CN113699237A - 一种检测早期结直肠癌和腺瘤的dna甲基化标志物的试剂盒 - Google Patents
一种检测早期结直肠癌和腺瘤的dna甲基化标志物的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中的第38位、第47位、第50位以及第52位中至少2个位点同时发生甲基化。本发明还提供了检测上述DNA甲基化标志物的方法、引物对、探针和试剂盒。本发明的方法对早期结直肠癌和腺瘤的特异性好、灵敏度高,且检测成本低、操作简单,有利于早期结直肠癌筛查的广泛应用。
Description
本申请是申请日为2020年07月29日、申请号为202010745610.X、发明名称为“早期结直肠癌和腺瘤的DNA甲基化标志物、检测其的方法及其应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体地,本发明涉及一种早期结直肠癌和腺瘤的甲基化标志物、检测其的方法及其应用。
背景技术
在中国,结直肠癌的发病率位列所有恶性肿瘤中的第4位。中国结直肠癌的筛查不足,是造成我国结直肠癌五年生存期低的主要原因。最新的研究表明,粪便中含有微量的来源于人类肠道表皮脱落细胞的核酸,对这些核酸的多靶标检测可以有效的预示恶变的信号,例如粪便DNA的多靶标检测可以用于筛查肠癌,虽然针对高级别腺瘤的灵敏度偏低。粪便DNA多靶标检测技术于2014年获得FDA批准用于肠癌筛查,并列入NCCN肠癌筛查指南和美国癌症预防计划。
肠癌从最初的息肉开始到腺癌,需要5-10年的生长周期,这一阶段的治疗成本低效果好;但是,一旦突破这个阶段,随着病程变长,病变速度加快,治疗费用高,而且效果极差。因此,早诊早治是应对结直肠癌的最好办法。
多数结直肠癌开始于结肠或直肠内衬的生长,称为息肉。随着病程延长,某些类型的息肉会发展为癌症。常见的息肉类型是增生性息肉,和结直肠腺瘤性息肉;后者有概率会发展为癌症,因此,腺瘤被称为癌前疾病。肠道腺瘤可以通过内镜筛查,但对检查者的技术要求就较高,临床上存在的内镜筛查的漏检率较高。因此,基因筛查腺瘤对于早期结直肠癌诊断和筛查具有重要意义。
本领域急需一种早期结直肠癌和腺瘤的DNA标志物,以用于早期结直肠癌诊断和筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一种早期结直肠癌和腺瘤的DNA甲基化标志物、检测其的方法及其应用。
在本发明的第一方面,提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的第38位、第47位、第50位以及第52位中至少2个位点同时发生甲基化,其中,所述序列编号是基于SEQ ID NO.:1中所示序列:AAGCGGCAGGAGCAGCTCACAGCCAGGAGCGCTCTCCCGCCCCCAACGCCGCGCTCCCCCCTCCAAAACGGTTTAAAAAAATCCACCAATTGCATGGCC(SEQ ID No.:1)。具体地,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的以下位点同时发生甲基化:
(1)第38位和第47位;或
(2)第38位和第50位;或
(3)第38位和第52位;或
(4)第47位和第50位;或
(5)第47位和第52位;或
(6)第50位和第52位;或
(7)第38位、第47位和第50位;或
(8)第38位、第47位和第52位;或
(9)第47位、第50位和第52位;或
(10)第38位、第47位、第50位和第52位。
在另一种实施方式中,本发明还提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的第38位、第47位以及第50位中至少2个位点同时发生甲基化,具体包括在SEQ IDNO.:1中所示序列中的以下位点同时发生甲基化:
(1)第38位和第47位;或
(2)第38位和第50位;或
(3)第47位和第50位;或
(4)第38位、第47位和第50位。
在本发明的第二方面,提供了一种用于扩增本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的引物对。在一个具体实施方式中,所述的引物对用于扩增SEQ ID No.:1所示的核苷酸区段。
在一个具体实施方式中,所述引物对包括:上游引物NDRG4-F1:5’-AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAG-3’(SEQ ID No.:3);和/或下游引物NDRG4-R1:5’-GACCATACAATTAATAAATTTTTTTAAACC-3’(SEQ ID No.:4)。
在本发明的第三方面,提供了一种靶向本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的探针。
在一个具体实施方式中,所述探针的序列如SEQ ID No.:7所示:AACGCGACGTTAAAAACGA(SEQ ID No.:7)。
在本发明的第四方面,提供了一种检测本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的方法,包括以下步骤:
1)从样品中提取基因组DNA;
2)使用亚硫酸盐对步骤1)得到的DNA进行转化处理,得到转化产物;
3)使用本发明第二方面所述的引物对对步骤2)得到的转化产物进行扩增,得到扩增产物;及
4)检测步骤3)中获得的扩增序列中本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况。
在一个具体实施方式中,所述样品选自:粪便、血液、结直肠病理组织及其组合;优选地为粪便。
在一个具体实施方式中,本发明第四方面的方法还包括在步骤1)之前保存样品的步骤。所述保存样品的步骤包括将样品置于样品保存液中。所述样品保存液至少包括:醋酸钠0.1M、氯化钠0.5M、EDTA50mM、SDS 1.4%以及适量醋酸,所述醋酸用于将所述样品保存液的PH调节至5.5。
在一个具体实施方式中,本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物所在序列为SEQID No.:1所示的序列。在所述DNA甲基化修饰转化试剂的作用下,所述DNA甲基化标志物所在序列转化为SEQ ID No.:2所示的序列:AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAGCGTTTTTTCGTTTTTAACGTCGCGTTTTTTTTTTTAAAACGGTTTAAAAAAATTTATTAATTGTATGGTC(SEQ ID No.:2),其中下划线处碱基为所述DNA甲基化标志物的确切位点。步骤3)中扩增产物的序列如SEQ IDNo.:2所示。
