CN117431321A - 一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用 - Google Patents
一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒通过检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平诊断前列腺癌组织样本、血浆样本和尿液样本的性能优异,提供了能够用于前列腺癌检测的甲基化生物标志物。此外,上述试剂盒对前列腺癌癌前病变(高级别前列腺上皮内瘤变)、早期(Ⅰ期+Ⅱ期)前列腺癌和中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)前列腺癌等不同病理阶段的前列腺癌均具有良好的检测效果,可以有效提高前列腺癌癌前病变和早期癌变的检出率,有利于提高患者的生命质量和存活率。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,更具体地,涉及一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用。
背景技术
前列腺癌是指发生于前列腺上皮的恶性肿瘤,是常见的泌尿外科恶性肿瘤之一。据世界卫生组织国际癌症研究署统计,在2020年,全球约有141.4万的前列腺癌新发病例和37.5万与前列腺癌相关的死亡病例,前列腺癌的发生率和死亡率分别位于第4位和第8位。前列腺癌的发病率因种族、地域差异而有所不同。总体而言,我国前列腺癌的发病率和死亡率低于西方发达国家,但是,随着社会的发展和人民生活方式的改变,前列腺癌的发病率呈逐年增加的趋势。
前列腺癌的潜伏期较长,但是由于其早期通常无明显症状且早期检测准确性低等问题,大部分患者在确诊时病情已经较为严重,约60%的患者在首次确诊时癌症已经发生远端转移。发生远端转移的前列腺癌患者其5年生存率约为31%,而早期局部前列腺癌患者经过手术切除和放射治疗后,其5年生存率可达90%以上。因此,早诊早治是提高前列腺癌患者生存质量和生命周期的重要方式。
目前前列腺癌早期诊断的方式主要依赖于前列腺特异性抗原(Prostatespecific antigen,PSA)检测和影像学检测。现阶段,血清PSA水平被广泛应用于前列腺癌的实验室筛查,但是研究者发现前列腺炎、急性尿潴留、膀胱镜检查和直肠指诊等均可能造成血清PSA水平增高,从而造成过度诊断和治疗。因此,开发兼具高灵敏度和高特异性的生物标志物用于前列腺癌的有效诊断是十分有必要的。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在胞嘧啶核苷酸的第5位碳原子上添加一个甲基基团从而生成5-甲基胞嘧啶的生物学过程,是目前研究的最深入的一种表观遗传调控机制,其可在不改变DNA序列的情况下影响物种的遗传性状。研究表明,DNA异常甲基化所导致的表观遗传修饰改变在前列腺癌的发生和发展中起着至关重要的作用。DNA甲基化的改变在前列腺癌中呈现出较强的特异性,且稳定性良好,因此,甲基化生物标志物在前列腺癌的诊断包括早期诊断中具有独特的优势。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物、试剂盒及应用,以改善现有技术对前列腺癌或癌前病变的检测准确度低,缺少能够用于前列腺癌或癌前病变检测的甲基化生物标志物,缺乏对高级别前列腺上皮内瘤变、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期前列腺癌等不同病理阶段的前列腺癌的检测等技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物,其为用于检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平的核酸组合物,以GRCh38为参考基因组,所述前列腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项:
(a)Chr19:45876820-45877222正链的全长或部分区域,所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;和/或,Chr19:45876820-45877222负链的全长或部分区域,所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子;
(c)与(a)具有85%以上序列一致性的多核苷酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
优选地,上述前列腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.1~2、SEQ ID NO.4~5和SEQ ID NO.15~30所示核苷酸序列中的至少一个。
优选地,上述核酸组合物包括用于扩增所述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化引物对。
优选地,上述核酸组合物还包括用于扩增所述前列腺癌甲基化生物标志物的非甲基化引物对。
进一步优选地,上述核酸组合物包括如下至少一个组合:
第一组合,包括SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.11~12所示的第一非甲基化引物对;
第二组合,包括SEQ ID NO.9~10所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13~14所示的第二非甲基化引物对。
优选地,上述核酸组合物还包括检测探针。
进一步优选地,上述核酸组合物包括如下至少一个组合:
第三组合,包括SEQ ID NO.31~32所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.33所示的第一检测探针;
