CN109929919B

CN109929919B - Dna甲基化检测方法及相关应用

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Publication number: CN109929919B
Application number: CN201811074552.1A
Authority: CN
Inventors: 于浩洋; 梁宁; 吕禾
Original assignee: Shenzhen Genebiohealth Co ltd
Current assignee: Shenzhen Genebiohealth Co ltd
Priority date: 2018-09-14
Filing date: 2018-09-14
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2038-09-14
Also published as: CN109929919A; CN111235238A

Abstract

本公开提供用于DNA甲基化检测的方法、试剂、试剂盒及相关的应用，进一步提供RNF180基因或Reprimo基因甲基化的检测方法、核酸、试剂盒和应用，所述方法、核酸、试剂盒等可用于癌症诊断和/或预后。

Description

DNA甲基化检测方法及相关应用

技术领域

本公开属于生物技术领域，涉及体外诊断技术。具体地讲，本公开涉及用于DNA甲基化检测的方法、试剂、试剂盒及相关的应用，涉及用于癌症诊断和/或预后的方法、产品(包括试剂、试剂盒)。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的一类重大疾病。虽然肿瘤的治疗有了长足的进步，但高死亡率仍未得到有效控制。根据国家癌症中心最新一期的全国癌症统计数据(来源于2017年全国肿瘤登记中心收集汇总的全国31省市自治区肿瘤登记处2014年的恶性肿瘤登记资料)显示，全国恶性肿瘤新发病例数380.4万例，标化发病率174.0/10万，略低于世界平均水平182.3/10万。但中国癌症发病约占全球的22％，发病人数全球第一。中国癌症死亡病例超200万，约占全球的27％，标化死亡率122.2/10万，高于世界平均水平102.4/10万。由于缺乏癌症早筛以及就诊时间偏晚等原因，中国癌症的5年生存率仅为30.9％，而发达国家普遍在70％以上。

以胃癌为例，我国每年新增胃癌病例约68万，死亡人数约49.8万；发病人数约占世界年新发病例数的50％。胃癌患者5年生存率与介入时期密切相关，中晚期胃癌5年生存率低于15％，而早期胃癌患者5年生存率超过90％。因此提升胃癌早期诊断和筛查水平，对于控制胃癌人群增长、延长患者生存期和提高生存质量均有重要意义。现阶段，内镜(胃镜)为主的影像学检查广泛应用于临床和体检。结合切片病理分析，胃镜检查可发现早期胃癌黏膜改变，但仍存在IIb型早期胃癌难发现，活检准确取材成功率不稳定导致误诊风险等问题。且胃镜依从性较差，70％的受检人会因其侵入性产生恐惧、紧张和焦虑情绪，所以多数患者，尤其老年人，不愿意接受胃镜检查。而由于操作人员经验不足或设备清洁不当导致的上消化道损伤和交叉感染的情况也时有报道。其它如X射线或CT扫描等影像检查手段多应用于术前评价和手术方案制定，早期诊断意义有限。而蛋白分子标志物，如CEA及CA19-9等的检测，对胃癌特异性较低，通常作为预后监测指标。综上，开发新型胃癌早期诊断技术，实现胃癌早期、灵敏、特异诊断，意义重大。

近年来，研究发现分离自肿瘤患者血浆的DNA中存在基因甲基化水平异常；基因甲基化可能是肿瘤发生、发展的重要分子特征。

环指蛋白180(ring finger protein 180，RNF180)具有抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用，参与胃癌的淋巴转移。近年研究发现RNF180基因的启动子序列内的CpG位点甲基化状态与胃癌发生、病程发展和患者预后之间关系紧密。一些研究提示，RNF180基因甲基化检测可能具有胃癌体外分子诊断的应用价值。

Reprimo是一种糖基化胞浆蛋白，作为p53的下游效应器，引起细胞周期的G2/M期阻滞，具有抑制细胞增殖的作用。据报道，在胃癌中，Reprimo作为抑癌基因，由于启动子区域的异常甲基化状态，其表达在部分样本中缺失。研究提示，Reprimo或其甲基化在胃癌诊断方面可能具有潜在的应用价值。

传统的甲基化检测包括甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性荧光PCR法(methylight)及亚硫酸氢盐测序法。

甲基化特异性PCR(MSP)及甲基化特异性荧光PCR法(methylight)均是通过对样本DNA进行亚硫酸盐处理，在保留甲基化胞嘧啶的同时将非甲基化胞嘧啶转化为胸腺嘧啶；再分别通过甲基化/非甲基化特异性的引物来进行PCR配合琼脂胶电泳后显影或使用荧光PCR发光法来检测样本DNA中的甲基化程度。

