CN115961038A

CN115961038A - 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN115961038A
Application number: CN202211430609.3A
Authority: CN
Inventors: 罗诗雅; 高堂杰; 陈明; 赵浩强; 吴康; 刘佳; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2022-11-15
Filing date: 2022-11-15
Publication date: 2023-04-14

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及胃癌检测领域。本发明提供了一种用于检测胃癌的组合物，包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：OTX1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；ZNF671基因中如SEQ IDNO:2所示的区域；以及ELMO1基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。同时，还提供了包括该组合物的试剂盒，所述组合物的用途。能够在临床上以高灵敏度和好特异性对胃癌进行检测；在临床上，在胃癌的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

Description

一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于胃癌检测领域，更具体地，涉及胃癌基因标志物的甲基化水平的检测。

背景技术

国家癌症中心2022年发布的全国恶性肿瘤统计数据显示，目前我国整体癌症发病率、死亡率仍持续上升，新发病例高达406.4万，死亡病例达241.4万，人数均远超世界其他国家，恶性肿瘤已成为严重威胁中国人群生命健康的主要公共卫生问题之一。其中，胃癌的发病率和死亡率均排在所有癌症类型中的第三位，发病人数较多，且预后不佳，防控形势严峻。研究表明，胃癌的总体预后与其诊断阶段密切相关，自然病史较长，发病过程缓慢。早期胃癌局限于粘膜和粘膜下层，在接受手术治疗后，5年生存率可达90％，但早期胃癌没有明显症状，易被忽视，因此大多数胃癌病例通常在中晚期发现确诊，术后5年生存率较低，小于30％。目前，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌的治疗费用分别约为0.5-2万元、3-5万元、10万元/年、15-20万元/年，相较于早期，中晚期胃癌治疗困难且费用昂贵。由此可见，胃癌早筛查和早诊断不但能提高患者生存率，同时也能减少国家和个人医疗支出负担。而如何在胃癌早期就能检测，实现真正的胃癌早筛和早干预，是一个迫切且艰巨的任务。

目前，胃癌早筛传统手段主要包括胃镜检查、影像学检查、血清学检查，但普遍存在一定局限性。胃镜及镜下活检是胃癌诊断的金标准，能较早发现胃癌，但属于侵入性检查，患者依从性较差，且对内镜医师专业度要求高，同时因临床匹配资源不足还存在预约周期较长的痛点，因此难以广度普及。而X射线或CT扫描等影像检查手段对早期胃癌诊断率较低，通常具有辐射、使用造影剂安全等风险。血清学筛查方法操作简便，属于非侵入性检测，目前常用的标志物包括PG、G-17、CEA、CA199等，但这些标志物检测胃癌的灵敏度和特异性较低，早期筛查诊断价值有限。

近年来，基于PCR、NGS等分子诊断技术，液体活检不断发展和突破，已成为癌症精准早筛的有力武器。从标志物的信号丰度和信号强度来看，ctDNA甲基化是较为理想的检测标志物。研究表明，抑癌基因甲基化水平升高的现象通常发生在癌症初期，是肿瘤早期发展的标志性改变；而在人类基因组CpG岛中，60-80％的胞嘧啶残基被甲基化修饰，DNA甲基化已成为癌症早筛中普遍而丰富的信号来源；此外，不同癌症类型有其独特的DNA甲基化模式，器官特异性强，可实现组织溯源。因此，ctDNA甲基化是国内外早筛企业采用的主流检测指标。

本领域亟需一种更有效的胃癌诊断产品，使得胃癌早期诊断兼具高灵敏度高特异性，且无创、快速。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于检测胃癌的组合物，所述组合物包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：

OTX1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；

ZNF671基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；以及

ELMO1基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。

OTX1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域、ZNF671基因中如SEQ ID NO:2所示的区域，以及ELMO1基因中如SEQ ID NO:3所示的区域为各自基因中启动子区域的CpG岛的一段序列。

具体地，OTX1(Genbank登录号：NC_000002.12)基因的SEQ ID NO:1区域如下所示：

GGCGTGTTTCTGCCCATTGGAGCACCCGCACACTACTCCAAATCAAAACCACTAAGAGTTCCTCCCGCGCAGACTGCTGCCCCTTCAGCTGCCCTCGATTTTGCTCCACGCCTGCCGGCCAGAGCCTCCCGGCGTTTCTTCCGCCCCAGCGGAGTGCGCTGGGGCGCGCCAGGGCTAGGCCCGCCGGAGGAGCGCGTCCCCAGCCTTCCGCGCACAGAGCCGCATCCCGCCCCGCCCTGCGCTGGACTGGTTCAAGCTTCCGCCTCGGCGGGAACGCTGTACATAGTCAGGTCCGTTCCAGGGACCACTTAAACTTTTTAGTTGCTGTTGGTTGGTTGAACTGAAC；

