CN114150065B - 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用，涉及肿瘤检测技术领域。结直肠癌或癌前病变的标记物为：NTMT1基因CpG位点。通过NTMT1基因CpG位点的甲基化水平，可以实现结直肠癌或癌前病变的早期筛查或辅助诊断。NTMT1基因在粪便样本中对结直肠癌样本或癌前病变样本都具有很高的灵敏度和特异性。经验证，NTMT1基因甲基化的检测灵敏度和特异性远高于SDC2、TFPI2、MAP3K14‑AS1和Septine 9基因，且NTMT1基因在血液样本中对I/II期结直肠癌和进展期腺瘤的灵敏度及对肠道其他疾病的特异性也较优。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤检测技术领域，具体而言，涉及一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用。
背景技术
结直肠癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一，主要包括结肠癌与直肠癌两大类。国家癌症中心2019年发布的全国癌症统计数据显示，我国2015年结直肠癌的新发病例数为37.63万人，因结直肠癌死亡患者19.10万人，位于恶性肿瘤发病率第三位、死亡率第五位。而结直肠癌的预后与疾病诊断时的严重程度相关。
散发性结直肠癌主要按照正常-腺瘤-癌的顺序和模式进展，早期发现可以显着降低死亡率。结肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准，但由于肠道准备过程的侵入性和复杂性，其在平均风险人群中的依从性较低。粪便潜血试验(FOBT)和粪便免疫化学试验(FIT)是无创性的，但它们的敏感性不足，特别是对于I期结直肠癌和进展期腺瘤。
而异常的DNA甲基化可能出现在结直肠癌发生的非常早期的阶段，到目前为止，已经确定了一些结直肠癌甲基化生物标志物，包括SDC2、NDRG4、BMP3、VIM、SFRP2和Septine 9等。虽然发现的标志物很多，但真正商品化的很少，第一个基于粪便的结直肠癌检测产品是“Cologuard”，其检测靶标为血红蛋白、KRAS突变和两个甲基化基因(NDRG4和BMP3)，对结直肠癌的敏感性为92％，特异性为87％。研究显示，大众对于结直肠癌血液检测的接受度比结直肠癌粪便检测的接受度更高，目前已经商品化的血液检测标志物只有Septine 9，一项Meta分析(Diagnostic accuracy of methylated SEPT9 for blood-based colorectalcancer detection:a systematic review and meta-analysis.Clin TranslGastroenterol.2017；8(1):e216.)结果显示，Septine 9对于I期结直肠癌的灵敏性为45％，对于息肉的灵敏性为15％，导致其不太适合用于结直肠癌的筛查检测，因此需要进一步寻找适用于血液的甲基化标志物及其组合。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种结直肠癌或癌前病变的标记物在制备结直肠癌或癌前病变检测产品中的用途，标记物为：NTMT1基因CpG位点。
基于现有技术针对结直肠癌或血液样本存在检测灵敏度低、特异性差的问题，发明人提出一种新的标记物，NTMT1基因在粪便样本中对结直肠癌样本或癌前病变样本都具有很高的灵敏度，分别在90％和70％以上，对于正常样本的特异性也大于95％。经验证，NTMT1基因甲基化的检测灵敏度和特异性远高于SDC2、TFPI2、MAP3K14-AS1和Septine 9基因，且NTMT1基因在血液样本中对I/II期结直肠癌和进展期腺瘤的灵敏度及对肠道其他疾病的特异性也较优。
NTMT1中文名称为N-末端甲基转移酶1，N-Terminal Xaa-Pro-Lysmethyltransferase 1。
癌前病变为结直肠腺瘤、腺瘤病、炎症性肠病相关异型增生、传统锯齿状腺瘤、广基锯齿状腺瘤或广基锯齿状息肉。
在其他实施方式中，癌前病变包括不限于：溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)等其他肠道疾病。
结直肠腺瘤包括不限于：管状腺瘤、绒毛状腺瘤或绒毛管状腺瘤。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述标记物还包括MAP3K14-AS1基因CpG位点。
发明人发现，当NTMT1和MAP3K14-AS1基因组合时，能显著提升结直肠癌或癌前病变的检测灵敏性，且保持较高的检测特异性。因此，NTMT1基因与MAP3K14-AS1基因的组合检测可用于血液样本中，由此可减小取样带来的人体创伤，提高检测试剂的普及性，为结直肠癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。
经验证，NTMT1基因和MAP3K14-AS1基因组合时，针对结直肠癌样本的检测灵敏度超过85％。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测产品选自如下产品中的至少一种：试剂、试剂盒、芯片和测序文库。上述试剂的形态包括不限于：液体、粉剂、颗粒剂、乳液、悬浮液。
上述试剂和试剂盒中还可以包含其他可接受的成分。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述NTMT1基因的CpG位点位于Chr9:129620154-129620726区域中。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述MAP3K14-AS1基因的CpG位点位于Chr17:45261758-45262465区域中。
上述标记物的区域是以hg38基因组为参比基因组，发明人发现，结直肠癌或癌前病变血液样本、粪便样本在上述区域的CpG位点存在高甲基化，通过检测这个区域的甲基化水平，即可判断对该样本进行判读。