亚硫酸盐测序同样先对样本DNA进行亚硫酸盐处理并用通用引物(不含有CpG岛，因此可用同时扩增甲基化模板及非甲基化模板)进行PCR扩增；再将扩增产物进行测序，根据甲基化序列与非甲基化序列的差异来识别样本DNA中的甲基化位点及程度。

但亚硫酸氢盐测序法成本高、通量低、操作繁琐，不利于广泛应用于早期诊断及筛查。而甲基化特异性PCR(MSP)及甲基化特异性荧光PCR法(methylight)在引物特异性上始终存在缺陷，甲基化引物也有一定概率可以通过错配而扩增非甲基化模板：理论上，单个引物含有的CpG序列不会超过3个，因此非甲基化模板的一对引物至多只有6个碱基位点与甲基化引物不匹配。而甲基化检测的样本是甲基化模板与非甲基化模板的混合物，且非甲基化模板通常占到总模板量的90％以上，故MSP及methylight存在假阳性的缺陷。因此，特异性地排除掉甲基化引物错配到非甲基化模板在实际测量中显得尤为重要。

发明内容：

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明人进行了大量的研究，提供以下技术方案。

1.一种DNA甲基化检测方法，该方法包括：

(1)用甲基化敏感性限制性内切酶处理一部分DNA样本，和

(2)对于经过所述酶处理过的DNA样本和未经所述酶处理的DNA样本，对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增，

根据经过所述酶处理的DNA样本的扩增结果和未经所述酶处理的DNA样本的扩增结果，确定所述基因的甲基化情况。

2.一种DNA甲基化检测试剂盒，其中所述试剂盒包含：甲基化敏感性限制性内切酶和用于DNA扩增的试剂。

3.甲基化敏感性限制性内切酶在制备DNA甲基化检测试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含用于DNA扩增的试剂。

4.根据项2或3所述的试剂盒或用途，其中所述试剂包括用于对待测DNA中含有至少一段所述酶所识别序列的序列进行扩增和/或检测的试剂，例如扩增引物和/或检测探针。

5.根据项1-4中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割未甲基化序列或切割甲基化序列。

6.根据项1-5中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割未甲基化序列，所述酶优选为选自在酶识别序列中含有CpG的甲基化敏感性限制性内切酶，更优选为选自BstUI酶、HpaII酶和HhaI酶的一种或更多种酶。

7.根据项1-5中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述酶特异性地切割甲基化序列，所述酶优选为选自在酶识别序列中含有CpG的甲基化特异性限制性内切酶，更优选为McrBC。

8.根据项4-7中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所使用的上游和/或下游扩增引物和/或检测探针含有所述酶所识别的序列。

9.根据项1-8中任一项所述的方法、试剂盒或用途，所述方法或试剂盒用于癌症的诊断和/或预后；所述癌症优选为选自胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌和头颈癌中的一种或更多种癌，更优选为胃癌。

10.根据项1-9中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述待测DNA为RNF180基因，优选扩增RNF180基因中包含选自SEQ ID NO:1-3的序列、或扩增选自SEQ ID NO:1-3的序列。

11.根据项10所述的方法、试剂盒或用途，其中所述扩增引物和/或探针包含或为选自SEQ ID NO:4-6的序列。

12.根据项1-9中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述待测DNA为Reprimo基因，优选扩增Reprimo基因中包含选自SEQ ID NO:7-9的序列、或扩增选自SEQ ID NO:7-9的序列。

13.根据项12所述的方法、试剂盒或用途，其中所述扩增引物和/或探针包含或为选自SEQ ID NO:10-12的序列。

14.一种DNA甲基化检测方法，所述方法包括：对DNA样本进行转化处理，以转化处理后的DNA作为模板进行扩增，所述方法还包括：

(1)使用ALU-C4作为内参基因；和/或

(2)在进行DNA扩增时加入阻断剂，

其中，所述阻断剂为或包含待测DNA中一段连续的非甲基化序列经转化处理后之序列的互补序列，且所述阻断剂的3’端基团使得所述阻断剂在DNA扩增时无法被延伸，

其中所述连续的非甲基化序列：

(i)为或包含扩增引物所针对的区域或其片段，其中所述片段包含所述区域中大部分或所有的待测甲基化位点，或

(ii)为或包含检测探针所针对的区域或其片段，其中所述片段包含所述区域中大部分或所有的待测甲基化位点，或

(iii)包含上游或下游引物所针对区域或其片段和检测探针所针对区域或其片段，并且覆盖所述上游或下游引物所针对区域和探针所针对区域两者序列之和的至少35％，其中所述片段包含所述区域中的至少一个待测甲基化位点；

