CN111676292B

CN111676292B - 一种用于检测肝癌的组合物，试剂盒及其用途

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Publication number: CN111676292B
Application number: CN202010798562.0A
Authority: CN
Inventors: 吴康; 陈明; 何翔; 缪为民; 胡娟; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2020-08-11
Filing date: 2020-08-11
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-11
Also published as: CN111676292A

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及肝癌检测领域。本发明提供了一种用于检测肝癌的组合物，其包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：FAR1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；SH3YL1基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；以及MTHFD2基因中如SEQ ID NO:3所示的区域；同时，还提供了包括该组合物的试剂盒，所述组合物的用途。能够在临床上以高灵敏度和好特异性对肝癌进行检测；在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

Description

一种用于检测肝癌的组合物，试剂盒及其用途

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，涉及肝癌检测领域，更具体地，涉及肝癌基因标志物的甲基化水平的检测。

背景技术

原发性肝癌是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，据2019年《中国癌症报告》数据显示，2014年我国肝癌发病约364,800人；因肝癌死亡约318,800人，肝癌正严重威胁我国人民的生命和健康。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）、肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和HCC-ICC 混合型3种不同病理学类型，3者在发病机制、生物学行为、组织学形态、治疗方法以及预后等方面差异较大，其中HCC占85%～90%。临床数据显示，我国肝癌患者的5年生存率只有12.5%，显著低于邻国日本，主要原因在于我国是肝病大国，有1.2亿乙型肝炎病毒携带者。大量慢性病毒性肝炎及肝硬化患者是引起原发性肝细胞癌的高危人群；同时我们对于肝癌的早期筛查工作缺乏普遍的意识，80%的肝癌发现的时候已经是中晚期了，错过了最佳的治疗时期。然而，对于单个癌结节小于3~5cm的“小肝癌”，可采用腹腔镜肝切除术，这种小肝癌手术切除率达90%以上，创伤小、术后并发症少，切除后5年生存率可达65%。“健康中国2030”规划纲要指出，要针对高发地区重点癌症开展早诊早治工作，并且明确提出，到2030年，总体癌症5年生存率要提升15%。

在我国，肝癌高危人群主要包括：具有乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）和（或）丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染、过度饮酒、非酒精性脂肪性肝炎、长期食用被黄曲霉毒素污染的食物、各种原因引起的肝硬化、以及有肝癌家族史等人群，尤其是年龄大于40岁的男性风险更大。传统的临床诊断主要借助于肝脏超声检查和血清甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）进行肝癌早期筛查，建议高危人群至少每隔6个月进行1次检查。但是AFP筛查的灵敏度只能达到40~60%，尤其是许多早期肝癌患者的AFP水平总是维持在一个正常水平；而在很多肝硬化患者中却存在着AFP异常升高的情况；超声检测则非常依赖于仪器和人为操作，受医疗资源分布的限制和医生的经验影响；超声造影和穿刺等检查则存在操作复杂、创伤等缺点，不适用于早筛早诊。

由于传统临床上的肝癌筛查方法具有上述缺陷，并且综合多种方法仍有可能难以确诊，特别是对于早期肝癌的筛查诊断，因此，亟需有效的早诊技术作为AFP的补充来弥补临床筛查资源、技术等严重匮乏的现状。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化是公认的最具肿瘤早筛价值的核酸标志物，目前已有基于DNA甲基化检测的结直肠癌、胃癌等肿瘤辅助诊断产品获得FDA或CFDA的认证，但尚无肝癌的筛查产品获批上市。

美国Exact Sciences公司基于甲基化检测的早期肝癌筛查临床研究显示，在135例HCC病例和308例对照参与的临床试验中，这一血液检测在诊断早期HCC患者时达到了71%的灵敏度和90%的特异性，该项目获得了FDA突破性医疗器械认定，但从临床数据来看依然存在灵敏度偏低的缺陷；华大数极一项基于重亚硫酸盐测序的肝癌早期诊断临床研究结果显示，在一个包含了112名肝细胞癌和96名健康对照的独立验证集，实现了高达82.9%的灵敏度和93.8%的特异性，但该研究入组的样本并不包含肝硬化、乙肝、丙肝等肝癌高风险人群，因此可能存在特异性偏低的不足。