在一个具体实施方式中,步骤4)中的检测采用选自下组的至少一种方法:TaqMan-PCR检测、甲基化特异性PCR法MSP、亚硫酸盐处理后测序法BSP、焦磷酸测序、高分辨熔解曲线分析HRM、质谱-荧光共振能量转移法MS-FRET、甲基化特异酶限制性酶切法、核酸质谱分析MassArray、Sanger测序、二代基因测序法NGS、扩增片段长度多态性分析AFLP、限制性片段长度多态性分析RFLP、LUMA法(Luminometric Methylation Assay)、酶联免疫吸附测定ELISA、长散在重复序列法(Long Interspersed Nuclear Elements)和Cold-PCR法。优选地,步骤4)中的检测采用TaqMan-PCR检测方法。优选地,所述步骤4)中的检测采用MS-HRM检测方法。更优选地,所述步骤4)中的检测采用锁核酸-MS-HRM检测方法,其中步骤3)中使用的扩增引物为锁核酸修饰的引物。
在一种实施方式中,步骤3)和步骤4)同时进行或依次进行。
在本发明的第五方面,提供了一种检测本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的试剂盒,其包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的PCR扩增试剂。
在一个具体实施方式中,所述的PCR扩增试剂包括本发明第二方面所述的引物对,以及任选地,本发明第三方面所述的探针。在一个具体实施方式中,所述的试剂盒还包括荧光定量PCR试剂。
在本发明的第六方面,提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的方法,其包括以下步骤:
a)检测样品中本发明第一方面中所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况;
及b)将步骤a)检测到的甲基化情况与早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测相关联。
在一个具体实施方式中,步骤a)中样品中的所述DNA甲基化标志物的甲基化情况使用本发明第四方面所述的方法进行检测。
在本发明的第七方面,提供了本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物在制备用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的试剂盒中的用途。
在一种实施方案中,所述第七方面的用途中,所述早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测包括以下步骤:
a)检测样品中第一方面中所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况;及
b)将步骤a)检测到的甲基化情况与早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测相关联。
在本发明的第八方面,提供了检测本发明第一方面所述的DNA甲基化标志物的试剂在制备用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的试剂盒中的用途。
在一个具体实施方式中,所述试剂选自本发明第二方面所述的引物对、本发明第三方面所述的探针及其组合。
在一个具体实施方式中,所述早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测包括结直肠癌I期、结直肠癌II期和/或结肠癌相关腺瘤的早期诊断、筛查与风险预测,以及区分结肠癌相关腺瘤与息肉、良性病变。
附图说明
图1显示了按照实施例1的方法检测NDRG4基因中DNA甲基化标志物的阳性率。
图2显示了使用特异性参考品质粒T1-T7检验探针NDRG4-1的特异性。
图3显示了按照实施例1的方法检测NDRG4基因中DNA甲基化标志物的检测结果绘制ROC曲线。
图4显示了按照实施例2的方法检测NDRG4基因中DNA甲基化标志物的熔解曲线。
图5显示了1号患者的病理组织样品通过实施例2的方法检测NDRG4基因中DNA甲基化标志物的熔解曲线。
图6显示了2号患者的病理组织样品通过实施例2的方法检测NDRG4基因DNA甲基化标志物的熔解曲线。
图7显示了4号患者的病理组织样品通过实施例2的方法检测NDRG4基因DNA甲基化标志物的熔解曲线。
图8显示了18号患者的病理组织样品通过实施例2的方法检测NDRG4基因DNA甲基化标志物的熔解曲线。
图9显示了5组参考品通过实施例2的方法检测NDRG4基因中DNA甲基化标志物的熔解曲线,每组参考品中分别由不同比例的完全甲基化DNA——HCT116DNA和未甲基化DNA——gDNA组成。
具体实施方式
参考以下本申请的优选实施方案的详述以及包括的实施例可更容易地理解本公开内容。
除非另有限定,本文使用的所有技术以及科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时,以本说明书中的定义为准。
如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中,此短语将使权利要求为封闭式,使其不包含除那些描述的材料以外的材料,但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时,其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开了范围“1至5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
为了实现早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测,本发明人通过大量实验发现,NDRG4基因中的甲基化位点与早期结直肠癌和腺癌关系密切。具体地,本发明人发现了一组NDRG4基因中的DNA甲基化CpG位点,并设计出针对这组CpG位点的引物对、探针和检测方法。进一步,使用临床样品检验发现,在保证特异性的同时,本方法检测腺瘤的灵敏度高达65%以上,检测早期结直肠癌的灵敏度更是高达75%以上。因此,所述NDRG4基因中的DNA甲基化位点可以作为早期结直肠癌和腺癌的诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物。
甲基化标志物
