTCATCGGTGAGAGAGACTCACTGACTTCCACTTGA TAGACCAAATGTTCGAAAGTCCAGGATGGGCTGTGTTCGCGTTTCTCG ATAACGACTGTCAGCACCAGCAGGGCTGCCTGAGGATGCACGCCTTGG TCCTCGGCCCTGAGAGTCAGCGTGAGCTCCCGCTGCT
SEQ ID NO.14:
CTGGAATATTCTCTAATTCTTGGTGGATCAAGATGGAAACTGGTAG GCTTGGAATAGATGTCCCTTTAAAAGGCTCCACTAACAATACAAGAATA TTTTTTCCATACGCAGTGACGTGGGTGGGTCATGGGTGTCTCAATGACA GTAACGTTCCCGAACCCCGGACCTTAGCTGTCATTTCACCTGCGTCGTC CCGGACGCCATTTGGCTGTTGACGTGGTTCCGAGCCAGCAAATAACGC CAGCAGCCCTCCCAGATCCACGCCGGCCCGTCTCTCCGCCGGCCCCCT CCTCGCAGTGGTTTCTCCTGCAGCTCCCCTGGGCTCCGCGGCCAGTAG TGCAGCCCGTGGAGCCGCGGCTTTGCCCGTCTCCTCTGGGTGGCCCCA GTGCGCGGGCTGACACTCATTCAGCCGGGGAAGGTGAGGCGAGTAGA
SEQ ID NO.15:
GTCCCCCGGGTGCCTCCCAGGCCCCCAGAGGGAGCTCAGAAAGC CCAGACCCCACGGCCCGCCCCTCTCCCTGCTCTGAGCTGGAGGCAGAG TCCGGGTCTGCGGGGCCGGCCCTCCCTGTATCCCTGTGAGAGGGTCGG GGACCCGGGGCGTCTGTCTGGCTTCCCCCAGCCCTGCTCTCAGCTCCC TGGGAGCGCAGGATTTGGACTCGCGGACTAGCTTTCGGAGCCACCTAA AGGAAATCTCAGGCGGCCCTAGTGCCCTCAGCTCCGTGGGAGCAGCA GAGACGCCAGAGTATCTCTGTCCGGGCTCCTGAGGGAGGTGCGGCCA GCAGGGCGCTAGAGGAGGAAGAGGGGCTGCTGGAGAGAGAGAGCGC GCCAGGTTCAGGTCCAGGGAGGAGAGAGAGCGAGCGCGCGAGGC
SEQ ID NO.16:
CCTCGGGGCCGTCTGCCTGCAGGAAGGAGTCCACGGACTTGCTG CTGAGGCGGAAGGGCATCAGGCGGCAGAAGGTGCCGGGAGAGTAGG GAATCTGCGTGCGGGCCCTCTGCGAGGGGACCACCGTCTCCCCGGGA GACAGCCAGGGCGGCAGCCTGGCCAGGAGGCTGCGGTCCAGGGCCTC GTCCGGAGAAAACACAGGGTTGTCAATTCCTAGGAGAGAGGGCAGCG GCTAGTCAGCCTTCGGAGAGCCCCACGGCGGCAGGGGAGACCTCGCC GGGGCCGTCACCTGCTGGGTGCCTTGGAAAGTTAGGGTCACCGG
SEQ ID NO.17:
GGGCGAGATCCGCGGTTTGCTGACTCGTCCGTAATGTCACTACCCT GTAGATCCCAATGTCAGCGGCTGCCCCGGCGCACGTGGCCTGGGATAC AAAACCAAGGGCATGTGTGAGACCAGAGGAGGGCAGATCGCGGCCCCGGGGCCCCTCGCCCTCACAGTGGTGGCTGAGGCCTGGGGCTGGGCGG ACAGCAGTGCCCTGGTGGGCCTGGGGACTGGTGCGCCCCGGGCTTCT GAGGACTAGGGCTGCAGTCGGCTGTAAGAATTATTTTTTAATTCCAAAA GCCTCATAGACGTTCCGAAGTCTCTTTGCTTTTTTTTTTTTTTTCCAAGT TTGCATTGAGGGGTGAAAGTTTGCTTAACTGACCTGTATATTTTACAAG TGATAAGGTTAGGATTTTACAATTCTTACTCTAAAAAGTATTTCCAACAGTGACCTGGCAGATATTTA
SEQ ID NO.18:
ATTTATTACTCTCCCTCCCACCTCCGGCATCTTGTGCTAATCCTTCT GCCCTGCGGACCTCCCCCGACTCTTTACTATGCGTGTCAACTGCCATCA ACTTCCTTGCTTGCTGGGGACTGGGGCCGCGAGGGCATACCCCCGAGG GGTACGGGGCTAGGGCTAGGCAGGCTGTGCGGTTGGGCGGGGCCCTG TGCCCCACTGCGGAGTGCGGGTCGGGAAGCGGAGAGAGAAGCAGCTG TGTAATCCGCTGGATGCGGACCAGGGCGCTCCCCATTCCCGTCGGGAG CCCGCCGATTGGCTGGGTGTGGGCGCACGTGACCGACATGTGGCTGTA TTGGTGCAGCCCGCCAGGGTGTCACTGGAGACAGAATGGAGGTGCTG CCGGACTCGGAAATGGGGTAGGTGCTGGAGCCACCATGGCCAGGCTT GCTGCGGGGGGAGGGGGGAAGGTGGTTTTCCCTCGCACTGTCTTAAA CCGATGGCCTTTCCTTGGCAC
SEQ ID NO.19:
AGTCGGCTCAGCCGCCCGCGTTCCGGGGGACACTAGGTGTCGATC ACCTGCGCGGGTCGGGGATGGGGCTATGCAAAGGGTGACTCACCAGA CCGAAGTCGTTCTCAGCCTTGGACCAGGAGGCTGCCAGAGACAGCAG CAGGAAGATCGCGGCAAACACCCAAACCCTACAGCCTCCCCAGAAGC CCAGAATCCGCGGCCCCCAGCGTCTGTCCGGGAGCGCCGTGCTGGGTC GCTCCCCAGTCATCTCTCCCCGCAGCTGCCGCGACCCTGGCAGCTAGA CTCCACAGAGTCGGGAGTCAGCTGACCCGGACCCTTTAAAGCGCAGAT GTCACCCTTAAGCCCGCCCCGGTCTGGAGGCCCCGCCGCGCTTCCCGG ACTCTAATTGGTCTTCAAGTAGCTCATCTCCTCCCACGTGATCACGCAG CATCTCGAAGCTTGCCCTTCCGATTGGCCCTCTTGGAGGCCCTCTTGGA GGCCCGGAGCGCGTGACCCGAACGGGAAGCGGACTGGCTGGGGTGA AGAAGGGACTGGCACCATCCTTATTGGGCTTTTTGATTGGCCGCGGCA CCAGGACACGTCACAGGGGCGGGGCCGATTTTAAAGAGCCGGGCGCG GAAAAAAAAAGGCCGCCTGTCGTCGTGGAGAGAATGAGT
SEQ ID NO.20:
AGCGCGTTCACATAATACGAAGAACTCATAATTTTGACCTGTGATT TGTTGTCCGGCAGCTTTCAGTGTCGGTTTTACGAGGTAGAGTGATATAT GATAACATTACACCCCCAGATTTACACCAAACCCCATTTTCTTTTGGAC GGAGCTCGCCGCAGCACGTGACCGCCCACATGACCGCCTCCGCCAATC TCAGCAGTCCTCACAGGTGGTCTCGCTCCGCAGGGCCCGCAGCCGCCT AGAATGGAAGGGCAAGAGGCTCAAATATGCGGCCAAAGAATCCGCCC GCGCCCGGCGGGCCTGGCGCGTCCCGCGGAAAAAGACCTGGAGGCTC CGCGGGAGCGCCCAGCTGGCGGCCAACCTCCGCACTGGGGTCTGCGG ACGCCAGGCGGCCCGGCCCCACGCAGCACCCCCCACCCCGCCCCCCC GCCGACTCCTGCTAGTGAGCCCTGGACCAAGCTTGGGATCCTCCCCAT CCCTCTCCTGTCCGCCTGCCCAGACCCTGGAAGGGTCTCTGTCCCCCG CAACAGCCTGCCCCGCGGTGGCCTTGTGGGCAGGACTCAGCTATGAGC AGATCGACT
SEQ ID NO.21:
TGCGATTCTCCCTCCCGGTTCCAGTCGCCGCGGACGATGCTTCCTC CCACCCACCGCCCGCGGGCTCAGAGAGCAGGTCCCCGCACCGCGCGG GCTGTGCGCGCTCCGGGCAACATGGTCCAGTGCCACTACGGTTTGGGCGCTGCTCCAGGAGCTCCTGAGTCTAGATCTAACCCCACTTGGTCCCCAT GGACTTGCCAGAGGACTTCACACTATCCACGCCTCAAGAAGCCCTTCT CCCGTGAAGACCAAGTTCAGGAAATCTGAAAGCCTGACACTTGGGAA CTGTCCCATAGTAGCTCCCAGCTTTGCGTGCCCCTACCTCGCGCTCCTT GGAACGGCCACCAAGACGTGAAATTTTGGAAGAAGATACTCCGACTTT AGTGGAAAGACCTAAAGGAAACGAACAGCGGCCTCTGCTTCTTTGAG CTTGGAAGAGCCGCTACTCGAATGAGCTCAGGCTTCCTGTGGCAAAGA GAGCGAAGCGGCTGTGCTCAGCCCACGCCCCGGCGCTGTTCC
SEQ ID NO.22:
GTCCCCGCCTGCGCCTGCACCCGCGCCGCCCGGGGCCCGGGGCG TGGAGGACGAGGGCTCCAGGGCGCTCTTCTTCCGCCACTTGGTCCTGC GGTTCTGGAACCACACCTGCGATGAGAAAGAATGTGAAGGGCACAGG GGCACAGCGCGCACGGGACGCGAGAACAGCCATCCTGCTTTTACAGCT AAACAAATGGCTCAACAACGGAGTGACTGTCACATTCACGTTTCTGTT GGGGAAGGACAATAAAATTTAAAAACGTGAGCGCGGCAGCCCTCCCC TCCGCCCCCCGCCCCCACCATTTGCTTCCTCTTCCACCGCCGCCTCCTC CCCCTCTCCCTCCCCCTCCCCCTCCCCTCCCCCTCCCCCTCCCCCT
SEQ ID NO.23:
GCTGCCTTCCCTGGGGTCGGGAGCGGCCCCGCTCCCCCCGTGGCT GGCGCGGAATGTGGTGATCCGTCCCGGGGCGGGGATGACTTCATGCAG CCGGAGCTCCGCGGCGGGAGCGGAGGCTGCTGCTGGCAGGTGGGGCG CGGGCCGGCGCGAGCTGACCGAGCACTCGGCGGGCGCGGCGGGACTG CGGCCCGTGGCGGCGTGCGCGGGGACCTGCGCTGACTAGGTCCGGGG AAGGTAAGCAGCCCGGCACCGGTGCGCCCTGGCCGCACTGCGTGGAG CTTTCCGCTTGGTTAATAATGGGGTTTGCAGCACGGAGGGAAGAAGGG GAGAACCCCGCTGCATTCTGCAATGAGAAAAGGAGCAACAACTAGGA
SEQ ID NO.24:
GCTCCCTTTCAAGCCAGCGAATTTATTCCTTAAAACCAGAAACTG AACCTCGGCACGGGAAAGGAGTCCGCGGAGGAGCAAAACCACAGCA GAGCAAGAAGAGCTTCAGAGAGCAGCCTTCCCGGAGCACCAACTCCG TGTCGGGAGTGCAGAAACCAACAAGTGAGAGGGCGCCGCGTTCCCGG GGCGCAGCTGCGGGCGGCGGGAGCAGGCGCAGGAGGAGGAAGCGAG CGCCCCCGAGCCCCGAGCCCGAGTCCCCGAGCCTGAGCCGCAATCGCT GCGGTACTCTGCTCCGGATTCGTGTGCGCGGGCTGCGCCGAGCGCTGG GCAGGAGGCTTCGTTTTGCCCTGGTTGCAAGCAGCGGCTGGGAGCAG CCGGTCCCTGGGGAATATGCGGCGCGCGTGGATCCTGCTCACCTTG
SEQ ID NO.25:
GCGGCGCCGCGGCCGCCGCCGGCGCGTGCCCTGCCCGACCGCCC TTCGGGTCCGTGCCGGCAGGGAGATGCCGGGCTTCAGCAGCTCAGCTC CGTCCCTCCGGACTTCCGAGTCTCACCAGGCTTCCCCGACAAGGTTTC TCTGGACTCGGTGGAGAGCGTTGAGCGCCCAGAGGAGGCTGATTCCA GGTGCAAGTTTGCAAATCCCGAGGCCCGGGGCGCTAACGGGGAGTCA GAGCAGCTAACGTGGGGGTTACTTTATGTGTTCATAAATGTATTTATAAA TATATATAAGTATACACACATATGTGTGTCTCTTTTAAAAATTCTCTTTTT CCCCCTACTTCGCAGCCAAGGGGTCCTGTC
SEQ ID NO.26:
CCGGCGCCTGCGAAGGTTCCGTACCTGTCGGTGCCCGCTCCCCCC ACCCCTTGCCTTTCCCTTGGCTGCAGCTTCTCGCACCGCGTAAATGTCA CTCACGTGTCAGGATGTGTGTTTACAGCCTGTTCCTCTGCTTGTTTAGTCTCGGCGGACAGGGCTCAGCGGTTGCGCGACGTTCCCCGCCGCTGGG GGAGATTAGCAAAGTTACCCGCCTCTGGACCCCGGGGCCTGGGCCCCT AGATCCCGCCCCGCGGCGGGAGATGCGTTTGAGCCTTTTACAGACGGAGCGCGTCCCAGCCTGACGCAGAGGGATG
SEQ ID NO.27:
CTGGCAGCAGGGCGCCGAGTCCCGGGGCGCTGCGGGGCGCTGCG CCGAGAACGGCCGGGCCTGAGCCCTGGGCGGCCCCCAGAGCCGATCA GAGCGCGGGGAGGCGGGGGCGAGGAGGAGGGGACCCGCCGCCGGGG GCTGGCTGCTTCGCTCCGAGCCGACTTTTCGCCAATGGTCCAAAGGGA CATGTCCAAGTCGCCTCCCACAGCGGCGGCGGCGGTGGCGCAGGAGA TCCAGATGGAACTGCTAGAGAACGTGGCTCCCGCGGGGGCGCTCGGA GCCGCCGCACAGGTAGCGAGAGCGCGGCGCCTTCTCCTTCCTTTGTGA GCCGCCGGGCAGGGCACCGACCTCGGGTTCTCCCGGCGCCTCCACTGC AGGGATCTCTAGCCTCGCACCTCCTCCCCTCGTCGCCTGCC
SEQ ID NO.28:
GTTCGCTTGGGGGGAAACCAGGCGTCCCTGGAAGGGAAGGGAAG GGAGTCCGGGCTGCGCGGGTCAGGTAGCCTCTCTCCGGTCGCCGCGTG TCCTCGCCGTCCCCAAACCTGCCCTTCCCCTCATCAAGGGAACTCCCC GGGGAGTCCAGACCGCGATCCCTTTCCTTGGCCCCGGGGTGCGGGGG GCGGACACGCGAGGCGTGGGACTGATGGTAGCCCTGCCTCCAGGAAG CAGGCAGGCGGGGACCTCTGGGCGCTCGGAGGGGCAGCTCCG
SEQ ID NO.29:
CTTGGGTTGGGGAGGCGGAGCGCCCTCCTGCCCAGTAGCTGGGCC TGACGCGGGACCGCGCTGGTGCGAAGCTCCCTCCTGGTGTCTGGGTGT CCTTTGCCTGGGTGTCCGTCTGTTCTGTGTTCTTTTTCCAGCTCAGGCCAACTTCGCCCCGCACTTCTTCGACAACGGGGTCGGCAGCACCAACGG AAACATGGCTCTGTTCAGCCTCCCAGAGGACACCCCTGTAGGTGAGTA GCCCTGGCACCTGCTCCCGATAGGTCTCCCTGAGGGGTGCAGGCAGACTTAGAACACAAAGT
SEQ ID NO.30:
CGGCCGAACCGGCGCTAGCGCTCTTTGGTTCCGTGCTCCCTGGGC CGACCTGGGCCCTGAGCTTTCCTCCGGCCGGCCTGCAGGGGGCGGAA AGGAGGCGGCCGGAGCTGAGAGGCCCCTCCGTCCTTGAGGAGCAAAC CTGGGGCTGCGGAGAACCGGGGCTGTCTGTCTTCTCGCTTTGGGGGCC GGGCGCCCTGCCCCTCGCCCAGAAAAGCCTGGAAATGGTGTGGGCTAT TGTTGGGAGAACCCGCCTCGCAACAGAGCTGACGTTGACCACAGCAG AGAAGCAGCTTAACCTATCTACTGCGATAACTCTCATGCCTGTTGGGAT TTTTGCTGTTTTACTATTCTAG
SEQ ID NO.31:
AGCCTGGATGGTTGGGAGGGACTGTGTGCATCAGAGCAGAACTG GGGGAAATGGCGAAAGCAAAAGCCAGGAAGTTTAGGTCTGGGCCGCT TGGAAGAGGGAGAAAGGACCGGAACTGGCCTTCTGGCTACTCCGGAA TCGCCAAGCAGATGAGGCCAGACCGCCGCCAGCGCTGATCACGCGCG CTCCCACAGGTCCTGGCGCGCGTGTTCAGCCGCGCCGCGCTGGAGCGC TACGTGCCGCGCCTGCAGGGGGCGCTGCGGCATGAGGTGCGCTCCTGG TGCGCGGCGGGCGGGCCGGTCTCAGTCTACGACGCCTCCAAAGCGCT CACCTTCCGCATGGCCGCGCGCATCCTGCTGGGGTTGCGGCTGGACGA GGCGCAGTGCGCCACGCTGGCCCGGACC
SEQ ID NO.32:
CAGGAATTTAGGAGCCAAGGAGGTGAGAGCAGCTCTGGCCCCTC ACTGTAGGTGACGCCAAACTCTCCTCGACTTGCCCCGACTCTTAGTTG AAAAATCTCTGTCCTCTCCCAGGCTCTCCAGCTTCCCAAGCAATGACCTCAATGAAAAAAATGACAGCGGGGCGGACTGCCCCCGCTCCAGAGTAC CAGTGCCGGCAGTGCGAGCTATGACGCAATCGGAGCTCGGTCGGTCCT TTGATTGGCTAGTCCTGGCCACTTTGGATTGGCCGCGCGGGCTGGTGG GGACCCCCCCCCTCCAGCTATCTCTGTAATAAGAGCGGGGTCTCCGCG GGGAAGGCGCCCACAGCAGGTGTGGTGTTCATCCCGGGTCGACCGGC CGCTCGCGCTGCCCTGAAACTCTAGTCGCCAGGTGAGGAACTTCC
SEQ ID NO.33:
CCAGGGTGCTAGAGAGAGCAGGTCAGGAACACTCTTGAACAGCG GAGGCCCAGCCTGGCTCGTCCCCCTCCTGCCCCCTGGGGCGGGTGTCT GCGGCCTCCAGGCTACTCCTGGATGATTTTATTAGCTGTGTTGGGAGCATATGGTCCTCGGACATGAGACCTGAAGTAGTATTTACTGGAGAGCCGA GGACACCGGGTTCCCGTGTGGGCTGGGTTTGGCACGCACTCGGTTACT GATTGATAGGCCATTCAGGAAACAAAGACCACAAGAGAATTCAGCATG CTCCTGGCTCGGGGCCAAGCCAGCCTCATCTCCTTTGCTTTGTCAAGTG TGTCTTTTTGTCTGCCTTCATCACTTGCTGGGCGCCTCTGTGTTCACTG CCGGGAGGAAGCCAAGTGTGTATTTGCAGGGGCTGTGGGGGTGTATCC AGCTTTTCTCTAAGAACAGCTATCCAAGGGGCGGGAGGGAACAAGGG GGTCAGCCACAGCTCTCCCCTTACCCCTTCCCCTGAAAAG
SEQ ID NO.34:
CCCCCTGCACGATCTCTTTCTCGTTGGGCAGCCGGTAGACGGGGA AGATGTAGAGCCAACAGAGGACCACGACACAGAGGGCACTGGCTCCC ATGGGCAGCCGGGTCCGCGGGAACTTCCACGCCAGTACAGCCATGGCC CCTCTGGACGTTTGTCGCCGGGCCCGCCCGCAGGGGCTCATCGCAGCC CCGGCGTCCCAGGGGCGGGGGCCGGGGCCTCAGCACAAAGCTAGGCG AAGTGGCAGCGGAGGGTCCCCCACCGCCAGCCCCCCATGCACACACA CCTTTGGTTCTCTTACTTGCAAACGCACGCACGCTTCTTCGGCCCCGTC GGCCCCAAAGGTCAGCGCAAGGATTTTTTCAAATGCAACTTTTCCAAG GATTTCTTTCTAGGGG
SEQ ID NO.35:
GCCTCACCCAGCCAAACCCGAGCGGTGGAACGCTGCGCTGGGTA AACGCCGCGCGTCGGGTCCTCCCTCGCGCGGCTCCGGGCAGCGTTCCG TGGCCACCGCGCTCCCGGTAACAGCAGAAAGGGGAGGGAGGAGAGCT ACCGAGGAGGGGACAGCGACGCCCCGACGCCGCCACGCCCCCCGCCT CCCACACGGGGGCCACCGTAGCTCTCTAGAAGCTCCTCAGGGAAGCA AAGCGCCGTTCCCGCCGCAGGCACCGAGACGTCGCCCAGATGGAAGA AACTCTGGAGATGCGCGCTCCTACACCGGTGCCGCGGCGCCCGGGCCC AGCACCACGCACCTATGCGCGCCTCTGCCGGTCCTCCTAGAAATCCCG CCCTGCCTACCCGCGGCGCGAGACGCAACGACGCTTTCAGGG
SEQ ID NO.36:
GCCAGGCGACAAGAGCTCGGTGCTGAGATGTGTTACGTTCTCATC TCCCCATCAATTATGGATGGAAACAAATAAGGAAGAGTCAATTTTGCTG AGCCCCTTCTCCGGCAACGAGAGGCGTTCTGCAGCCGGGAGGGAGCCGCCGCTCGCGCCGGCAGCCGCTGGCAGGGGCATGGTGAGGAGGAAGG TAGGGAAACTTTTATTTCCCGTCTTGACAGCGGCGGTGTTTGTCCCTGG TCTGCAGAAACTGATACAGTAGCCTCCTTCCTTGGGTAATTTAGGAGGGCTTGAAGCTTCTT
SEQ ID NO.37:
GAGGCTCGGTGCATTGGAGAAAGACTCAGTTAGAGGCGACTCCA ACGAGCCGCGGTTTTCCCCAGCCCAACGCCCAGCGGCCGAAGCGCTG CTCGGGTCCGGATTGCGGGATGCGGGGCTGGAGAGGCCGAGCAGGCA CCACCGACTTCCCAGGGCGCCCGGGCCCCCTGGTACAGCCCGGCTGCC CGCTGGAAGGCGCCTCGGGGCAGCAGAGAGCCTCAGCCCGGCTGCTG CTGTCGCTCAAAGGCGCCGGCGCCGGCCGCACCCGCATCGGGGTCCTT TTGCTCCCAGACCCCGGGCCCGAAAGGGCCGGAGCGTGTCCCCCGCC AGGGCGCAGGCCCCAGCCCCCCGCACCCCTATTGTCCAGCCAGCTGGA GCTCCGGCCAGATCCCGGGCTGCCGCCTCTGCTGCCTTCCCTGAGCGG GAGCGGAGCGCAGAGAAAAGTTCAAGCCTTGCCCACCCGGGCTGCAG CTGCTTGTTAACCCTCAGAGCGCCACGGCGCGAGGGAAGGGCACGCC AACCAGGAGAGGGGGCGAGGGAGATGCGGTCCGCCTGCAGTCACCTC TGCACCTCAGAGATTTCGGGAAGTTTGAGTGCAGGAAAGCAGCGCTC CGAGGCCAGGCCTGGGGTGCTGGCCGCTGCG
SEQ ID NO.38:
AGGAAGATCGCGGGGTGACGGTCGGTACCCGTTCGGCTGGGCCG CGCTGCCGCTCCGATCCACCTCCCTTCCGCGCCCGCGCCCTCCCCCTTC CTTTCACTAGGAGTCCGGGATTCGGAGAGGGCGCGGGAGGCAGGCAC ACGGGCCCGACCCCACTCCAGCGCTCACCGGGGACGCGGGCGGGCGG CGACGGGACGCGGCGGGGGCGCGGGGCGGGCGCGGCCATGGAGCAG CAGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCAACACTAGCGACCGCGGGCGGACGAGCGGGCGGGCAGG
SEQ ID NO.39:
CCCGCGCGGACCCGACTGGGGCAGCACCACGCCCCCTACAGTCC AGCTCCCACCGCCTGGCCCCGCCCCTGGCGGACCAGACTCTCCACCTC CTGGCTCCCGCGGTTCTGACCACGCCTCCTCCCAGCCCTCCCCATGAG TTCCTGGCCCCGCCTCCCTCCACCCCCGGATGTTTTGTCCTCGCCCCCT TCCAGACTCTGAATGCATGACCCCGCCTCCTTCTCTACCCGGCCCCGCC CACAGGCTGCCTGAAGGGGCTGCGCCTGGGCCACAAGTGCTTCCTGCT CTCGCGCGACTTCGAAGCTCAGGCGGCGGCGCAGGCGCGGTGCACGG CGCGGGGCGGGAGCCTGGCGCAGCCGGCAGACCGCCAGCAGATGGAG GCGCTCACTCGGTACCTGCGCGCGGCGCTCGCTCCCTACAACTGGCCC GTGTGGCTGGGCGTGCACGATCGGCGCGCCGAGGGCCTCTACCTCTTC GAAAACGGCCAGCGCGTGTCCTTCTTCGCCTGGCATCGCTCACCCCGC CCCGAGCTCGGCGCCCAGCCCAGCGCCTCGCCGCATCCGCTCAGCCCGGACCAGCCCAACGGTGGC
SEQ ID NO.40:
TCTCTTCCTGCCGAGTGCGCCGAGCCCCCCGCCCCTTCCTGCCCC CCGCCCCTCCGCAGCCTCCTGCCCGCCCACAGCCCGCTGCCCGCCTCG GACCTCGGAGAGGAGGAGAGGGCCGGGAGGAGCGAGCGGGGCTGAC CTCCAAGGGGCCGCCCCAAGTCTCAGGACCGCCGACTCTGCCCTTCCT CTCCGCCGTCTGGGGCCAACCCGCCTCGTTGGCGCGCTGCGCCTTTATA GTCTGCAAAGCCACACTGAAGAGACCAGAGATCACCTGGTGGCCATC AAGTCGACCAACAGGAGGCAAAGCCCCTTATCTGAGCAATTCAGAATG ACACTTCCCTATTGTCTAAAGCCACATCTGGTACCAAGCTTCCGTCCCA AGAATTTATA
SEQ ID NO.41:
GGCTGGGCCGGCGCTGGGGAGGAGGAAGGGAGGGAACGGGTAG GAGGAGGGGAAGCGCAGTATAAAAGTCCCGGCCGGACTGAGCGTCCG CTACTCCGAGTCACTTCGGTAAGGCGGGAGCCCGAGCAAGGTCAAGG AGGGAAGTGCGCGGTGCCACGGACCGACACAGTTCGCTCTAGCATCT GACGCTCGGACTCCGCGCCCTCAGCCGGATCCCAGAGCCCTTCCATTC GCCAACCGCCCACTGCAAGGCATGAGCCGCACGCGGGAGCCCGAGGC TGCAGCGCGGTCATGAGGCGGTGGCCCGGGATCGACAGCTGCGCGAC GCCAGCCCCCAAATCCCCTCTGGGCGCGGCACCC
SEQ ID NO.42:
GAGCAAGGCGACCCCGGCCGCCCGCGCCAGCAAGAGGATCGTCC TGCCGGAGCCCAGGTACCAGCTGCCCCGGCCGGCGCCGGCCCCAAGC CGCCGCCCCCTGCGGCCGCCAGCTACCCCCTGCTTCCTGGAGGGTCGG GCGCTGAGCCTCCGCTGCCCCGGGGCGGGTGACACAGCGGAGCGGGC GATGCGGGGCCGGCCTCGTCGTTCCAGTCTCTGAAATGGGGCATCGGA GGGCCGGTGGGGGGCACCCCGGGAGAGAGCGCTCCAAAGTGCCCGGC GCGGCGCCCTGCGCGCAGCGAGCGCCCCAGCCAGGGTCTGGTTATGA CTTGGCTGGACCAGCTCCATCCCTGTCGCCCCCTCCCCCCAGCCCTGTC CTGTC。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> 用于诊断胃癌的DNA甲基化生物标记物、试剂盒及用途
<130> 6C69-2253588IP
<160> 369
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 1
ctctttgcag ctcgcacagc taagggcgag ggcgcccttc ggcagaagca gcaaaccgcc 60
ggcaagccca gcgaggaggg ctgccggggt ctgggcttgg gaattggctg gcacccagcg 120
gaaagggacg tgagctgagc ggcgggggag aagagtgcgc aggtcagagg gcggcgcgca 180
gcggcgctcc gcgaggtccc cacgccgggc gatatggggt gcctgctgtt tctgctgctc 240
tgggcgctcc tccaggcttg gggaagcgct gaaggtgggt ggaacgaggg cgcttgagtg 300
cactcgcggg agggcggaga gagggagctg ggtagggacg gggagggcaa cgcctgatgg 360
ggactggtga gacccgggac gcactggcgc gatctaggta gaaaactc 408
<210> 2
<211> 425
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 2
ggatttttcc ctcaagaacc gagtctggac gcggagatgg agccaagtgt ggctgcattt 60
tcggacccgg aaatccgttg ggcactgaag gacttttcga accctgtagc gctgttgctt 120
cgcggtccat cgtcgccgct gcagacggat gcgctccccg gcggctctac gccctccagt 180
cccggccagg cctctgggct gggagccgag ccgtctcggg ccctccggcg ccgcgttttc 240
tagagaaccg ggtctcagcg atgctcattt cagccccgtc ttaatgcaac aaacgaaacc 300
ccacacgaac gaaaaggaac atgtctgcgc tctctgcgca gcgcttgggc ggcgcggtcc 360
cggcgcgcgg ggaagcggcg tctccgctaa ccgaggcgct ggaaggggaa aagcgaatgc 420
ggaat 425
<210> 3
<211> 337
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 3
gctctgcttt cgaaagtccc tgggccgtgg gagtttccca ggagcctctc cgacgcgcgc 60
agcagctagg ctcttctaaa gccgtccgct ccagccctgg tggtgctcgt tcccggcgct 120
cgctcgaggg ggggctgttg gaacttggcg gggctggacc agcccggccg tgggaggtgc 180
gggccgcggc ggctgcagcg gcggggtggc tgcgctgagc aaacagcggc cccttccggc 240
cgcaccgccg cgctgcgcgc tgctcttggg aggtggagga agcaaagggg cgaacctggt 300
cttgcttttt attgcttgct tcttttgcaa actccaa 337
<210> 4
<211> 406
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 4
gggcagccga tccgccccca gcgcgcgcgt ctcggcgcca ggagccgtcc cggggcgtgt 60
tggcgagcgt tgatatagat ataaggacat ttctcttcat ggcgtcacgt gacataatta 120
ccaccagaat caatcaagat gaattgcacg tcagcgcccg gtggggattt ttgcttagtt 180
gatcctggcc caagcctctt gtgcaatcga tggctcaggt tggctgcgcg gggagcggcc 240
agaggctcgc tggcgcgcac gccgcggagt catgaacgac tttgacgagt gcggccagag 300
cgcagccagc atgtacctgc cgggctgcgc ctactatgtg gccccgtctg acttcgctag 360
caagccttcg ttcctttccc aaccgtcgtc ctgccagatg actttc 406
<210> 5
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 5
cgcggggctc ctcgtccccg tcacgctgac tttccgtgca gtgctgtggt gcgaaaatgc 60
ctcgccggtg cgcaccgggt cggcagcctc ggcggcgggg gcgagattgg cgggaggggg 120
gcgcgggggg ggcgcggtaa gaggtggcgg cgggcagagg gtgttttttt tcttttccct 180
ccagagccgg ggtttgtaaa ccgaggccag agtgtccccg tgggccgagc gcactttttt 240
cttgtccggg tgcgctcagt cactggtgcc tgagaggaaa cagtggaggc agcggggca 299
<210> 6
<211> 370
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 6
tccccccacc tcgcccaata cctgtccgag agcaggcgtt ctgccctctc gccccgccct 60
tgcccaggca gcccccggtc gcgacggctc tcctcggggc tcgggggcgc tgggcggcgg 120
ccctgggctg ctttggctaa cttggctgcg gggcaggcgc gaggagcggc gcgccgaccg 180
ggccgagcgg agaggccgcc cattggccgg ccagcgccac gtggccgccc ccgccggtat 240
attaggccac tatttacctc cggctcactc gccatgggtt ggagagggca gctcgggtag 300
agagggctgg cggagcggcg cagacggcgg cagtcctgct cagcctctgc ccggctccgt 360
actccggccc 370
<210> 7
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 7
acttagaggg cttcccgagc tggcgcctcg cctgttttct cggtatcacg aatcccctcg 60