其中所述转化处理优选用包括亚硫酸氢盐和/或重亚硫酸盐的试剂进行。

15.一种DNA甲基化检测试剂盒，其中所述试剂盒包含对待测DNA进行转化处理的试剂和/或用于DNA扩增和/或检测的试剂，和

(1)用于检测内参基因ALU-C4的试剂，和/或

(2)阻断剂，

其中所述连续的非甲基化序列：

16.(1)用于检测内参基因ALU-C4的试剂和/或(2)阻断剂在制备DNA甲基化检测试剂盒中的用途，其中所述试剂盒包含对待测DNA进行转化处理的试剂和/或用于DNA扩增和/或检测的试剂，所述转化处理优选用亚硫酸氢盐和/或重亚硫酸盐进行。

17.根据项14-16中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述阻断剂的3’端基团选自磷酸基团、间隔子C3(Spacer C3)、间隔子C9(Spacer C9)、间隔子18(Spacer 18)中的一种。

18.ALU-C4作为内参基因在制备DNA甲基化检测试剂盒中的用途，其中所述试剂盒优选包含对待测DNA样本进行转化处理的试剂和/或用于DNA扩增和/或检测的试剂，所述转化处理优选用亚硫酸氢盐和/或重亚硫酸盐进行。

19.根据项14-18中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述方法或试剂盒用于癌症的诊断和/或预后；所述癌症优选为选自胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌和头颈癌中的一种或更多种癌，更优选为胃癌。

20.根据项14-19中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述待测DNA为RNF180基因，所述DNA扩增和/或检测优选为扩增和/或检测RNF180基因中包含选自SEQ ID NO:13-15的序列、或选自SEQ ID NO:13-15的序列。

21.根据项20所述的方法、试剂盒或用途，其中所述用于DNA扩增和/或检测的试剂包括扩增引物和/或检测探针，所述扩增引物和/或探针包含或为选自SEQ ID NO:16-18的序列。

22.根据项14-19中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中所述待测DNA为Reprimo基因，所述DNA扩增和/或检测优选扩增和/或检测Reprimo基因中包含选自SEQ IDNO:20-22的序列、选自SEQ ID NO:20-22的序列。

23.根据项22所述的方法、试剂盒或用途，其中所述用于DNA扩增和/或检测的试剂包括扩增引物和/或检测探针，所述扩增引物和/或探针包含或为选自SEQ ID NO:23-25的序列。

24.根据项14-23中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中用于检测ALU-C4的试剂包括扩增引物和/或探针，所述扩增引物和/或探针包含或为选自SEQ ID NO:27-29的序列。

25.根据项14-24中任一项所述的方法、试剂盒或用途，其中用于检测RNF180基因甲基化的阻断剂包含或为SEQ ID NO:19的序列，用于检测Reprimo基因甲基化的阻断剂包含或为SEQ ID NO:26的序列。

26.一种核酸，其选自SEQ ID NO:1-29。

27.根据项26的核酸，其用于RNF180基因或Reprimo基因甲基化的检测，和/或用于癌症诊断或预后，所述癌症优选为选自胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宫颈癌和头颈癌中的一种或更多种癌，更优选为胃癌。

28.根据前述任一项所述的方法、试剂盒、用途或核酸，其中所述检测探针用标记物标记，所述标记物优选为荧光标记物。

29.根据前述任一项所述的方法、试剂盒、用途，其中所述试剂盒包括PCR反应试剂、阳性对照品和/或阴性对照品，所述PCR反应试剂可以包括选自以下的成分：核酸酶和DNA聚合酶，所述阳性对照品可以为RNF180合成DNA、Reprimo合成DNA，所述阴性对照品可以为纯化水。

附图说明

图1为实施例1所述酶法的Reprimo实时PCR扩增曲线。

图2为实施例2所述酶法的Reprimo临床样本检测结果箱型散点图。

图3为ACTB的实时PCR扩增曲线。

图4为ALU-C4的实时PCR扩增曲线。

图5为实施例4所述阻断剂法的RNF180实时PCR扩增曲线。曲线从左到右，1.未加入阻断剂时用RNF180基因甲基化引物扩增甲基化标准品；2.加入阻断剂时用RNF180基因甲基化引物扩增甲基化标准品；3.未加入阻断剂时用RNF180基因甲基化引物扩增非甲基化标准品；4.加入阻断剂时用RNF180基因甲基化引物扩增非甲基化标准品。