因此，本领域需求一种基于DNA甲基化检测的兼具高灵敏度高特异性的肝癌辅助诊断产品，在肝癌的早期阶段即能进行检出，同时该产品理应具有成本低、检测流程简单等优点，能够进行广泛的临床推广。

发明内容

本发明通过搜集分析TCGA和GEO数据库中肝癌相关的甲基化数据，经过大量研究筛选出部分极具相关性的区域，通过构建多靶标联合检测体系，筛选出检测性能最优的检测组合，实现了对肝癌进行高灵敏、高特异性的临床无创诊断筛查。

第一方面，本发明提供一种用于检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：

FAR1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；

SH3YL1基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；以及

MTHFD2基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。

FAR1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域、SH3YL1基因中如SEQ ID NO:2所示的区域，以及MTHFD2基因中如SEQ ID NO:3所示的区域为各自基因中启动子区域的CpG岛的一段序列。

具体地，FAR1（Genbank登录号：NG_041826.1）基因的SEQ ID NO:1区域如下所示：

ACTCGAGATGTGGGGCGCGGGCCCATTGGCTGAGCATTCCCCCGCGAGCCTCCCGGCCGCAGGGCCCACCTCCCGGCCCTCTCTCCGCGCCCCCATTGGCCGTTCGCGTTCCGCGGGCGTCCGCTCCCGCCCCACTCCCGCCCGGAGGGAAACCGGGTTGGGGGTGAGAGGCTAAAGCAGGGAGGAGGATGACTGGTCCTGCGGATAAGGGTGTGCGCGAGAGCCAATCAAAAGCGGATGTCGAAAAGAGGCGCCGCTCCAGCCAGTCACGTCGCGAGGTGCGGTCGGGGCCGGCTGACGCGACTGCGGGCCTCAGCCAATGGGCGTGCCACTGCCCGTCCGCTCTTCAG；

SH3YL1（Genbank登录号：NC_000002.12）基因的SEQ ID NO:2区域如下所示：

GCGACCTAGAAACCCCAGAGGCATCGCCGGTTTTCCCGTCCTCCTCCTCCCACCACCGCCCAGCTCTTGAGAGGGGAGGGTGCTGCCGGACAGGTGGGTCCCCGGGTACTCACTGCTGCCCGCCCGGCCGCGGCGCCCCGTCCCGAGGCTGCCCAGGAAGAGGAAGGCGCGCTGCCCCGCCCCGCGGACAAGGAGGCCCCAGCGAGGGCGTACCTGCGGCAGGTGACGAAGGAGGCGGCGCAAAACACCCGCCGTGTACGTTTCGCGGGACAAAAACCACGCGCCCGCCGGGCCGCGCTCAGGCCTTCGCCCTCAGGGACTTCGGAACCGCCCCGTCCTCAAGATCGAAAAGCCCAGAGCCCCGCGGCGGCTCCAAGCACGGTGTTGGGGGTGGGGGTCTCAGGGAGCGCCCAGGCCCAAGGCCGCCCTGGTCCGGCGTGGACCCCGCGGGGCTCAAGGCAGGTTCCCCGCGTGACCCGCCCAGCCCCTCTATGCGAACT；

MTHFD2（Genbank登录号：NG_029162.1）基因的SEQ ID NO:3区域如下所示：

GTTGGCCCCTTCGGCTCCACCTGGCTCAACAGACAGCCAGTGGCATGCGGCAGGGACCAATGGGTGGCGGAGGGAGGCGGGGCCTGCCACGAGGCCGCAGTATAACCGCGTGGCCCGCGCGCGCGCTTCCCTCCCGGCGCAGTCACCGGCGCGGTCTATGGCTGCGACTTCTCTAATGTCTGCTTTGGCTGCCCGGCTGCTGCAGCCCGCGCACAGCTGCTCCCTTCGCCTTCGCCCTTTCCACCTCGCGGCAGTTCGGTAAGAGGGTCACAGAGCTCGGTCAGCGCGGAAAGCTGAGGGGAACGG。

使用本发明的组合物，能够在临床上以高灵敏度和好特异性对肝癌进行检测；在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

