CN117248021A - 一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用。本发明提供的核酸组合和试剂盒通过检测样本中MEIS1基因和/或PITX1基因的CpG岛上的特定区域的甲基化水平，可以有效区分尿路上皮癌患者和非尿路上皮癌受试者，对浸润性尿路上皮癌、非浸润性尿路上皮癌和癌前病变均具有良好的检测效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用。
背景技术
尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一种多源性的恶性肿瘤，包括肾盂癌、输尿管癌、膀胱癌以及尿道癌，是最常见的泌尿系统肿瘤。尿路上皮癌一般可分为非肌层浸润性和肌层浸润性。WHO2004新分类法将非浸润性尿路上皮癌分为三级：低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤、低级别和高级别尿路上皮癌。低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤定义为乳头状瘤，其细胞形态正常，无恶性肿瘤的细胞学特征，虽然此种尿路上皮肿瘤进展风险小，但其仍不完全属于良性病变，临床将其定义为癌前病变。非肌层浸润性尿路上皮癌具有手术、BCG灌注、化疗等治疗方式，5年生存率为80～90％，具有较好的预后；而发展为肌层浸润性尿路上皮癌后，肿瘤容易发生转移，5年生存率不到40％。
目前，尿路上皮癌的检测方法包括影像学技术(CT，MRI，尿路造影，B超)、膀胱镜结合尿脱落细胞学和FISH检测等。然而，CT、MRI等影像学检查对于输尿管肿瘤的检出率相对偏低，尿液脱落细胞学检测的阳性率低于50％，且对于进展期尿路上皮肿瘤的检出率更低，尿液FISH检测也受制于标本条件和肿瘤梗阻水平，输尿管镜/软镜镜检是有创检查且可能增加膀胱转移的风险。
现有技术公开的一些用于尿路上皮癌的风险判定的引物或探针对尿路上皮癌患者与非尿路上皮癌受试者的检测具有良好的灵敏度和特异性，但目前尚缺乏能够用于诊断病理分期较早的尿路上皮癌的试剂盒，尤其缺乏能够用于尿路上皮癌癌前病变检测的试剂盒。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供了一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用，以改善现有技术对病理分期较早的尿路上皮癌检测灵敏度低，尤其是对尿路上皮癌癌前病变的检测灵敏度低等技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合，其为用于检测样本中MEIS1基因和/或PITX1基因的CpG岛上的特定区域的甲基化水平的核酸组合。
优选地，以GRCh38.p14为参考基因组，所述MEIS1基因的CpG岛上的特定区域选自Chr2:66440306-66440490正链和/或Chr2:66440296-66440461负链的全长或部分区域；所述PITX1基因的CpG岛上的特定区域选自Chr5:135029763-135029937正链和/或Chr5:135029758-135029939负链的全长或部分区域。
进一步优选地，所述MEIS1基因的CpG岛上的特定区域选自如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述PITX1基因的CpG岛上的特定区域选自如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
优选地，所述核酸组合包括用于检测SEQ ID NO.1～4所示核苷酸序列中的至少一者的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
优选地，所述核酸组合选自如下核酸组合中组中的至少一组：
第一核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对；优选地，还包括与所述第一引物对对应的第一检测探针；
第二核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对；优选地，还包括与所述第二引物对对应的第二检测探针；
第三核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对；优选地，还包括与所述第三引物对对应的第三检测探针；
第四核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对；优选地，还包括与所述第四引物对对应的第四检测探针。
进一步优选地，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.12～13所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
优选地，所述检测探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的试剂盒，其包括所述核酸组合。
优选地，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。
本发明还提供了所述核酸组合或所述试剂盒在制备尿路上皮癌或癌前病变诊断产品中的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合和试剂盒，通过检测样本中MEIS1基因和/或PITX1基因上特定区域的甲基化水平，可以对尿路上皮癌或癌前病变进行检测或诊断，有效区分尿路上皮癌患者和非尿路上皮癌受试者，适用于诊断不同病理分期的尿路上皮癌，对浸润性尿路上皮癌、非浸润性尿路上皮癌、尿路上皮癌癌前病变均具有良好的检测效果，对尿路上皮癌或癌前病变的尿液样本均具有较高的检测灵敏度和特异性。
(2)本发明提供的试剂盒检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度可达96.4％，检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度可达89.0％，检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的灵敏度可达80.6％，检测对照组尿液样本的特异性可达95.3％。
综上，本发明为尿路上皮癌或癌前病变的无创检测以及早期筛查提供了一种新的思路，对尿路上皮癌的早期筛查，尤其是癌前病变的早期筛查具有重要意义。
附图说明
图1为区域1～4检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线，其中内容(a)、内容(b)、内容(c)、内容(d)分别为区域1、区域2、区域3、区域4检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线；