第四组合,包括SEQ ID NO.34~35所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.36所示的第二检测探针;
第五组合,包括SEQ ID NO.37~38所示的第五甲基化引物对和SEQ ID NO.39所示的第三检测探针;
第六组合,包括SEQ ID NO.40~41所示的第六甲基化引物对和SEQ ID NO.42所示的第四检测探针;
第七组合,包括SEQ ID NO.43~44所示的第七甲基化引物对和SEQ ID NO.45所示的第五检测探针;
第八组合,包括SEQ ID NO.46~47所示的第八甲基化引物对和SEQ ID NO.48所示的第六检测探针;
第九组合,包括SEQ ID NO.49~50所示的第九甲基化引物对和SEQ ID NO.51所示的第七检测探针;
第十组合,包括SEQ ID NO.52~53所示的第十甲基化引物对和SEQ ID NO.54所示的第八检测探针。
优选地,上述核酸组合物还包括扩增内参基因的检测引物对和内参基因的检测探针;上述检测探针和上述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团。
本发明还提供了一种用于前列腺癌或癌前病变检测的试剂盒,其包括上述核酸组合物。
优选地,上述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种;上述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
本发明还提供了上述核酸组合物或上述试剂盒在制备前列腺癌或癌前病变检测产品中的应用。
优选地,上述前列腺癌或癌前病变包括高级别前列腺上皮内瘤变、Ⅰ期前列腺癌、Ⅱ期前列腺癌、Ⅲ期前列腺癌和Ⅳ期前列腺癌中的至少一种。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
(1)本发明提供的一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物和试剂盒,通过检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平诊断前列腺癌组织样本、血浆样本和尿液样本的性能优异,提供了能够用于前列腺癌检测的甲基化生物标志物。上述试剂盒检测前列腺癌癌前病变(高级别前列腺上皮内瘤变)尿液样本的灵敏度可达64.41%,检测前列腺癌尿液样本的灵敏度可达88.03%,检测健康人尿液样本的特异性可达96%。
(2)相较于现有技术,本发明提供的试剂盒对前列腺癌癌前病变(高级别前列腺上皮内瘤变)、早期(Ⅰ期+Ⅱ期)前列腺癌和中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)前列腺癌等不同病理阶段的前列腺癌均具有良好的检测效果,可以有效提高前列腺癌癌前病变和早期癌变的检出率,有利于提高患者的生命质量和存活率。该试剂盒检测前列腺癌癌前病变(高级别前列腺上皮内瘤变)尿液样本的灵敏度可达64.41%,检测早期(Ⅰ期+Ⅱ期)前列腺癌患者尿液样本的灵敏度可达84.42%,检测中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)前列腺癌尿液样本的灵敏度可达92.31%,检测健康人尿液样本的特异性可达96%。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中,受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。一些实施例中,哺乳动物可以是人。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”前列腺癌或癌前病变是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有前列腺癌或癌前病变。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“生物标志物”是指可以标记系统、器官、组织、细胞及亚细胞结构或功能的改变或可能发生的改变的生化指标,如蛋白质、DNA或RNA等,具有非常广泛的用途。生物标志物可用于疾病诊断、判断疾病分期或者用来评价新药或新疗法在目标人群中的安全性及有效性。筛选可用于疾病筛查、早期诊断的生物标志物可大大提高患者的临床治疗效果。术语“甲基化生物标志物”是指一种生化指标,其包括至少一个甲基化基因座和/或至少一个甲基化基因座的甲基化状态,例如高甲基化基因座。特别地,甲基化生物标志物是甲基化状态在癌症个体和非癌个体呈现差异化的一个或多个核酸基因座。其中,“甲基化基因座”是指包含至少一个差异甲基化区域的DNA区域或片段。在选定的条件下,例如癌症状态下,甲基化基因座是高甲基化的,即相比于非癌状态包括更多数量或频率的甲基化位点;或者,在癌症状态下,甲基化基因座可以是低甲基化的,即相比于非癌状态包括较少数量或频率的甲基化位点。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应,PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在组织样本中Ct≤38),则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术也是基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,但是qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
本发明提供了一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物,其为用于检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平的核酸组合物,以GRCh38为参考基因组,所述前列腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项:
(a)Chr19:45876820-45877222正链的全长或部分区域,所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;和/或,Chr19:45876820-45877222负链的全长或部分区域,所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子;
(c)与(a)具有85%以上序列一致性的多核苷酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
一些实施例中,上述Chr19:45876820-45877222正链的部分区域选自Chr19:45876820-45876944正链、Chr19:45876878-45877049正链、Chr19:45877035-4587712正链和Chr19:45877063-45877190正链中的至少一个;上述Chr19:45876820-45877222负链的部分区域选自Chr19:45876822-45876912负链、Chr19:45876853-45877031负链、Chr19:45876992-45877120负链和Chr19:45877113-45877222负链中的至少一个。
一些实施例中,上述前列腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.1~2、SEQ IDNO.4~5和SEQ ID NO.15~30所示核苷酸序列中的至少一个。
发明人发现,上述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平与前列腺或癌前病变之间存在显著的相关性。上述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化状态可以被量化,并用于衡量其甲基化水平。一些实施例中,包含上述前列腺癌甲基化生物标志物的样本可以广泛地采集自受试者的器官、组织、细胞和体液等,特别是可以采集自受试者的尿液进行无创检测。一些实施例中,上述前列腺癌甲基化生物标志物也可以使用DNA重组技术、PCR法、利用DNA/RNA自动合成仪的方法等一般的技术来合成。上述前列腺癌甲基化生物标志物在前列腺癌早期筛查/诊断、前列腺癌患病风险预测、前列腺癌预后预测、前列腺癌相关药物评估等方面的应用可实现筛查/诊断、预测、评估的灵敏度和特异性的提高。一些实施例中,上述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平可以通过使用上述核酸组合检测受试者生物样本而获得。
一些实施例中,上述核酸组合物包括用于扩增上述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化引物对。
一些实施例中,上述核酸组合物包括用于扩增上述Chr19:45876820-45877222正链的全长或部分区域的甲基化引物对,和/或,用于扩增上述Chr19:45876820-45877222负链的全长或部分区域的甲基化引物对。
较佳实施例中,上述用于扩增上述Chr19:45876820-45877222正链的全长区域的甲基化引物对包括SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对;上述用于扩增上述Chr19:45876820-45877222负链的全长区域的甲基化引物对包括SEQ ID NO.9~10所示的第二甲基化引物对。
较佳实施例中,上述用于扩增上述Chr19:45876820-45877222正链的部分区域的甲基化引物对包括SEQ ID NO.31~32所示的第三甲基化引物对、SEQ ID NO.34~35所示的第四甲基化引物对、SEQ ID NO.37~38所示的第五甲基化引物对和SEQ ID NO.40~41所示的第六甲基化引物对中的至少一个;上述用于扩增上述Chr19:45876820-45877222负链的部分区域的甲基化引物对包括SEQ ID NO.43~44所示的第七甲基化引物对、SEQ ID NO.46~47所示的第八甲基化引物对、SEQ ID NO.49~50所示的第九甲基化引物对和SEQ IDNO.52~53所示的第十甲基化引物对中的至少一个。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括用于扩增上述前列腺癌甲基化生物标志物的非甲基化引物对。较佳实施例中,上述非甲基化引物对包括用于扩增上述Chr19:45876820-45877222正链的全长区域的第一非甲基化引物对,和/或,用于扩增上述Chr19:45876820-45877222负链的全长区域的第二非甲基化引物对。
在本发明较佳实施例中,上述核酸组合物包括如下至少一个组合:
第一组合,包括SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.11~12所示的第一非甲基化引物对;
第二组合,包括SEQ ID NO.9~10所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13~14所示的第二非甲基化引物对。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括检测探针。在本发明较佳实施例中,上述核酸组合物包括如下至少一个组合:
第三组合,包括SEQ ID NO.31~32所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.33所示的第一检测探针;
第四组合,包括SEQ ID NO.34~35所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.36所示的第二检测探针;