本发明提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的第38位、第47位、第50位以及第52位中至少2个位点同时发生甲基化,其中,所述序列编号是基于SEQ IDNO.1中所示序列:AAGCGGCAGGAGCAGCTCACAGCCAGGAGCGCTCTCCCGCCCCCAACGCCGCGCTCCCCCCTCCAAAACGGTTTAAAAAAATCCACCAATTGCATGGCC(SEQ ID No.:1)。具体地,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的以下位点同时发生甲基化:
(1)第38位和第47位;或
(2)第38位和第50位;或
(3)第38位和第52位;或
(4)第47位和第50位;或
(5)第47位和第52位;或
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(7)第38位、第47位和第50位;或
(8)第38位、第47位和第52位;或
(9)第47位、第50位和第52位;或
(10)第38位、第47位、第50位和第52位。
在另一种实施方式中,本发明还提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的DNA甲基化标志物,所述标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的第38位、第47位以及第50位中至少2个位点同时发生甲基化,具体包括在SEQ IDNO.:1中所示序列中的以下位点同时发生甲基化:
(1)第38位和第47位;或
(2)第38位和第50位;或
(3)第47位和第50位;或
(4)第38位、第47位和第50位。
本申请中的“NDRG4基因”是N-myc基因下调基因家族属于α/β水解酶家族的一员。位于16号染色体上NC_000016.10(58463704-58515403),具有24个外显子,其NCBI参考序列RefSeqGene编号为NG_041803.1。本发明中选取NDRG4基因(NG_041803.1)的第4445-6444位之间的序列,具体地选择了第4782-4911位、第5065-5200位、第5574-5672位三段序列,以寻找其中与早期结直肠癌和腺癌相关的甲基化位点。发明人发现,上述三段序列中在第5574-5672位之间序列中存在的多个甲基化位点,其中有3个位点中至少两个同时发生甲基化时与早期结直肠癌和腺癌相关。
本申请中的“甲基化”是指从活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上将甲基催化转移到其他化合物的过程。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰,调节基因的表达和关闭,与癌症、衰老等许多疾病密切相关。最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化,本发明涉及NDRG4基因的DNA甲基化。脊椎动物的DNA甲基化一般发生在CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点,即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)。经DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DMT)催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶(5mC)。人类基因中约80%-90%的CpG位点已被甲基化,但是在某些特定区域,如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。这与包含所有广泛表达基因在内的56%的哺乳动物基因中的启动子有关。1%-2%的人类基因组是CpG群,并且CpG甲基化与转录活性成反比。本文中,“甲基化”、“DNA甲基化”、“核酸甲基化”、“基因甲基化”、“NDRG4基因中的DNA甲基化”、“NDRG4基因的DNA甲基化”可以相互替换,均指NDRG4基因中的CpG位点发生甲基化修饰。
本发明的具体实施方式中,SEQ ID NO.:1所述的序列位于NDRG4基因(NG_041803.1)的第5574-5672位处。
本发明的具体实施方式中,所述SEQ ID NO.:1序列在DNA甲基化修饰转化试剂的作用下,转化为SEQ ID No.:2所示的序列:AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAGCGTTTTTTCGTTTTTAACGTCGCGTTTTTTTTTTTAAAACGGTTTAAAAAAATTTATTAATTGTATGGTC(SEQ ID No.:2),其中下划线处碱基为NDRG4基因中DNA甲基化标志物的确切位点。预料不到地,发明人发现4个邻近的CpG位点(第38位、第47位、第50位和第52位)中的至少两个的组合具有甲基化标志物意义,可以用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测。
本申请中的“结直肠癌(Colorectal Cancer)”是胃肠道中常见的恶性肿瘤,早期症状不明显,随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状,晚期则出现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。结直肠癌生长很慢,潜伏期较长,93%的结直肠癌来源于腺瘤(一种癌前病变),从腺瘤发展到癌需5~7年;美国研究表明,每年进行便隐血检测,可使结直肠癌死亡率降低33%。虽然结直肠癌可防可治,但是在我国实际上超过80%患者确诊时已发展到中晚期,早期诊断率仅10-15%;国内调查显示,早期大肠癌术后存活率达90-95%以上,而晚期则只有5%。
至于结直肠癌的分期。肿瘤分期的目的是通过检查明确肿瘤的范围,提供预后的情况并指导治疗方案的确定。根据AJCC(American Joint Committee on Cancer,美国癌症联合委员会)的TNM(Tumor肿瘤,Node淋巴结,Metastasis转移)标准,可将结肠癌划分为0、I、II、III、IV个阶段。根据原发肿瘤的浸润深度,分为T1:侵及黏膜及黏膜下层;T2:侵及肌层;T3:侵及浆膜下层;T4:侵及浆膜层或其它器官组织;根据淋巴结转移情况,分为N0:肿瘤局限于肠壁内,无区域淋巴结转移;N1:1-3个淋巴结转移;N2:4个以上淋巴结转移;以及远处转移情况,分为:M0:无远处转移;M1:有远处转移。0级结肠癌为原位癌,未超过结直肠壁的第一层;I级结肠癌指癌症已经发展成结直肠壁的第二层或第三层,但附近的淋巴结或远离结直肠的区域没有癌症;II级指癌症已经长入或超出结直肠壁的第四层,附近的淋巴结或远离结直肠的区域没有癌症;III级指癌症已从结直肠扩散到附近的淋巴结或有肿瘤沉积(结直肠周围脂肪中的小肿瘤);IV级指癌症已扩散到远离结直肠的区域。本文中所述的“结直肠癌早期”、“结直肠癌(I期+II期)”、“早期结直肠癌”可以互换,就是指未发生癌症淋巴结和远离结直肠区域的转移的结直肠癌。对于这一类早期结直肠癌,治疗成本相对较低,愈后效果也比较好,因此早期结直肠癌的筛查具有很重要的临床意义。