在本发明中，“CpG岛”是胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）的缩写，指的是位于基因的启动子和外显子区域，是富含CpG二核苷酸的一些区域，长度为300~3000bp。

在一些实施方案中，使用本发明的检测试剂，可以对样本中所存在的相应基因上的CpG岛或者CpG岛上的一段序列的甲基化水平进行检测。

在本发明中，“样本”为选自个体的生物样本。具体地，例如，选自细胞系、组织学切片、组织活检／石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选地，本发明的“样本”为血浆，即血浆中的游离DNA。

血浆中的游离DNA能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此，存在灵敏度较低的问题。使用本发明的检测试剂，能够使用血浆中的游离DNA作为样本进行检测，具有较高的灵敏度和准确性。

在本发明中，“检测试剂”指的是对样本中的基因的甲基化水平进行检测的试剂。其中，所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片、甲基化荧光定量PCR的方式测量。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物、测序Tag序列，用于通过扩增-测序测量甲基化水平。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。所述芯片可以是包括但不限于例如安捷伦的Human CpG Island Microarrays和Human DNA Methylation Microarrays、Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip、Infinium HumanMethylation450BeadChip和GoldenGate Methylation Assay以及Roche NimbleGen的Human DNAMethylation 2.1M Deluxe Promoter Array、Human DNA Methylation Array等，用于通过芯片测量甲基化水平。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物以及核酸探针，用于通过甲基化荧光定量PCR测量甲基化水平。

进一步地，所述检测试剂还包括内标引物以及内标探针。

在一个具体的实施方案中，内标引物和探针的靶标为B3GALT6基因。

在一个优选的实施方案中，内标引物和探针的靶标为B3GALT6基因的如SEQ IDNO:7所示的区域。

B3GALT6基因的SEQ ID NO:7区域如下所示：

GCGGAAGCGGTCGCGGGGCCGCTCCGAGGTTGACCAATGACAAGGGTGCCCGAGGCCACGTGACGGCCGCCGATTGGCCGCCGGCCTCCGAGCGCCCCGGGGCTCGGCGTCTGCGGAAG。

当所述检测试剂包括核酸引物以及核酸探针时，所述检测试剂通过甲基化荧光定量PCR对样本中核酸的甲基化水平进行检测。

在本发明中，“甲基化荧光定量PCR”是指将待检测区域通过亚硫酸盐转化，再使用设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测，从而得出所述待检测区域的甲基化水平。

在基于甲基化荧光定量PCR法的一个示例性实施方案中，样本中存在有含片段SEQID NO:1的FAR1、含片段SEQ ID NO:2的SH3YL1、含片段SEQ ID NO:3的MTHFD2，如片段SEQID NO:7所示的内标；在对样本进行亚硫酸盐转化处理后，上述片段可依次转化为SEQ IDNO:4、5、6、8所示的片段。随后使用引物和探针对转化后的样本进行实时荧光定量PCR反应，并依据反应结果判断甲基化水平。

进一步地，上述组合物还可以额外包括其余的试剂，具体地，例如，各种对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。例如，提取样本核酸的样本释放剂，转化所用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐等。

在一些具体的实施方案中，所述检测试剂为表1、表2所示：

在一个优选的实施方案中，所述检测试剂为表1所示。

使用该优选的实施方案，相比使用其余的引物和探针的组合物，其检测的灵敏度和特异性分别提高了10%左右，所以，使用该优选的组合物在临床上能够以更高的灵敏度和更好的特异性检测早期肝癌，使得早期肝癌的检测准确率进一步提升。

进一步地，所述检测试剂还包括用于监测的内标上游引物、内标下游引物以及内标探针。

在一个具体的实施方案中，所述内标上游引物、内标下游引物以及内标探针为：

引物名称	序列(5’-3’)
		bs-B3G-F	AAGCGGTCGCGGGGTCGTTTC（SEQ ID NO:27）
bs-B3G-R	CGCAAACGCCGAACCCCG（SEQ ID NO:28）
		bs-B3G-P	AGGTTGATTAATGATAAGGGTGTTCGAGG（SEQ ID NO:29）