图2为双区域组合检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线，其中内容(a)、内容(b)、内容(c)、内容(d)分别为区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线；
图3为区域1～4检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线，其中内容(a)、内容(b)、内容(c)、内容(d)分别为区域1、区域2、区域3、区域4检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线；
图4为双区域组合检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线，其中内容(a)、内容(b)、内容(c)、内容(d)分别为区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线；
图5为区域1～4检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的ROC曲线，其中内容(a)、内容(b)、内容(c)、内容(d)分别为区域1、区域2、区域3、区域4检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的ROC曲线；
图6为双区域组合检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的ROC曲线，其中内容(a)、内容(b)、内容(c)、内容(d)分别为区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的ROC曲线；
图7为区域1+区域3组合检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的ROC曲线；
图8为区域1+区域4组合检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的ROC曲线；
图9为区域2+区域3组合检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的ROC曲线；
图10为区域2+区域4组合检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态，涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下，术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态，“辅助诊断”用于在患者临床状态确定或验证过程中提供各种信息辅助判断，不作为唯一确定指标。一些实施例中，“检测”尿路上皮癌或癌前病变是指检测疾病的存在与否，即判断受试者是否患有尿路上皮癌或癌前病变。
术语“特定区域”或“靶区域”具有相同含义，可互换使用，是指基因序列中包括被检测的CpG位点的一段核苷酸序列。该特定区域可以位于该基因的CpG岛，也可以是CpG岛以外的包括CpG位点的区域。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子，优选多于三个，并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素，而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较；在一些情况下，可计算样本中基因甲基化的比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100％，然后再进行比较；在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中，基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素，包括温度、引物来源以及所用方法等。例如，对于诊断和预后应用，根据靶序列的复杂度，寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸，但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中，术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一，能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后，所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶，而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变，因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物，通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对，从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来，但是qMSP最终的检测指标为荧光信号，因此，在qMSP反应系统中，除加入甲基化检测引物以外，还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比，qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高，更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段，且该技术不需要凝胶电泳检测，操作更加简便。在本申请公开内容中，进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物对，若Ct值满足所述要求(例如在尿液样本中Ct≤35)，则表明目标序列是甲基化的。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时，因为荧光基团附近存在淬灭基团，探针不会发出荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的链结合，DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针，荧光基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步的指数增长的过程。