引物对
本发明提供了一种用于扩增上述DNA甲基化标志物的引物对。
在一个具体实施方式中,所述的引物对用于扩增SEQ ID No.:1所示的核苷酸区段。
在一个具体实施方式中,所述引物对包括:上游引物NDRG4-F1:5’-AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAG-3’(SEQ ID No.:3);和/或下游引物NDRG4-R1:5’-GACCATACAATTAATAAATTTTTTTAAACC-3’(SEQ ID No.:4)。
在一个具体实施方式中,作为内参基因的肌动蛋白ACTIN基因扩增的引物对为:上游引物ACTIN-F:5’-TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA-3’(SEQ ID No.:5);和下游引物ACTIN-R:5’-CACCAACCTCATAACCTTATC-3’(SEQ ID No.:6)。
探针
本发明提供了一种靶向上述DNA甲基化标志物的探针。
在一个具体实施方式中,所述探针的序列如SEQ ID No.:7所示:5’FAM–AACGCGACGTTAAAAACGA-BHQ 3’(SEQ ID No.:7)。
在一个具体实施方式中,还用到ACTIN基因靶向探针:5’VIC-TAATACCTACACCCACAACAC-BHQ 3’(SEQ ID No.:8)。
本领域技术人员可以选择其他合适的内参基因,并可以根据现有技术针对已知标志物、位点和核酸序列设计并选择合适的引物对和探针。
检测上述DNA甲基化标志物的方法
本发明提供了一种检测上述DNA甲基化标志物的方法,包括以下步骤:
1)从样品中提取基因组DNA;
2)使用亚硫酸盐对步骤1)得到的DNA进行转化处理;
3)使用上述引物对对步骤2)得到的转化产物进行扩增,得到扩增产物;
及4)检测步骤3)中获得的扩增产物中上述DNA甲基化标志物的甲基化情况。
常见的检测DNA甲基化的方法包括:甲基化特异性的PCR(Methylation-specificPCR,MSP)、亚硫酸盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)、高分辨率熔解曲线法(HighResolution Melting,HRM)、基因组直接测序法等。
MSP法是用亚硫酸盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR;然后通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。
BSP法是用亚硫酸盐处理基因组DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。
HRM法是在非CpG岛位点设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用亚硫酸盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。
基因组直接测序法是过去一直沿用的DNA甲基化的研究方法,用Maxam-Gilbert化学裂解法对基因组DNA进行处理,并以连接介导的PCR来放大信号强度,然后进行序列分析。此法是基于5mC在标准的Maxam-Gilbert胞嘧啶化学裂解反应中不被裂解,故5mC可通过在测序胶上缺少对应于胞嘧啶降解反应产物的一个条带而得以鉴定。如采用MnO4 -哌啶法,结果则反之因此在检测5mC时,此两法可提供完全互补的检测信息。该法与LM—PCR结合后,大大降低了对基因组DNA的需要量(1-2ng)。当5mC和C同时处于不同DNA分子上的同一位点时,该位点至少要有25%的5mC才能被N2H4法检测到;MnO4 -法比N2H4法更灵敏。因为这两种基因组DNA化学修饰法均有抑制DNA聚合酶延伸的特性,无须进行DNA哌啶裂解就可通过基因组直接测序技术进行甲基化分析。
本发明的具体实施方式中,所述样品选自:粪便、血液、结直肠病理组织及其组合;优选地为粪便。
在一个具体实施方式中,上述方法还包括在步骤1)之前保存样品的步骤。所述保存样品的步骤包括将样品置于样品保存液中。所述样品保存液至少包括:醋酸钠0.1M、氯化钠0.5M、EDTA 50mM、SDS 1.4%以及适量醋酸,所述醋酸用于将所述样品保存液的PH调节至5.5。
在一个具体实施方式中,上述DNA甲基化标志物所在序列为SEQ ID No.:1所示的序列。在所述DNA甲基化修饰转化试剂的作用下,所述DNA甲基化标志物所在序列转化为SEQID No.:2所示的序列:AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAGCGTTTTTTCGTTTTTAACGTCGCGTTTTTTTTTTTAAAACGGTTTAAAAAAATTTATTAATTGTATGGTC(SEQ ID No.:2),其中下划线处碱基为所述DNA甲基化标志物的确切位点。步骤3)中扩增得到的序列如SEQ ID No.:2所示。
在一个具体实施方式中,步骤4)中的检测采用选自下组的至少一种方法:TaqMan-PCR检测、甲基化特异性PCR法MSP、亚硫酸盐处理后测序法BSP、焦磷酸测序、高分辨熔解曲线分析HRM、质谱-荧光共振能量转移法MS-FRET、甲基化特异酶限制性酶切法、核酸质谱分析MassArray、Sanger测序、二代基因测序法NGS、扩增片段长度多态性分析AFLP、限制性片段长度多态性分析RFLP、LUMA法(Luminometric Methylation Assay)、酶联免疫吸附测定ELISA、长散在重复序列法(Long Interspersed Nuclear Elements)和Cold-PCR法。优选地,步骤4)中的检测采用TaqMan-PCR检测方法。
在一种实施方式中,步骤3)和步骤4)同时进行或依次进行。
除了MS-HRM方法之外,本发明还可以采用锁核酸-MS-HRM检测方法。锁核酸是一种寡核甘酸衍生物,和普通寡核甘酸分子区别在于其结构中含有一个或多个2’-O,4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核甘酸单体,核糖的2’-O位和4’-C位通过亚甲基桥连接起来,成环形。本发明采用的锁核酸-MS-HRM检测方法,就是在针对SEQ ID No.:1所设计的PCR扩增引物或探针中添加至少一个锁核酸修饰,具体数量可能为一个、二个、三个、四个、五个或六个等。在引物或探针位点引入锁核酸修饰,一方面增加上游引物(A/T含量较高且重复)的TM值,解决了以往根据PCR所设计的双端引物TM值不匹配的问题;另一方面可同时提高上下游引物或探针的特异性及扩增效率。除了添加锁核酸之外,锁核酸-MS-HRM检测方法其他操作步骤和MS-HRM相同。通过调整扩增引物或探针中锁核酸修饰的位点和数量,即使很低丰度的甲基化也呈现很明显的峰值信号。证实该位点确实存在鉴别部分肠癌特征的能力。