ZNF671(Genbank登录号：NC_000019.10)基因的SEQ ID NO:2区域如下所示：

CAGGGGCTGCAGGCACTTTACGATTCGGAGTCGGAGAAAGGGTGACTGAGGGCCCGGAGGACGCAGCACCCACCCGCGCGGAGTCCGTTAGCTCCGCCATAGGACCGTGGGCGCGGACAGCTGCCGGGAGCGGCAGGCGTCTCGATCGGGGACGCAGGCACTTCCGTCCCTGCAGAGCATCAGACGCGTCTCGGGACACTGGGGACAACATCTCCTCCGCGCTTTCCCAACACCTCCACCTGCGGCCCACACAAGCGTTACAGAACCCCGGCCAGGGACAGCCTGACAGAAACAAAATGTCCGCTACAAGGAGGAGCCGGAAGTCCCGCCCACGCACCCCCCGCAGGCACTGAAACACCCCTCTCCTGGGCCCTCATTGGGTATGCAACGTATAGGTTTGTGGGTAGAGTGTGG；

ELMO1(Genbank登录号：NC_000007.14)基因的SEQ ID NO:3区域如下所示：

ACACATATTATTTATAGCAGATCTGAGGCATGCATGGTGTTTGACATTTCTGTCTTTTAAGTAGGGGGACTTCAAAAAGTCGTGGGCATCCCCCTAGGCAAAGTGCAGTGGGCAGGGACCAGGCAGGGTGCGGGCGCAAGGCGAACGCGCAGACCACGAGTGTCCTGGCGCAGGTGCCGGGGGCGGCGGCTGCAACTCCGCAGCGTCCGCTCGGGAGGAGAGTTCGCGGCTGATCTCCGGATGCCTTGCAGATGCAAAATGTGTCTCTGGCCAGCAGGAGGAAGGAAGAGGAAGTGAGAGCAGCGGCAGCCGGCGGTGCAGCAGCCGGCCGACCCAGAGTGTAAGTGCGTGTGCTGGGGCGAGCGGGAGCGGGCGAGGATGGGCACAGGA。

使用本发明的组合物，能够在临床上以100％的灵敏度对胃癌癌组织样本进行检测；在临床上，在胃癌恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

在本发明中，“CpG岛”是胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)的缩写，指的是位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300～3000bp。

在一些实施方案中，使用本发明的检测试剂，可以对样本中所存在的相应基因上的CpG岛或者CpG岛上的一段序列的甲基化水平进行检测。

在本发明中，“样本”为选自个体的生物样本。具体地，例如，选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选地，本发明的“样本”为血浆，即血浆中的游离DNA。

血浆中的游离DNA能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此，存在灵敏度较低的问题。使用本发明的检测试剂，能够使用血浆中的游离DNA作为样本，能够在临床上以88.33％的灵敏度和96.67％的特异性进行检测。

在本发明中，“检测试剂”指的是对样本中的基因的甲基化水平进行检测的试剂。其中，所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片、甲基化荧光定量PCR的方式测量。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物、测序Tag序列，用于通过扩增-测序测量甲基化水平。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。所述芯片可以是包括但不限于例如安捷伦的Human CpG Island Microarrays和Human DNA Methylation Microarrays、Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip、Infinium HumanMethylation450BeadChip和GoldenGate Methylation Assay以及Roche NimbleGen的Human DNAMethylation 2.1M Deluxe Promoter Array、Human DNA Methylation Array等，用于通过芯片测量甲基化水平。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物以及核酸探针，用于通过甲基化荧光定量PCR测量甲基化水平。