术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地，是指接受者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是诊断测试的不同可能切割点的真阳性率相比于假阳性率的图。其取决于所选择切割点的灵敏度与特异性之间的权衡(灵敏度的任何增加将伴随着特异性的降低)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试准确度的度量(面积越大效果越优异；最佳值是1；随机测试将具有位于对角线上的ROC曲线，面积为0.5)。
MEIS1基因是同源异型(HOMEOBOX)基因中的一种，在人的正常发育中起着至关重要的作用，其同源基因编码的蛋白参与了某些肿瘤的形成。
PITX1基因所属的基因家族参与控制器官发育，其编码的蛋白作为一种转录调节因子参与基础和激素调节催乳素活性。
本发明提供的一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合，其为用于检测样本中MEIS1基因和/或PITX1基因的CpG岛上的特定区域的甲基化水平的核酸组合。
以GRCh38.p14为参考基因组，上述MEIS1基因的CpG岛上的特定区域选自Chr2:66440306-66440490正链和/或Chr2:66440296-66440461负链的全长或部分区域；上述PITX1基因的CpG岛上的特定区域选自Chr5:135029763-135029937正链和/或Chr5:135029758-135029939负链的全长或部分区域。
一些实施例中，上述MEIS1基因的CpG岛上的特定区域选自如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述PITX1基因的CpG岛上的特定区域选自如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
以GRCh38.p14为参考基因组，SEQ ID NO.1～4的信息如下表所示。
| 特定区域 | 染色体位置(GRCh38.p14) | 核苷酸序列 |
| 区域1 | Chr2:66440306-66440490正链 | SEQ ID NO.1 |
| 区域2 | Chr2:66440296-66440461负链 | SEQ ID NO.2 |
| 区域3 | Chr5:135029763-135029937正链 | SEQ ID NO.3 |
| 区域4 | Chr5:135029758-135029939负链 | SEQ ID NO.4 |
本申请的发明人发现，尿路上皮癌与上述特定区域的甲基化水平相关，并且在各种尿路上皮癌尿液样本中的甲基化水平均显著高于正常样本，通过检测样本中至少一种上述特定区域或特定区域组合的甲基化水平，可以有效区分尿路上皮癌患者和非尿路上皮癌受试者，可以为受试者在检测或诊断尿路上皮癌等方面提供参考。
进一步实验发现，将本发明中MEIS1基因CpG岛上的特定区域与PITX1基因CpG岛上的特定区域的组合作为区域组合进行甲基化水平的检测时，其检测效果相对于单一基因CpG岛上的特定区域有一定程度的优化。
一些实施例中，较佳的特定区域选自如下任一组合：
SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.3的组合、SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.4的组合、SEQ IDNO.2与SEQ ID NO.3的组合、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.4的组合。
可以理解的是，在检测特定区域的甲基化水平时，可以针对上述任一特定区域的全长区域进行检测，还可以针对上述任一特定区域的部分区域进行检测。
一些实施例中，上述核酸组合包括用于检测SEQ ID NO.1～4所示核苷酸序列中的至少一者的甲基化水平的引物对，较佳实施例中，上述核酸组合还包括检测探针。
较佳实施例中，上述核酸组合包括以下核酸组合中的至少一种：
第一核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对；较佳实施例中，还包括与上述第一引物对对应的第一检测探针；
第二核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对；较佳实施例中，还包括与上述第二引物对对应的第二检测探针；
第三核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对；较佳实施例中，还包括与上述第三引物对对应的第三检测探针；
第四核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对；较佳实施例中，还包括与上述第四引物对对应的第四检测探针。
一些实施例中，上述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.9～10所示，上述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；上述第二引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.12～13所示，上述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；上述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示，上述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；上述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示，上述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
较佳实施例中，本发明用于检测尿路上皮癌或癌前病变的较佳的核酸组合为如下的任意一种或多种：第一核酸组合与第三核酸组合的组合、第一核酸组合与第四核酸组合的组合、第二核酸组合与第三核酸组合的组合、第二核酸组合与第四核酸组合的组合。
需要说明的是，若一种引物对与上述引物对(第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对)所示的核苷酸序列具有至少具有85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)等以上的序列一致性，且该引物对同样具有一定的尿路上皮癌或癌前病变诊断功能(特异性或灵敏度与本申请引物对相比，相当或略有下降或略有提高或大幅提高等)，也在本发明的保护范围内。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述特定区域中的一个或多个的组合的甲基化水平进行检测，对不同病理分期的尿路上皮癌进行诊断，无论采用何种技术，其都是属于本发明的保护范围。