gacaccgttt cagtccgtca agaccttggc ctccgggaaa ggcccaagtg actgtgacgg 120
cggcgactcg ggctcagttc tcccccaccc cgtggtgcct tccctccccg ccctacagcc 180
aagcccagag gaacagggca tcgcctcgcg cggtcccgga gccacatccg gacttgggaa 240
ccccgtgtcg ggcttagagg acttcactgg gcgggttggg gtttattttc aataaattca 300
gctgttcaca tacaccccca ccaccatttc cacgcgcgcg cgcgcacaca cacacacaca 360
cacacagagg gacttgtcaa ctattgagac agcgacccag 400
<210> 8
<211> 316
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 8
ggcgcctccg gccccgaaga gccccttgcc gggctggaag tgcgcgggcg gcggccggaa 60
gggcctcttc atgcggcggc ggcgccggta gttgcccttc tcgaacatgt cttcgcaggc 120
cgggtccagc gtccagtagt tgcccttgcg ctcgccgccg ccctcgcgcg gcaccttgat 180
gaagcactcg ttgaggctga ggttgtggcg gatgctattt tgccagccct tcttattctt 240
ctcgtagaac gggaacttcg cgatgatgta ctggtagatg ccggacagcg tgagcctctt 300
ctccgcgctc tcgcgg 316
<210> 9
<211> 612
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 9
agtttccctt gacctcgctg cgcctctggc gcgctctgca gcgcggaccc gcggcccctc 60
gggaaagcgc agtcggaaag ttatccgcgg cggttccctg cgcgccctgt tgtgtaagct 120
cggcgttgcc agcggacgga gaagttgctg gcttgcccga tagcccagtt cggtggcggc 180
ccggggcgga tttcatggcc cgcggcgaac gcggggccag agctggcgtg ggcgagcccc 240
tgcgcgcccc ctcccgcggg gatccagttc gcctgctccc ttccgctcgc tggcttttcc 300
gatgcttgct gcgcccctgg ccgccgctgc cctctcgccg cctcctaccc ctcggagccg 360
ccgcctaagt cgaggaggag agaatgaccg aggtgctgtg gccggctgtc cccaacggga 420
cggacgctgc cttcctggcc ggtccgggtt cgtcctgggg gaacagcacg gtcgcctcca 480
ctgccgccgt ctcctcgtcg ttcaaatgcg ccttgaccaa gacgggcttc cagttttact 540
acctgccggc tgtctacatc ttggtattca tcatcggctt cctgggcaac agcgtggcca 600
tctggatgtt cg 612
<210> 10
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 10
aggacctgct cctccagggt ccccatctgg gtctccagcg gtccttcctc tctgccttct 60
cctcgcagag caccccgtgg gcctagtcta aacgagggca ccactggtcc ggagttgcac 120
ttgttcgctc cctcctgggc tctggcagcg ctgcatcccc ggggttgctt cgggttcggg 180
cccaatagca gagtcagagc cgagacgcat gtcccctgca ccggccaagg gtgccgctgg 240
ggctcgcgcc aaggaggcaa aggcggggac cagaggcgcc ggaggcggcg caacgcgcac 300
aggtggcgcc cggcctggcc aggctctggc aggcgaggct gggtgtggtc g 351
<210> 11
<211> 604
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 11
ggagtgggag agattggctg aggactctac agatcagcta gagagcgaaa gaactaagtc 60
tctctctctc atacacacac acacacgcac acacgcgcgc gcgcgcgcgc acacacacac 120
acacgtacac taaaaaactc ggaccagccg cgccgcagct gctccaatcc ctggaaaagg 180
caatcgagcg ccctccggac cgctgcgcac agccccggct ccgacctggc gcccaaaaca 240
gagctagtcc tagtccctcg cgcggccagt ttggccgggt gttcccaaaa ataaagcgag 300
gagggaaggt acagacagat cttgaaaaca cccgggccac acacgccgcg acctacagct 360
ctttctcagc gttggagtgg agacggcgcc cgcagcgccc tgcgcgggtg aggtccgcgc 420
agctgctggg gaagagccca cctgtcaggc tgcgctgggt cagcgcagca agtggggctg 480
gccgctatct cgctgcaccc ggccgcgtcc cgggctccgt gcgccctcgc cccagctggt 540
ttggagttca accctcggct ccgccgccgg ctccttgcgc cttcggagtg tcccgcagcg 600
acgc 604
<210> 12
<211> 439
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 12
agcagccgct gcagccacga cgcggccctc tgagcgcacc ctccgcaacg cgcacacgca 60
cacccctcgg gcggtcgaac aggagccggg ccttgccgca gctcagctcc aggcacccag 120
gcgagcgacg gaccagatct gcggctccgc gcttccctgt tggcctaaca tcttaaaacc 180
agaggcgggc ttcctggtgc cgagacgtca ctccgccgcg gccctcccca gccctctccg 240
cctccgcctc ctcccagacc cttctccggg tgcgactgac gtggctccgc accaatcagg 300
acgccccgag ccgcggtgga gggactgtcc tgcctgcacc tatcagcagt gcggggccgg 360
gctactgcct cgccgtgcgc actgggtcta cacaggcaag ctcccgggaa ttcagctcct 420
gcccagccca aggcgatcc 439
<210> 13
<211> 419
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 13
ctcatcccag acacgaacaa tgactgtagt gctcacattt tgcaagaatc cgtcctcggg 60
gatccaagca aacactctaa aattatatgt ttgggtggat tcatagtcaa actgtcgccg 120
caaataaatc cagcccgtgt aagggcggat tccaaacata gcagagtcta cgctgggttc 180
cagcgagtac ctaagaggcg aggctgcacg ctgggggcca agtgggtgcg cctgtgtttg 240
cagcatttgt gtcatcggtg agagagactc actgacttcc acttgataga ccaaatgttc 300
gaaagtccag gatgggctgt gttcgcgttt ctcgataacg actgtcagca ccagcagggc 360
tgcctgagga tgcacgcctt ggtcctcggc cctgagagtc agcgtgagct cccgctgct 419
<210> 14
<211> 432
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 14
ctggaatatt ctctaattct tggtggatca agatggaaac tggtaggctt ggaatagatg 60
tccctttaaa aggctccact aacaatacaa gaatattttt tccatacgca gtgacgtggg 120
tgggtcatgg gtgtctcaat gacagtaacg ttcccgaacc ccggacctta gctgtcattt 180
cacctgcgtc gtcccggacg ccatttggct gttgacgtgg ttccgagcca gcaaataacg 240
ccagcagccc tcccagatcc acgccggccc gtctctccgc cggccccctc ctcgcagtgg 300
tttctcctgc agctcccctg ggctccgcgg ccagtagtgc agcccgtgga gccgcggctt 360
tgcccgtctc ctctgggtgg ccccagtgcg cgggctgaca ctcattcagc cggggaaggt 420
gaggcgagta ga 432
<210> 15
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 15
gtcccccggg tgcctcccag gcccccagag ggagctcaga aagcccagac cccacggccc 60
gcccctctcc ctgctctgag ctggaggcag agtccgggtc tgcggggccg gccctccctg 120
tatccctgtg agagggtcgg ggacccgggg cgtctgtctg gcttccccca gccctgctct 180
cagctccctg ggagcgcagg atttggactc gcggactagc tttcggagcc acctaaagga 240
aatctcaggc ggccctagtg ccctcagctc cgtgggagca gcagagacgc cagagtatct 300
ctgtccgggc tcctgaggga ggtgcggcca gcagggcgct agaggaggaa gaggggctgc 360
tggagagaga gagcgcgcca ggttcaggtc cagggaggag agagagcgag cgcgcgaggc 420
<210> 16
<211> 322
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 16
cctcggggcc gtctgcctgc aggaaggagt ccacggactt gctgctgagg cggaagggca 60
tcaggcggca gaaggtgccg ggagagtagg gaatctgcgt gcgggccctc tgcgagggga 120
ccaccgtctc cccgggagac agccagggcg gcagcctggc caggaggctg cggtccaggg 180
cctcgtccgg agaaaacaca gggttgtcaa ttcctaggag agagggcagc ggctagtcag 240
ccttcggaga gccccacggc ggcaggggag acctcgccgg ggccgtcacc tgctgggtgc 300
cttggaaagt tagggtcacc gg 322
<210> 17
<211> 451
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 17
gggcgagatc cgcggtttgc tgactcgtcc gtaatgtcac taccctgtag atcccaatgt 60
cagcggctgc cccggcgcac gtggcctggg atacaaaacc aagggcatgt gtgagaccag 120
aggagggcag atcgcggccc cggggcccct cgccctcaca gtggtggctg aggcctgggg 180
ctgggcggac agcagtgccc tggtgggcct ggggactggt gcgccccggg cttctgagga 240
ctagggctgc agtcggctgt aagaattatt ttttaattcc aaaagcctca tagacgttcc 300
gaagtctctt tgcttttttt ttttttttcc aagtttgcat tgaggggtga aagtttgctt 360
aactgacctg tatattttac aagtgataag gttaggattt tacaattctt actctaaaaa 420
gtatttccaa cagtgacctg gcagatattt a 451
<210> 18
<211> 496
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 18
atttattact ctccctccca cctccggcat cttgtgctaa tccttctgcc ctgcggacct 60
cccccgactc tttactatgc gtgtcaactg ccatcaactt ccttgcttgc tggggactgg 120
ggccgcgagg gcataccccc gaggggtacg gggctagggc taggcaggct gtgcggttgg 180
gcggggccct gtgccccact gcggagtgcg ggtcgggaag cggagagaga agcagctgtg 240
taatccgctg gatgcggacc agggcgctcc ccattcccgt cgggagcccg ccgattggct 300
gggtgtgggc gcacgtgacc gacatgtggc tgtattggtg cagcccgcca gggtgtcact 360
ggagacagaa tggaggtgct gccggactcg gaaatggggt aggtgctgga gccaccatgg 420
ccaggcttgc tgcgggggga ggggggaagg tggttttccc tcgcactgtc ttaaaccgat 480
ggcctttcct tggcac 496
<210> 19
<211> 656
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 19
agtcggctca gccgcccgcg ttccggggga cactaggtgt cgatcacctg cgcgggtcgg 60
ggatggggct atgcaaaggg tgactcacca gaccgaagtc gttctcagcc ttggaccagg 120
aggctgccag agacagcagc aggaagatcg cggcaaacac ccaaacccta cagcctcccc 180
agaagcccag aatccgcggc ccccagcgtc tgtccgggag cgccgtgctg ggtcgctccc 240
cagtcatctc tccccgcagc tgccgcgacc ctggcagcta gactccacag agtcgggagt 300
cagctgaccc ggacccttta aagcgcagat gtcaccctta agcccgcccc ggtctggagg 360
ccccgccgcg cttcccggac tctaattggt cttcaagtag ctcatctcct cccacgtgat 420
cacgcagcat ctcgaagctt gcccttccga ttggccctct tggaggccct cttggaggcc 480
cggagcgcgt gacccgaacg ggaagcggac tggctggggt gaagaaggga ctggcaccat 540
ccttattggg ctttttgatt ggccgcggca ccaggacacg tcacaggggc ggggccgatt 600
ttaaagagcc gggcgcggaa aaaaaaaggc cgcctgtcgt cgtggagaga atgagt 656
<210> 20
<211> 581
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 20
agcgcgttca cataatacga agaactcata attttgacct gtgatttgtt gtccggcagc 60
tttcagtgtc ggttttacga ggtagagtga tatatgataa cattacaccc ccagatttac 120
accaaacccc attttctttt ggacggagct cgccgcagca cgtgaccgcc cacatgaccg 180
cctccgccaa tctcagcagt cctcacaggt ggtctcgctc cgcagggccc gcagccgcct 240
agaatggaag ggcaagaggc tcaaatatgc ggccaaagaa tccgcccgcg cccggcgggc 300