图6为实施例4所述阻断剂法的Reprimo实时PCR扩增曲线。曲线从左到右，1.未加入阻断剂时用Reprimo基因甲基化引物扩增甲基化标准品；2.加入阻断剂时用Reprimo基因甲基化引物扩增甲基化标准品；3.未加入阻断剂时用Reprimo基因甲基化引物扩增非甲基化标准品；4.加入阻断剂时用Reprimo基因甲基化引物扩增非甲基化标准品。

图7为实施例5所述阻断剂法的RNF180临床样本测试结果箱型散点图。纵坐标为RNF180实测Ct值与内参基因ALU-C4实测Ct值的差值。

图8为实施例5所述阻断剂法的RNF180临床样本测试ROC曲线。横坐标表示(1-特异性)x100％，纵坐标表示灵敏度。

图9为实施例5所述阻断剂法的Reprimo临床样本测试结果箱型散点图。纵坐标为Reprimo实测Ct值与内参基因ALU-C4实测Ct值的差值。

图10为实施例5所述阻断剂法的Reprimo临床样本测试ROC曲线。横坐标表示(1-特异性)x100％，纵坐标表示灵敏度。

具体实施方式

在描述本发明方法和组合物之前，应当理解，本发明并不局限于所述的特定方法或组合物，因此当然可能会有所不同。还应当理解的是，本文所使用的术语仅用于描述特定的实施方案，并非限制性的。描述实施例是为本领域的普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整的公开内容和描述，并非旨在限制发明人视为其发明的范围，也并非旨在表示下面的实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保所用数字(例如量、温度等)的准确度，但一些实验误差和偏差应该予以考虑。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如由本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。现在描述一些潜在的和优选的方法和材料，尽管类似或等同于本文描述的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明。本文提及的所有出版物在此通过引用并入，以公开和描述与所引用的出版物有关的方法和/或材料。可以理解的是，存在矛盾的情况下，以本公开内容取代所引用的出版物中的任何公开内容。

如在阅读本公开内容时对本领域技术人员显而易见的，每个本文所述和说明的单独的实施方案具有分立的组件和特征，其可容易地与其他若干实施方案中的特征分离或结合，而不脱离本发明的范围或实质。可以按所列举事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施任何列举的方法。

除非另外说明，否则本文和所附权利要求中所用的“一个(种)”意指“一个(种)或多个(种)”。

当提供数值范围时，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)也被具体地公开，除非上下文另有明确说明。在所述范围中的任何所述值或中间值之间的各个较小的范围以及在所述范围内的其他所述值或中间值包含在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可独立地包含在该范围内或排除在该范围之外，并且服从于所述范围中任何所特定地排除的，其中上下限中任一个或两个或无一个包含在所述较小范围内的每个范围也包含在本发明内。当所述范围包含一个或两个界限，除去任一或两个那些包含在内的界限的范围也包含在本发明中。

本公开中所用的术语“上游引物”与“正向引物”可互换使用，“下游引物”与“反向引物”可以互换使用。

第一方面，针对上述阐述的问题，本公开通过甲基化敏感的限制性内切酶处理，提供了DNA甲基化检测的方法、试剂盒及相关应用。

在该方面，本公开提供一种基因甲基化检测方法，该方法包括用甲基化敏感性限制性内切酶处理DNA样本，根据经过和未经所述酶处理的DNA样本的DNA扩增结果，确定待测DNA(如基因)的甲基化情况，例如确定所述DNA是否被甲基化和/或所述DNA的甲基化程度。

人类(例如癌症患者，如胃癌患者)DNA的甲基化通常发生在CpG岛上，胞嘧啶的5’端碳上被修饰上一个甲基。应用甲基化特异性限制性内切酶特异性识别的回文序列对基因中特异性片段的甲基化进行检测。例如，当特异性片段中酶识别片段的胞嘧啶呈现甲基化状态，该片段不会被切断；非甲基化状态下的特异性片段中酶识别片段将会被切断。例如，通过设计含有至少一段甲基化敏感性限制性内切酶识别序列或其片段的特异性引物、探针对待扩增序列进行PCR扩增，则甲基化片段可以产生扩增信号，而非甲基化片段则不会产生扩增信号。通过设计至少包含一段含有对应酶识别回文序列或其片段的扩增引物、检测探针及待扩增的核酸片段，可以实现对基因甲基化程度的定量检测。