一些实施例中，上述核酸组合可以通过如下至少一种的方法检测样本中特定区域的甲基化水平：甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
本发明还提供了包括上述核酸组合的用于检测尿路上皮癌或癌前病变的试剂盒，该试剂盒能够检测如上所述的特定区域的甲基化水平以进行尿路上皮癌或癌前病变的诊断。
一些实施例中，上述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。一些实施例中，上述甲基化转化试剂为亚硫酸氢盐转化试剂。
一些实施例中，上述内参基因的检测引物对是针对ACTB基因设计的检测引物对。在一个可选地具体示例中，ACTB基因的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21～22所示。可以理解的是，在其他实施例中，还可以选择其他基因作为内参基因，此时，内参基因的检测引物对对应设计即可。
一些实施例中，本发明所用检测探针为荧光探针，可选地，检测探针为TaqMan探针。具体地，上述特定区域的检测探针和上述内参引物对对应的检测探针均含有荧光基团，其中，荧光基团包括荧光报告基团和荧光淬灭基团。可选地，荧光报告基团位于检测探针的5’端，荧光淬灭基团位于检测探针的3’端。可选地，荧光报告基团选自FAM、ROX、CY5、VIC、TET、JOE和HEX中的一种或多种，荧光淬灭基团选自MGB、BHQ1、BHQ-2和BHQ-3中的一种或多种。在同一个反应体系中有两种以上的检测探针时，不同检测探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是，检测探针的荧光基团不限于上述，还可以是其他荧光基团。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒的检测样本包括不限于尿液样本、组织样本、血浆样本、血清样本、血液样本或尿路上皮来源的细胞样本。
本发明还提供了一种通过检测样本中特定区域的甲基化水平检测不同病理分期的尿路上皮癌的方法，包括如下步骤：提取受试者尿液样本的DNA，采用甲基化转化试剂对其进行转化，随后对转化的DNA进行纯化，采用本发明提供的试剂盒进行qPCR扩增，通过qMSP法检测上述特定区域的甲基化水平，进而判断待测样本是否为尿路上皮癌或癌前病变阳性。
本发明还提供了上述试剂盒在制备尿路上皮癌或癌前病变诊断产品中的应用。尿路上皮癌或癌前病变诊断产品可以为试剂、试剂盒、芯片和测序文库等中的一种或多种。可选地，上述试剂可以是冻干粉状、溶液、悬浮液、乳液等产品形态。需要说明的是，本发明提供的尿路上皮癌或癌前病变诊断产品并不限于上述所列举的核酸组合、试剂盒，只要能满足尿路上皮癌或癌前病变的检测或诊断的需求的产品均在本发明的保护范围内。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1利用甲基化荧光定量PCR法分析目标区域诊断尿路上皮癌或癌前病变的性能
发明人发现，通过检测MEIS1和/或PITX1基因中的特定区域的甲基化水平，可以检测尿路上皮癌或癌前病变，具体的检测过程如下所示：
1.尿液样本收集：
共收集了54例确诊为乳头状尿路上皮肿瘤患者的尿液作为癌前病变样本，收集68例确诊为非浸润性尿路上皮癌(不包括乳头状尿路上皮肿瘤)患者尿液样本，收集72例浸润性尿路上皮癌患者尿液样本，收集169例对照组的志愿者尿液样本(对照组包括泌尿系统良性疾病如腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等患者的尿液样本65例，健康人尿液样本104例，经临床诊断均完全排除尿路上皮癌或癌前病变)。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有志愿者都签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取：
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取，具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化：
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)，具体操作按照试剂盒说明书进行。
样本DNA的纯化如下：1)将转化产物转入2mL离心管，加入600μL结合液及10μL磁珠，混匀静置结合15min，期间每3min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。2)加入600μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。3)加入800μL脱硫剂，涡旋混匀20s分散磁珠，室温静置15min脱硫，期间每5min震荡混匀5s，使磁珠一直处于悬浮状态。4)加入800μL漂洗液，涡旋混匀20s分散磁珠；短暂离心，将离心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后(约1min)，小心移除上清。5)重复步骤4)一次。6)短暂离心将液体收集至管底，将离心管置于磁力架上，小心吸尽上清；开盖于25℃放置约5min至磁珠表面无光泽。7)加入30μL洗脱液TE，涡旋使磁珠充分悬浮于洗脱液中，56℃孵育10min，期间每3min涡旋混匀一次促进核酸充分洗脱。8)短暂离心，将离心管置于磁力架上静置2min，转移DNA溶液至新的离心管中。
4.甲基化荧光定量PCR反应：
为了保证荧光定量PCR反应的扩增效率位于95％～105％之间，且没有非特异性扩增和引物二聚体出现，分别以亚硫酸氢盐转化后的DNA序列(SEQ ID NO.5～8)为模板，设计多对用于甲基化荧光定量PCR反应的引物对，然后对上述引物对进行验证，使用SYBR GreenPCR体系扩增目的片段，通过溶解曲线和标准曲线分析，筛选到满足上述要求的引物对，并针对每对引物设计对应的Taqman检测探针，用于Taqman PCR反应体系。特定区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列如表1所示，检测引物对和检测探针如表2所示。
表1特定区域的DNA序列及经亚硫酸氢盐转化后的序列
表2检测引物对、检测探针的核苷酸序列