第五组合,包括SEQ ID NO.37~38所示的第五甲基化引物对和SEQ ID NO.39所示的第三检测探针;
第六组合,包括SEQ ID NO.40~41所示的第六甲基化引物对和SEQ ID NO.42所示的第四检测探针;
第七组合,包括SEQ ID NO.43~44所示的第七甲基化引物对和SEQ ID NO.45所示的第五检测探针;
第八组合,包括SEQ ID NO.46~47所示的第八甲基化引物对和SEQ ID NO.48所示的第六检测探针;
第九组合,包括SEQ ID NO.49~50所示的第九甲基化引物对和SEQ ID NO.51所示的第七检测探针;
第十组合,包括SEQ ID NO.52~53所示的第十甲基化引物对和SEQ ID NO.54所示的第八检测探针。
一些实施例中,上述核酸组合物还包括用于扩增内参基因的检测引物对和内参基因的检测探针。本发明并不对上述内参基因进行限定,上述内参基因可以是但不限于ACTB。在本发明具体实施例中,上述内参基因为ACTB,上述用于扩增内参基因ACTB的检测引物对包括上游引物和下游引物,上游引物为:AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ IDNO.55),下游引物为:AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.56);上述内参基因ACTB的检测探针为:GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.57)。
一些实施例中,上述甲基化引物对和检测探针可以使用DNA自动合成装置来化学合成,本申请并不对DNA自动合成装置进行限定,本领域技术人员可根据情况进行选择。
一些实施例中,上述检测探针和上述内参基因的检测探针均为荧光探针,例如为TaqMan探针,其中检测探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团。本发明并不对上述荧光报告基团和上述荧光淬灭基团进行限定,本领域技术人员可根据实际情况选择合适的荧光基团。一些实施例中,上述荧光报告基团包括但不限于FAM、ROX、CY5和VIC;上述荧光淬灭基团包括但不限于TAMRA、BHQ、MGB和NFQ。
本发明还提供了一种用于前列腺癌或癌前病变检测的试剂盒,其包括上述核酸组合物。
一些实施例中,上述试剂盒还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。上述甲基化转化试剂包括但不限于亚硫酸氢盐转化试剂和重亚硫酸氢盐转化试剂。
一些实施例中,上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+。上述阳性对照是指其中包含甲基化的生物标志物,用于监测试剂的检测性能;上述阴性对照是指其中不包含甲基化的生物标志物,用于监测实验是否受到污染。
一些实施例中,上述试剂盒还可以包括至少一个设备的任何制品(例如,包装或容器)。容器可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器和/或其他容器。试剂盒还可以包括用于接收生物样本的适合装置、用于实施在本文中描述的方法或其步骤中使用的说明书。
一些实施例中,上述生物样本包括但不限于分离自受试者的器官、组织、细胞和/或体液的组合物。一些实施例中,体液包括但不限于组织液、唾液、尿液、灌洗液(例如,膀胱灌洗液)、前列腺液、精液等,或其组合。一些实施例中,上述生物样本来自受试者尿液,特别是尿液的有形成分。尿液有形成分可包含循环游离核酸(例如,来源于前列腺的循环游离DNA(cfDNA))、循环肿瘤细胞(CTCs)(例如,前列腺肿瘤释放的肿瘤细胞)和脱落细胞(例如,尿路系统脱落的细胞)中的一种或多种。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平进行检测,对前列腺癌或癌前病变进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本发明的保护范围。上述检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了上述核酸组合物或上述试剂盒在制备前列腺癌或癌前病变检测产品中的应用。一些实施例中,上述前列腺癌或癌前病变检测产品包括试剂盒、芯片和测序文库中的至少一种。
一些实施例中,上述前列腺癌或癌前病变包括高级别前列腺上皮内瘤变、Ⅰ期前列腺癌、Ⅱ期前列腺癌、Ⅲ期前列腺癌和Ⅳ期前列腺癌中的至少一种。
本发明还提供了上述核酸组合物或上述试剂盒在检测前列腺癌或癌前病变或用在检测患有前列腺癌或癌前病变的风险提高、疑似患有前列腺癌或癌前病变或已经患有前列腺癌或癌前病变的受试者的用途。
本发明还提供了一种通过检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平进而检测前列腺癌或癌前病变的方法,包括如下步骤:
S1、提取受试者尿液样本的DNA,采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化;
S2、采用本发明提供的上述试剂盒进行qPCR扩增,通过qMSP法检测前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平;
S3、基于S2的结果,进而判断待测尿液样本为前列腺癌阴性或阳性。
本发明提供的上述方法能够低侵袭性地进行灵敏度和特异性高的前列腺癌或癌前病变的早期诊断,由此带来早期的治疗和预后的改善,进一步地,还能够监视疾病憎恶、监视外科治疗、放射线疗法的治疗和化学疗法的治疗的有效性。
本发明提供的上述方法还可以与直肠诊、经直肠的前列腺超声波检查、CT检查、MRI检查、骨闪烁显像检查等图像诊断法组合。本发明的方法能够特异性地检测前列腺癌或癌前病变,能够有效区分前列腺癌患者和健康人。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。
