CN115948561B

CN115948561B - 一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115948561B
Application number: CN202310116115.6A
Authority: CN
Inventors: 周俊; 董兰兰; 熊杨辉; 郑义慧; 张良禄
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2023-02-10
Filing date: 2023-02-10
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2043-02-10
Also published as: CN115948561A

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用。本发明提供的食管鳞癌检测试剂盒，通过检测样本中目标区域的甲基化水平，可有效区分食管鳞癌患者和健康人，其诊断食管鳞癌患者血浆样本的敏感度可达97％，其检测健康人血浆样本的特异性可达94.3％。本发明提供的目标区域可以作为食管鳞癌的生物标志物，用于食管鳞癌患者的诊断或辅助诊断，具有良好的敏感度和特异性，提高了食管鳞癌的检出率。

Description

一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用。

背景技术

食管癌是全球第八大常见癌症类型，死亡率在所有癌症类型中排第六位，5年生存率<20％。食管恶性肿瘤包括食管腺癌和食管鳞状细胞癌(ESCC)两种主要亚型。其中ESCC是由鳞状上皮恶性转化的细胞团块所组成，不规则地向真皮内浸润，周围一般伴有淋巴细胞和浆细胞浸润。

ESCC患者通常表现为吞咽困难和体重减轻，出现相应症状时通常处于疾病晚期，预后不良，所以针对食管鳞癌的早诊早治是非常必要的。目前常规检查中的一些异常可能提示ESCC的存在，但诊断的金标准仍然是内镜检查及活检。ESCC病变主要位于食管中部，在内镜检查中表现为斑块、结节、糜烂和易碎区，更严重的病变可出现溃疡并呈周向外观。尽管在临床中，通过内镜直接显示肿块几乎可以确定肿瘤的可能性，但必须对病变进行活检，通过组织学检测上皮内瘤变(不确定的、低级别的或高级别的，后两者被认为是ESCC的癌前前体)或ESCC，以及肿瘤分化状态来确认诊断。除了传统的内镜检查，人们还发明了多种技术来加强对食道癌变的检测，如进行肿瘤相关标志物(鳞状细胞癌抗原)检查、食管吞钡X线检查等，但是内镜检查属于侵入性检查，患者依从性差；而抗原检查、X线检查的准确性有待商榷。这些现存检查方式存在的种种不足导致食管鳞癌无法实现大规模的早诊早治。

1948年，Mandel和Metais发现人体血液中存在循环游离DNA(cfDNA)，研究发现，癌症患者血液样本中的cfDNA含量高于健康个体的血液样本，肿瘤来源的cfDNA，称为循环肿瘤DNA(ctDNA)，ctDNA中含有肿瘤特异性的遗传改变和表观遗传学改变，可以用作癌症检测的标志物。其中，DNA甲基化水平异常是癌症发生的早期事件，可以用于早期食管癌检测。由于cfDNA在血液中具有含量少、提取困难、存在周期短等缺点，且血液中的cfDNA来源于全身各个组织，很多标志物在多种类型的癌症中均会出现甲基化异常，因此寻求肿瘤特异性的甲基化生物标志物充满挑战，目前尚缺乏可用于食管癌检测的血液甲基化生物标志物。

现有技术CN113789388A和CN113637754A公开的一些用于食管癌检测的甲基化标志物一定程度上能够区分食管鳞癌或食管健康受试者，但是这些甲基化标志物诊断食管鳞癌血液样本的检测敏感度和检出率偏低，仍然需要进一步提高。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒及其应用，以解决现有技术用于食管鳞癌检测的甲基化标志物少、对食管鳞癌的检出率低、检测的敏感度欠佳等的技术问题，尤其适用于食管鳞癌的高敏感度检测。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂，所述试剂用于检测样本中目标区域的甲基化水平，所述目标区域选自如下至少一种区域的全长或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8、区域9和区域10；

以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域1选自Chr6:42050176-42050352正链，所述区域2选自Chr3:98733928-98734059负链，所述区域3选自Chr14:87992619-87992797负链，所述区域4选自Chr3:156291518-156291694负链，所述区域5选自Chr19:11888420-11888590正链，所述区域6选自Chr1:65264752-65264945正链，所述区域7选自Chr6:26183662-26183831正链，所述区域8选自Chr10:11742012-11742176正链，所述区域9选自Chr12:113462547-113462755负链，所述区域10选自Chr19:53254485-53254661正链。