本发明提供了一种用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其包括用于检测NTMT1基因甲基化的第一核酸组合，第一核酸组合包括引物对1，引物对1的碱基序列与SEQID NO.1-2所示的碱基序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述其包括用于检测MAP3K14-AS1基因甲基化的第二核酸组合，第二核酸组合包括引物对2，引物对2的碱基序列与SEQ ID NO.3-4所示的碱基序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第二核酸组合还包括与SEQ ID NO.6所示的碱基序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的一致性的探针2。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸组合还包括与SEQ ID NO.5所示的碱基序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的一致性的探针1。
在一种可选的实施方式中，在上述探针的5’端标记有荧光报告基团，在上述探针的3’端标记有荧光猝灭基团，通过荧光标记以便于更好的实现信号的放大，实现高灵敏度地检测。一种实施方式中，上述探针为Taqman探针。
上述荧光报告基团为HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、CY3、CY5、Texas Red、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团为MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性PCR法、测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flapendonuclease法。
上述flap endonuclease法是一种依赖于酶切产生的瓣膜(Flap)序列的荧光定量PCR方法，通常包括三个反应，FEN1酶切产生Flap序列的反应、PCR反应、Flap序列结合到FRET cassette上产生荧光，具体参见文献US8361720B2和Allawi,et al.,“Invader PlusMethod Detects Herpes Simplex Virus in Cerebrospinal Fluid and SimultaneouslyDifferentiates Types 1and 2”,J Clin Microbiol.,2006,44:3443-7。
上述测序法选自亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序法或焦磷酸测序法。
本发明还提供了一种试剂或试剂盒，其包括上述用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂或试剂盒的还包括检测内参基因的第三核酸组合；第三核酸组合与SEQ ID NO.7-8所示的碱基序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的一致性。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述第三核酸组合还包括与SEQ ID NO.9所示的碱基序列具有至少90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的一致性的探针3。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂或试剂盒的检测样本为粪便样本或血液样本。血液样本包括不限于全血、血清、血浆或血细胞。
术语“甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
本发明具有以下有益效果：
发明人基于现有技术针对结直肠癌或血液样本存在检测灵敏度低、特异性差的问题，提出了一种新的标记物，NTMT1基因在粪便样本中对结直肠癌样本或癌前病变样本都具有很高的灵敏度，分别在90％和70％以上，其对于正常样本的特异性也大于95％。经验证，NTMT1基因甲基化的检测灵敏度和特异性远高于SDC2、TFPI2、MAP3K14-AS1和Septine 9基因，且NTMT1基因在血液样本中对I/II期结直肠癌和进展期腺瘤的灵敏度及对肠道其他疾病的特异性也较优。
另外，本发明还提供了用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，该核酸组合检测特异性好，灵敏度高。可以避免避免肠道其他疾病的干扰导致的假阳性。可以用于制备检测试剂、试剂盒，具有良好的应用前景，本发明为结直肠癌的无创诊断提供了一种新思路。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其包括第一核酸组合。
第一核酸组合包括引物对1(包括上游引物和下游引物)和探针1，引物对1的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示；探针1的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
NTMT1上游引物：TAGTAGGGATCGTAGTAGTTTTCGT，SEQ ID NO.1；
NTMT1下游引物：ACGCCAAACCCGAAATAAAC，SEQ ID NO.2；
NTMT1探针：TCGTCGGGTCGCGGTGAGTAA；SEQ ID NO.5。
实施例2
本实施例提供了一种结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其包括第二核酸组合。
第二核酸组合包括引物对2和探针2，引物对2的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示，探针2的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
MAP3K14-AS1上游引物：GTGAGAGTATATGGGTGTGTATCGC，SEQ ID NO.3；