进一步地，所述检测试剂还包括内标引物以及内标探针。

在一个具体的实施方案中，内标引物和探针的靶标为β-actin基因。

在一个优选的实施方案中，内标引物和探针的靶标为β-actin基因的如SEQ IDNO:4所示的区域。

β-actin基因(Gene bank登录号：NC_007992.1)的SEQ ID NO:4区域如下所示：

TTTTTGGCTTGACTCAGGATTTAAAAACTGGAACGGTGAAGGTGACAGCAGTCGGTTGGAGCGAGCATCCCCCAAAGTTCACAATGTGGCCGAGGACTTTGATTGCACATTGTTGTTTTTTTAATAGTCATTCCAAATATGAGATGCGTTGTTACAGGAAGTCCCTTGCCATCCTAAAAGCCACCCCACTTCTCTCTAAGGAGAATGGCCCAGTCCTCTCCCAAGTCCACACAGGGGAGGTGATAGCATTGCTTTCGTGTAAATTATGTAATGCAAAATTTTTTTAATCTTCGCCTTAATACTTTTTTATTTTGTTTTATTTTGAATGATGAGCCTTCGTGCCCCCCCTTCCCCCTTTTTTGTCCCCCAACTTGAGATGTATGAAGGCTTTTGGTCTCCCTGGGA。

当所述检测试剂包括核酸引物以及核酸探针时，所述检测试剂通过甲基化荧光定量PCR对样本中核酸的甲基化水平进行检测。

在本发明中，“甲基化荧光定量PCR”是指将待检测区域通过亚硫酸盐转化或甲基化敏感性限制性内切酶酶切，再使用针对检测靶标特异性设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测，从而得出所述待检测区域的甲基化水平。

进一步地，上述组合物还可以进一步包括其余的试剂，具体地，例如，各种对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。例如，提取样本核酸的核酸释放剂，转化所用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐等。

在一些具体的实施方案中，所述检测试剂为表1所示：

表1

在一些具体的实施方案中，本发明所采取的4个荧光通道分别为FAM、HEX、CY5及ROX通道，但实际运用当中并不仅限于此，可以是其他任何荧光通道的组合；同时不同的靶标也可以对应不同的荧光通道，如可以采用任何一个荧光通道作为内标检测通道。

使用该优选的实施方案，相比使用其余的引物和探针的组合物，其检测的灵敏度和特异性分别提高了10％左右，所以，使用该优选的组合物在临床上能够以更高的灵敏度和更好的特异性检测早期胃癌，使得早期胃癌的检测准确率进一步提升。

第二方面，本发明提供了上述组合物在制备用于检测胃癌的试剂盒中的用途。

进一步地，本发明提供了上述试剂组合在制备使用血浆游离DNA检测胃癌的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种用于检测胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括但不限于提取核酸的试剂、纯化核酸的试剂、重亚硫酸盐中的至少一种。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性样本。

具体地，阴性样本是经测序验证无目标基因甲基化的人基因组DNA。

进一步地，所述提取核酸的试剂是提取组织DNA的试剂和血浆游离DNA的试剂。

进一步地，所述提取核酸的试剂是提取血浆游离DNA的试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Mg²⁺、甲基化敏感限制性内切酶、PCR缓冲液、热启动酶中的至少一种。

进一步地，所述甲基化敏感限制性内切酶包括HpaII、HinP1I和HhaI中的至少一种。

进一步地，各组分终浓度的范围如下所示：Mg²⁺1～6mM、dNTPs 1～40mM、甲基化敏感限制性内切酶0.01～30U、引物0.1～40μM、探针0.1～20μM。

附图说明

图1为本发明组合物在0.05ng/反应中甲基化的检测；

图2为本发明组合物在20ng/反应的非甲基化DNA中无非特异扩增的检测；

图3为本发明组合物检测胃癌组织和癌旁组织的检测结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

本发明从UCSC Xena网站的TCGA数据集(https://tcga.xenahubs.net)和美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库中收集肿瘤甲基化检测数据。以胃癌和对照数据进行差异分析，对差异位点进行物理位置和基因信息注释，为保证筛选片段具有一致的甲基化水平，甲基化基因片段的筛选需要同时符合以下几点要求：1)要求所选基因片段具有不少于2个位点具有较为一致的甲基化水平；2)以胃癌和癌旁组织或正常对照组织进行差异分析，挑选胃癌样品中一致性高且与癌旁或正常组织存在高差异的甲基化基因片段；3)以胃癌和健康样本全血甲基化检测数据进行差异分析，挑选胃癌差异高甲基化的基因片段；4)最后再从中进行逐个甲基化位点的分析，从而得出候选甲基化位点。

最终确定了以OTX1、ZNF671、ELMO1三个基因启动子区域CpG岛为最佳组合的检测靶标，并采用β-actin基因作为检测内标。本发明所采用的组合物如表1和表5所示。