第二方面，本发明提供了上述组合物在制备用于检测肝癌的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括提取核酸的试剂、dNTP、Mg²⁺、甲基化扩增酶、PCR缓冲液、GC增强剂中的至少一种。

进一步地，各组分的终浓度的范围如下所示：Mg²⁺2~6mM、dNTP 100~400mM、甲基化扩增酶0.01~30U、引物10~400nM、探针8~200nM。

附图说明

图1为本发明组合物检测阳性参考品的检测结果；

图2为本发明组合物检测阴性参考品的检测结果；

图3为本发明组合物检测FAR1基因样本的灵敏度结果；

图4为本发明组合物检测SH3YL1基因样本的灵敏度结果；

图5为本发明组合物检测MTHFD2基因样本的灵敏度结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、甲基化基因的筛选以及检测体系的设计

本发明通过在TCGA和GEO数据库挖掘数据并构建肝癌相关的甲基化大数据集，采用生物信息学方法构建不同甲基化位点组合的分析模型，筛选出具有应用价值的血浆游离DNA甲基化生物标志物，通过对临床样本采用高通量甲基化测序进一步筛选出具有高特异性、高灵敏度的甲基化标志物。

具体地，本发明通过如下步骤挖掘适用于血浆游离DNA甲基化的候选靶标：基于TCGA和GEO数据库中肝癌组织和健康人群全血甲基化数据进行差异分析，并筛选健康人群全血数据中低甲基化的差异位点；进一步，从TCGA数据库中提取肝癌组织和其他18种癌症上述获得的差异位点甲基化水平进行差异分析，并提取其他癌症差异低甲基化位点；进一步，对筛选到的差异位点进行物理位置和基因信息注释，为保证筛选片段具有一致的甲基化水平，要求基因片段具有不少于2个满足要求的位点。最终筛选到FAR1、FCHSD1、RNF135、SH3YL1以及MTHFD2作为候选基因。最终我们确定了以FAR1、SH3YL1以及MTHFD2三个基因为最佳组合的检测靶标，并采用B3GALT6基因作为检测内标，开发出一种用于早期肝癌筛查的检测体系。

本发明所采用的组合物如下表3和表4所示：

实施例2、本发明组合物检测参考品的检测结果以及灵敏度特异性结果

阳性参考品为标准甲基化人基因组DNA，0.01ng/µL；阴性参考品为经测序验证无目标基因甲基化的人基因组DNA，2ng/µL。

检测流程

核酸转化：分别取50ng标准甲基化人基因组DNA及野生型非甲基化人基因组DNA，采用ZYMO公司生产的亚硫酸盐转化试剂盒（D5042）进行转化及纯化回收，并将回收产物按照理论值稀释至上述浓度，即0.01ng/µL及2ng/µL，待用。

体系配置：按照下表5的试剂配方配制PCR反应液

将样本按照5µL/反应加入到PCR反应管，然后依次加入25µL PCR反应液，盖上PCR管盖，瞬时离心5s。

荧光PCR反应与结果分析

1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称；

2）荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reportere: FAM, Quencher: None）检测FAR1；选择CY5通道（Reportere: CY5, Quencher: None）检测SH3YL1；选择ROX通道（Reportere: ROX, Quencher: None）检测MTHFD2；选择HEX通道（Reportere: HEX,Quencher: None）作为内标通道检测B3GALT6；

3）荧光定量PCR反应条件为：

4）结果分析

反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）。

使用本发明实施例1所述的表3的组合物，检测阳性参考品和阴性参考品的结果分别如图1和图2所示。

取25ng标准甲基化DNA，经亚硫酸盐转化及纯化后，用25µL洗脱液进行洗脱，其浓度为1ng/µL, 取适量的洗脱液样本分别稀释至0.2ng/µL、0.02ng/µL、0.01ng/µL、0.002ng/µL后，取5µL样本进行检测，三个靶标的检测示意图如图3~图5所示，由图可知，本发明提供的引物探针能够对0.05ng/反应的标准甲基化DNA进行高效检出，而0.01ng/反应的样本则检出相对较差。