优选地，所述试剂包括用于检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，可选地，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针。

优选地，所述试剂包括以下所述引物对中的至少一组，优选地，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针：

用于检测Chr6:42050176-42050352正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对；进一步优选地，还包括与所述第一引物对对应的第一检测探针；

用于检测Chr3:98733928-98734059负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对；进一步优选地，还包括与所述第二引物对对应的第二检测探针；

用于检测Chr14:87992619-87992797负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对；进一步优选地，还包括与所述第三引物对对应的第三检测探针；

用于检测Chr3:156291518-156291694负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对；进一步优选地，还包括与所述第四引物对对应的第四检测探针；

用于检测Chr19:11888420-11888590正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对；进一步优选地，还包括与所述第五引物对对应的第五检测探针；

用于检测Chr1:65264752-65264945正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对；进一步优选地，还包括与所述第六引物对对应的第六检测探针；

用于检测Chr6:26183662-26183831正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第七引物对；进一步优选地，还包括与所述第七引物对对应的第七检测探针；

用于检测Chr10:11742012-11742176正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第八引物对；进一步优选地，还包括与所述第八引物对对应的第八检测探针；

用于检测Chr12:113462547-113462755负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第九引物对；进一步优选地，还包括与所述第九引物对对应的第九检测探针；

用于检测Chr19:53254485-53254661正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第十引物对；进一步优选地，还包括与所述第十引物对对应的第十检测探针。

优选地，所述试剂包括如下核酸分子组合中的至少一种：

第一核酸分子组合，包括所述第一引物对和所述第六引物对，进一步优选还包括所述第一检测探针和所述第六检测探针；第二核酸分子组合，包括所述第四引物对和所述第八引物对，进一步优选还包括所述第四检测探针和所述第八检测探针；第三核酸分子组合，包括所述第九引物对和所述第十引物对，进一步优选还包括所述第九检测探针和所述第十检测探针；第四核酸分子组合，包括所述第二引物对和所述第六引物对，进一步优选还包括所述第二检测探针和所述第六检测探针；第五核酸分子组合，包括所述第七引物对和所述第八引物对，进一步优选还包括所述第七检测探针和所述第八检测探针；第六核酸分子组合，包括所述第一引物对和所述第八引物对，进一步优选还包括所述第一检测探针和所述第八检测探针；第七核酸分子组合，包括所述第二引物对和所述第七引物对，进一步优选还包括所述第二检测探针和所述第七检测探针。

进一步优选地，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.24～25所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27～28所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30～31所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33～34所示，所述第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述第六引物对的核苷酸序列如SEQID NO.36～37所示，所述第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.39～40所示，所述第七检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.41所示；所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.42～43所示，所述第八检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.45～46所示，所述第九检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.48～49所示，所述第十检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示。

优选地，所述样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本。

按照本发明的另一个方面，提供了一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，包括所述的试剂。

优选地，所述的检测试剂盒，还包括PCR反应试剂、甲基化转化试剂、扩增内参基因的引物对以及标记所述内参基因的探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或多种。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的试剂或所述的检测试剂盒在制备食管鳞癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明提供的一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂，通过检测样本中目标区域的甲基化水平，可以有效区分食管鳞癌患者和食管健康受试者，对食管鳞癌具有较高的诊断敏感度和特异性。

(2)本发明提供的一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，通过检测样本中目标区域的甲基化水平，不仅可以有效区分食管鳞癌和食管健康受试者，且相对于现有技术显著提高了食管鳞癌的检测敏感度和检出率，可以用于食管鳞癌的早诊早治。本发明提供的检测试剂盒检测食管鳞癌的敏感度最高可达97％，检测健康人的特异性最高可达94.3％。

(3)本发明优选实施例中通过将单一目标区域组合，检测组合区域的甲基化水平，实验发现其检测食管鳞癌的敏感度或特异性较单一区域有显著提高，其中通过检测区域4和区域8组合的甲基化水平联合诊断食管鳞癌的敏感度可达97％。

综上，本发明提供了一些能够用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的检测试剂，可用于食管鳞癌患者的检测诊断，具有良好的敏感度和特异性，对于食管鳞癌非介入性检测、早期筛查及改善患者预后具有重要意义。