作为实例，所述甲基化敏感性限制性内切酶可以是在酶识别序列中含有CpG的甲基化敏感性限制性内切酶。所述酶可以是特异性切割非甲基化序列的酶，可以是选自BstUI酶、HpaII酶和HhaI酶的一种或更多种酶。所述扩增引物和/或探针可以包含所述酶所识别的回文序列或其片段。

所检测的基因可以是RNF180和/或Reprimo。

所述甲基化敏感性限制性内切酶也可以是特异性切割甲基化序列的酶。根据对经过甲基化敏感性限制性内切酶消化的DNA样本和未经所述酶消化的DNA样本的扩增结果，可以确定待测DNA(如基因)的甲基化情况，如是否被甲基化、甲基化程度。所述甲基化敏感性限制性内切酶优选选自在酶识别序列中含有CpG的甲基化特异性限制性内切酶，更优选为McrBC。

所检测的基因可以是RNF180和/或Reprimo。

在一个实施方案中，所述基因是RNF180基因，优选扩增引物和/或探针针对RNF180基因的启动子区域。例如，所述引物和/或探针可以扩增和/或检测包含或为选自以下序列的序列：

CTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGGGTGGGAACC(SEQ IDNO:1)；

CTTTCCCACGGTTCCGTCTGGCCCGCGGCGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGGGTGGGAACC(SEQ ID NO:2)；和

ACTTTCCCACGGTTCCGTCTGGCCCGCGGCGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGGGTGGGAACCCGCAGACGTGGGGCGAGGCTGGCTGTGGCGGGCGAG(SEQ ID NO:3)。

优选所述扩增引物和/或探针可以扩增和/或检测包含RNF180基因启动子区域中所述酶所识别的回文序列或其包含甲基化部位的片段。在更优选的实施方案中，扩增引物和探针包含或为选自SEQ ID NO:4-6的序列：

CTTGTCTGCCTGCG(RNF180上游引物序列)(SEQ ID NO:4)，

GGTTCCCACCCGAGC(RNF180下游引物序列)(SEQ ID NO:5)，

GGGTCAAAGCCCGGCG(RNF180检测探针序列)(SEQ ID NO:6)。

在另一个实施方案中，所述基因是Reprimo基因，优选扩增引物和/或探针针对Reprimo基因的启动子区域，例如，所述引物和/或探针可以扩增和/或检测包含或为选自以下序列的序列：

CAGATCGCGGTCATGTGCGTGCTCTCACTCACCGTGGTCTTCGGCATCTTCTTCC(SEQ ID NO:7)，

CAGATCGCGGTCATGTGCGTGCTCTCACTCACCGTGGTCTTCGGCATCTTCTTCCTCGGCTGCAATCTGCTCATCAAGTCCGAGGG(SEQ ID NO:8)，

CAGATCGCGGTCATGTGCGTGCTCTCACTCACCGTGGTCTTCGGCATCTTCTTCCTCGGCTGCAATCTGCTCATCAAGTCCGAGGGCATGATCAACTTCCTCGTGAA(SEQ ID NO:9)。

优选所述扩增引物和/或探针可以包含Reprimo基因启动子区域中所述酶所识别的回文序列或其包含甲基化部位的片段。在更优选的实施方案中，扩增引物和探针包含或为选自SEQ ID NO:10-12的序列：

CAGATCGCGGTCATGT(Reprimo上游引物序列)(SEQ ID NO:10)，

GGAAGAAGATGCCGAAG(Reprimo下游引物序列)(SEQ ID NO:11)，

CGTGCTCTCACTCACCGTG(Reprimo检测探针序列)(SEQ ID NO:12)。

在该方面，本公开还涉及包含所述甲基化敏感性限制性内切酶的试剂盒以及所述甲基化敏感性限制性内切酶的相关应用。

如上所述，传统的甲基化检测方法(如甲基化特异性PCR(MSP)及甲基化特异性荧光PCR法(methylight))在引物特异性上始终存在缺陷，甲基化引物也有一定概率可以通过错配而扩增非甲基化模板。理论上，单个引物含有的CpG序列不会超过3个，因此非甲基化模板的一对引物至多只有6个碱基位点与甲基化引物不匹配。而甲基化检测的样本是甲基化模板与非甲基化模板的混合物，且非甲基化模板通常占到总模板量的90％以上，故MSP及methylight存在假阳性的缺陷。因此，特异性地排除掉甲基化引物错配到非甲基化模板在实际测量中显得尤为重要。

第二方面，针对上述阐述的问题，本公开通过增加PCR阻断剂、筛选内参基因的方式，提供了操作简便、灵敏度高、特异性强、定量程度高、重复性、稳定性优于现有技术的方法及试剂盒。