MAP3K14-AS1下游引物：CTAAAAAACAAATCGACCCGC，SEQ ID NO.4；
MAP3K14-AS1探针：AGGGGTTGAGGTTGGGAGTCGTAGT；SEQ ID NO.6。
实施例3
本实施例提供了一种结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其包括实施例1中的第一核酸组合和实施例2中的第二核酸组合。
实施例4
本实施例提供用甲基化特异性PCR方法检测基因在粪便样本和血液样本中的甲基化水平的方法，具体步骤包括：
(1)DNA模板的提取。
当所用样本是粪便样本时，采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20200225号)分别提取粪便中的人源NTMT1基因、SDC2基因、TFPI2基因、MAP3K14-AS1基因和内参基因ACTB基因，该试剂盒采用捕获探针对粪便中的目的片段进行捕获，捕获探针上标记有生物素，将10μM的不同区域的探针和10mg/mL的链霉亲和素磁珠等体积混合，形成捕获剂。使用时用表1中的捕获探针与链霉亲和素混合形成的捕获剂替代试剂盒中自带的捕获剂即可。各个基因的捕获探针序列参见表1，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
表1.实施例中涉及的捕获探针。
| 目的基因 | 捕获探针 | 序列编号 |
| NTMT1 | AGGCGCGTGGCCAGGGAGGACCCCGACTTCTT | SEQ ID NO.10 |
| SDC2 | CTCACTTGTTGGTTTCTGCACTCCCGACA | SEQ ID NO.11 |
| TFPI2 | TGGCGGGAGGAGGTGCGCGGCTTTCTGCTCCA | SEQ ID NO.12 |
| MAP3K14-AS1 | GCACACCCATGTGCTCTCACGGACACGCA | SEQ ID NO.13 |
| Septine 9 | TGCGCCTGCAAGGGTTAAACGGCAGCGCAC | SEQ ID NO.14 |
| ACTB | TGGGTCTGCGCTGTAAGAGTTGGTTGCC | SEQ ID NO.15 |
当所用样本是血液样本，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，所用血浆体积为1.5mL,具体操作参见试剂盒说明书,提取完成后，用50μL纯化水进行洗脱。
(2)亚硫酸盐的转化。
将提取好的全部基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843)，具体实验操作参见试剂盒说明书，转化完成后，用30μL纯化水进行洗脱。
(3)甲基化特异性PCR反应。
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测目的基因NTMT1、SDC2、TFPI2、MAP3K14-AS1和Septine 9基因在粪便样本和血液样本中的甲基化水平，每个基因单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个基因的检测引物和探针，同时加入内参基因ACTB的检测探针。各个基因的上下游引物及探针序列如表2所示。
表2各基因引物探针序列
检测目的基因的探针均为Taqman探针，5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，内参基因ACTB的探针5’端报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
PCR反应体系各组分配方如表3所示。
表3.PCR反应体系中各组分配方成分表。
PCR反应条件如表4和表5所示，其中表4为粪便样本DNA的PCR反应条件，表5为血液样本DNA的PCR反应条件。
表4粪便样本DNA的PCR反应条件。
表5血液样本DNA的PCR反应条件。
阴性对照和阳性对照：在对各个目的基因分别进行检测时，应在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。阴性对照为纯化水。阳性对照为人工合成质粒，阳性对照的制备方法为：将完全甲基化的各目的基因的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列(即各扩增区域中除了CG二核苷酸中的C保持不变外，其余位置的C均变成T，其他三种碱基的种类和位置保持不变)进行人工合成，并克隆至载体pUC57上，形成人工合成质粒，将质粒稀释到103拷贝/微升。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照的Ct值均应在26-30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤36，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
(4)PCR结果分析。
对于粪便样本，若某一目的基因在样本上的Ct值≤38，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阳性，若某一目的基因在样本上的Ct值>38，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阴性；对于血液样本，若某一目的基因在样本上的Ct值≤48，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阳性，若某一目的基因在样本上的Ct值>48，则认为该目的基因在该样本中为甲基化阴性。当评价两个基因联合时的检测效果时，只要至少一个基因在样本中为甲基化阳性，则认为该基因组合在该样本中为甲基化阳性，当两个基因在样本中均为甲基化阴性时，则认为该基因组合在该样本中为甲基化阴性，将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的灵敏度和特异性：
在本实施例中，灵敏度为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。