附图说明

图1为区域1检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图2为区域2检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图3为区域3检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图4为区域4检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图5为区域5检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图6为区域6检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图7为区域7检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图8为区域8检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图9为区域9检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图10为区域10检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图11为A组合(区域3+区域4)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图12为B组合(区域3+区域5)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图13为C组合(区域1+区域6)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图14为D组合(区域2+区域6)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图15为E组合(区域4+区域8)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图16为F组合(区域7+区域8)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图17为G组合(区域9+区域10)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图18为H组合(区域1+区域8)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

图19为I组合(区域2+区域7)检测食管鳞癌血液样本的ROC曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明使用术语“或”、“至少一种”时通常包括“和/或”的含义，除非内容中有明确相反的指示。

术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。

术语“基因”是指编码产生氨基酸多肽链的DNA区段，它包括参与基因转录/翻译和转录/翻译调控的位于编码区和非编码区的序列，以及外显子和内含子序列。

术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。

术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。

术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。

术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物，若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38)，则表明目标序列是甲基化的。

术语“甲基化特异性荧光定量PCR(QMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是q-MSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在q-MSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，q-MSP检测DNA甲基化水平的敏感度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。

术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。

术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，其是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大越好；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。

本发明提供了一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂，所述试剂用于检测样本中目标区域的甲基化水平，所述目标区域选自如下至少一种区域的全长或部分区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8、区域9和区域10；

本申请的发明人发现，上述目标区域在食管鳞癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，通过检测样本中至少一种上述目标区域的甲基化水平，可以有效区分食管鳞癌患者和健康人，可以为受试者(对象)在诊断或辅助诊断食管鳞癌方面提供参考。

一些实施例中，所述区域1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述区域2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述区域3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述区域4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述区域5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述区域6的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述区域7的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述区域8的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述区域9的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述区域10的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

在本申请的实施例中，所述试剂包括可PCR扩增上述目标区域核苷酸序列的引物对及检测探针。本申请中，所述试剂包括的引物对及检测探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对及探针，只要可以实现检测上述核苷酸序列是否发生甲基化的目的即可。

一些实施例中，所述试剂包括用于检测所述目标区域的甲基化水平的引物对，可选地，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针。

一些实施例中，所述试剂包括以下所述引物对中的至少一组，较佳实施例中，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针：

用于检测Chr6:42050176-42050352正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第一引物对；较佳地，还包括与所述第一引物对对应的第一检测探针；

用于检测Chr3:98733928-98734059负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第二引物对；较佳地，还包括与所述第二引物对对应的第二检测探针；

用于检测Chr14:87992619-87992797负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第三引物对；较佳地，还包括与所述第三引物对对应的第三检测探针；

用于检测Chr3:156291518-156291694负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第四引物对；较佳地，还包括与所述第四引物对对应的第四检测探针；

用于检测Chr19:11888420-11888590正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第五引物对；较佳地，还包括与所述第五引物对对应的第五检测探针；

用于检测Chr1:65264752-65264945正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第六引物对；较佳地，还包括与所述第六引物对对应的第六检测探针；

用于检测Chr6:26183662-26183831正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第七引物对；较佳地，还包括与所述第七引物对对应的第七检测探针；

用于检测Chr10:11742012-11742176正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第八引物对；较佳地，还包括与所述第八引物对对应的第八检测探针；

用于检测Chr12:113462547-113462755负链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第九引物对；较佳地，还包括与所述第九引物对对应的第九检测探针；