检测区域1～区域4中单个区域的甲基化水平时，以转化后的DNA为模板，用表2中该区域对应的检测引物对来扩增该区域。此时，每个PCR管中除加入必需的反应成分和模板以外，还需加入该区域的检测引物对和检测探针，以及内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。其中，内参基因ACTB的上游扩增引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.21)，下游扩增引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.22)，检测探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.23)。
若同时检测区域1～区域2中任一区域和区域3～区域4中任一区域的双区域组合的甲基化水平，则需要加入双区域组合对应的检测引物对和检测探针，用来同时扩增两个区域。在这种情况下，根据检测的双区域组合不同，共有4种组合方式，如表3所示。扩增时，每个PCR管中除加入必需的反应成分和模板以外，还需加入两个特定区域对应的检测引物对和检测探针，以及内参基因ACTB的检测引物对和检测探针。
本申请中，上述检测探针均为TaqMan探针，特定区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM或ROX，3’端的荧光淬灭基团均为MGB，ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC，3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增，PCR反应体系的配置如表4所示(若检测单个区域，则不加入另一个区域的检测引物对及检测探针，其体积用超纯水补足)，按照表5展示的扩增程序进行PCR扩增。
表3双区域组合的组合方式
表4荧光定量PCR反应体系
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 3 |
| 每一区域的上游引物 | 10μM | 0.5 |
| 每一区域的下游引物 | 10μM | 0.5 |
| 每一区域的检测探针 | 10μM | 0.5 |
| ACTB上游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB下游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB检测探针 | 10μM | 0.5 |
| Taq酶 | / | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 超纯水 | / | 补至25 |
表5荧光定量PCR反应程序
阴性对照和阳性对照：在进行PCR反应检测样本时，阴性对照和阳性对照也应同时进行检测，阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为：将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒；将经亚硫酸氢盐完全转化后的序列如SEQ ID NO.5～8进行人工合成，并分别克隆至载体，形成人工合成质粒。若只检测单一区域的甲基化水平，阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含检测单一区域的人工合成质粒，二者1:1等体积混合而成；若检测双区域组合的甲基化水平，则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含一个区域的人工合成质粒和103拷贝/微升的含另一个区域的人工合成质粒，三者1:1:1等体积混合而成。
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1～2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照各基因的Ct值应在26～30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
实施例2qMSP法检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的性能
1.样本收集及处理、甲基化检测方法同实施例1。
2.qMSP检测及结果分析：
采用实施例1中提供的检测引物对和检测探针分别扩增区域1～4，再计算其与内参基因ACTB的Ct值之差ΔCt，并根据得到的ΔCt值进行ROC(receiver operatingcharacteristic curve,ROC)分析。具体地，将尿路上皮癌或癌前病变尿液样本的状态变量定为“1”，将对照组尿液样本的状态变量定为“0”，点击“分析”-“ROC曲线图”，分别指定检验变量和状态变量的值，将状态变量的值定为1，并选择“较小的检验结果表示更明确的检验”，得出检验尿路上皮癌或癌前病变的ROC分析结果，选择约登指数(灵敏度+特异性-1)最大时的ΔCt为截断值，并得到平均AUC值、灵敏度和特异性数值。
双区域的联合诊断使用Logistic回归模型计算两区域联合诊断测试集样本时的概率值P，若P值小于截断值，则表明此样本为对照组样本，若P值大于等于截断值，则表明此样本为尿路上皮癌或癌前病变阳性样本。
单区域检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的结果如表6所示，区域1、2、3、4检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线分别如图1内容(a)、图1内容(b)、图1内容(c)、图1内容(d)所示。双区域检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的结果如表7所示，其中区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线分别如图2内容(a)、图2内容(b)、图2内容(c)、图2内容(d)所示。
表6单区域检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度和特异性
表7双区域检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度和特异性
由表6可以看出，通过qMSP法检测区域1～4的甲基化水平浸润性尿路上皮癌尿液样本的效果优异，其AUC值都大于0.938。各个区域检测浸润性尿路上皮癌的灵敏度均大于等于92.0％，检测灵敏度较优。同时，所有区域对于对照组尿液样本的检测特异性较好，检测特异性均大于等于92.9％，其中，区域3的检测特异性最优，达95.1％。
表7中，双区域组合进行浸润性尿路上皮癌尿液样本检测时，其诊断浸润性尿路上皮癌的灵敏度为93.9％～96.4％，相比于单区域检测有所提高；其检测对照组尿液样本的特异性范围为91.5％～93.6％，相比于单区域检测仅有小幅度降低，但仍处于较高水平。总体来说，双区域组合对于检测浸润性尿路上皮癌的总体效果相比单区域有一定程度的优化。意外的是，区域2、区域3作为单区域检测灵敏度较低的区域，其组合检测浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度高于其它双区域组合，甚至高于单区域检测灵敏度较高的区域1、区域4的组合。