本领域技术人员可以选择其他合适的检测方法,并可以根据现有技术针对本发明提供的NDRG4基因中的甲基化标志物设计并选择合适的检测试剂。
试剂盒
本发明还提供了一种检测上述DNA甲基化标志物的试剂盒,其包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及所述DNA甲基化标志物的PCR扩增试剂。
在一个具体实施方式中,所述的PCR扩增试剂包括上述引物对,以及任选地,上述探针。在一个具体实施方式中,所述的试剂盒还包括荧光定量PCR试剂。
本发明提供了一种早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的方法,其包括以下步骤:
a)检测样品中上述DNA甲基化标志物的甲基化情况;
及b)将步骤a)检测到的甲基化情况与早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测相关联。
在一个具体实施方式中,步骤a)中样品中的所述标志物的甲基化情况使用上述方法进行检测。
用途
本发明提供了上述DNA甲基化标志物在制备用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的试剂盒中的用途。
在一个具体实施方式中,所述早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测包括以下步骤:
a)检测样品中第一方面中所述的DNA甲基化标志物的甲基化情况;及
b)将步骤a)检测到的甲基化情况与早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测相关联。
本发明还提供了检测上述DNA甲基化标志物的试剂在制备用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测的试剂盒中的用途。
在一个具体实施方式中,所述试剂选自所述的引物对、所述的探针及其组合。
在一个具体实施方式中,所述早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测包括结直肠癌I期、结直肠癌II期和/或结肠癌相关腺瘤的早期诊断、筛查与风险预测,以及区分结肠癌相关腺瘤与息肉、良性病变。
机体的正常细胞在不同致癌因素的长期作用下,表现为数量增加,但细胞形态尚未发生改变,病理上称这个变化为“单纯性增生”。在数量增加的同时,细胞形态也发生改变,称为“不典型增生”。如果继续发展,细胞形态与起源组织的细胞形态差异(又称异型性)逐渐加重,但尚未发展为癌,这个阶段属于癌的前驱阶段,称为“癌前病变”(PrecancerousLesion)。尽管这时增生的细胞有向癌细胞转变的倾向,但不是所有的癌前病变都会发展为癌。大部分癌前病变停留在此阶段并处于长期稳定状态,一部分或自愈或经治疗后消退复原,只有一小部分癌前病变继续发展,最终发展成为癌症。癌前病变是指继续发展下去具有癌变可能的某些病变,例如:黏膜白斑,交界痣,慢性萎缩性胃炎,子宫颈糜烂,结直肠的多发性腺瘤性息肉,某些良性肿瘤等。
所述息肉可以分为两种,非腺瘤性息肉和腺瘤性息肉。非腺瘤性息肉主要是炎性息肉或增生性息肉,几乎都是良性,鲜少会发生癌变。腺瘤性息肉是癌变几率较高的息肉。有数据表明,95%的肠癌都来自于腺瘤性息肉。腺瘤性息肉(Adenomatous Polyp)虽有较大的癌变可能,但并不意味着一定会发生癌变。一般来讲,从腺瘤性息肉演变成肠癌,需要经历5~15年的时间,且会受到诸多因素的影响。本文中,“癌前病变”、“腺瘤”、“结直肠癌相关的腺瘤”、“腺瘤性息肉”、“息肉性腺瘤”可以相互替换,均指结直肠黏膜的腺瘤,多呈息肉状,可以为单发性或多发性,有蒂或无蒂。本文中,“息肉”、“增生性息肉”、“非腺瘤性息肉”、“结直肠息肉”可以相互替换,均指结直肠黏膜表面的未表现出明显的恶变倾向的赘生物。
目前对于早期结直肠癌的筛查,最常规的方式是粪便隐血实验(Fecal OccultBlood Test,FOBT),其中化学法检查上消化道出血(胃、十二指肠等)可靠,而免疫化学法来检测便潜血(Fecal Immunochemical Test,FIT)主要适用于下消化道(小肠、大肠)出血的检查。有报道,在通过腺瘤样品的前期筛选的前提下,即保障90%以上特异性,粪便隐血实验筛查肠道腺瘤的灵敏度是24%。而本发明的一个实施例中,本发明提供的方法检测肠道腺瘤的灵敏度高达65%,远高于粪便隐血实验的结果,对于早期肠癌筛查方面也更有优势。
另一种较常见的筛查方式是利用血液标本进行的甲基化Septin9单靶标检测,及基于结直肠癌中SEPT9-v2启动子区的CPG岛高度甲基化原理的检测。但是,Septin9在肠道腺瘤中的灵敏度缺乏报道,而在早期肠癌中的灵敏度在50-60%之间。而本发明的一个实施例中,对于早期肠癌的灵敏度可以达到75%,在保障90%以上特异性的前提下,筛查肠道腺瘤和早期肠癌(临床分期I期和II期)的灵敏度更高。
目前还有一种利用二代测序方法的组合靶标检测。利用血液标本的组合靶标检测的优势在特异性极高,但在筛查早期肠癌方面的实际灵敏度仅有,I期肠癌30-50%,II期肠癌65-70%(Grail的CGGA数据),并没有肠道腺瘤的数据报道。且竞品方法的成本高达2000美元以上(而本发明的一个实施例中的检测成本低于100元),数据分析方法极为复杂,难以实际用于筛查。
相比于现有技术,本发明提供的NDRG4基因中的新DNA甲基化标志物用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测,表现出更高的灵敏度和特异性。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
1.本发明提供了一种NDRG4基因中的新DNA甲基化标志物,并建立了针对这一标志物检测早期结直肠癌的方法,应用本方法结合TaqMan-PCR技术,可以仅使用一对引物和探针,实现高特异性高灵敏度的检测腺瘤和早期结直肠癌。
2.本方法使用单基因单引物对的检测方式,靶向的核酸片段不超过200bp,技术简单、操作容易,大大降低了检测成本,易于推广和应用。
3.本方法不仅对结肠癌具有高特异性高灵敏度,检测结直肠癌相关的腺瘤的效果更优异,能够区分腺瘤和息肉,因此相对于现有技术本发明在结直肠癌的早期诊断和筛查方面具有突出的优势。