用于检测Chr19:53254485-53254661正链区域内全长或部分区域的甲基化水平的第十引物对；较佳地，还包括与所述第十引物对对应的第十检测探针。

一些实施例中，所述试剂能够检测如下至少一种所述目标区域的一个或多个甲基化的胞嘧啶位点：

所述区域1的Chr6:42050177、Chr6:42050200、Chr6:42050235、Chr6:42050240、Chr6:42050252、Chr6:42050328、Chr6:42050334和Chr6:42050336至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域2的Chr3:98734059、Chr3:98734051、Chr3:98734036、Chr3:98733969、Chr3:98733949和Chr3:98733937至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域3的Chr14:87992797、Chr14:87992785、Chr14:87992776、Chr14:87992677、Chr14:87992662、Chr14:87992629和Chr14:87992627至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域4的Chr3:156291677、Chr3:156291671、Chr3:156291623、Chr3:156291610、Chr3:156291531、Chr3:156291521和Chr3:156291519至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域5的Chr19:11888420、Chr19:11888427、Chr19:11888504、Chr19:11888510、Chr19:11888571和Chr19:11888576至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域6的Chr1:65264754、Chr1:65264761、Chr1:65264798、Chr1:65264811、Chr1:65264817和Chr1:65264941至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域7的Chr6:26183671、Chr6:26183682、Chr6:26183737、Chr6:26183816、Chr6:26183822和Chr6:26183827至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域8的Chr10:11742016、Chr10:11742018、Chr10:11742035、Chr10:11742059、Chr10:11742082和Chr10:11742152至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域9的Chr12:113462750、Chr12:113462736、Chr12:113462605、Chr12:113462603、Chr12:113462596、Chr12:113462586、Chr12:113462561和Chr12:113462555至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化；

所述区域10的Chr19:53254485、Chr19:53254505、Chr19:53254567、Chr19:53254570、Chr19:53254572、Chr19:53254579、Chr19:53254637、Chr19:53254648和Chr19:53254657至少一个位置上的胞嘧啶的甲基化。

实验中发现，将本发明中上述目标区域进行组合，检测目标区域组合的甲基化水平时，采用本发明检测试剂检测食管鳞癌的敏感度相对于检测单一目标区域时有所提高。较佳的组合包括但不限于：区域1和区域6的组合，区域4和区域8的组合，区域9和区域10的组合，区域2和区域6的组合，区域7和区域8的组合，区域1和区域8的组合，区域2和区域7的组合。

与此相对应地，本发明用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂中包括如下核酸分子组合中的至少一种：第一核酸分子组合，包括所述第一引物对和所述第六引物对，较佳实施例中还包括所述第一检测探针和所述第六检测探针；第二核酸分子组合，包括所述第四引物对和所述第八引物对，较佳实施例中还包括所述第四检测探针和所述第八检测探针；第三核酸分子组合，包括所述第九引物对和所述第十引物对，较佳实施例中还包括所述第九检测探针和所述第十检测探针；第四核酸分子组合，包括所述第二引物对和所述第六引物对，较佳实施例中还包括所述第二检测探针和所述第六检测探针；第五核酸分子组合，包括所述第七引物对和所述第八引物对，较佳实施例中还包括所述第七检测探针和所述第八检测探针；第六核酸分子组合，包括所述第一引物对和所述第八引物对，较佳实施例中还包括所述第一检测探针和所述第八检测探针；第七核酸分子组合，包括所述第二引物对和所述第七引物对，较佳实施例中还包括所述第二检测探针和所述第七检测探针。

一些实施例中，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.24～25所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27～28所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30～31所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33～34所示，所述第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述第六引物对的核苷酸序列如SEQID NO.36～37所示，所述第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.39～40所示，所述第七检测探针的核苷酸序列如SEQIDNO.41所示；所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.42～43所示，所述第八检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述第九引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.45～46所示，所述第九检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.48～49所示，所述第十检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示。

一些实施例中，本发明用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂可以制备为如下检测产品中的至少一种：试剂、试剂盒、芯片和测序文库。可选地，所述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。

一些实施例中，所述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。

本发明还提供了一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括上述试剂。一些实施例中，所述检测试剂盒还包括扩增内参基因的引物对以及所述引物对对应的探针。

一些实施例中，所述内参基因为ACTB，所述扩增内参基因ACTB的引物对包括上游扩增引物和下游扩增引物，其中上游扩增引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQIDNO.51)，下游扩增引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.52)，所述扩增内参基因ACTB的引物对对应的探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.53)。

一些实施例中，本发明所用检测探针均为TaqMan探针，所述检测探针和所述内参基因的检测引物对对应的探针均含有荧光报告基因和荧光淬灭基因，其中检测探针的5’端包含有荧光报告基团，所述荧光报告基团包括FAM、ROX、CY5、VIC中的任意一种；检测探针的3’端包含有荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团包括MGB、BHQ1、BHQ-2、BHQ-3中的任意一种。

一些实施例中，所述检测试剂盒还包括扩增试剂(PCR反应试剂)、甲基化转化试剂、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、质控品、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

一些实施例中，所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或多种。所述甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测试剂盒的检测样本包括不限于血浆样本、血清样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本。