实施例1桑戈尔测序法检测目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌组织样本的性能
以Chr19:45876820-45877222的DNA作为目标区域,通过桑戈尔测序法检测目标区域的甲基化水平,进而分析其检测前列腺癌组织样本的性能。
1)样本收集
收集经组织病理活检确诊的前列腺癌组织样本86例,收集前列腺癌旁正常组织样本34例,所收集的组织样本均为经福尔马林固定且经石蜡包埋的样本。另收集86例健康人的抗凝血样本。血液样本收集过程如下:从每名志愿者体内抽取大于8mL静脉血,收集的抗凝血样本经室温静置后,3000rpm离心10min,共离心两次,分别收集血浆样本和血细胞样本。所有样本的收集过程已获得伦理委员会的审批,所有志愿者在样本收集前均已签署知情同意书。
2)样本DNA的提取、转化和纯化
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取石蜡包埋的组织样本基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。使用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取血液白细胞基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的DNA进行转化,并对转化的DNA进行纯化,用于后续实验,具体操作参见试剂盒说明书。
3)桑戈尔测序
以Chr19:45876820-45877222的DNA作为目标区域,获得该区域DNA正链、DNA负链及经亚硫酸氢盐转化后的DNA的核苷酸序列,具体如表1所示。分别以SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.5作为模板,设计用于桑戈尔测序的甲基化检测引物对,以便于扩增待测样本中发生甲基化的目标区域的正链和负链;分别以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6作为模板,设计用于桑戈尔测序的非甲基化检测引物对,以便于扩增待测样本中未甲基化的目标区域的正链和负链。所述甲基化检测引物对和非甲基化检测引物对的核苷酸序列见表2。
表1目标区域的DNA核苷酸序列
表2用于桑戈尔测序的甲基化检测引物对和非甲基化检测引物对的核苷酸序列
将表2中所展示的引物对分别人工合成备用。以从前列腺癌组织样本、癌旁正常组织样本、健康人白细胞样本中提取且经亚硫酸氢盐转化的DNA为模板,使用表2中提供的引物对进行PCR扩增。对于某一待测样本,需配置4管PCR体系,其中两管分别加入甲基化检测引物对(核酸组合1和核酸组合2),而另外两管分别加入非甲基化检测引物对(核酸组合3和核酸组合4),4管反应体系的其它成分相同。PCR反应的体系配置如表3所示,PCR扩增程序如表4所示。PCR扩增结束后,使用琼脂糖凝胶电泳检测每个反应管中是否存在扩增产物,若电泳结果显示在目标产物大小处有明显的电泳条带,认为扩增成功,PCR扩增的结果如表5所示。
表3 PCR反应体系
组分 | 体积 |
5×PrimeSTAR Buff(Mg2+Plus) | 10μL |
dNTP Mixture(2.5mM each) | 4μL |
甲基化(或非甲基化)上游引物(10μM) | 1μL |
甲基化(或非甲基化)下游引物(10μM) | 1μL |
模板DNA | 200ng |
PrimeSTAR HSDNA Polymerase(2.5U/μL) | 0.5μL |
灭菌水 | 补足至50μL |
表4 PCR扩增程序
表5 PCR扩增结果
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由表5可以看出,甲基化检测引物对(核酸组合1和2)、非甲基化检测引物对(核酸组合3和4)均可扩增超过94%的前列腺癌组织样本来源的模板,说明绝大部分从癌组织中提取的模板中既含有甲基化的DNA也含有未甲基化的DNA;非甲基化检测引物对(核酸组合3和4)可以扩增所有的癌旁组织样本来源的模板,而甲基化检测引物对(核酸组合1和2)仅可扩增低于36%的癌旁组织样本,说明本实施例收集的所有癌旁组织样本其模板中均含有非甲基化的DNA,然而,约32%~36%的癌旁组织样本的模板中含有甲基化的DNA;另外,甲基化检测引物对(核酸组合1和2)仅对低于6%的健康人白细胞来源的模板产生扩增产物,而非甲基化检测引物对(核酸组合3和4)则对所有健康人白细胞来源的模板有扩增,说明健康人白细胞样本中的模板DNA主要为非甲基化的。
将上述扩增成功的PCR产物切胶回收后送测序公司进行桑戈尔测序,为保证测序的准确性,测序从双端进行,测序所用的引物对如表2所示。根据桑戈尔测序的结果,分析各个样本中目标区域内各个CpG位点甲基化水平,且需同时分析针对某一检测区域的甲基化引物对的扩增产物和非甲基化引物对的扩增产物的测序结果。
对于一个CpG位点,如果测序结果为CG,则该位点为完全甲基化的;如果测序结果为CG和TG(双峰),则该位点为不完全甲基化的,上述两种情况均认为该位点是甲基化的;如果测序结果为TG,则该位点为完全非甲基化的。对于某一个确定的CpG位点,1)如果甲基化引物对和非甲基化引物对的扩增产物的测序结果均为CG,则该位点是完全甲基化的;如果甲基化引物对的扩增产物的测序结果为CG,非甲基化引物对的扩增产物的测序结果为TG,认为该样本中此CpG位点是部分甲基化的;上述两种情况均认为该CpG位点是甲基化的。2)如果非甲基化引物对无扩增,甲基化引物对的扩增产物的测序结果为CG,则认为该样本中此CpG位点是甲基化的。3)如果甲基化引物对无扩增,非甲基化引物对的扩增产物的测序结果为TG,则认为该样本中此CpG位点是非甲基化的。4)如果甲基化引物对和非甲基化引物对的扩增产物的测序结果均为TG,则该位点是非甲基化的。