ctggcgcgtc ccgcggaaaa agacctggag gctccgcggg agcgcccagc tggcggccaa 360
cctccgcact ggggtctgcg gacgccaggc ggcccggccc cacgcagcac cccccacccc 420
gcccccccgc cgactcctgc tagtgagccc tggaccaagc ttgggatcct ccccatccct 480
ctcctgtccg cctgcccaga ccctggaagg gtctctgtcc cccgcaacag cctgccccgc 540
ggtggccttg tgggcaggac tcagctatga gcagatcgac t 581
<210> 21
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 21
tgcgattctc cctcccggtt ccagtcgccg cggacgatgc ttcctcccac ccaccgcccg 60
cgggctcaga gagcaggtcc ccgcaccgcg cgggctgtgc gcgctccggg caacatggtc 120
cagtgccact acggtttggg cgctgctcca ggagctcctg agtctagatc taaccccact 180
tggtccccat ggacttgcca gaggacttca cactatccac gcctcaagaa gcccttctcc 240
cgtgaagacc aagttcagga aatctgaaag cctgacactt gggaactgtc ccatagtagc 300
tcccagcttt gcgtgcccct acctcgcgct ccttggaacg gccaccaaga cgtgaaattt 360
tggaagaaga tactccgact ttagtggaaa gacctaaagg aaacgaacag cggcctctgc 420
ttctttgagc ttggaagagc cgctactcga atgagctcag gcttcctgtg gcaaagagag 480
cgaagcggct gtgctcagcc cacgccccgg cgctgttcc 519
<210> 22
<211> 377
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 22
gtccccgcct gcgcctgcac ccgcgccgcc cggggcccgg ggcgtggagg acgagggctc 60
cagggcgctc ttcttccgcc acttggtcct gcggttctgg aaccacacct gcgatgagaa 120
agaatgtgaa gggcacaggg gcacagcgcg cacgggacgc gagaacagcc atcctgcttt 180
tacagctaaa caaatggctc aacaacggag tgactgtcac attcacgttt ctgttgggga 240
aggacaataa aatttaaaaa cgtgagcgcg gcagccctcc cctccgcccc ccgcccccac 300
catttgcttc ctcttccacc gccgcctcct ccccctctcc ctccccctcc ccctcccctc 360
cccctccccc tccccct 377
<210> 23
<211> 376
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 23
gctgccttcc ctggggtcgg gagcggcccc gctccccccg tggctggcgc ggaatgtggt 60
gatccgtccc ggggcgggga tgacttcatg cagccggagc tccgcggcgg gagcggaggc 120
tgctgctggc aggtggggcg cgggccggcg cgagctgacc gagcactcgg cgggcgcggc 180
gggactgcgg cccgtggcgg cgtgcgcggg gacctgcgct gactaggtcc ggggaaggta 240
agcagcccgg caccggtgcg ccctggccgc actgcgtgga gctttccgct tggttaataa 300
tggggtttgc agcacggagg gaagaagggg agaaccccgc tgcattctgc aatgagaaaa 360
ggagcaacaa ctagga 376
<210> 24
<211> 420
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 24
gctccctttc aagccagcga atttattcct taaaaccaga aactgaacct cggcacggga 60
aaggagtccg cggaggagca aaaccacagc agagcaagaa gagcttcaga gagcagcctt 120
cccggagcac caactccgtg tcgggagtgc agaaaccaac aagtgagagg gcgccgcgtt 180
cccggggcgc agctgcgggc ggcgggagca ggcgcaggag gaggaagcga gcgcccccga 240
gccccgagcc cgagtccccg agcctgagcc gcaatcgctg cggtactctg ctccggattc 300
gtgtgcgcgg gctgcgccga gcgctgggca ggaggcttcg ttttgccctg gttgcaagca 360
gcggctggga gcagccggtc cctggggaat atgcggcgcg cgtggatcct gctcaccttg 420
<210> 25
<211> 365
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 25
gcggcgccgc ggccgccgcc ggcgcgtgcc ctgcccgacc gcccttcggg tccgtgccgg 60
cagggagatg ccgggcttca gcagctcagc tccgtccctc cggacttccg agtctcacca 120
ggcttccccg acaaggtttc tctggactcg gtggagagcg ttgagcgccc agaggaggct 180
gattccaggt gcaagtttgc aaatcccgag gcccggggcg ctaacgggga gtcagagcag 240
ctaacgtggg ggttacttta tgtgttcata aatgtattta taaatatata taagtataca 300
cacatatgtg tgtctctttt aaaaattctc tttttccccc tacttcgcag ccaaggggtc 360
ctgtc 365
<210> 26
<211> 314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 26
ccggcgcctg cgaaggttcc gtacctgtcg gtgcccgctc cccccacccc ttgcctttcc 60
cttggctgca gcttctcgca ccgcgtaaat gtcactcacg tgtcaggatg tgtgtttaca 120
gcctgttcct ctgcttgttt agtctcggcg gacagggctc agcggttgcg cgacgttccc 180
cgccgctggg ggagattagc aaagttaccc gcctctggac cccggggcct gggcccctag 240
atcccgcccc gcggcgggag atgcgtttga gccttttaca gacggagcgc gtcccagcct 300
gacgcagagg gatg 314
<210> 27
<211> 416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 27
ctggcagcag ggcgccgagt cccggggcgc tgcggggcgc tgcgccgaga acggccgggc 60
ctgagccctg ggcggccccc agagccgatc agagcgcggg gaggcggggg cgaggaggag 120
gggacccgcc gccgggggct ggctgcttcg ctccgagccg acttttcgcc aatggtccaa 180
agggacatgt ccaagtcgcc tcccacagcg gcggcggcgg tggcgcagga gatccagatg 240
gaactgctag agaacgtggc tcccgcgggg gcgctcggag ccgccgcaca ggtagcgaga 300
gcgcggcgcc ttctccttcc tttgtgagcc gccgggcagg gcaccgacct cgggttctcc 360
cggcgcctcc actgcaggga tctctagcct cgcacctcct cccctcgtcg cctgcc 416
<210> 28
<211> 276
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 28
gttcgcttgg ggggaaacca ggcgtccctg gaagggaagg gaagggagtc cgggctgcgc 60
gggtcaggta gcctctctcc ggtcgccgcg tgtcctcgcc gtccccaaac ctgcccttcc 120
cctcatcaag ggaactcccc ggggagtcca gaccgcgatc cctttccttg gccccggggt 180
gcggggggcg gacacgcgag gcgtgggact gatggtagcc ctgcctccag gaagcaggca 240
ggcggggacc tctgggcgct cggaggggca gctccg 276
<210> 29
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 29
cttgggttgg ggaggcggag cgccctcctg cccagtagct gggcctgacg cgggaccgcg 60
ctggtgcgaa gctccctcct ggtgtctggg tgtcctttgc ctgggtgtcc gtctgttctg 120
tgttcttttt ccagctcagg ccaacttcgc cccgcacttc ttcgacaacg gggtcggcag 180
caccaacgga aacatggctc tgttcagcct cccagaggac acccctgtag gtgagtagcc 240
ctggcacctg ctcccgatag gtctccctga ggggtgcagg cagacttaga acacaaagt 299
<210> 30
<211> 353
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 30
cggccgaacc ggcgctagcg ctctttggtt ccgtgctccc tgggccgacc tgggccctga 60
gctttcctcc ggccggcctg cagggggcgg aaaggaggcg gccggagctg agaggcccct 120
ccgtccttga ggagcaaacc tggggctgcg gagaaccggg gctgtctgtc ttctcgcttt 180
gggggccggg cgccctgccc ctcgcccaga aaagcctgga aatggtgtgg gctattgttg 240
ggagaacccg cctcgcaaca gagctgacgt tgaccacagc agagaagcag cttaacctat 300
ctactgcgat aactctcatg cctgttggga tttttgctgt tttactattc tag 353
<210> 31
<211> 404
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 31
agcctggatg gttgggaggg actgtgtgca tcagagcaga actgggggaa atggcgaaag 60
caaaagccag gaagtttagg tctgggccgc ttggaagagg gagaaaggac cggaactggc 120
cttctggcta ctccggaatc gccaagcaga tgaggccaga ccgccgccag cgctgatcac 180
gcgcgctccc acaggtcctg gcgcgcgtgt tcagccgcgc cgcgctggag cgctacgtgc 240
cgcgcctgca gggggcgctg cggcatgagg tgcgctcctg gtgcgcggcg ggcgggccgg 300
tctcagtcta cgacgcctcc aaagcgctca ccttccgcat ggccgcgcgc atcctgctgg 360
ggttgcggct ggacgaggcg cagtgcgcca cgctggcccg gacc 404
<210> 32
<211> 424
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 32
caggaattta ggagccaagg aggtgagagc agctctggcc cctcactgta ggtgacgcca 60
aactctcctc gacttgcccc gactcttagt tgaaaaatct ctgtcctctc ccaggctctc 120
cagcttccca agcaatgacc tcaatgaaaa aaatgacagc ggggcggact gcccccgctc 180
cagagtacca gtgccggcag tgcgagctat gacgcaatcg gagctcggtc ggtcctttga 240
ttggctagtc ctggccactt tggattggcc gcgcgggctg gtggggaccc cccccctcca 300
gctatctctg taataagagc ggggtctccg cggggaaggc gcccacagca ggtgtggtgt 360
tcatcccggg tcgaccggcc gctcgcgctg ccctgaaact ctagtcgcca ggtgaggaac 420
ttcc 424
<210> 33
<211> 518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 33
ccagggtgct agagagagca ggtcaggaac actcttgaac agcggaggcc cagcctggct 60
cgtccccctc ctgccccctg gggcgggtgt ctgcggcctc caggctactc ctggatgatt 120
ttattagctg tgttgggagc atatggtcct cggacatgag acctgaagta gtatttactg 180
gagagccgag gacaccgggt tcccgtgtgg gctgggtttg gcacgcactc ggttactgat 240
tgataggcca ttcaggaaac aaagaccaca agagaattca gcatgctcct ggctcggggc 300
caagccagcc tcatctcctt tgctttgtca agtgtgtctt tttgtctgcc ttcatcactt 360
gctgggcgcc tctgtgttca ctgccgggag gaagccaagt gtgtatttgc aggggctgtg 420
ggggtgtatc cagcttttct ctaagaacag ctatccaagg ggcgggaggg aacaaggggg 480
tcagccacag ctctcccctt accccttccc ctgaaaag 518
<210> 34
<211> 395
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 34
ccccctgcac gatctctttc tcgttgggca gccggtagac ggggaagatg tagagccaac 60
agaggaccac gacacagagg gcactggctc ccatgggcag ccgggtccgc gggaacttcc 120
acgccagtac agccatggcc cctctggacg tttgtcgccg ggcccgcccg caggggctca 180
tcgcagcccc ggcgtcccag gggcgggggc cggggcctca gcacaaagct aggcgaagtg 240
gcagcggagg gtcccccacc gccagccccc catgcacaca cacctttggt tctcttactt 300
gcaaacgcac gcacgcttct tcggccccgt cggccccaaa ggtcagcgca aggatttttt 360
caaatgcaac ttttccaagg atttctttct agggg 395
<210> 35
<211> 418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 35
gcctcaccca gccaaacccg agcggtggaa cgctgcgctg ggtaaacgcc gcgcgtcggg 60
tcctccctcg cgcggctccg ggcagcgttc cgtggccacc gcgctcccgg taacagcaga 120
aaggggaggg aggagagcta ccgaggaggg gacagcgacg ccccgacgcc gccacgcccc 180
ccgcctccca cacgggggcc accgtagctc tctagaagct cctcagggaa gcaaagcgcc 240
gttcccgccg caggcaccga gacgtcgccc agatggaaga aactctggag atgcgcgctc 300