本发明还提供了一种通过检测样本中目标区域的甲基化水平来诊断或辅助诊断食管鳞癌的方法，包括如下步骤：1)提取受试者的血浆DNA并用亚硫酸氢盐处理；2)以经转化和纯化的血浆DNA为模板，加入用于检测食管鳞癌的目标区域甲基化水平的引物对和所述引物对对应的检测探针，以及试剂盒其他组分，进行PCR反应，获得血浆样本中扩增目标区域的Ct值；3)根据血浆样本中扩增目标区域的Ct值与扩增内参基因的Ct值的差值(ΔCt)判断该样本是否为食管鳞癌阳性样本。

本发明还提供了所述试剂以及所述检测试剂盒在制备食管鳞癌检测产品中的应用。实验证明本发明目标区域1～10的甲基化水平与食管鳞癌有重要关联，上述目标区域是否发生甲基化可以特异性地指示受试者是否患有食管鳞癌，为食管鳞癌的诊断或辅助诊断提供了一种有效的检测试剂。本发明进一步提供了通过检测样本中目标区域的甲基化水平诊断或辅助诊断食管鳞癌的方法，及基于上述方法制备的用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂、检测试剂盒，可用于食管鳞癌患者的诊断及辅助诊断。本发明提供的检测试剂盒可有效区分食管鳞癌患者和健康人，其诊断食管鳞癌患者血浆样本的敏感度可达97％，其检测健康人血浆样本的特异性可达94.3％。需要说明的是，基于人类疾病诊断的复杂性，本发明所述的食管鳞癌检测试剂盒所获得的结果仅作为食管鳞癌诊断的中间结果或提示患者患有食管鳞癌的可能性或风险，还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患食管鳞癌的结论。

以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。

实施例1甲基化特异性荧光定量法(qMSP)检测目标区域的甲基化水平

以GRCh38.p14为参考基因组，以Chr6：42050176-42050352bp、Chr3:98733928-98734059bp、Chr14:87992619-87992797bp、Chr3:156291518-156291694bp、Chr19:11888420-11888590bp、Chr1:65264752-65264945bp、Chr6:26183662-26183831bp、Chr10:11742012-11742176bp、Chr12:113462547-113462755bp、Chr19:53254485-53254661bp的正链或负链DNA分子为模板设计适用于荧光定量PCR扩增的甲基化引物对和检测探针。

具体的实验步骤包括：

1.样本DNA的提取

收集抗凝血样本，离心后取上层血浆，用于提取血浆游离DNA。使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2.样本DNA的转化和纯化

样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作步骤参见试剂盒说明书。

3.甲基化特异性荧光定量PCR

1)甲基化引物对和检测探针设计：

分别以各个目标区域经亚硫酸氢盐转化后的序列为模板，设计甲基化引物对和检测探针用以扩增目的区域目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示，用以扩增不同目标区域的甲基化引物对、检测探针的序列以及可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表2所示。

表1目标区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列

/>

表2检测引物对、检测探针的核苷酸序列及可检测的甲基化的胞嘧啶位点

/>

2)PCR扩增：

按照表3的配方配制甲基化荧光定量PCR反应体系，反应体系中用到的引物对和检测探针由上海生工生物合成，用到的模板为从各类样本中提取的且经亚硫酸氢盐转化的DNA。在每个PCR管中，除加入目标区域的引物对和检测探针以外，还需加入内参基因ACTB的引物对和检测探针。内参基因ACTB的上游扩增引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ IDNO.51)，下游扩增引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.52)，检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.53)。上述检测探针均为TaqMan探针，目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM，3’端的荧光淬灭基团为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。PCR反应体系配制结束后按照表4所示的反应程序进行扩增。

表3qMSP反应体系

表4qMSP反应程序

进行qPCR反应检测样本时，需要同时设置阴性对照和阳性对照，以保证实验体系是可靠的。阴性对照管：按照表3的配方配置PCR反应体系，但是模板为TE缓冲液。阳性对照管：按照表3的配方配置PCR反应体系，但是模板为含ACTB(转化后序列)和目标区域(转化后序列)的人工合成的质粒。阳性对照模板的制备方法：将ACTB基因经亚硫酸氢盐转化后的序列和各个目标区域经亚硫酸氢盐转化后的序列分别克隆至pUC57上，形成人工合成质粒，将各个质粒均稀释到10³拷贝/微升。例如区域1的阳性对照模板为：10³拷贝/微升的含转化后ACTB基因的质粒和10³拷贝/微升的含区域1序列的质粒1:1混合而成。