在该方面，本公开提供一种DNA(如基因)甲基化检测方法，所述方法包括在对DNA样本进行转化处理(例如用亚硫酸氢盐和/或重亚硫酸盐进行)后，在对转化处理后DNA样本进行扩增时提供一种阻断剂。

所述阻断剂为或包含所述基因中一段连续的非甲基化序列经转化处理后序列的互补序列，且所述阻断剂的3’端基团使得所述阻断剂在DNA扩增时无法被延伸，其中所述连续的非甲基化序列：

(iii)包含上游或下游引物所针对区域或其片段和检测探针所针对区域或其片段，并且覆盖所述上游或下游引物所针对区域和探针所针对区域两者序列之和的至少35％(如至少40％)，其中所述片段包含所述区域中的至少一个待测甲基化位点。

本公开所用的术语“大部分”具有本领域技术人员通常理解的含义，即超过50％。如果所述区域含有3个待测甲基化位点时，则“所述片段包含所述区域中大部分或所有的待测甲基化位点”意指所述片段包含至少两个待测甲基化位点。

当所述非甲基化序列包含(1)上游或下游引物所针对区域(引物结合区域)或其片段和(2)检测探针所针对区域(探针结合区域)或其片段时，所述非甲基化可以覆盖(上游或下游引物所针对区域+探针所针对区域)的至少35％，例如至少40％、至少45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％等、或甚至100％。举例而言，如果下游引物所针对区域A长15bp，探针所针对区域B长20bp，那么所述连续的非甲基化序列例如可以覆盖A中的7bp和B中的7bp(14/(15+20)＝40％)、A中全部15bp和B中的5bp(20/(15+20)＝57.1％)等等。

本公开的阻断剂是或包含待测基因中一段连续的非甲基化序列经转化处理后之序列的互补序列(即100％匹配)，因而其与非甲基化模板的结合亲和力高于甲基化引物与非甲基化模板之间的结合亲和力，可以降低甲基化引物错配到非甲基化模板的概率。通过这种阻断剂设计，提升了反应的整体特异性，能有效地抑制因为错配而导致的假阳性扩增；并能减少背景信号的干扰，进一步优化反应的灵敏度。通过阻断剂的引入，能提高阳性的检出率，并排除由引物错配或样本DNA背景太复杂引起的假阳性，从而保证了检测结果的正确、可靠及稳定性。

在本公开的技术方案中，所述阻断剂的3’端基团为可以使阻断剂在扩增时无法被延伸的基团。这样的基因为本领域技术人员所知晓，例如可以为磷酸基团、间隔子C3(SpaceC3)、间隔子C9(Space C9)、间隔子18(Space 18)中的一种。如本领域技术人员所知晓的，所述间隔子C3为含有3个碳原子的短碳链；间隔子C9为含有9个碳原子的短碳链；间隔子18为酰胺化合物。

在该方面的一个实施方案中，利用阻断剂的所述方法用于检测RNF180甲基化。在某些具体实施方案中，所述引物和探针针对RNF180基因的启动子区域，例如，所述引物和/或探针可以扩增和/或检测包含或为选自以下序列的序列：

CGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGGGTGGGAA(SEQ IDNO:13)，

CACGGTTCCGTCTGGCCCGCGGCGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGGGTGGGAA(SEQ ID NO:14)，

ACTTTCCCACGGTTCCGTCTGGCCCGCGGCGCTTGTCTGCCTGCGCGGGGTCAAAGCCCGGCGCCGCCCACGCGCGGCTCGGGTGGGAACCCGCAGACGTGGGGCGAGCAGGGCCGCTGGCTGTGGCGGG(SEQ ID NO:15)。

其中用于此方法的引物、探针和阻断剂可以是或包含选自以下的序列：

CGTTTGTTTGTTTGCG(RNF180上游引物序列)(SEQ ID NO:16)，

TTCCCACCCGAACC(RNF180下游引物序列)(SEQ ID NO:17)，

GGGTTAAAGTTCGGCGTCGTT(RNF180检测探针序列)(SEQ ID NO:18)，

TTCCCACCCAAACCACACAT(RNF180阻断剂序列)(SEQ ID NO:19)。

在该方面的另一个实施方案中，利用阻断剂的所述方法用于检测Reprimo甲基化。在某些具体实施方案中，所述引物和探针针对Reprimo基因的启动子区域，例如，所述引物和/或探针可以扩增和/或检测包含或为选自以下序列的序列：