实验例1
为了验证本发明实施例提供的结直肠癌的检测和诊断的试剂检测粪便样本的有效性，本发明还提供了实验例1：
于武汉某医院收集经肠镜和组织活检确诊为结直肠癌患者、腺瘤患者和健康人的粪便样本，每人收集一份粪便，收集装置为武汉艾米森粪便标本采集保存管(鄂汉械备20191654号)，共收集到结直肠癌患者粪便样本80例、结直肠腺瘤患者粪便样本57例、健康人的粪便样本98例。选用实施例4中的针对粪便样本基因组提取、亚硫酸氢盐转化、甲基化特异性PCR和PCR结果分析的方法对单个目的基因进行PCR检测，PCR检测结果如表6所示。
表6各目的基因在粪便样本中的检测灵敏度和特异性。
由表6可以看出，NTMT1、TFPI2和Septine 9这三个基因对于80例结直肠癌粪便样本的检测灵敏度均不低于90％，高于SDC2和MAP3K14-AS1这两个基因，五个基因对于57例结直肠腺瘤粪便样本的检测灵敏度差别较大，在40％-75％之间，其中NTMT1基因的灵敏度最高，为71.93％。在98例健康人粪便样本中，检测特异性大于95％的基因有三个，分别为NTMT1基因、SDC2基因和MAP3K14-AS1基因。综合来看，NTMT1在粪便样本中的检测灵敏度和特异性最优。
实验例2
与实验例1不同的是，实验例2采用的是血浆样本，于郑州某医院收集88例临床I期或II期结直肠癌患者、23例进展期腺瘤患者、54例肠道良性疾病和7例肠道其他肿瘤患者的血浆样本，按照实施例4中的针对血液样本进行基因组提取(每个样本的血浆用量为1mL)、亚硫酸氢盐转化、甲基化特异性PCR和PCR结果分析，对单个目的基因的PCR检测效果进行总结，如表7所示。
表7单个基因在血液样本中的检测灵敏度和特异性。
从表7的结果可以看出，在5个目的基因中，SDC2对88例结直肠癌和23例进展期腺瘤的灵敏度最低，TFPI2对结直肠癌样本和进展期腺瘤样本的灵敏度最高，但TFPI2对54例肠道良性疾病的特异性只有83.33％，对7例肠道其他肿瘤的特异性只有71.33％，表明TFPI2在血浆样本中不能将结直肠癌/进展期腺瘤样本和肠道良性疾病/肠道其他肿瘤有效区分开来。
综合来看，NTMT1基因、MAP3K14-AS1基因和Septine 9基因的检测灵敏度和特异性均较好，它们对结直肠癌的检测灵敏度均大于60％，对进展期腺瘤的检测灵敏度均在25％以上(其中NTMT1和MAP3K14-AS1的检测灵敏度均在30％以上)，对54例肠道良性疾病的特异性均在90％以上(其中NTMT1和MAP3K14-AS1的特异性均在95％以上)，对7例肠道其他肿瘤的检测特异性均为100％。
进一步地，评估在血液样本中灵敏度和特异性均较好的三个基因，即NTMT1基因、MAP3K14基因和Septine 9基因两两组合时、及NTMT1基因分别与SDC2或TFPI2基因组合时对于88例结直肠癌样本、23例进展期腺瘤样本、54例肠道良性疾病样本和7例肠道其他肿瘤样本的检测灵敏度和特异性，结果如表8所示。
表8两个基因组合在血液样本中的检测灵敏度和特异性
从表8的结果可以看出，当基因两两组合时，对于88例结直肠癌样本和23例进展期腺瘤样本的检测灵敏度均大幅提升，但当Septine 9基因和NTMT1/MAP3K14-AS1基因组合时，在54例肠道良性疾病样本中的特异性下降到90％以下。NTMT1基因和MAP3K14-AS1基因组合时的检测效果最优，对88例结直肠癌样本的检测灵敏度为85.23％，对23例进展期腺瘤的检测灵敏度为56.52％，在54例肠道良性疾病中的特异性为96.3％，在7例肠道其他肿瘤中的检测特异性为100％，NTMT1基因和TFPI2基因组合对于腺瘤的检测灵敏度也在50％以上，但二者组合检测对于肠道良性疾病和肠道其他肿瘤的特异性较差，以上结果表明NTMT1基因和MAP3K14-AS1二者的组合在结直肠癌样本及作为结直肠癌前病变的进展期腺瘤样本中为高甲基化阳性率，同时又能避免肠道其他疾病如良性疾病或其他肿瘤的干扰。
综上，在粪便样本中，NTMT1基因甲基化的检测灵敏度和特异性最优，优于SDC2、TFPI2、MAP3K14-AS1和Septine 9基因，且NTMT1在血液样本中对I/II期结直肠癌和进展期腺瘤的灵敏度及对肠道其他疾病的特异性也较优，当NTMT1和MAP3K14组合时，能显著提升灵敏性，且能保持较好的特异性，因此NTMT1基因甲基化检测可应用于粪便和血液样本中。而NTMT1基因与MAP3K14-AS1基因的组合检测可用于血液样本中，由此可减小取样创伤，提高检测试剂的普及性，为结直肠癌的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 一种结直肠癌或癌前病变的标记物及其应用
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tagtagggat cgtagtagtt ttcgt 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgccaaacc cgaaataaac 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgagagtat atgggtgtgt atcgc 25
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaaaaaaca aatcgacccg c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgtcgggtc gcggtgagta a 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aggggttgag gttgggagtc gtagt 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aataacaccc ccaccctgc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggagtggttt ttgggtttg 19
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aggcgcgtgg ccagggagga ccccgacttc tt 32