Ct值读取：qPCR反应结束后，可手动调整基线，将基线荧光值标准差的10倍高度对应的荧光强度值设置为阈值，阈值线为穿过阈值的与X轴平行的直线，其必须位于指数扩增期内，阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。

质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤33，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

3)qMSP结果分析

定义ΔCt＝Ct(目标区域)-Ct(ACTB)，计算所有样本中扩增各个目标区域的ΔCt值，然后使用IBM SPSS 20.0软件进行受试者操作曲线特征(ROC)分析。根据ROC分析结果，选择约登指数(敏感度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，若待测样本的ΔCt值小于等于截断值，则该样本为甲基化阳性，该样本为食管鳞癌阳性样本；若待测样本的ΔCt值大于截断值，则该样本为甲基化阴性，该样本为食管鳞癌阴性样本。

实施例2qMSP法检测待测样本中单个目标区域的甲基化水平诊断食管鳞癌血液样本的性能

1)样本收集

收集71例经组织活检确诊为食管鳞癌的患者的血液样本，收集健康人的血液样本90例作为对照，每份血液样本的体积大于8mL。所有血液样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。

2)血浆样本中游离DNA的提取、转化和纯化同实施例1。

3)qMSP检测及结果分析

采用实施例1中提供的引物对和探针分别扩增区域1-10，根据得到的ΔCt值进行ROC分析。具体地，将食管鳞癌血浆样本的状态变量定为“1”，将健康人血浆样本的状态变量定为“0”，点击“分析”-“ROC曲线图”，分别指定检验变量和状态变量的值，将状态变量的值定为1，并选择“较小的检验结果表示更明确的检验”，得出ROC分析结果，选择约登指数(敏感度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，并得到平均AUC值、敏感度和特异性数值，结果如表5所示，各目标区域的ROC曲线如图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9和图10所示。

表5各目标区域检测食管鳞癌血液样本的性能

目标区域	敏感度(％)	特异性(％)	AUC值	截断值
					区域1	71.8	80.9	0.755	18.00
区域2	85.2	90.0	0.859	18.05
					区域3	89.6	93.0	0.894	18.06
区域4	88.9	91.2	0.894	17.99
					区域5	83.9	94.3	0.838	17.99
区域6	83.3	86.5	0.852	18.00
					区域7	84.8	88.4	0.874	18.02
区域8	84.8	87.8	0.865	18.00
					区域9	76.1	89.3	0.833	18.18
区域10	84.2	85.0	0.869	18.02

由表5可以看出，各个区域诊断食管鳞癌血浆样本的AUC值范围为0.755～0.894，总体来看，所有的区域对食管鳞癌都有一定的检出率。其中，区域2-8以及区域10检测食管鳞癌的检测敏感度均大于等于83.3％，诊断效果较好；同时，所有区域对于健康人血浆样本的检测特异性较好，检测特异性均大于80％，其中，区域2-5对于健康人血浆样本的检测特异性相对较优，检测特异性均大于等于90％。

实施例3qMSP法检测待测样本中两个目标区域的甲基化水平联合诊断食管鳞癌血液样本的性能

样本收集、血浆样本中游离DNA的提取、转化和纯化同实施例2。

在本实施例中，使用Logistic回归模型分析了来自2个区域的联合诊断的效果。

当使用不同的方式进行组合时，所使用的计算方程不同，具体如表6所示。根据上述方程，ΔCt值为目标基因与内参基因ACTB的Ct值之差，计算两区域联合诊断测试集样本时的概率值P，若P值小于截断值，则表明此样本为健康人样本，若P值大于等于截断值，则表明此样本为食管鳞癌阳性样本。具体的分析方法为：首先对多个区域的ΔCt值进行二元Logistic分析，得出一个概率值，再以概率值为检验变量进行ROC分析，软件设置过程同上述单一检测区域的分析过程。结果如表7和图11、图12、图13、图14、图15、图16、图17、图18和图19所示。