实施例3qMSP法检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的性能
1.样本收集及处理、甲基化检测方法同实施例1。
2.qMSP检测及结果分析同实施例2。
单区域检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的结果见表8，区域1、2、3、4检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线分别如图3内容(a)、图3内容(b)、图3内容(c)、图3内容(d)所示。双区域检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的结果见表9，其中区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的ROC曲线分别如图4内容(a)、图4内容(b)、图4内容(c)、图4内容(d)所示。
表8单区域检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度和特异性
表9双区域检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度和特异性
由表8可以看出，通过检测区域1～4的甲基化水平诊断非浸润性尿路上皮癌尿液样本的AUC值范围为0.827～0.919，检测的准确度较高。具体地，通过检测区域1～4的甲基化水平诊断非浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度范围为74.4％～84.7％，检测对照组尿液样本的特异性范围为92.1％～95.3％。其中，通过检测区域1、区域2、区域3的甲基化水平诊断非浸润性尿路上皮癌患者和对照组尿液样本的性能相对较好，其检测非浸润性尿路上皮癌的灵敏度均大于等于82.9％，检测对照组的特异性均大于等于92.1％，AUC值均大于等于0.881。
表9中，将区域1、区域2分别与区域3、区域4进行双区域组合检测，其检测非浸润性尿路上皮癌患者尿液样本的灵敏度为75.6％～89.0％，大多高于单区域检测的灵敏度；其检测对照组尿液样本的特异性在84.4％～94.1％之间，低于单区域检测的特异性，但仍处于较高水平。由表8可知，区域1检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度最高(灵敏度为84.7％)、区域2次之(灵敏度为83.0％)、区域4最低(灵敏度为74.4％)，将区域1、区域2分别与区域4组合检测非浸润性尿路上皮癌患者尿液样本。由表9可以看出，区域1+区域4检测对照组尿液样本的特异性为84.4％，低于区域1、区域4的单区域检测效果，但区域1+区域4检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本的灵敏度高达89.0％，相比于区域1、区域4的单区域检测有显著提高。意外的是，区域2+区域4组合检测非浸润性尿路上皮癌尿液样本时，没有产生预期中较好的效果，并未使组合检测的灵敏度或特异性相较于单区域检测有所提高。
实施例4qMSP法检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的性能
1.样本收集及处理、甲基化检测方法同实施例1。
2.qMSP检测及结果分析同实施例2。
单区域检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的结果见表10，区域1、2、3、4检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的ROC曲线分别如图5内容(a)、图5内容(b)、图5内容(c)、图5内容(d)所示。双区域检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的结果见表11，其中区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的ROC曲线分别如图6内容(a)、图6内容(b)、图6内容(c)、图6内容(d)所示。
表10单区域检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本中的灵敏度和特异性
表11双区域检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的灵敏度和特异性
表10中，区域1～4检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的AUC值为0.719～0.801，表明各个区域对于尿路上皮癌癌前病变均有较好的检出效果，检测准确度较高。所有区域检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的灵敏度均大于等于61.3％，其中区域1、区域2、区域3检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的灵敏度相对较优，均大于等于71.3％。所有区域检测对照组尿液样本的特异性均大于等于82.3％，其中，区域2检测对照组尿液样本的特异性达89.2％。
表10中，区域2检测对照组尿液样本的特异性最高，区域3的检测特异性较低，区域4的检测特异性最低，将区域2与区域3、区域4组合检测对照组尿液样本时，意外发现，区域2+区域3组合检测对照组尿液样本的特异性为87.1％，仅高于区域3检测的特异性(特异性为84.3％)。而区域2+区域4组合检测对照组尿液样本的特异性为92.5％>区域2(特异性为89.2％)>区域4(特异性为82.3％)，甚至高于区域2+区域3组合检测的特异性。
本实施例中，将区域1、区域2分别与区域3、区域4进行组合检测。由表11可以看出，组合A～D检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的AUC值为0.834～0.870，优于区域1～4对尿路上皮癌癌前病变的检出效果。组合A～D检测尿路上皮癌癌前病变尿液样本的灵敏度为69.4％～80.6％，相比于单区域检测展现出较大的提升或与单区域检测基本持平，其中，区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3组合检测的灵敏度均大于等于76.5％。组合A～D检测对照组尿液样本的特异性范围为83.0％～92.5％，处于较高水平。综合来看，相比单区域的检测，表11所示组合A～D在尿路上皮癌癌前病变尿液样本的检测中展现出较好的效果。