CTCGTGAAGGACCGGAGGCCGTCTAAGGAGGTGGAGGCGGTGGTCGTGGGGCCCTA(SEQ ID NO:20)，

AGTCCGAGGGCATGATCAACTTCCTCGTGAAGGACCGGAGGCCGTCTAAGGAGGTGGAGGCGGTGGTCGTGGGGCCCTACTGACCCGCCC(SEQ ID NO:21)，

TCGGCTGCAATCTGCTCATCAAGTCCGAGGGCATGATCAACTTCCTCGTGAAGGACCGGAGGCCGTCTAAGGAGGTGGAGGCGGTGGTCGTGGGGCCCTACTGACCCGCCCT(SEQ ID NO:22)。

其中用于此方法的Reprimo引物、探针和阻断剂可以是或包含选自以下的序列：

TTCGTGAAGGATCGGA(Reprimo上游引物序列)(SEQ ID NO:23)，

TAAAACCCCACGACC(Reprimo下游引物序列)(SEQ ID NO:24)，

CCGCCTCCACCTCCTTAAACGA(Reprimo检测探针序列)(SEQ ID NO:25)，

TAAAACCCCACAACCACCACC(Reprimo阻断剂序列)(SEQ ID NO:26)。

在第二方面，本公开还涉及应用所述阻断剂的试剂盒和相关应用。

另外，本发明人对内参基因进行筛查，发现ALU-C4可以用作内参基因。内参基因ALU-C4的引入，能定量或半定量地对结果进行分析，提高了反应的可靠性和正确率。尤其是，在以血浆为样本的甲基化检测中，DNA来源为碎片化的DNA，选用ALU-C4基因(例如ALU-C4基因组重复子序列)，可以更准确地作为样本原始DNA的内部参照进行计算；而其他内参基因，如β-肌动蛋白(β-actin)、球蛋白(Globin)等，因其在碎片DNA中含量低且与实际被检测基因之间不构成正比例关系而只能作为质控标准，不能通过其Ct值辅助含量测定。

因此，在第三方面，本公开涉及ALU-C4作为内参基因的应用，涉及的检测方法和试剂盒、以及ALU-C4作为内参基因的用途。

ALU-C4作为内参基因，可以应用于利用DNA扩增进行检测的方法、试剂盒及相关应用，尤其是应用于对血浆DNA进行检测(例如DNA甲基化检测)的方法、试剂盒和相关应用中。

关于方法，本公开提供一种基因甲基化检测方法，所述方法应用ALU-C4作为内参基因。在所述方法中，优选ALU-C4扩增引物和/或检测探针针对ALU-C4基因组重复子序列，更优选所述扩增引物和/或检测探针为或包含选自以下的序列：

ALU-C4正向引物F2:GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA(SEQ ID NO:27)，

ALU-C4反向引物R2:ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA(SEQ ID NO:28)，

ALU-C4检测探针P2:CCTACCTTAACCTCCC(SEQ ID NO:29)。

在第三方面，本公开还涉及ALU-C4(尤其是ALU-C4基因组重复子序列)作为内参基因在检测、诊断中的应用及相关的方法、试剂盒和应用，涉及用于检测作为内参基因的ALU-C4(尤其是ALU-C4基因组重复子序列)的试剂、含有所述试剂的相关试剂盒以及所述试剂的相关应用。

上述第三方面可以与上述第二方面的技术方案相结合，即所述方法和试剂盒等可以同时应用阻断剂和利用ALU-C4作为内参基因。

在本公开所记载的技术方案中，所述试剂盒可以包括PCR反应试剂、阳性对照品和/或阴性对照品。所述PCR反应试剂可以包括选自以下的成分：核酸酶、DNA聚合酶和ExTaq酶。所述阳性对照品可以为RNF180合成DNA、Reprimo合成DNA，所述阴性对照品可以为纯化水。

针对现有技术中存在的上述问题，本发明人通过使用甲基化敏感性限制性内切酶、筛选内参基因、改善引物探针设计、增加阻断剂，提供了操作简便、灵敏度高、特异性强、定量程度高、重复性、稳定性优越的试剂盒及方法。

下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处描述具体实施例是为了帮助本领域技术人员更好地理解本公开的技术方案并非意欲限定所述技术方案。

实施例

材料和方法

一、酶：

实施例中所用的M.SssI酶、HpaII酶和HhaI酶购自New England Biolabs.。BstUI酶购自Thermo Fisher Scientific。

二、临床样本：

胃癌患者的血浆样本选自2018年5-7月期间在浙江大学附属第一医院就诊的14例患者，正常人的血浆样本选自2018年4月17日在深圳晋百慧生物有限公司自愿捐血参与项目的8例正常人。