4.本方法使用的检测样品来源可以是粪便样品,并配套提供了一种长期保存粪便样品的试剂,适用于实际操作中遇到的不同环境和背景。
5.本方法还可以结合多种检测方法,实际检验时可以多种方法自由组合,还可以结合其他临床检验指标一起分析。
6.本方法的靶标数目相对较少,理论上扩大样品量后的稳定性比其他多靶标检测的稳定性更高,因此作为检测指标更清晰和有代表性。
实施例
下面结合说明书附图,进一步对本申请的优选实施例进行详细描述,以下的描述为示例性的,并非对本申请的限制,任何的其他类似情形也都落入本申请的保护范围之中。
实施例1 TaqMan-PCR方法检测粪便样品中的甲基化位点
1.1 DNA样品的提取与转化
用链接特异性探针的磁珠从粪便样品中提取出人源NDRG4和ACTIN基因片段,排除了微生物及其它人源DNA的干扰。其中或NDRG4作为检测靶点,ACTIN作为内参。
本实施例中使用的样品为粪便,取样方便。粪便样品的保存使用配制的样品保存液,可在常温下保存样品时长达7天,降低了样品运输的难度。其中,磁珠上链接的特异性探针的序列如下所示:
样品保存液配方:
成份 | 醋酸钠 | 氯化钠 | EDTA | SDS |
浓度 | 0.1M | 0.5M | 50mM | 1.4% |
用醋酸调节PH至5.5。
核酸提取具体操作如下:
(1)样品用电子天平配平,样品和配平管重量相差在±0.01g之间;
(2)离心:10000g离心10min;
(3)过滤:用滤网将上层液体过滤至新的50mL离心管中备用。
(4)取15mL离心管,每管中加入5mL吸附剂,5000g离心10min,然后用真空泵吸弃上层液体。
(5)向15mL离心管加入5mL样品,涡旋混匀后5000g离心10min。
(6)把上层液体转移至新的15mL离心管中,并向管中加入1mL去垢剂和100μL蛋白酶K,涡旋混匀30s后70℃孵育15min。
(7)孵育完成后擦净离心管上的水,向管中加入2mL 1-溴-3-氯丙烷。涡旋混匀后5000g离心10min。
(8)转移上层清夜至新的15mL离心管中,并向管中加入4mL异丙醇和80μL磁珠(磁珠使用前振荡混匀)。涡旋混匀30s后放至旋转混匀仪上混匀5min。
(9)将样品管放至磁力架上静置2min,待磁珠吸附到管壁后用真空泵吸弃废液。
(10)将离心管转移至管架,向其中加入5mL洗涤液1,涡旋振荡30s,尽量使磁珠分散。将离心管放置于磁力架上2min,待磁珠吸附至管壁后用真空泵吸弃废液。
(11)重复步骤(10)。
(12)向离心管中加入5mL洗涤液2,涡旋振荡30s。将离心管放置于磁力架上2min,待磁珠吸附至管壁后用真空泵吸弃废液。
(13)将离心管转移至管架,向其中加入1mL洗涤液3,用移液器反复吹打磁珠使磁珠分散后转移所有液体至1.5mL离心管中。将离心管放置于磁力架上2min,待磁珠吸附完全后用真空泵吸弃废液。尽量把废液去除干净,该步骤对于核酸纯度影响较大。
(14)将离心管和磁力架转移至生物安全柜中开盖晾干10min。
(15)洗脱:向离心管中加入80μL洗脱液,涡旋混匀后置于恒温金属浴1300rpm 65℃孵育5min。孵育完成后将样品管13500rpm离心30s,将液体收集到管低。将离心管转移至磁力架上静置5min,转移DNA溶液至新的1.5mL离心管中,样品-20℃保存。
然后,将提取的DNA进行亚硫酸盐转化,具体步骤如下:
(1)向CT转化试剂中加入900μL水、300μL M-稀释缓冲液和50μLM-溶解缓冲液,配置成工作液。
(2)将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻。取200μL PCR管,按20μL DNA加130μL CT转化试剂的比例混合。混合好的样品运行如下程序:
98℃ | 10分钟 |
64℃ | 2.5小时 |
4℃ | 保存时间在20小时以内 |
(3)把吸附住放入收集管。向吸附住中加入600μL M-结合缓冲液,并把(2)中反应液全部转移至吸附柱中,上下颠倒10次,混匀后18000g离心30s;
(4)弃废液,向吸附柱中加入100μL M-洗涤缓冲液,混匀后18000g离心30s;
(5)弃废液,向吸附柱中加入200μL M-脱磺化缓冲液,直立放置室温孵育20min,18000g离心30s;
(6)弃废液,向吸附柱中加入200μL M-洗涤缓冲液,18000g离心30s,弃废液;
(7)重复步骤(6);
(8)将吸附住转移至1.5mL离心管中,向吸附柱中加入50μL洗脱缓冲液,18000g离心30s,离心管中即为转化好的DNA。
如此,得到亚硫酸盐转化后的DNA样品。
1.2 TaqMan-PCR方法检测甲基化位点
设计结直肠癌基因转化后的特异性扩增引物,设计引物扩增的DNA片段不超200bp。本实施例中设计了针对NDRG4(NG_041803.1)的第4445位到第6444位之间的1对引物,并根据其间的甲基化位点设计了对应的探针,具体的引物及探针信息如下:
扩增引物 | 引物序列(5’-3’) | SEQ ID No.: |
NDRG4 1F | AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAG | 3 |
NDRG4 1R | GACCATACAATTAATAAATTTTTTTAAACC | 4 |
ACTIN F | TTTGTTTTTTTGATTAGGTGTTTAAGA | 5 |
ACTIN R | CACCAACCTCATAACCTTATC | 6 |
探针名称 | 探针序列 | SEQ ID No.: |
NDRG4-1 | 5'FAM–AACGCGACGTTAAAAACGA-3'BHQ | 7 |
ACTIN | 5'VIC–TAATACCTACACCCACAACAC-3'BHQ | 8 |
每对引物的上下游引物等摩尔混合,得到相应的扩增引物混合液,每对扩增引物混合液的最终工作浓度为5μM。探针的工作液浓度为5μM。
以实施例1中得到的亚硫酸盐转化后的DNA样品为模板,利用上述扩增引物和探针分别进行PCR扩增反应。具体操作步骤如下:
配制检测反应体系,PCR反应体系中组分如下:
KAPA PROBE FORCR Universal(KM4301) | 10μL |
引物对 | 0.1~1.0μmol |
探针 | 0.1~1.0μmol |
样品DNA模板 | 8.8μL |
超纯水补足总体积 | 20μL |
实时荧光PCR扩增反应条件优选为:
第一阶段:98℃3min;
第二阶段:95℃10s,58℃30s,50个循环;
每个循环收集荧光信号。
1.3探针NDRG4-1的特异性验证
为了证明本实施例使用的探针NDRG4-1检测NDRG4的甲基化位点的特异性,还设计了使用探针NDRG4-1检测特异性参考品的验证实验。