表6两区域联合诊断计算方程式

表7两区域联合诊断食管鳞癌血液样本的性能

组合方式	目标区域	敏感度(％)	特异性(％)	AUC值	截断值(概率值)
						A	区域3+区域4	86.7	94.2	0.951	0.52
B	区域3+区域5	87.0	86.8	0.920	0.37
						C	区域1+区域6	88.9	82.2	0.909	0.47
D	区域2+区域6	93.6	84.1	0.933	0.46
						E	区域4+区域8	97.0	86.7	0.964	0.28
F	区域7+区域8	92.9	84.9	0.934	0.27
						G	区域9+区域10	94.1	83.3	0.949	0.27
H	区域1+区域8	76.1	91.5	0.896	0.64
						I	区域2+区域7	85.0	92.5	0.952	0.59

本实施例选用的目标区域为表5中10个区域中任选两个的组合。由表5可知，区域3与区域4检测食管鳞癌血浆样本的敏感度较高，区域3与区域5的检测健康人血浆样本的特异性较高，于是首先将区域3+区域4(A组合)，区域3+区域5(B组合)分别组合进行验证，如表7所示，A组合检测食管鳞癌血浆样本的敏感度为86.7％，略低于区域3(敏感度为89.6％)及区域4的单区域检测敏感度(敏感度为88.9％)，A组合检测健康人血浆样本的特异性为94.2％，略高于区域3(特异性为93.0％)及区域4(特异性为91.2％的)的单区域检测特异性。B组合检测食管鳞癌血浆样本的敏感度为87.0％，比区域3的89.6％的检测敏感度略低，比区域5的83.9％的检测敏感度略高，B组合检测健康人血浆样本的特异性为86.8％，低于区域3(特异性为93.0％)及区域5(特异性为94.3％)的单区域检测特异性。综合来看，将选定的检测敏感度或检测特异性较好的优势区域进行组合时，并没有产生预期中的较好的效果，优势区域的组合不一定会使检测的敏感度或特异性产生较大的提高。

将表5所有区域两两组合进行了分析，其中区域两两组合后检测敏感度或特异性有显著提高的组合如表7中C-I组合所示。与单区域检测相比，按照C-I组合所示的两区域组合方式进行食管鳞癌血浆样本的组合检测时，C-I组合其诊断食管鳞癌的效果在检测敏感度或者检测特异性方面明显优于单独检测某一个区域。同时，C-I组合对应的诊断食管鳞癌的AUC值均高于0.896，表明两区域组合对食管鳞癌都有一定的检出率。其中，C、D、E、F、G五种组合方式在两个区域联合诊断时，其对于食管鳞癌血液样本的敏感度均高于单区域检测时的检测敏感度，例如，C组合中，区域1的检测敏感度为71.8％，区域6的检测敏感度为83.3％，而用区域1+区域6进行检测时，对于食管鳞癌血浆样本的检测敏感度提高到88.9％，比单区域的检测敏感度都高；D组合中，区域1的检测敏感度为71.8％，区域9的检测敏感度为76.1％，而用区域1+区域9进行检测时，对于食管鳞癌血浆样本的检测敏感度有明显提高，检测敏感度达到87.0％。E组合中，区域4的检测敏感度为88.9％，区域8的检测敏感度为84.8％，而用区域4+区域8进行检测时，对于食管鳞癌血浆样本的检测敏感度有明显提高，检测敏感度达到97.0％；F组合中，区域7的检测敏感度为84.8％，区域8的检测敏感度为84.8％，而用区域7+区域8进行检测时，对于食管鳞癌血浆样本的检测敏感度有明显提高，检测敏感度达到92.9％；G组合中，区域9的检测敏感度为76.1％，区域10的检测敏感度为84.2％，而用区域9+区域10进行检测时，对于食管鳞癌血浆样本的检测敏感度有明显提高，检测敏感度达到94.1％。此外，以H、I的组合方式进行组合时，对于健康人血浆样本的检测特异性具有明显提高，例如，在H组合中，区域1的检测特异性为80.9％，区域8的检测特异性为87.8％，而用区域1+区域8双区域进行检测时，对于健康人血浆样本的检测特异性提高到91.5％，对比单区域的检测特异性有明显提高；在I组合中，区域2的检测特异性为90.0％，区域7的检测特异性为88.4％，而用区域2+区域7进行双区域进行检测时，对于健康人血浆样本的检测特异性提高到92.5％，对比单区域的检测特异性也有明显提高。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的试剂，其特征在于，所述试剂用于检测样本中目标区域的甲基化水平，所述目标区域选自如下至少一种区域：区域1、区域2、区域3、区域4、区域5、区域6、区域7、区域8、区域9和区域10；