ctacaccggt gccgcggcgc ccgggcccag caccacgcac ctatgcgcgc ctctgccggt 360
cctcctagaa atcccgccct gcctacccgc ggcgcgagac gcaacgacgc tttcaggg 418
<210> 36
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 36
gccaggcgac aagagctcgg tgctgagatg tgttacgttc tcatctcccc atcaattatg 60
gatggaaaca aataaggaag agtcaatttt gctgagcccc ttctccggca acgagaggcg 120
ttctgcagcc gggagggagc cgccgctcgc gccggcagcc gctggcaggg gcatggtgag 180
gaggaaggta gggaaacttt tatttcccgt cttgacagcg gcggtgtttg tccctggtct 240
gcagaaactg atacagtagc ctccttcctt gggtaattta ggagggcttg aagcttctt 299
<210> 37
<211> 643
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 37
gaggctcggt gcattggaga aagactcagt tagaggcgac tccaacgagc cgcggttttc 60
cccagcccaa cgcccagcgg ccgaagcgct gctcgggtcc ggattgcggg atgcggggct 120
ggagaggccg agcaggcacc accgacttcc cagggcgccc gggccccctg gtacagcccg 180
gctgcccgct ggaaggcgcc tcggggcagc agagagcctc agcccggctg ctgctgtcgc 240
tcaaaggcgc cggcgccggc cgcacccgca tcggggtcct tttgctccca gaccccgggc 300
ccgaaagggc cggagcgtgt cccccgccag ggcgcaggcc ccagcccccc gcacccctat 360
tgtccagcca gctggagctc cggccagatc ccgggctgcc gcctctgctg ccttccctga 420
gcgggagcgg agcgcagaga aaagttcaag ccttgcccac ccgggctgca gctgcttgtt 480
aaccctcaga gcgccacggc gcgagggaag ggcacgccaa ccaggagagg gggcgaggga 540
gatgcggtcc gcctgcagtc acctctgcac ctcagagatt tcgggaagtt tgagtgcagg 600
aaagcagcgc tccgaggcca ggcctggggt gctggccgct gcg 643
<210> 38
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 38
aggaagatcg cggggtgacg gtcggtaccc gttcggctgg gccgcgctgc cgctccgatc 60
cacctccctt ccgcgcccgc gccctccccc ttcctttcac taggagtccg ggattcggag 120
agggcgcggg aggcaggcac acgggcccga ccccactcca gcgctcaccg gggacgcggg 180
cgggcggcga cgggacgcgg cgggggcgcg gggcgggcgc ggccatggag cagcagcggc 240
ggcggcggcg gcggcggcgg caacactagc gaccgcgggc ggacgagcgg gcgggcagg 299
<210> 39
<211> 590
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 39
cccgcgcgga cccgactggg gcagcaccac gccccctaca gtccagctcc caccgcctgg 60
ccccgcccct ggcggaccag actctccacc tcctggctcc cgcggttctg accacgcctc 120
ctcccagccc tccccatgag ttcctggccc cgcctccctc cacccccgga tgttttgtcc 180
tcgccccctt ccagactctg aatgcatgac cccgcctcct tctctacccg gccccgccca 240
caggctgcct gaaggggctg cgcctgggcc acaagtgctt cctgctctcg cgcgacttcg 300
aagctcaggc ggcggcgcag gcgcggtgca cggcgcgggg cgggagcctg gcgcagccgg 360
cagaccgcca gcagatggag gcgctcactc ggtacctgcg cgcggcgctc gctccctaca 420
actggcccgt gtggctgggc gtgcacgatc ggcgcgccga gggcctctac ctcttcgaaa 480
acggccagcg cgtgtccttc ttcgcctggc atcgctcacc ccgccccgag ctcggcgccc 540
agcccagcgc ctcgccgcat ccgctcagcc cggaccagcc caacggtggc 590
<210> 40
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 40
tctcttcctg ccgagtgcgc cgagcccccc gccccttcct gccccccgcc cctccgcagc 60
ctcctgcccg cccacagccc gctgcccgcc tcggacctcg gagaggagga gagggccggg 120
aggagcgagc ggggctgacc tccaaggggc cgccccaagt ctcaggaccg ccgactctgc 180
ccttcctctc cgccgtctgg ggccaacccg cctcgttggc gcgctgcgcc tttatagtct 240
gcaaagccac actgaagaga ccagagatca cctggtggcc atcaagtcga ccaacaggag 300
gcaaagcccc ttatctgagc aattcagaat gacacttccc tattgtctaa agccacatct 360
ggtaccaagc ttccgtccca agaatttata 390
<210> 41
<211> 360
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 41
ggctgggccg gcgctgggga ggaggaaggg agggaacggg taggaggagg ggaagcgcag 60
tataaaagtc ccggccggac tgagcgtccg ctactccgag tcacttcggt aaggcgggag 120
cccgagcaag gtcaaggagg gaagtgcgcg gtgccacgga ccgacacagt tcgctctagc 180
atctgacgct cggactccgc gccctcagcc ggatcccaga gcccttccat tcgccaaccg 240
cccactgcaa ggcatgagcc gcacgcggga gcccgaggct gcagcgcggt catgaggcgg 300
tggcccggga tcgacagctg cgcgacgcca gcccccaaat cccctctggg cgcggcaccc 360
<210> 42
<211> 382
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 42
gagcaaggcg accccggccg cccgcgccag caagaggatc gtcctgccgg agcccaggta 60
ccagctgccc cggccggcgc cggccccaag ccgccgcccc ctgcggccgc cagctacccc 120
ctgcttcctg gagggtcggg cgctgagcct ccgctgcccc ggggcgggtg acacagcgga 180
gcgggcgatg cggggccggc ctcgtcgttc cagtctctga aatggggcat cggagggccg 240
gtggggggca ccccgggaga gagcgctcca aagtgcccgg cgcggcgccc tgcgcgcagc 300
gagcgcccca gccagggtct ggttatgact tggctggacc agctccatcc ctgtcgcccc 360
ctccccccag ccctgtcctg tc 382
<210> 43
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 43
ccccacgccg ggcgatatgg ggtgcctgct gtttctgctg ctctgggcgc tcctccaggc 60
ttggggaagc gctgaaggtg ggtggaacga gggcgcttga gtgcactcg 109
<210> 44
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 44
aggagggctg ccggggtctg ggcttgggaa ttggctggca cccagcggaa agggacgtga 60
gctgagcggc gggggagaag agtgcgcagg tcagagggcg gcgcgcagcg gcgctccgcg 120
<210> 45
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 45
ccaagcctgg aggagcgccc agagcagcag aaacagcagg caccccatat cgcccggcgt 60
ggggacctcg cggagcgccg ctgcgcgccg ccc 93
<210> 46
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 46
ggcccgagac ggctcggctc ccagcccaga ggcctggccg ggactggagg gcgtagagcc 60
gccggggagc gcatccgtct gcagcggc 88
<210> 47
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 47
tcttaatgca acaaacgaaa ccccacacga acgaaaagga acatgtctgc gctctctgcg 60
cagcgcttgg gcggcgcggt cccggcgcgc ggggaagcgg cgtctccgct aac 113
<210> 48
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 48
gccctggtgg tgctcgttcc cggcgctcgc tcgagggggg gctgttggaa cttggcgggg 60
ctggaccagc ccggccgtgg gaggtgcggg ccgcggcggc tgcag 105
<210> 49
<211> 107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 49
gggctggacc agcccggccg tgggaggtgc gggccgcggc ggctgcagcg gcggggtggc 60
tgcgctgagc aaacagcggc cccttccggc cgcaccgccg cgctgcg 107
<210> 50
<211> 131
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 50
ctgcagccgc cgcggcccgc acctcccacg gccgggctgg tccagccccg ccaagttcca 60
acagcccccc ctcgagcgag cgccgggaac gagcaccacc agggctggag cggacggctt 120
tagaagagcc t 131
<210> 51
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 51
tgtgcaatcg atggctcagg ttggctgcgc ggggagcggc cagaggctcg ctggcgcgca 60
cgccgcggag tcatgaacga ctttgacgag tgcggccaga gcgcagccag catgtacctg 120
ccgggctgcg 130
<210> 52
<211> 98
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 52
tgctagcgaa gtcagacggg gccacatagt aggcgcagcc cggcaggtac atgctggctg 60
cgctctggcc gcactcgtca aagtcgttca tgactccg 98
<210> 53
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 53
ctcccgccaa tctcgccccc gccgccgagg ctgccgaccc ggtgcgcacc ggcgaggcat 60
tttcgcacca cagcactgca cggaaagtca gcg 93
<210> 54
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 54
ctccagagcc ggggtttgta aaccgaggcc agagtgtccc cgtgggccga gcgcactttt 60
ttcttgtccg ggtgcgctca gtcact 86
<210> 55
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 55
taacttggct gcggggcagg cgcgaggagc ggcgcgccga ccgggccgag cggagaggcc 60
gcccattggc cggccagcgc cacgtggcc 89
<210> 56
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 56
gccacgtggc gctggccggc caatgggcgg cctctccgct cggcccggtc ggcgcgccgc 60
tcctcgcgcc tgccccgcag ccaagttagc caa 93
<210> 57
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 57
cggatgtggc tccgggaccg cgcgaggcga tgccctgttc ctctgggctt ggctgtaggg 60
cggggaggga aggcaccacg gggtggggga gaactgagcc cgagtcgcc 109
<210> 58
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 58
ctcaacgagt gcttcatcaa ggtgccgcgc gagggcggcg gcgagcgcaa gggcaactac 60
tggacgctgg acccggcct 79
<210> 59
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 59
gcagggaacc gccgcggata actttccgac tgcgctttcc cgaggggccg cgggtccgcg 60
ctgcagagcg cgccagaggc gcagcgaggt caagggaaac tcgct 105
<210> 60
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 60
ccctcgggaa agcgcagtcg gaaagttatc cgcggcggtt ccctgcgcgc cctgttgtgt 60
aagctcggcg ttgccagcgg acggagaagt tgctggcttg cccgatagcc cagttc 116
<210> 61
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 61
ttggtcaagg cgcatttgaa cgacgaggag acggcggcag tggaggcgac cgtgctgttc 60
ccccaggacg aacccggacc ggccaggaag gcagcgtccg tcccgttggg gacagccggc 120
cacagcacc 129
<210> 62
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 62
ctaaacgagg gcaccactgg tccggagttg cacttgttcg ctccctcctg ggctctggca 60
gcgctgcatc cccggggttg cttcgggttc gggcccaata gcagagtcag agccgagac 119
<210> 63
<211> 115
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 63
cggaccagcc gcgccgcagc tgctccaatc cctggaaaag gcaatcgagc gccctccgga 60
ccgctgcgca cagccccggc tccgacctgg cgcccaaaac agagctagtc ctagt 115
<210> 64
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 64