同时，如图2所示，在10ng/反应的非甲基化DNA中无非特异扩增（特异性）。

实施例3、本发明组合物检测临床样本的结果

收集临床血浆样本若干，其中初诊肝癌患者66例，乙肝（HBV）患者45例，丙肝（HCV）患者34例，肝硬化患者55例，其他癌症患者样本30例，健康人血浆样本30例；同时收集到66位肝癌患者各自对应的癌组织样本。

采用本公司的人血浆游离DNA样本提取试剂盒（S1008）对血浆样本进行核酸提取，具体步骤如下所示：

采用凯杰的FFPE样本核酸提取试剂盒进行组织样本的核酸提取，采用ZYMO公司的亚硫酸盐转化试剂盒（D5042）对所提取的核酸进行转化处理，转化量为10ng；DNA转化后按照实施例2的流程进行检测。按照以下方式进行临床结果的判读，我们按照预期设定本试剂盒的目标临床检测特异性为93%，当FAR1、SH3YL1以及MTHFD2的阳性判断Ct值分别为42、43、42时，检测特异性即为93%，以此阳性判断值进行结果判定，肝癌血浆样本的检测灵敏度为85%，组织样本的检测灵敏度为98.5%，具体如下表6所示：

组织样本检测灵敏度（%）=阳性检出数/阳性病例总数*100%=98.5%；

血浆样本检测灵敏度（%）=阳性检出数/阳性病例总数数*100%=84.8%；

血浆样本检测特异性（%）=阴性检出总数/阴性样本总数*100%=93.3%；

癌种特异性（%）=非肝癌癌症患者阴性检出数/非肝癌癌症患者总数*100%=93.3%；

其中阴性样本为所有非肝癌患者样本综合。

对326例样品，其中66例初诊肝癌患者组织和对应血浆样品，对照乙肝（HBV）患者45例，丙肝（HCV）患者34例，肝硬化患者55例，其他癌症患者样本30例，健康人血浆样本30例，按照上述方法检测的结果如图3所示（对照样品阴性检测结果部分展示）。

综上所述，采用本发明的检测靶标组合对癌组织样本的检测灵敏度达到了98.5%，说明本发明所提供的检测靶标与肝癌存在密切的相关性，且组织样本和血浆样本的检测一致性达到86.4%，说明采用血浆样本进行肝癌的筛查诊断是科学可行的；采用本发明提供的检测体系对非肝癌癌症患者血浆样本进行检测，特异性达到93.3%，说明本发明所提供的检测靶标具有良好的癌种特异性；采用本发明提供的检测体系对初诊肝癌患者血浆样本的临床检测灵敏度达到84.8%，特异性达到93%，检测性能远远高于现行的AFP检测方法，而现行的AFP（甲胎蛋白），其作为常用的肿瘤分子标记物，在临床上存在灵敏度低、特异性差的缺陷，60% 左右的原发性肝癌患者出现AFP浓度上升的现象，而另外40% 左右的肝癌患者的AFP检测是呈正常现象的，更重要的是，AFP检测对于早期肝癌患者的检出率更是不足50%。因此，本发明的组合物能够很好的作为一种补充技术应用于肝癌的早期筛查或辅助诊断。

实施例4、本发明组合物检测阳性参考品的检测结果

本发明针对候选基因的靶序列设计不同的引物探针组合（表1和表2中所示的引物和探针）进行筛选，获得检测性能最佳的组合进行后续的检测体系构建。具体的，以0.05ng/反应的甲基化阳性标准品为检测对象，重复检测30次，对所有候选引物探针进行检测灵敏度的比较，本发明表1所示的引物探针对所有靶标均能100%检出，表2所示的引物探针组合检测出率也能达到85%到95%，具体的，FAR1、SH3YL1以及MTHFD2的检出率分别为86.7%（26/30），90%(27/30)，93.3%(28/30)。

因此，本发明的表1和表2所示的引物和探针组合均能用于检测肝癌。

对比例1、其余基因为靶标的组合物检测临床样本的结果

如实施例1中所述，发明人在发明过程还筛选到了其余的基因，因此，同时以FCHSD1及RNF135基因启动子区域的CpG为检测靶标，对临床样本进行检测，其检测结果如下表7所示：