实施例2、临床样本的基因甲基化水平检测

阳性样本：标准甲基化人基因组DNA和目标基因非甲基化人基因组DNA混合配置而成，浓度为1ng/μL含10％标准甲基化人基因组DNA；浓度为1ng/μL含1％标准甲基化人基因组DNA；浓度为1ng/μL含0.5％标准甲基化人基因组DNA；

阴性样本：经测序验证无目标基因甲基化的人基因组DNA，2ng/μL；

甲基化敏感型性限制性内切酶：包括HpaII、HinP1I，和HhaI；

检测流程：

PCR体系配置：按照下表2的试剂配方配制PCR反应液

表2

试剂组分	单人份用量(μL)
		ME-OTX1-F(50μM)	0.22
ME-OTX1-R(50μM)	0.22
		ME-OTX1-P(50μM)	0.11
ME-ZNF671-F(50μM)	0.2
		ME-ZNF671-R(50μM)	0.2
ME-ZNF671-P(50μM)	0.1
		ME-ELMO1-F(50μM)	0.2
ME-ELMO1-R(50μM)	0.2
		ME-ELMO1-P(50μM)	0.1
ME-Actin-F(50μM)	0.2
		ME-Actin-R(50μM)	0.2
ME-Actin-P(50μM)	0.1
		PCR扩增buffer(S10)	32.25
<![CDATA[Mg<sup>2+</sup>(1M)]]>	0.2
		dNTPs(80mM)	1.5
甲基化敏感限制性内切酶mix(10U/μL)	2
		热启动酶(10U/μL)	2

将样本按照10μL/反应加入到PCR反应管，然后依次加入40μL PCR反应液，盖上PCR管盖，震荡混匀后，瞬时离心5s。

荧光PCR反应与结果分析

1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。

2)荧光检测通道选择：选择ROX通道(Reportere:ROX,Quencher:None)检测OTX1；选择FAM通道(Reportere:FAM,Quencher:None)检测ZNF671；选择HEX通道(Reportere:HEX,Quencher:None)检测ELMO1；选择CY5通道(Reportere:CY5,Quencher:None)作为内标检测管家基因β-actin；

3)荧光定量PCR反应条件为表3：

表3

4)结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值)。标准品扩增曲线如图1～2所示，本发明所提供的检测试剂灵敏度能达到0.05ng/反应(图1)，在20ng/反应的非甲基化DNA中无非特异扩增(图2)。

实施例3、本发明组合物检测临床样本的结果

收集150例临床血浆样本，其中胃癌患者血浆样本60例，健康人血浆样本60例，其他癌症患者血浆样本30例；同时也收集了150例胃癌患者癌组织石蜡切片样本。采用圣湘生物血浆游离DNA提取试剂盒对血浆cfDNA进行提取；采用圣湘生物S1008核酸提取试剂盒对石蜡组织样本进行提取；按照实施例2的流程，使用表1所示组合物在同一反应管中进行核酸样本酶切处理及PCR扩增检测。胃癌组织中三靶标基因扩增Ct值均小于32，为甲基化阳性，且与癌旁组织扩增Ct值差异显著，靶标具有较好特异性(图3)。

本发明组合物血浆样本检测特异性和灵敏度分别为95.56％和86.67％，组织样本的检测灵敏度为97.97％，具体检测结果如下表4所示。从表中还可以看出，本发明组合物的特异性较好，30例其余癌的患者，仅有两例检测为阳性。

表4

组织样本检测灵敏度(％)＝阳性检出数/阳性病例总数*100％＝100％；

血浆样本检测灵敏度(％)＝阳性检出数/阳性病例总数*100％＝88.33％；

血浆样本检测特异性(％)＝阴性检出总数/阴性样本总数*100％＝96.67％；

癌种特异性(％)＝非胃癌癌症患者阴性检出数/非胃癌癌症患者总数*100％＝93.33％，

其中阴性样本为所有非胃癌患者样本综合。

实施例4、本发明对比例组合物检测临床样本的结果

收集150例临床血浆样本，其中胃癌患者血浆样本60例，健康人血浆样本60例，其他癌症患者血浆样本30例；同时也收集了150例胃癌患者癌组织石蜡切片样本。采用圣湘生物血浆游离DNA提取试剂盒对血浆cfDNA进行提取；采用圣湘生物S1008核酸提取试剂盒对石蜡组织样本进行提取；按照实施例2的流程，使用表5所示组合物在同一反应管中进行核酸样本酶切处理及PCR扩增检测。本发明对比例组合物血浆样本检测特异性和灵敏度分别为77.78％和70.00％，组织样本的检测灵敏度为80.67％，具体检测结果如下表6所示。