tgctcgcccc agccatggct aggtacccgc gcggcgcgtc ggctcccggc gtcgctgcgg 60
gacactccga aggcgcaagg agccggcggc ggagccgagg gttgaactcc aaaccagctg 120
gggcga 126
<210> 65
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 65
ggaagagccc acctgtcagg ctgcgctggg tcagcgcagc aagtggggct ggccgctatc 60
tcgctgcacc cggccgcgtc ccgggctccg tgcgccctcg ccccagctg 109
<210> 66
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 66
gggtgcagcg agatagcggc cagccccact tgctgcgctg acccagcgca gcctgacagg 60
tgggctcttc cccagcagct gcgcggacct caccc 95
<210> 67
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 67
gtgaggtccg cgcagctgct ggggaagagc ccacctgtca ggctgcgctg ggtcagcgca 60
gcaagtgggg ctggccgcta tctcgctgca cccggccgcg tcccgggctc cgtgcgccct 120
cgcccca 127
<210> 68
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 68
gcggagccac gtcagtcgca cccggagaag ggtctgggag gaggcggagg cggagagggc 60
tggggagggc cgcggcggag tgacgtctcg gcaccagga 99
<210> 69
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 69
gtacctaaga ggcgaggctg cacgctgggg gccaagtggg tgcgcctgtg tttgcagcat 60
ttgtgtcatc ggtgagagag actcact 87
<210> 70
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 70
cgtggttccg agccagcaaa taacgccagc agccctccca gatccacgcc ggcccgtctc 60
tccgccggcc ccctcctcgc agtggtttct cctgcagctc cc 102
<210> 71
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 71
taacgttccc gaaccccgga ccttagctgt catttcacct gcgtcgtccc ggacgccatt 60
tggctgttga cgtggttccg agccagcaaa taacgccagc agccctccca 110
<210> 72
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 72
tgggagggct gctggcgtta tttgctggct cggaaccacg tcaacagcca aatggcgtcc 60
gggacgacgc aggtgaaatg acagctaagg tccg 94
<210> 73
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 73
gctcctgagg gaggtgcggc cagcagggcg ctagaggagg aagaggggct gctggagaga 60
gagagcgcgc caggttcagg tccagg 86
<210> 74
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 74
ccctggacct gaacctggcg cgctctctct ctccagcagc ccctcttcct cctctagcgc 60
cctgctggcc gcacctccct caggagc 87
<210> 75
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 75
ggagcccgga cagagatact ctggcgtctc tgctgctccc acggagctga gggcactagg 60
gccgcctgag atttccttta ggtggctccg aaagctagtc cgcgagtcca aatcctgcgc 120
tccc 124
<210> 76
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 76
ctctgcgagg ggaccaccgt ctccccggga gacagccagg gcggcagcct ggccaggagg 60
ctgcggtcca gggcctcgtc cggag 85
<210> 77
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 77
gccaccactg tgagggcgag gggccccggg gccgcgatct gccctcctct ggtctcacac 60
atgcccttgg ttttgtatcc caggccacgt gcgccggggc agccgctgac attgggatct 120
acagggtag 129
<210> 78
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 78
tgtgagacca gaggagggca gatcgcggcc ccggggcccc tcgccctcac agtggtggct 60
gaggcctggg gctgggcgga cagcagtgcc ctggtgggcc tggggactgg tgcgcccc 118
<210> 79
<211> 102
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 79
gggctgcacc aatacagcca catgtcggtc acgtgcgccc acacccagcc aatcggcggg 60
ctcccgacgg gaatggggag cgccctggtc cgcatccagc gg 102
<210> 80
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 80
agggcatacc cccgaggggt acggggctag ggctaggcag gctgtgcggt tgggcggggc 60
cctgtgcccc actgcggagt gcg 83
<210> 81
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 81
ggccaatcgg aagggcaagc ttcgagatgc tgcgtgatca cgtgggagga gatgagctac 60
ttgaagacca attagagtcc gggaagcg 88
<210> 82
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 82
ggtccgggtc agctgactcc cgactctgtg gagtctagct gccagggtcg cggcagctgc 60
ggggagagat gactggggag cgacccagca cggcgctccc 100
<210> 83
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 83
ttgattggcc gcggcaccag gacacgtcac aggggcgggg ccgattttaa agagccgggc 60
gcggaaaaaa aaaggccgcc tgtcgtcgtg 90
<210> 84
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 84
cggagcgaga ccacctgtga ggactgctga gattggcgga ggcggtcatg tgggcggtca 60
cgtgctgcgg cgagctcc 78
<210> 85
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 85
tttgagcttg gaagagccgc tactcgaatg agctcaggct tcctgtggca aagagagcga 60
agcggctgtg ctcagcccac gccccggcgc tgttcctgc 99
<210> 86
<211> 107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 86
cgaagcggct gtgctcagcc cacgccccgg cgctgttcct gcccagccaa tcagcctcac 60
cacagatgac tgctcccggc ccggattgac tgaatgctga ttcctcg 107
<210> 87
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 87
tggaccatgt tgcccggagc gcgcacagcc cgcgcggtgc ggggacctgc tctctgagcc 60
cgcgggcggt gggtgggagg aagcatcgtc cgcggcgact ggaaccggga gggagaatcg 120
cac 123
<210> 88
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 88
ggctcagaga gcaggtcccc gcaccgcgcg ggctgtgcgc gctccgggca acatggtcca 60
gtgccactac ggtttgggcg ctgctccagg 90
<210> 89
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 89
catcgcaggt gtggttccag aaccgcagga ccaagtggcg gaagaagagc gccctggagc 60
cctcgtcctc cacgccccgg gccccggg 88
<210> 90
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 90
aaccacacct gcgatgagaa agaatgtgaa gggcacaggg gcacagcgcg cacgggacgc 60
gagaacagcc atcctgcttt tacagctaaa caaatggctc aacaacgga 109
<210> 91
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 91
ccgccacggg ccgcagtccc gccgcgcccg ccgagtgctc ggtcagctcg cgccggcccg 60
cgccccacct gccagcagca gcctccgctc ccgccgc 97
<210> 92
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 92
cggcgggact gcggcccgtg gcggcgtgcg cggggacctg cgctgactag gtccggggaa 60
ggtaagcagc ccggcaccgg tgcgccctgg ccgcactgcg tggagctttc cgcttggtta 120
<210> 93
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 93
ctcggcgcag cccgcgcaca cgaatccgga gcagagtacc gcagcgattg cggctcaggc 60
tcggggactc gggctc 76
<210> 94
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 94
tcccggagca ccaactccgt gtcgggagtg cagaaaccaa caagtgagag ggcgccgcgt 60
tcccggggcg cagctgcggg cggcgggagc aggcgcagga ggaggaagcg agcgccccc 119
<210> 95
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 95
ccgggcctcg ggatttgcaa acttgcacct ggaatcagcc tcctctgggc gctcaacgct 60
ctccaccgag tccagagaaa ccttgtcggg gaagcctggt gagactcgga agtccg 116
<210> 96
<211> 112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 96
cctccggact tccgagtctc accaggcttc cccgacaagg tttctctgga ctcggtggag 60
agcgttgagc gcccagagga ggctgattcc aggtgcaagt ttgcaaatcc cg 112
<210> 97
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 97
tccagaggcg ggtaactttg ctaatctccc ccagcggcgg ggaacgtcgc gcaaccgctg 60
agccctgtcc gccgagacta aacaagcaga ggaacaggct g 101
<210> 98
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 98
tgcttgttta gtctcggcgg acagggctca gcggttgcgc gacgttcccc gccgctgggg 60
gagattagca aagttacccg cct 83
<210> 99
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 99
gcccccgcgg gagccacgtt ctctagcagt tccatctgga tctcctgcgc caccgccgcc 60
gccgctgtgg gaggcgactt ggacatgtcc ctttggacca ttggcgaaaa gtcg 114
<210> 100
<211> 127
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 100
tggctgcttc gctccgagcc gacttttcgc caatggtcca aagggacatg tccaagtcgc 60
ctcccacagc ggcggcggcg gtggcgcagg agatccagat ggaactgcta gagaacgtgg 120
ctcccgc 127
<210> 101
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 101
cgggtcaggt agcctctctc cggtcgccgc gtgtcctcgc cgtccccaaa cctgcccttc 60
ccctcatcaa gggaactccc cggggagtcc agaccgcga 99
<210> 102
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 102
ttggtgctgc cgaccccgtt gtcgaagaag tgcggggcga agttggcctg agctggaaaa 60
agaacacaga acagacggac acccaggcaa agg 93
<210> 103
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 103
aacgtcagct ctgttgcgag gcgggttctc ccaacaatag cccacaccat ttccaggctt 60
ttctgggcga ggggcagggc gcccggcccc caaagcgaga agacagacag ccccggttct 120
<210> 104
<211> 129
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 104
gatgaggcca gaccgccgcc agcgctgatc acgcgcgctc ccacaggtcc tggcgcgcgt 60
gttcagccgc gccgcgctgg agcgctacgt gccgcgcctg cagggggcgc tgcggcatga 120
ggtgcgctc 129
<210> 105
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 105
cgcgccagga cctgtgggag cgcgcgtgat cagcgctggc ggcggtctgg cctcatctgc 60
ttggcgattc cggagtagcc agaaggcca 89
<210> 106
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 106
tgacagcggg gcggactgcc cccgctccag agtaccagtg ccggcagtgc gagctatgac 60
gcaatcggag ctcggtcggt cctttgattg gctagtcctg gccactttgg attggccg 118
<210> 107
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 107
tgtgttggga gcatatggtc ctcggacatg agacctgaag tagtatttac tggagagccg 60