通过上述检测结果可知，FCHSD1与RNF135对于阴性样本的检测均具有良好的特异性，分别为98.1%和94.5%，但是二者的癌种特异性均较差，仅分别为50%和60%；同时二者在阳性血浆样本中的检出率分别为65.2%和45.5%，因此，二者不适合作为肝癌特异性的检测靶标对临床肝癌患者进行辅助诊断或早期筛查。

除此之外，发明人对所有靶标进行组合后分别计算灵敏度及特异性，结果如表8所示，结果表明，本发明提供的最终检测组合具有最佳的检测灵敏度及特异性，其余组合的灵敏度在74%到80%之间，值得注意的是，四基因或五基因的检测组合在灵敏度上并没有进一步的提升，而特异性反而有所下降，因此本发明最终确定了以FAR1、SH3YL1以及MTHFD2为组合的检测体系。

序列表

<110> 圣湘生物科技股份有限公司

<120> 一种用于检测肝癌的组合物，试剂盒及其用途

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actcgagatg tggggcgcgg gcccattggc tgagcattcc cccgcgagcc tcccggccgc 60

agggcccacc tcccggccct ctctccgcgc ccccattggc cgttcgcgtt ccgcgggcgt 120

ccgctcccgc cccactcccg cccggaggga aaccgggttg ggggtgagag gctaaagcag 180

ggaggaggat gactggtcct gcggataagg gtgtgcgcga gagccaatca aaagcggatg 240

tcgaaaagag gcgccgctcc agccagtcac gtcgcgaggt gcggtcgggg ccggctgacg 300

cgactgcggg cctcagccaa tgggcgtgcc actgcccgtc cgctcttcag 350

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgacctaga aaccccagag gcatcgccgg ttttcccgtc ctcctcctcc caccaccgcc 60

cagctcttga gaggggaggg tgctgccgga caggtgggtc cccgggtact cactgctgcc 120

cgcccggccg cggcgccccg tcccgaggct gcccaggaag aggaaggcgc gctgccccgc 180

cccgcggaca aggaggcccc agcgagggcg tacctgcggc aggtgacgaa ggaggcggcg 240

caaaacaccc gccgtgtacg tttcgcggga caaaaaccac gcgcccgccg ggccgcgctc 300

aggccttcgc cctcagggac ttcggaaccg ccccgtcctc aagatcgaaa agcccagagc 360

cccgcggcgg ctccaagcac ggtgttgggg gtgggggtct cagggagcgc ccaggcccaa 420

ggccgccctg gtccggcgtg gaccccgcgg ggctcaaggc aggttccccg cgtgacccgc 480

ccagcccctc tatgcgaact 500

<210> 3

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gttggcccct tcggctccac ctggctcaac agacagccag tggcatgcgg cagggaccaa 60

tgggtggcgg agggaggcgg ggcctgccac gaggccgcag tataaccgcg tggcccgcgc 120

gcgcgcttcc ctcccggcgc agtcaccggc gcggtctatg gctgcgactt ctctaatgtc 180

tgctttggct gcccggctgc tgcagcccgc gcacagctgc tcccttcgcc ttcgcccttt 240

ccacctcgcg gcagttcggt aagagggtca cagagctcgg tcagcgcgga aagctgaggg 300

gaacgg 306

<210> 4

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attcgagatg tggggcgcgg gtttattggt tgagtatttt ttcgcgagtt tttcggtcgt 60

agggtttatt tttcggtttt tttttcgcgt ttttattggt cgttcgcgtt tcgcgggcgt 120

tcgttttcgt tttattttcg ttcggaggga aatcgggttg ggggtgagag gttaaagtag 180

ggaggaggat gattggtttt gcggataagg gtgtgcgcga gagttaatta aaagcggatg 240

tcgaaaagag gcgtcgtttt agttagttac gtcgcgaggt gcggtcgggg tcggttgacg 300

cgattgcggg ttttagttaa tgggcgtgtt attgttcgtt cgttttttag 350

<210> 5

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgatttaga aattttagag gtatcgtcgg ttttttcgtt tttttttttt tattatcgtt 60