按照上述判断标准,使用桑戈尔测序法分析86例前列腺癌组织样本、34例前列腺癌旁组织样本及86例健康人白细胞样本中目标区域各个CpG位点的甲基化水平。Chr19:45876820-45877222所示的正、负链DNA序列(区域1和区域2)内共有25个CpG位点。结果发现,对于前列腺癌组织样本,有81例在区域1中有大于等于23个CpG位点发生了甲基化,有82例在区域2中有大于等于23个CpG位点发生了甲基化;对于前列腺癌旁正常组织样本,有22例在区域1中所有CpG位点均为非甲基化的,有21例在区域2中所有CpG位点均为非甲基化的;对于健康人白细胞样本,分别有81例和82例样本在区域1和区域2中所有CpG位点均为非甲基化的。统计结果如表6所示。
表6甲基化的CpG位点在前列腺组织样本和白细胞样本中的分布频数
对于某一待测样本,如果扩增子中95%以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的,则认为此样本中该目标区域是甲基化阳性的;如果扩增子中所有CpG位点都是未甲基化的,则认为此样本中该目标区域是甲基化阴性的。根据上述标准计算各类样本中的甲基化阳性数目和甲基化阴性数目,并计算甲基化阳性和甲基化阴性的比例。灵敏度是指病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例。特异性是指病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例,统计结果如表7所示。
表7桑戈尔测序法分析目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌组织样本的性能
通过桑戈尔测序法检测目标区域(区域1和区域2)的甲基化水平进而检测前列腺癌组织样本和健康人白细胞样本的性能优异。通过检测区域1、区域2的甲基化水平,检测前列腺癌组织样本的灵敏度分别为94.19%和97.62%,检测健康人白细胞样本的特异性分别为94.19%和95.35%,但是,所示目标区域检测前列腺癌旁组织样本的特异性较差。考虑到在进行前列腺癌筛查或早期诊断时,通常采用体液样本而不是组织样本作为受试样本,而所述目标区域(Chr19:45876820-45877222的DNA)在健康人白细胞样本中特异性优异,因此目标区域(区域1和区域2)具有良好的区分前列腺癌和非癌样本的潜力。由表7可看出,对大量前列腺癌样本和非癌样本(健康人白细胞样本)进行桑戈尔测序,在前列腺癌组织样本中Chr19:45876820-45877222的DNA区域展示出高甲基化水平,而非癌样本(健康人白细胞样本)中该区域展示出极低的甲基化水平,因此,该目标区域具备区分前列腺癌样本和非癌样本的能力,可作为一个潜在的用于液体活检的甲基化生物标志物。
实施例2qMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌患者血液样本的性能
1)样本收集
实施例2共招募了301名受试者,包括142例经组织病理活检确诊的前列腺癌患者、59例高级别前列腺上皮内瘤变(HGPIN)患者和100例健康人,其中142例前列腺癌患者中,早期(Ⅰ期+Ⅱ期)患者77例,中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)患者65例。分别收集上述受试者的血液样本和尿液样本。每份血液样本的体积为8~10mL。每份尿液样本的体积大于50mL,尿液样本均为晨尿。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2)血浆样本游离DNA的提取、转化和纯化
使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取,具体操作参见试剂盒说明书。采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号)对提取的血浆游离DNA进行转化,随后对转化的DNA进行纯化,用于后续实验,具体操作步骤参见试剂盒说明书。
3)qMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌患者和健康人的血液样本
分别以区域1经亚硫酸氢盐转化后的序列(SEQ ID NO.2)和区域2经亚硫酸氢盐转化后的序列(SEQ ID NO.5)作为模板,设计用于各个子区域的甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)扩增的引物对和TaqMan检测探针,其中区域1的子区域包括区域1-1(Chr19:45876820-45876944正链),区域1-2(Chr19:45876878-45877049正链),区域1-3(Chr19:45877035-45877122正链)和区域1-4(Chr19:45877063-45877190正链);区域2的子区域包括区域2-1(Chr19:45876822-45876912负链),区域2-2(Chr19:45876853-45877031负链),区域2-3(Chr19:45876992-45877120负链)和区域3-4(Chr19:45877113-45877222负链),各个子区域的核苷酸序列见表8。
本实施例中,要求上述引物对具有良好的扩增特异性,即该引物对仅扩增发生甲基化的DNA模板,而不扩增未发生甲基化的DNA模板,同时也不会引起其它非特异性扩增;另外,要求该引物对具有良好的扩增效率,即其对各个部分区域的扩增效率在90%~110%之间。为满足上述要求,分别设计多对引物对和检测探针用以扩增区域1的部分区域和区域2的部分区域,所述引物对和检测探针的核苷酸序列如表9所示。
表8各个子区域的核苷酸序列
表9检测引物对和检测探针的核苷酸序列