aggacaccgg gttcccgtgt gggctgggtt tggcacgcac tcggttactg attgatagg 119
<210> 108
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 108
tgtcgccggg cccgcccgca ggggctcatc gcagccccgg cgtcccaggg gcgggggccg 60
gggcctcagc acaaagctag gcgaagtggc agcg 94
<210> 109
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 109
tgtgctgagg ccccggcccc cgcccctggg acgccggggc tgcgatgagc ccctgcgggc 60
gggcccggcg acaaacgtcc agaggggcca tggctgtact ggcgt 105
<210> 110
<211> 116
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 110
acgtctcggt gcctgcggcg ggaacggcgc tttgcttccc tgaggagctt ctagagagct 60
acggtggccc ccgtgtggga ggcggggggc gtggcggcgt cggggcgtcg ctgtcc 116
<210> 111
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 111
tgttccccga ctggaaatgc tttacggaag cgtcttggac agggtctccg ccaggcgaca 60
agagctcggt gctgagatgt gttacgttc 89
<210> 112
<211> 110
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 112
gccagctgga gctccggcca gatcccgggc tgccgcctct gctgccttcc ctgagcggga 60
gcggagcgca gagaaaagtt caagccttgc ccacccgggc tgcagctgct 110
<210> 113
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 113
aagtcggtgg tgcctgctcg gcctctccag ccccgcatcc cgcaatccgg acccgagcag 60
cgcttcggcc gctgggcgtt gggctgggga aaaccgcggc tcg 103
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 114
tttcactagg agtccgggat tcggagaggg cgcgggaggc aggcacacgg gcccgacccc 60
actccagcgc tcaccggg 78
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<211> 112
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 115
gaggcaggca cacgggcccg accccactcc agcgctcacc ggggacgcgg gcgggcggcg 60
acgggacgcg gcgggggcgc ggggcgggcg cggccatgga gcagcagcgg cg 112
<210> 116
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 116
gcgccgccgc ctgagcttcg aagtcgcgcg agagcaggaa gcacttgtgg cccaggcgca 60
gccccttcag gcagcctgtg ggcggggccg ggtagagaag gaggcggggt catgcattca 120
gag 123
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 117
tgtggctttg cagactataa aggcgcagcg cgccaacgag gcgggttggc cccagacggc 60
ggagaggaag ggcagagtcg gcggtcctga gacttggggc ggccccttgg aggtcagccc 120
cgctcgctc 129
<210> 118
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 118
cgcccacagc ccgctgcccg cctcggacct cggagaggag gagagggccg ggaggagcga 60
gcggggctga cctccaaggg gccgccccaa gtctcaggac cgccgact 108
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 119
ccgcgtgcgg ctcatgcctt gcagtgggcg gttggcgaat ggaagggctc tgggatccgg 60
ctgagggcgc ggagtccgag cgtcagatgc tagagcgaac tgtgtcggtc cgtggcaccg 120
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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gccaaccgcc cactgcaagg catgagccgc acgcgggagc ccgaggctgc agcgcggtca 60
tgaggcggtg gcccgggatc gacagctgcg cgacgccagc 100
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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cgatgcccca tttcagagac tggaacgacg aggccggccc cgcatcgccc gctccgctgt 60
gtcacccgcc ccggggcagc ggaggctca 89
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<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
<400> 138
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<223> Artificial Sequence
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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tgtcgtcggg ttcgttcgta 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<211> 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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aaacgacgcg ccgaccgaac c 21
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<213> Artificial Sequence
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<223> Artificial Sequence
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aataccttcc ctccccgccc tacaac 26
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<213> Artificial Sequence
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attaccctta cgctcgccgc cg 22
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cccacctatc aaactacgct aaatcaacgc a 31
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accctcccca accctctccg c 21
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tcccgaacgc catttaacta ttaacgtaat tccg 34
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tctccaacaa cccctcttcc tcctctaacg 30
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tccaacaacc cctcttcctc ctctaacgc 29
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tcccacgaaa ctaaaaacac taaaaccgcc t 31
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cctaaccaaa ctaccgccct aactatctcc cg 32
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taccccgacg cacgtaacct aaaatacaaa a 31
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aaacactact atccgcccaa ccccaaacc 29
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attcccgtcg aaaacccgcc g 21
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cccgcccaac cgcacaacct ac 22
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catctcctcc cacgtaatca cgcaacat 28
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caatcatctc tccccgcaac taccgc 26
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cccgactctt taaaatcgac cccgc 25
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cacataaccg cctccgccaa tctc 24
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aacacaaccg cttcgctctc tttaccacaa 30
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ccgacgctat tcctacccaa ccaatcaacc 30
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<211> 25
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<223> Artificial Sequence
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cgaacgatac ttcctcccac ccacc 25
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aaaccatatt acccgaaacg cgcacaac 28
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<223> Artificial Sequence
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cgaaaactcc aaaacgctct tcttccg 27
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<211> 31
<212> DNA
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<223> Artificial Sequence
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ccctataccc ttcacattct ttctcatcgc a 31
<210> 330
<211> 24
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cgaaccgacg cgaactaacc gaac 24
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cgccgccacg aaccgca 17
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ccgcaatcgc tacgatactc tactccgaa 29
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ctactcccgc cgcccgcaac tac 23
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cttccccgac aaaatttctc taaactcgat 30
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tctaaacgct caacgctctc caccgaat 28
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cgaacaaaac tcaacgatta cgcgacg 27
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aaaacgtcgc gcaaccgcta aacc 24
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aacatatcca aatcgcctcc cacaacg 27
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atctcctacg ccaccgccgc c 21
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ctcaaaccaa cttcgccccg cacttctt 28
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aaaaccgaac gccctacccc tcg 23
<210> 343
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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gttggagcgt tacgtgtcgc gtttgtagg 29
<210> 344
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 344
aaaccaaacc gccgccaacg ctaatc 26
<210> 345
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 345
ccgaccgaac tccgattacg tcataactcg 30
<210> 346
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 346
caaacccaac ccacacgaaa acccg 25
<210> 347
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 347
ccgcccctaa aacgccgaaa ctacga 26
<210> 348
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cgtttatcgc cgaacccgcc cg 22
<210> 349
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 349
ccccgcctcc cacacgaaaa cc 22
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 350
cgcctaacga aaaccctatc caaaacgctt 30
<210> 351
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 351
ttctctacgc tccgctcccg ctcaaa 26
<210> 352
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 352
caacgcccaa cgaccgaaac gcta 24
<210> 353
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 353
cccgtatacc tacctcccgc gccc 24
<210> 354