实施例5qMSP法检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的性能
1.样本收集及处理、甲基化检测方法同实施例1。
2.qMSP检测及结果分析同实施例2。
双区域检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的结果见如表12所示，其中区域1+区域3、区域1+区域4、区域2+区域3、区域2+区域4检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的ROC曲线分别如图7、图8、图9、图10所示。
表12双区域检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的灵敏度和特异性
由表12可以看出，通过检测双区域组合的甲基化水平，能够有效区分尿路上皮癌及癌前病变患者(包括浸润性尿路上皮癌、非浸润性尿路上皮癌及癌前病变)和对照组(未发生尿路上皮癌或癌前病变)，其中组合A～D检测尿路上皮癌及癌前病变患者尿液样本的AUC值为0.834～0.893，表明双区域组合对于尿路上皮癌及癌前病变的检出效果好，检测的准确度较高。组合A～D检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的灵敏度均大于等于86.4％，检测对照组尿液样本的特异性均大于等于89.1％。其中，组合A检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的AUC值为0.893，检测尿路上皮癌及癌前病变尿液样本的灵敏度高达92.6％，检测对照组尿液样本的特异性高达91.5％，其诊断性能优于组合B、组合C、组合D。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合，其特征在于，其为用于检测样本中MEIS1基因和/或PITX1基因的CpG岛上的特定区域的甲基化水平的核酸组合。
2.如权利要求1所述的核酸组合，其特征在于，以GRCh38.p14为参考基因组，所述MEIS1基因的CpG岛上的特定区域选自Chr2:66440306-66440490正链和/或Chr2:66440296-66440461负链的全长或部分区域；所述PITX1基因的CpG岛上的特定区域选自Chr5:135029763-135029937正链和/或Chr5:135029758-135029939负链的全长或部分区域。
3.如权利要求2所述的核酸组合，其特征在于，所述MEIS1基因的CpG岛上的特定区域选自如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；所述PITX1基因的CpG岛上的特定区域选自如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括用于检测SEQ IDNO.1～4所示核苷酸序列中的至少一者的甲基化水平的引物对，和/或检测探针。
5.如权利要求4所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合选自如下核酸组合中组中的至少一组：
第一核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.1区域内的甲基化水平的第一引物对；优选地，还包括与所述第一引物对对应的第一检测探针；
第二核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.2区域内的甲基化水平的第二引物对；优选地，还包括与所述第二引物对对应的第二检测探针；
第三核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.3区域内的甲基化水平的第三引物对；优选地，还包括与所述第三引物对对应的第三检测探针；
第四核酸组合，包括用于检测SEQ ID NO.4区域内的甲基化水平的第四引物对；优选地，还包括与所述第四引物对对应的第四检测探针。
6.如权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.9～10所示，所述第一检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12～13所示，所述第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；所述第三引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15～16所示，所述第三检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述第四引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18～19所示，所述第四检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
7.如权利要求5或6所述的核酸组合，其特征在于，所述检测探针的5’端含有荧光报告基团，3’端含有荧光淬灭基团。
8.一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1至7任一项所述的核酸组合。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、PCR反应试剂、质控品、内参基因的检测引物对、内参基因的检测探针中的一种或多种。
10.如权利要求1至7任一项所述的核酸组合或如权利要求8或9所述的试剂盒在制备尿路上皮癌或癌前病变诊断产品中的应用。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118685527A (zh) * | 2024-08-26 | 2024-09-24 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 多基因甲基化联合诊断的检测引物探针组在制备尿路上皮癌诊断产品中的应用 |
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2023
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN118685527A (zh) * | 2024-08-26 | 2024-09-24 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 多基因甲基化联合诊断的检测引物探针组在制备尿路上皮癌诊断产品中的应用 |
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