tagtttttga gaggggaggg tgttgtcgga taggtgggtt ttcgggtatt tattgttgtt 120

cgttcggtcg cggcgtttcg tttcgaggtt gtttaggaag aggaaggcgc gttgtttcgt 180

ttcgcggata aggaggtttt agcgagggcg tatttgcggt aggtgacgaa ggaggcggcg 240

taaaatattc gtcgtgtacg tttcgcggga taaaaattac gcgttcgtcg ggtcgcgttt 300

aggttttcgt ttttagggat ttcggaatcg tttcgttttt aagatcgaaa agtttagagt 360

ttcgcggcgg ttttaagtac ggtgttgggg gtgggggttt tagggagcgt ttaggtttaa 420

ggtcgttttg gttcggcgtg gatttcgcgg ggtttaaggt aggtttttcg cgtgattcgt 480

ttagtttttt tatgcgaatt 500

<210> 6

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gttggttttt tcggttttat ttggtttaat agatagttag tggtatgcgg tagggattaa 60

tgggtggcgg agggaggcgg ggtttgttac gaggtcgtag tataatcgcg tggttcgcgc 120

gcgcgttttt ttttcggcgt agttatcggc gcggtttatg gttgcgattt ttttaatgtt 180

tgttttggtt gttcggttgt tgtagttcgc gtatagttgt ttttttcgtt ttcgtttttt 240

ttatttcgcg gtagttcggt aagagggtta tagagttcgg ttagcgcgga aagttgaggg 300

gaacgg 306

<210> 7

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcggaagcgg tcgcggggcc gctccgaggt tgaccaatga caagggtgcc cgaggccacg 60

tgacggccgc cgattggccg ccggcctccg agcgccccgg ggctcggcgt ctgcggaag 119

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcggaagcgg tcgcggggtc gtttcgaggt tgattaatga taagggtgtt cgaggttacg 60

tgacggtcgt cgattggtcg tcggttttcg agcgtttcgg ggttcggcgt ttgcggaag 119

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgttacgag gtcgtagtat aatcgc 26

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcgcaacca taaaccgcg 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggttcgcgc gcgcgtttt 19

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcggataagg gtgtgcgc 18

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

taactaaaac ccgcaatcgc g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

agttacgtcg cgaggtgcgg tc 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gtaggtgacg aaggaggcgg c 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctaataacga caacctaacc gcg 23

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgtacgtttc gcgggat 17

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atagatagtt agtggtatgc gg 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atagatagtt agtggtatgc gg 22

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agggattaat gggtggcgga gggagg 26

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgcgttttta ttggtcgttc gc 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

actctcgcgc acacccttat ccg 23

<210> 23

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ccaatcatcc tcctccctac tttaacc 27

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcgcgttgtt tcgtttcgc 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

aacgcgaccc gacgaacgcg 20

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ttatcccgcg aaacgtacac gacg 24

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

aagcggtcgc ggggtcgttt c 21

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

cgcaaacgcc gaaccccg 18

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

aggttgatta atgataaggg tgttcgagg 29

Claims

1.一种用于检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测以下区域的甲基化水平的检测试剂：

FAR1基因中如SEQ ID NO:1所示的区域；

SH3YL1基因中如SEQ ID NO:2所示的区域；以及

MTHFD2基因中如SEQ ID NO:3所示的区域。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述检测试剂为扩增-测序、芯片、甲基化荧光定量PCR检测甲基化水平中所使用的检测试剂。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中，所述检测试剂为核酸引物、测序Tag序列、甲基化芯片、核酸探针中的任意一种或多种。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述检测试剂为核酸引物和核酸探针。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述核酸引物和核酸探针为：

SEQ ID NO:9~17所示的核酸引物和探针；或者，SEQ ID NO:18~26所示的核酸引物和探针。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述检测试剂还包括用于监测的内标上游引物、内标下游引物以及内标探针。

7.根据权利要求1~6任一项所述的组合物，其中，所述组合物还额外包括对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂为提取样本核酸的样本释放剂，转化所用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐。

9.权利要求1~8中任一项所述组合物在制备用于检测肝癌的试剂盒中的用途。

10.一种用于检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~8中任一项所述组合物。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括提取核酸的试剂、dNTP、Mg²⁺、甲基化扩增酶、PCR缓冲液、GC增强剂中的至少一种。