以亚硫酸盐处理后的序列SEQ ID NO.:2为模板T0设计参考品,其中参考品T1为模拟一个位点发生甲基化的质粒;参考品T2到T4为模拟四个位点中两个位点发生甲基化的质粒;参考品T5到T7为模拟四个位点中三个位点发生甲基化的质粒。具体地,本实施例使用的参考质粒的序列信息如下表所示。
把质粒T1-T7稀释至浓度为10ng/ul和0.01ng/ul两组,作为亚硫酸盐转化后的DNA样品,然后如1.2中所述的操作进行TaqMan-PCR方法检测甲基化位点。
结果:比较使用所述引物与探针与临床样品结果的配适度,发现使用引物对NDRG41F+NDRG4 1R和探针NDRG4-1检测NDRG4的甲基化的结果与临床样品病理分型一致。具体情况详述如下:
本实施例的样品为176例临床样品,随机分为验证集和测试集。验证集和测试集的样品均进行独立双盲实验其中,预测值=1/(1+EXP(-(2.58357-0.05622*NDRG4-actin))),预测值>0.5为阳性,预测值<0.5为阴性,测试集的具体数据如下表所示:
验证集的具体数据如下表所示:
TaqMan-PCR检测方法检测临床样品的统计结果如图1所示。
根据本发明提供的NDRG4基因的DNA甲基化标定物的检测方法检测腺瘤,结果显示在验证集中,检测30例,其中20例检测结果为阳性,检测阳性率为66%;在测试集中,检测22例,其中14例检测结果为阳性,检测阳性率为64%;因此在训练和测试集中,共检测腺瘤样品52例,其中34例检测结果为阳性,检测评价阳性率为64%,远高于目前常规报道20%。
根据本发明提供的NDRG4基因的DNA甲基化标定物的检测方法检测肠癌(I期+II期),结果显示在测试集中,检测0例,未出现假阳性结果;在验证集中,检测24例,其中18例检测结果为阳性,检测阳性率为75%,阳性率也高于目前常规报道。
根据本发明提供的NDRG4基因中DNA甲基化标定物的检测方法检测增生性息肉,结果显示在验证集中,检测27例,其中4例检测结果为阳性,检测阳性率为14.8%;在测试集中,检测25例,其中1例检测结果为阳性,检测阳性率为4%;因此在测试和验证集中,共检测腺瘤样品52例,其中5例检测结果为阳性,检测评价阳性率为9.6%,腺瘤和息肉的区分度很大。
根据本发明提供的NDRG4基因中DNA甲基化标定物的检测方法检测良性病变,结果显示在验证集中,检测22例,其中2例检测结果为阳性,检测阳性率为9%;在测试集中,检测25例,其中2例检测结果为阳性,检测阳性率为8%;因此在测试和验证集中,共检测腺瘤样品47例,其中4例检测结果为阳性,检测评价阳性率为8.5%,结果与增生性息肉的检测结果均比较低,远低于肠癌(I期+II期)和腺瘤的阳性率。
另外,本实施例还检测了1例家族性肠癌样品,意外地发现,该家族性肠癌样品也表现出了阳性。
探针特异性验证实验结果显示,如图2所示,无论在高浓度和低浓度模板的情况下:在第38位、第47位、第50位、第52位中的任意2个位点以上位点在模拟甲基化修饰的质粒中,通过PCR扩增反应均采集到荧光信号,而对于这四个甲基化位点均未发生甲基化和只有一个位点发生甲基化的模拟甲基化修饰的质粒中,通过PCR扩增反应则无荧光信号。表明探针NDRG4-1对检测SEQ ID NO.:1的所述四个甲基化位点具有很高的特异性,探针NDRG4-1可以检测SEQ ID NO.:1中第38位、第47位、第50位、第52位中的至少2个位点。同时,利用这对引物和探针的临床试验结果表明该探针在早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查中具有很高的特异性。本发明提供的甲基化标志物即SEQ ID NO.:1中第38位、第47位、第50位、第52位中的至少2个位点发生甲基化,在检测早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查中具有很高的特异性。因此,本发明提供的甲基化标志物可以用于早期结直肠癌和腺瘤的诊断、筛查与风险预测。
为了分析比较本发明针对不同病理表型的区分度,利用上述数据进一步绘制了接受者操作特征曲线ROC,ROC曲线结果如图3所示。结果显示ROC曲线分析表明,AUC值为0.844,说明该种分类方法是可行的,检测结果的临床疾病分型的符合度较高。
实施例2 MS-HRM方法检测组织样品中的甲基化位点
本实施例中还提供了检测样品中的甲基化位点的另一种方法——甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-High Resolution Melting Curve Analyse)。MS-HRM法是一种不需要PCR产物后续操作的,简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法主要通过比较曲线的熔解温度和峰形得以实现并且可以在一系列的CpG位点中检测出单一的一个甲基化的发生,同时,也可以对一系列的CpG位点的甲基化水平进行分析。单个CpG位点的甲基化和平均的甲基化水平会对熔解曲线的形状造成影响。在PCR反应前,在非CpG岛位点设计引物,使这对引物中间包含有意义的甲基化CpG岛,一旦这些CpG岛发生甲基化,使胞嘧啶(C)不发生变化,而与未甲基化的胞嘧啶(C)转变成胸腺嘧啶(T),样品中的GC含量发生了变化,最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位点也会对熔解峰的形状产生影响,因此,根据Tm值和熔解峰的形状可以检测出样品的甲基化位点和甲基化程度。
2.1 DNA样品的提取与转化
使用TIANamp Genomic DNA Kit(天根,北京)从组织样品中提取DNA,操作按照产品说明书进行。
然后,将提取的DNA进行亚硫酸盐转化,具体步骤如下:
(1)向CT转化试剂中加入900μL水、300μL M-稀释缓冲液和50μLM-溶解缓冲液,配置成工作液。
(2)将提取的基因组DNA从冰箱取出解冻。取200μL PCR管,按20μL DNA加130μL CT转化试剂的比例混合。混合好的样品运行如下程序:
98℃ | 10分钟 |
64℃ | 2.5小时 |
4℃ | 保存时间在20小时以内 |
(3)把吸附住放入收集管。向吸附住中加入600μL M-结合缓冲液,并把(2)中反应液全部转移至吸附柱中,上下颠倒10次,混匀后18000g离心30s;
(4)弃废液,向吸附柱中加入100μL M-洗涤缓冲液,混匀后18000g离心30s;
(5)弃废液,向吸附柱中加入200μL M-脱磺化缓冲液,直立放置室温孵育20min,18000g离心30s;
(6)弃废液,向吸附柱中加入200μL M-洗涤缓冲液,18000g离心30s,弃废液;
(7)重复步骤(6);
(8)将吸附住转移至1.5mL离心管中,向吸附柱中加入50μL洗脱缓冲液,18000g离心30s,离心管中即为转化好的DNA。