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ctcacttgtt ggtttctgca ctcccgaca 29
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggcgggagg aggtgcgcgg ctttctgctc ca 32
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gcacacccat gtgctctcac ggacacgca 29
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgcgcctgca agggttaaac ggcagcgcac 30
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgggtctgcg ctgtaagagt tggttgcc 28
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gagtattaat ttcgtgtcgg gagtg 25
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
taccgcaacg attacgactc aaac 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caactacgcc ccgaaaacgc 20
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtttttttag ggcgttttcg tttgg 25
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ccgccgaaac gaaacctaaa a 21
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ttcatacacg aaaactatca ccccg 25
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tcgttggtgt tatgggattc 20
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cgctctacgc ctacaaaaat taaac 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcggtttttg agtttatagg tcggg 25
Claims (14)
1.检测结直肠癌或癌前病变的标记物甲基化水平的试剂在制备结直肠癌或癌前病变检测产品中的用途，其特征在于，所述标记物为：NTMT1基因CpG位点，以hg38基因组为参比基因组，所述NTMT1基因的CpG位点位于Chr9:129620154-129620726区域中。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标记物还包括MAP3K14-AS1基因CpG位点；以hg38基因组为参比基因组，所述MAP3K14-AS1基因的CpG位点位于Chr17:45261758-45262465区域。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述检测产品选自如下产品中的至少一种：
试剂和试剂盒。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述检测产品选自芯片。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述检测产品选自测序文库。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述癌前病变为结直肠腺瘤。
7.一种用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其特征在于，其包括用于检测NTMT1基因甲基化的第一核酸组合，所述第一核酸组合包括引物对1，所述引物对1的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示。
8.根据权利要求7所述的用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其特征在于，还包括用于检测MAP3K14-AS1基因甲基化的第二核酸组合，所述第二核酸组合包括引物对2，所述引物对2的碱基序列如SEQ ID NO.3-4所示。
9.根据权利要求8所述的用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，所述第二核酸组合还包括如SEQ ID NO.6所示的碱基序列的探针2。
10.根据权利要求7所述的用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合，其特征在于，所述第一核酸组合还包括如SEQ ID NO.5所示的碱基序列的探针1。
11.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求7-10任一项所述的用于结直肠癌或癌前病变检测的核酸组合。
12.根据权利要求11所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒的还包括检测内参基因的第三核酸组合；所述第三核酸组合的碱基序列如SEQ ID NO.7-8所示。
13.根据权利要求12所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述第三核酸组合还包括如SEQ ID NO.9所示的碱基序列的探针3。
14.根据权利要求11所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒的检测样本为粪便样本或血液样本。
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