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 354
aacgctcacc gaaaacgcga acg 23
<210> 355
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 355
tctacccgac cccgcccaca aactac 26
<210> 356
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 356
caaatctcaa aaccgccgac tctaccct 28
<210> 357
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 357
aaaatcaacc ccgctcgctc ctcc 24
<210> 358
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 358
cgctctaaca tctaacgctc gaactccg 28
<210> 359
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 359
cgaaccaccg cctcataacc gc 22
<210> 360
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 360
cacaacgaaa cgaacgatac gaaaccga 28
<210> 361
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 361
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 362
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 362
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 363
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
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accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
<210> 364
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 364
aaaacctact cctcccttaa aaattacaaa aaccacaacc taataaaaaa aataaccacc 60
acccaacaca caataacaaa cacaaattca caatccaaaa aacttactaa acctcctcca 120
tcac 124
<210> 365
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 365
gtagttttag atggtttttt gagttgga 28
<210> 366
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 366
cactcccatc ctatcttccc tctata 26
<210> 367
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 367
agggattaga gtaggtttg 19
<210> 368
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 368
gtagttttag atggtttttt gagttggatg attttaggtt tttagatatt tagggattag 60
agtaggtttg ggaatataga gggaagatag gatgggagtg 100
<210> 369
<211> 338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial Sequence
<400> 369
ttggagtttg caaaagaagc aagcaataaa aagcaagacc aggttcgccc ctttgcttcc 60
tccacctccc aagagcagcg cgcagcgcgg cggtgcggcc ggaaggggcc gctgtttgct 120
cagcgcagcc accccgccgc tgcagccgcc gcggcccgca cctcccacgg ccgggctggt 180
ccagccccgc caagttccaa cagccccccc tcgagcgagc gccgggaacg agcaccacca 240
gggctggagc ggacggcttt agaagagcct agctgctgcg cgcgtcggag aggctcctgg 300
gaaactccca cggcccaggg actttcgaaa gcagagcg 338

Claims (15)

1.一种用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中所述的甲基化生物标记物组合为：
SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：81的组合；SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：84的组合；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：81和SEQ ID NO：84的组合；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84和SEQ ID NO：118的组合；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：116的组合；SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQID NO：84、SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：118的组合；SEQ ID NO：46、81、84、118、116、111、98、58、105和57的组合；SEQ ID NO：46、81、84、118、116、111、98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、66、91、110和57的组合；或，SEQ ID NO：46、81、84、118、116、111、98、58、105、80、76、54、68、61、88、109、66、91、110、57、43、45、49、62、89、93、96、102、103和113的组合中的任一组。
2.根据权利要求1所述的用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中，所述胃癌选自I期、II期、III期或IV期的胃癌；和/或，
所述胃癌为来自受试者的胃癌，所述的受试者是哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中所述的哺乳动物是人。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中，通过以下方法中的一种或多种检测所述甲基化生物标记物组合的甲基化程度：荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(MSDGGE)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)、甲基化敏感性解链曲线分析(MS-MCA)甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、甲基化特异性多连接依赖性探针扩增、重亚硫酸盐测序和焦磷酸测序。
5.根据权利要求4所述的用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中，所述方法为荧光定量PCR法。
6.根据权利要求5所述的用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中，所述荧光定量PCR法为单重荧光定量PCR法或多重荧光定量PCR法。
7.根据权利要求6所述的用于诊断胃癌的甲基化生物标记物组合，其中，所述多重荧光定量PCR法为多重荧光定量PCR通道合并检测方法。
8.一种用于诊断胃癌的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中如权利要求1～7中任一项所述的甲基化生物标记物组合的甲基化程度的引物和探针，其中，所述引物和探针分别为：
(1)如SEQ ID NO:122、203所示的引物，如SEQ ID NO:283所示的探针；
(2)如SEQ ID NO:124、205所示的引物，如SEQ ID NO:285所示的探针；
(3)如SEQ ID NO:125、206所示的引物，如SEQ ID NO:286所示的探针；
(4)如SEQ ID NO:128、209所示的引物，如SEQ ID NO:289所示的探针；
(5)如SEQ ID NO:133、214所示的引物，如SEQ ID NO:294所示的探针；
(6)如SEQ ID NO:136、217所示的引物，如SEQ ID NO:297所示的探针；
(7)如SEQ ID NO:137、218所示的引物，如SEQ ID NO:298所示的探针；
(8)如SEQ ID NO:140、221所示的引物，如SEQ ID NO:301所示的探针；
(9)如SEQ ID NO:141、222所示的引物，如SEQ ID NO:302所示的探针；
(10)如SEQ ID NO:145、226所示的引物，如SEQ ID NO:306所示的探针；
(11)如SEQ ID NO:147、228所示的引物，如SEQ ID NO:307所示的探针；
(12)如SEQ ID NO:155、234所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(13)如SEQ ID NO:155、235所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(14)如SEQ ID NO:159、239所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(15)如SEQ ID NO:159、240所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(16)如SEQ ID NO:160、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(17)如SEQ ID NO:161、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(18)如SEQ ID NO:164、244所示的引物，如SEQ ID NO:323所示的探针；
(19)如SEQ ID NO:168、248所示的引物，如SEQ ID NO:327所示的探针；
(20)如SEQ ID NO:169、249所示的引物，如SEQ ID NO:328所示的探针；
(21)如SEQ ID NO:171、251所示的引物，如SEQ ID NO:330所示的探针；
(22)如SEQ ID NO:173、253所示的引物，如SEQ ID NO:332所示的探针；
(23)如SEQ ID NO:176、256所示的引物，如SEQ ID NO:335所示的探针；
(24)如SEQ ID NO:178、258所示的引物，如SEQ ID NO:337所示的探针；
(25)如SEQ ID NO:182、262所示的引物，如SEQ ID NO:341所示的探针；
(26)如SEQ ID NO:183、263所示的引物，如SEQ ID NO:342所示的探针；
(27)如SEQ ID NO:185、265所示的引物，如SEQ ID NO:344所示的探针；
(28)如SEQ ID NO:189、269所示的引物，如SEQ ID NO:348所示的探针；
(29)如SEQ ID NO:190、270所示的引物，如SEQ ID NO:349所示的探针；
(30)如SEQ ID NO:191、271所示的引物，如SEQ ID NO:350所示的探针；
(31)如SEQ ID NO:192、271所示的引物，如SEQ ID NO:350所示的探针；
(32)如SEQ ID NO:194、273所示的引物，如SEQ ID NO:352所示的探针；
(33)如SEQ ID NO:197、276所示的引物，如SEQ ID NO:355所示的探针；
(34)如SEQ ID NO:199、278所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针；
(35)如SEQ ID NO:199、279所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针。
9.根据权利要求8所述的用于诊断胃癌的试剂盒，其中，检测甲基化程度的方法为荧光定量PCR法。
10.根据权利要求9所述的用于诊断胃癌的试剂盒，其中，所述荧光定量PCR法为单重荧光定量PCR法或多重荧光定量PCR法。
11.根据权利要求10所述的用于诊断胃癌的试剂盒，其中，所述多重荧光定量PCR法为多重荧光定量PCR通道合并检测方法。
12.根据权利要求8～11中任一项所述的用于诊断胃癌的试剂盒，其中，所述的待测样本选自细胞、组织样品、体液样品和排泄物中的任一种或其任意组合。
13.根据权利要求12所述的用于诊断胃癌的试剂盒，所述体液样品选自血浆、唾液和血清中的任一种或其任意组合，所述排泄物选自尿液、粪便和结肠流出物中的任一种或其任意组合。
14.根据权利要求13所述的用于诊断胃癌的试剂盒，所述体液样品为血浆。
15.用于检测待测样本中如权利要求1～7中任一项所述的甲基化生物标记物组合的甲基化程度的引物和探针在制备用于诊断胃癌的试剂盒中的用途，其中，所述引物和探针分别为：
(1)如SEQ ID NO:122、203所示的引物，如SEQ ID NO:283所示的探针；
(2)如SEQ ID NO:124、205所示的引物，如SEQ ID NO:285所示的探针；
(3)如SEQ ID NO:125、206所示的引物，如SEQ ID NO:286所示的探针；
(4)如SEQ ID NO:128、209所示的引物，如SEQ ID NO:289所示的探针；
(5)如SEQ ID NO:133、214所示的引物，如SEQ ID NO:294所示的探针；
(6)如SEQ ID NO:136、217所示的引物，如SEQ ID NO:297所示的探针；
(7)如SEQ ID NO:137、218所示的引物，如SEQ ID NO:298所示的探针；
(8)如SEQ ID NO:140、221所示的引物，如SEQ ID NO:301所示的探针；
(9)如SEQ ID NO:141、222所示的引物，如SEQ ID NO:302所示的探针；
(10)如SEQ ID NO:145、226所示的引物，如SEQ ID NO:306所示的探针；
(11)如SEQ ID NO:147、228所示的引物，如SEQ ID NO:307所示的探针；
(12)如SEQ ID NO:155、234所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(13)如SEQ ID NO:155、235所示的引物，如SEQ ID NO:315所示的探针；
(14)如SEQ ID NO:159、239所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(15)如SEQ ID NO:159、240所示的引物，如SEQ ID NO:319所示的探针；
(16)如SEQ ID NO:160、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(17)如SEQ ID NO:161、241所示的引物，如SEQ ID NO:320所示的探针；
(18)如SEQ ID NO:164、244所示的引物，如SEQ ID NO:323所示的探针；
(19)如SEQ ID NO:168、248所示的引物，如SEQ ID NO:327所示的探针；
(20)如SEQ ID NO:169、249所示的引物，如SEQ ID NO:328所示的探针；
(21)如SEQ ID NO:171、251所示的引物，如SEQ ID NO:330所示的探针；
(22)如SEQ ID NO:173、253所示的引物，如SEQ ID NO:332所示的探针；
(23)如SEQ ID NO:176、256所示的引物，如SEQ ID NO:335所示的探针；
(24)如SEQ ID NO:178、258所示的引物，如SEQ ID NO:337所示的探针；
(25)如SEQ ID NO:182、262所示的引物，如SEQ ID NO:341所示的探针；
(26)如SEQ ID NO:183、263所示的引物，如SEQ ID NO:342所示的探针；
(27)如SEQ ID NO:185、265所示的引物，如SEQ ID NO:344所示的探针；
(28)如SEQ ID NO:189、269所示的引物，如SEQ ID NO:348所示的探针；
(29)如SEQ ID NO:190、270所示的引物，如SEQ ID NO:349所示的探针；
(30)如SEQ ID NO:191、271所示的引物，如SEQ ID NO:350所示的探针；
(31)如SEQ ID NO:192、271所示的引物，如SEQ ID NO:350所示的探针；
(32)如SEQ ID NO:194、273所示的引物，如SEQ ID NO:352所示的探针；
(33)如SEQ ID NO:197、276所示的引物，如SEQ ID NO:355所示的探针；
(34)如SEQ ID NO:199、278所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针；
(35)如SEQ ID NO:199、279所示的引物，如SEQ ID NO:357所示的探针。
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