表5

编号	引物/探针	序列(5’-3’)
			SEQ ID NO:17	ME-OTX1-F”	CCTTGGTGGGGACCTGGAA
SEQ ID NO:18	ME-OTX1-R”	CGTGCAGATCTCTCCTCGGC
			SEQ ID NO:19	ME-OTX1-P”	CCTGGGAAGAGCACCCACTGGGAG
SEQ ID NO:20	ME-ZNF671-F”	GCAGGTGGAGGTGTTGGGAAA
			SEQ ID NO:21	ME-ZNF671-R”	CTCCGCCATAGGACCGTGG
SEQ ID NO:22	ME-ZNF671-P”	AGGAGATGTTGTCCCCAGTGTCCCG
			SEQ ID NO:23	ME-ELMO1-F”	GAGACACTTTTGTTTCCTCCCTGG
SEQ ID NO:24	ME-ELMO1-R”	CTCAGACTTCCCCAACTGCAGA
			SEQ ID NO:25	ME-ELMO1-P”	CGCAGCCCTCACCCTGCCGA

OTX1检测序列(SEQ ID NO:26)如下所示：

AGAGAAAGAGCGAAAAAGAAACTTTCCTATCAAAATGTTTCAATTAAGAAGTAGGGTGTACGTGTGAGGGGAAGAGGACGCTGGGCTCCAACGTTTCAGTAGAAGCGCTTAAGACTTGCAAACACCCTTGGTGGGGACCTGGAACCCCGGGAGATGCCGACGAGCAAGCAGGTAAGTGGCGGCGCCCTCCCAGTGGGTGCTCTTCCCAGGCGCGAGAGTCCGGAGGGGCCGAGGAGAGATCTGCACGCCCGGAGCTGCTCCCGCGCTCTGCAAAGTAGCCTGCGCCGGCACGAGCAGCCCGCGGCGTCGGTCTCAGGTGGCGGCGCCGGGGAAGAAAACGCTGGZNF671检测序列(SEQ ID NO:27)如下所示：

CGGCTCCTCCTTGTAGCGGACATTTTGTTTCTGTCAGGCTGTCCCTGGCCGGGGTTCTGTAACGCTTGTGTGGGCCGCAGGTGGAGGTGTTGGGAAAGCGCGGAGGAGATGTTGTCCCCAGTGTCCCGAGACGCGTCTGATGCTCTGCAGGGACGGAAGTGCCTGCGTCCCCGATCGAGACGCCTGCCGCTCCCGGCAGCTGTCCGCGCCCACGGTCCTATGGCGGAGCTAACGGACTCCGCGCGGGTGGGTGCTGCGTCCTCCGGGCCCTCAGTCACCCTTTCTCCGACTCCGAATCGTAAAG

ELMO1检测序列(SEQ ID NO:28)如下所示：

CGCGCCCCGACTCGCTGACCTCGGCGCGGCAGGGGAGGGGGCCGGGACTGGGGCCGGGAGGAGGCGTCCTGCTCCGGGGGACTCCGGGCGCCGCGGAGACACTTTTGTTTCCTCCCTGGGGGCGCCGCGGCTCGGGCGGGGGTGGCCGCCGCGCTCGGCAGGGTGAGGGCTGCGGGCGCGTCGGGGCGCTCTGCAGTTGGGGAAGTCTGAGCTCCGGGGATGGCGGGAGTGGGAGTGGGAGCGGAGGGAGGGGGCGCTGGAGGTGCGGCGCCCGCGGATGAAGCGCAGGGCCCGGGGCCCGGGA

表6

Claims

1.一种用于检测胃癌的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：

OTX1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；

ZNF671基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；以及

ELMO1基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂为扩增-测序、芯片，或甲基化荧光定量PCR检测甲基化水平中所使用的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂为核酸引物、测序Tag序列、甲基化芯片、核酸探针中的任意一种或多种。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂为核酸引物和核酸探针。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述核酸引物和核酸探针为：

SEQ ID NO:5～13所示的核酸引物和探针。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述检测试剂还包括用于监测的内标上游引物、内标下游引物以及内标探针。

7.权利要求1～6中任一项所述组合物在制备用于检测胃癌的试剂盒中的用途。

8.一种用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～6中任一项所述组合物。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Mg²⁺、甲基化敏感限制性内切酶、PCR缓冲液、热启动酶中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述甲基化敏感限制性内切酶包括HpaII、HinP1I和HhaI中的至少一种。