如此,得到亚硫酸盐转化后的DNA样品。
2.2 MS-HRM方法检测甲基化位点
以重亚硫酸盐转化后得到的阳性DNA样品为模板,利用实施例1中的扩增引物对NDRG4 1F和NDRG4 1R进行PCR扩增反应。具体操作步骤如下:
配制检测反应体系,PCR反应体系中组分如下:
KAPA 2X Master Mix | 12.5U |
扩增引物对(终浓度为200nM) | 2U |
Syto 9染料 | 0.5U |
参考物质 | 1U |
水 | 9U |
PCR扩增反应条件优选为:
结果:临床患者的癌组织和癌旁组织的样品进行MS-HRM方法检测NDRG4基因DNA甲基化标志物的熔解曲线如图4-8所示。20名临床患者的癌组织和癌旁组织的样品进行MS-HRM方法检测NDRG4基因DNA甲基化标志物的熔解曲线的总体情况如图4所示。其中,各样品在MS-HRM检测方法中的核酸含量和熔解曲线的熔解温度Tm值如下表1所示。
表1
根据各样品的Tm值分析该样品中所述位点的甲基化情况:一般认为癌旁组织来源的样品为结直肠癌阴性样品,而癌组织来源的样品为结直肠癌阳性样品。对于癌旁组织来源的样品,其Tm值(代表未甲基化扩增产物)分布较单一,主要分布在70.62至70.7的区间(Tm1值)。对于癌组织来源的的样品,其Tm值(包含甲基化扩增产物),可能有Tm1和Tm2,用当中稍大的一个值减去其对应的癌旁组织的Tm1值;当差值大于等于0.1,代表癌组织中包含有NDRG4位点的甲基化产物。
具体地,如图5所示,1号患者的病理组织样品的熔解曲线显示,相比2号样品(癌旁组织),1号样品(癌组织)具有疑似阳性的样品溶解曲线,但1号癌组织甲基化的峰不明显,因此判断1号样品为阴性。如图6所示,2号患者的病理组织样品的熔解曲线显示,相比4号样品(癌旁组织),3号样品(癌组织)具有阳性的样品溶解曲线,虽然3号癌组织甲基化的峰比例较低但可以识别,因此判断3号样品为阳性,2号患者的病理组织样品为典型的低比例甲基化的样品。如图7所示,4号患者的病理组织样品的熔解曲线显示,相比8号样品(癌旁组织),7号样品(癌组织)具有阳性的样品溶解曲线,7号癌组织甲基化的峰可以明显识别,因此判断7号样品为阳性,4号患者的病理组织样品为典型的高比例甲基化的样品。如图8所示,18号患者的病理组织样品的熔解曲线显示,相比36号样品(癌旁组织),35号样品(癌组织)的溶解曲线基本重合,无甲基化峰,因此判断35号样品为阴性,18号患者的病理组织样品为典型的阴性样品。
根据上述分析方法,得到通过MS-HRM方法检测20名患者的癌组织和癌旁组织(40份样品)的所述位点的DNA甲基化分析结果如下表2所示。
表2:
结果说明,所述20对肠癌患者样品中,其中至少有13对样品,可以通过NDRG4的新检测位点的MS-HRM分析方法中,发现甲基化的阳性信号,阳性率为65%。证实该位点确实存在鉴别部分肠癌特征的能力。
为了进一步证明上述方法的合理性,还涉及了使用参考品模拟不同比例甲基化的样品的甲基化检测情况。其中各组参考品中分别由不同比例的完全甲基化DNA——HCT116DNA和未甲基化DNA——gDNA组成,其具体含量为:
编号 | 配置 |
1 | 0%HCT116+100%gDNA |
2 | 1%HCT116+99%gDNA |
3 | 5%HCT116+95%gDNA |
4 | 25%HCT116+75%gDNA |
5 | 100%HCT116+0%gDNA |
上述5组参考品通过MS-HRM方法检测NDRG基因DNA甲基化标志物的熔解曲线如图9所示。熔解曲线中的Tm值确实如前述的分析方法所述的,存在明显不同的甲基化和非甲基化出峰位点,且峰高度与对应的DNA含量相关,即甲基化DNA(此处为HCT116 DNA)含量越高,熔解曲线中甲基化对应的峰高度越高。
结论:本发明所选取的NDRG4的四个甲基化位点构成的标志物与肠癌和腺瘤的的相关度高,可以作为早期筛查的靶标。
本发明提供的NDRG4基因的新甲基化标志物,以及针对这一标志物检测早期结直肠癌的方法,结合TaqMan-PCR方法、和/或MS-HRM方法等检测方法,可以仅使用一对引物和探针,实现高特异性高灵敏度的检测腺瘤和早期结直肠癌。
前述的示例仅是说明性的,用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围,且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此,申请人的用意是所附的权利要求并不被说明本申请的特征的示例的选择限制。如在权利要求中使用的,术语“包括”和其语意上的变体在逻辑上也包括不同和变化的用语,例如但不限于“基本组成为”或“组成为”。当需要时,提供了一些数值范围,而这些范围也包括了在其之间的子范围。这些范围中的变化也对于本领域技术人员也是自明的,且不应被认为被捐献给公众,而这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未被目前考虑的可能的等同物或子替换,且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (6)
1.一种检测早期结直肠癌和腺瘤的DNA甲基化标志物的试剂盒,其包括样品DNA提取试剂、DNA甲基化修饰转化试剂以及DNA甲基化标志物的PCR扩增试剂,所述DNA甲基化标志物是NDRG4基因中的CpG位点在SEQ ID NO.:1中所示序列中的第38位、第47位、第50位以及第52位中至少2个位点同时发生甲基化:
其中,所述序列编号是基于SEQ ID NO.1中所示序列:AAGCGGCAGGAGCAGCTCACAGCCAGGAGCGCTCTCCCGCCCCCAACGCCGCGCTCCCCCCTCCAAAACGGTTTAAAAAAATCCACCAATTGCATGGCC(SEQID No.:1)。
2.权利要求1所述的试剂盒,其中所述PCR扩增试剂包括用于扩增所述DNA甲基化标志物的引物对,以及任选地,靶向所述DNA甲基化标志物的探针。
3.权利要求2所述的试剂盒,其中所述引物对用于扩增SEQ ID No.:1所示的核苷酸区段。
4.权利要求2所述的试剂盒,其中所述引物对包括:
上游引物NDRG4-F1:
5’-AAGCGGTAGGAGTAGTTTATAGTTAGGAG-3’(SEQ ID No.:3);和/或
下游引物NDRG4-R1:
5’-GACCATACAATTAATAAATTTTTTTAAACC-3’(SEQ ID No.:4)。
5.权利要求2所述的试剂盒,其中所述探针的序列如SEQ ID No.:7所示:AACGCGACGTTAAAAACGA(SEQ ID No.:7)。
6.权利要求1所述的试剂盒,其中还包括荧光定量PCR试剂。
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