表9中的探针均为TaqMan探针,其5’端为荧光报告基团,如FAM、ROX、VIC、CY5等,其3’端为荧光淬灭基团,如TAMRA、BHQ、NFQ、MGB等。本实施例中,每个qPCR反应体系需检测2个目标基因,分别为甲基化生物标志物的目标区域和内参基因ACTB。此时,目标区域特异性的TaqMan探针其5’端荧光报告基团为FAM,其3’端为荧光淬灭基团NFQ;ACTB基因的检测引物对和检测探针见表8,其检测探针5’端荧光报告基团为ROX,3’端荧光淬灭基团为BHQ。将上述引物、探针人工合成备用。以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的血浆样本中的游离DNA作为模板,分别使用表9中提供的引物对和检测探针进行qMSP反应,qMSP的扩增体系见表10,扩增程序见表11。在对每个样本进行qPCR反应时,均需要检测内参基因ACTB的量,用以监测样本质量及结果判读。在每块PCR反应板内,除设置实验孔用以检测待测样本以外,还需要同时设置阳性对照孔和阴性对照孔。阳性对照孔的模板为103copies/μL含转化后ACTB序列的质粒和103copies/μL含转化后目标区域DNA序列(SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5)的质粒混合物(等体积混合),其它成分与实验管相同;阴性对照孔的模板为TE缓冲液,其它成分也与实验管相同。
表10 qMSP反应体系
组分 | 体积(μL) |
5X Platinum II PCR Buffer | 5 |
dNTPs(2.5mM each) | 3 |
每一目标区域的上游引物(10μM) | 0.5 |
每一目标区域的下游引物(10μM) | 0.5 |
每一目标区域的检测探针(10μM) | 0.5 |
ACTB上游引物(10μM) | 0.5 |
ACTB下游引物(10μM) | 0.5 |
ACTB检测探针(10μM) | 0.5 |
Platinum II Taq Hot-Start DNA Polymerase(5U/μL)Cat:14966005 | 0.2 |
待测样本DNA | 5 |
超纯水 | 补至25 |
表11 qMSP反应程序
qPCR反应结束后,调整基线(一般将第3~15个循环所对应的信号值设置为基线水平),并设置阈值,阈值必须位于指数扩增期内,穿越阈值与X轴平行的直线称为阈值线,阈值线与扩增曲线的交点所对应的循环数即为Ct值。分析qPCR反应的结果,要求①阴性对照管无扩增;②阳性对照PCR管有明显的指数增长期,且阳性对照PCR管的目标基因的Ct值在26~30之间;③待测样本的内参基因ACTB的Ct值小于等于33。若阳性对照、阴性对照和内参基因均满足上述要求,则可以分析待测样本的检测结果并进行结果判读,否则,当次实验无效,必须重新进行检测。
结果判读:对于血浆样本,阳性判断值为43,若使用某一对检测引物对和探针进行扩增的Ct值≤43,认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性,该样本为前列腺癌阳性样本;若使用某一对检测引物对和探针进行扩增的Ct值>43,认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性,该样本为前列腺癌阴性样本。根据以上标准,使用qMSP法检测目标区域各个子区域的甲基化水平进而诊断前列腺癌患者血浆样本和健康人血浆样本的性能如表12所示。
表12 qMSP法检测目标区域各个子区域的甲基化水平诊断前列腺癌血浆样本的性能
由表12可以看出,通过qMSP法检测目标区域内各个子区域的甲基化水平进而诊断前列腺癌患者血浆样本的性能良好,且8个子区域的诊断性能无显著差异。具体地,表12中8个子区域检测前列腺癌前病变患者(高级别前列腺上皮内瘤变)血浆样本的灵敏度范围为42.37%~54.24%,检测早期(Ⅰ期+Ⅱ期)和中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)前列腺癌患者血浆样本的灵敏度范围分别为70.13%~76.62%和81.54%~89.23%,其检测前列腺癌患者血浆样本的总灵敏度范围为76.06%~82.39%,其检测健康人血浆样本的特异性范围为96%~99%。其中,通过检测区域1-3的甲基化水平检测前列腺癌血浆样本的性能最佳,其检测前列腺癌前病变患者血浆样本的灵敏度最高可达54.24%,检测前列腺癌患者血浆样本的灵敏度为89.23%,检测健康人血浆样本的特异性为98%。
实施例3 qMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌患者尿液样本的性能
1)样本收集同见实施例2。
2)尿液样本中DNA的提取、转化和纯化
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取,具体操作按照试剂盒说明书进行。尿液样本中DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作步骤见试剂盒说明书。
3)qMSP法检测目标区域的甲基化水平诊断前列腺癌患者和健康人的尿液样本
具体的检测方法、质控标准同实施例2。
结果判读:对于尿液样本,阳性判断值为38,若使用某一对检测引物对和探针进行扩增的Ct值≤38,认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性,该样本为前列腺癌阳性样本;若使用某一对检测引物对和探针进行扩增的Ct值>38,认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性,该样本为前列腺癌阴性样本。根据以上标准,使用qMSP法检测目标区域各个子区域的甲基化水平进而诊断前列腺癌患者尿液样本和健康人尿液样本的性能如表13所示。
表13 qMSP法检测目标区域各个子区域的甲基化水平诊断前列腺癌尿液样本的性能