以GRCh38.p14为参考基因组，所述区域1为Chr6:42050176-42050352正链，所述区域2为Chr3:98733928-98734059负链，所述区域3为Chr14:87992619-87992797负链，所述区域4为Chr3:156291518-156291694负链，所述区域5为Chr19:11888420-11888590正链，所述区域6为Chr1:65264752-65264945正链，所述区域7为Chr6:26183662-26183831正链，所述区域8为Chr10:11742012-11742176正链，所述区域9为Chr12:113462547-113462755负链，所述区域10为Chr19:53254485-53254661正链；

所述区域1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述区域2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述区域3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述区域4的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述区域5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述区域6的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，所述区域7的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述区域8的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，所述区域9的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述区域10的核苷酸序列如SEQID NO.10所示。

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于检测所述目标区域的甲基化水平的引物对。

3.如权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针。

4.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括以下所述引物对中的至少一组，所述试剂还包括与所述引物对对应的检测探针：

用于检测所述区域1的甲基化水平的第一引物对；还包括与所述第一引物对对应的第一检测探针；

用于检测所述区域2的甲基化水平的第二引物对；还包括与所述第二引物对对应的第二检测探针；

用于检测所述区域3的甲基化水平的第三引物对；还包括与所述第三引物对对应的第三检测探针；

用于检测所述区域4的甲基化水平的第四引物对；还包括与所述第四引物对对应的第四检测探针；

用于检测所述区域5的甲基化水平的第五引物对；还包括与所述第五引物对对应的第五检测探针；

用于检测所述区域6的甲基化水平的第六引物对；还包括与所述第六引物对对应的第六检测探针；

用于检测所述区域7的甲基化水平的第七引物对；还包括与所述第七引物对对应的第七检测探针；

用于检测所述区域8的甲基化水平的第八引物对；还包括与所述第八引物对对应的第八检测探针；

用于检测所述区域9的甲基化水平的第九引物对；还包括与所述第九引物对对应的第九检测探针；

用于检测所述区域10的甲基化水平的第十引物对；还包括与所述第十引物对对应的第十检测探针。

5.如权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括如下核酸分子组合中的至少一种：

第一核酸分子组合，包括所述第一引物对和所述第六引物对，还包括所述第一检测探针和所述第六检测探针；

第二核酸分子组合，包括所述第四引物对和所述第八引物对，还包括所述第四检测探针和所述第八检测探针；

第三核酸分子组合，包括所述第九引物对和所述第十引物对，还包括所述第九检测探针和所述第十检测探针；

第四核酸分子组合，包括所述第二引物对和所述第六引物对，还包括所述第二检测探针和所述第六检测探针；

第五核酸分子组合，包括所述第七引物对和所述第八引物对，还包括所述第七检测探针和所述第八检测探针；

第六核酸分子组合，包括所述第一引物对和所述第八引物对，还包括所述第一检测探针和所述第八检测探针；

第七核酸分子组合，包括所述第二引物对和所述第七引物对，还包括所述第二检测探针和所述第七检测探针。

6.如权利要求4或5所述的试剂，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.21～22所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24～25所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27～28所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30～31所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示；所述第五引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.33～34所示，所述第五检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示；所述第六引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.36～37所示，所述第六检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述第七引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.39～40所示，所述第七检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示；所述第八引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.42～43所示，所述第八检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；所述第九引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.45～46所示，所述第九检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.47所示；所述第十引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.48～49所示，所述第十检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.50所示。

7.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂能够检测如下至少一种所述目标区域中一个或多个胞嘧啶位点的甲基化：

所述区域1的Chr6:42050177、Chr6:42050200、Chr6:42050235、Chr6:42050240、Chr6:42050252、Chr6:42050328、Chr6:42050334和Chr6:42050336至少一个位点；

8.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本。

9.一种用于食管鳞癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至8任一项所述的试剂。

10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应试剂、甲基化转化试剂、扩增内参基因的引物对以及标记所述内参基因的探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂和质控品中的一种或多种。

11.如权利要求1至8任一项所述的试剂或如权利要求9或10所述的检测试剂盒在制备食管鳞癌诊断或辅助诊断产品中的应用。