由表13可以看出,通过qMSP法检测目标区域内各个子区域的甲基化水平进而诊断前列腺腺癌患者尿液样本的性能优异,同血浆样本的趋势一致,8个子区域的诊断性能无显著差异。具体地,8个子区域检测前列腺癌癌前病变(高级别前列腺上皮内瘤变)患者尿液样本的灵敏度范围为55.93%~64.41%,其中除区域1-4和区域2-1外,其它子区域检测前列腺上皮内瘤变尿液样本的灵敏度均大于60%。8个子区域检测早期(Ⅰ期+Ⅱ期)前列腺癌患者尿液样本的灵敏度范围为77.92%~84.42%,除区域1-1和区域1-4外,其它子区域检测早期(Ⅰ期+Ⅱ期)前列腺癌患者尿液样本的灵敏度均大于80%。8个子区域检测中晚期(Ⅲ期+Ⅳ期)前列腺癌患者尿液样本的灵敏度范围均大于86%,其中区域1-3、区域2-1和区域2-3的检测灵敏度甚至大于90%。8个子区域检测前列腺癌患者尿液样本的总灵敏度范围为83.10%~88.03%,检测健康人尿液样本的特异性范围为92%~96%。
与表12相比,采用qMSP法检测前列腺癌患者尿液样本中目标区域的甲基化水平检测前列腺癌的灵敏度高于血浆样本,推测可能与尿液中含有更多的循环肿瘤细胞及循环肿瘤DNA有关。综上,通过qMSP法检测前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平可以有效提高前列腺癌癌前病变和早期癌变的检出率,有利于提高患者的生命质量和存活率。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于前列腺癌或癌前病变检测的核酸组合物,其特征在于,其为用于检测样本中前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化水平的核酸组合物,以GRCh38为参考基因组,所述前列腺癌甲基化生物标志物选自(a)-(c)中至少一项:
(a)Chr19:45876820-45877222正链的全长或部分区域,所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;和/或,Chr19:45876820-45877222负链的全长或部分区域,所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点;
(b)(a)中CpG二核苷酸位点发生部分甲基化或全部甲基化的多核苷酸分子;
(c)与(a)具有85%以上序列一致性的多核苷酸分子,其CpG二核苷酸位点与(a)保持一致。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物,其特征在于,所述前列腺癌甲基化生物标志物选自SEQ ID NO.1~2、SEQ ID NO.4~5和SEQ ID NO.15~30所示核苷酸序列中的至少一个。
3.根据权利要求1所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物包括用于扩增所述前列腺癌甲基化生物标志物的甲基化引物对。
4.根据权利要求3所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括用于扩增所述前列腺癌甲基化生物标志物的非甲基化引物对;
所述核酸组合物包括如下至少一个组合:
第一组合,包括SEQ ID NO.7~8所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.11~12所示的第一非甲基化引物对;
第二组合,包括SEQ ID NO.9~10所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.13~14所示的第二非甲基化引物对。
5.根据权利要求3所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括检测探针;
所述核酸组合物包括如下至少一个组合:
第三组合,包括SEQ ID NO.31~32所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.33所示的第一检测探针;
第四组合,包括SEQ ID NO.34~35所示的第四甲基化引物对和SEQ ID NO.36所示的第二检测探针;
第五组合,包括SEQ ID NO.37~38所示的第五甲基化引物对和SEQ ID NO.39所示的第三检测探针;
第六组合,包括SEQ ID NO.40~41所示的第六甲基化引物对和SEQ ID NO.42所示的第四检测探针;
第七组合,包括SEQ ID NO.43~44所示的第七甲基化引物对和SEQ ID NO.45所示的第五检测探针;
第八组合,包括SEQ ID NO.46~47所示的第八甲基化引物对和SEQ ID NO.48所示的第六检测探针;
第九组合,包括SEQ ID NO.49~50所示的第九甲基化引物对和SEQ ID NO.51所示的第七检测探针;
第十组合,包括SEQ ID NO.52~53所示的第十甲基化引物对和SEQ ID NO.54所示的第八检测探针。
6.根据权利要求5所述的核酸组合物,其特征在于,所述核酸组合物还包括扩增内参基因的检测引物对和内参基因的检测探针;
所述检测探针和所述内参基因的检测探针的5’端包含有荧光报告基团,3’端包含有荧光淬灭基团。
7.一种用于前列腺癌或癌前病变检测的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1~6任一项所述的核酸组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,其还包括核酸提取试剂、核酸纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种;所述扩增试剂包括扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。
9.权利要求1~6任一项所述的核酸组合物或权利要求7或8所述的试剂盒在制备前列腺癌或癌前病变检测产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述前列腺癌或癌前病变包括高级别前列腺上皮内瘤变、Ⅰ期前列腺癌、Ⅱ期前列腺癌、Ⅲ期前列腺癌和Ⅳ期前列腺癌中的至少一种。
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