正常人入组条件为：

1. 45周岁以下

2.无既往严重消化道疾病史

3.无家族癌症遗传史。

三、血浆游离cf-DNA的提取：

采用天根大体积游离核酸提取试剂盒(购自天根生物公司,Tiangen Biotech(Beijing)Co.,Ltd.)，按照试剂盒所提供的说明，从血浆中提取游离cf-DNA。

四、转化处理

转化处理采用EZ DNA Methylation-Gold^TM试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold^TMKit,Zymo Research Inc.)，按照试剂盒中提供的相应说明进行。

五、PCR流程

PCR流程使用购自宝生物(大连)工程有限公司(Takara Bio Inc.)的PCR试剂盒，按照试剂盒中所提供的说明书进行。

PCR流程所使用的PCR仪器为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR系统(购自LifeTech Applied Biosystems)，反应体系为20μl，正向(上游)引物和反向(下游)引物的终浓度为600nM，探针的终浓度为300nM。PCR扩增反应程序为：95℃变性2min，一个循环；95℃8s，60℃30s，45个循环。

实施例1：利用标准品验证限制性内切酶法甲基化检测的方法

在人基因组Reprimo基因(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列,Reprimo,TP53dependent G2arrest mediator homolog[Homo sapiens(human)]Gene ID:56475,updated on 12-Aug-2018)的启动子区域设计一对至少含有一段对应酶识别回文序列的特异性的甲基化检测的引物和探针。然后用该引物及探针扩增和检测经过或未经CpG甲基转移酶处理的(下文称为“经处理”或“未经处理”)、甲基化特异性限制性内切酶消化后的正常人样本DNA，根据甲基化特异性限制性内切酶消化后的经处理DNA中Reprimo基因扩增Ct值、酶消化后的未经处理DNA中Reprimo基因扩增Ct值与未被酶消化的Reprimo基因扩增Ct值的对比，检测该方法对于甲基化检测的有效性。

按照以下步骤进行检测。

步骤一：取3份2mL正常人血浆，用天根大体积游离核酸提取试剂盒，按照试剂盒所提供的说明，提取游离DNA，用65μl DEPC水洗脱。每一份DNA的1/3用CpG甲基转移酶M.SssI处理为甲基化标准品，剩余的2/3用同样的但不含有该酶的反应体系进行平行处理作为非甲基化标准品。具体操作按照下列表格进行：

模板来源	正常人血浆DNA	正常人血浆DNA	正常人血浆DNA
				样本命名	M1<sup>*</sup>	F1<sup>*</sup>	F2<sup>*</sup>
模板加入量	20μl	20μl	20μl
				S-腺苷基甲硫氨酸	4μl	4μl	4μl
NEB Buffer 2	4μl	4μl	4μl
				M.SssI甲基转移酶	2μl	0	0
DEPC水	10μl	12μl	12μl

*M表示甲基化标准品，F表示非甲基化标准品

CpG甲基转移酶M.SssI反应程序为：37℃5h，65℃20min。

步骤二：分别取10μl上述处理后的DNA进行甲基化敏感性限制性内切酶处理。具体操作按照下列表格进行：

模板来源	M1/F1/F2	M1/F1/F2	M1/F1/F2	M1/F1/F2
					样本命名	BsM1/BsF1<sup>*</sup>	HpM1/HpF1<sup>*</sup>	HhM1/HhF1<sup>*</sup>	FM/FF<sup>*</sup>
模板加入量	10μl	10μl	10μl	10μl
					酶切反应Buffer	2μl	2μl	2μl	2μl
甲基化敏感性限制性内切酶	0.1μl	0.1μl	0.1μl	0
					DEPC水	7.9μl	7.9μl	7.9μl	8μl

*Bs表示使用BstUI酶处理，Hp表示使用HpaII酶处理，Hh表示使用HhaI酶处理。M表示甲基化标准品，F表示非甲基化标准品。

FM表示未经过甲基化敏感性限制性内切酶处理的甲基化标准品，FF表示未经过甲基化敏感性限制性内切酶处理的非甲基化标准品。

甲基化敏感性限制性内切酶反应程序均为：37℃16h，80℃20min。

步骤三：使用Reprimo正向(上游)引物F1(5’-CAGATCGCGGTCATGT-3′,SEQ ID NO:6)、Reprimo反向(下游)引物R1(5′-GGAAGAAGATGCCGAAG-3′,SEQ ID NO:7)、Reprimo检测探针P1(5′-CGTGCTCTCACTCACCGTG-3′,SEQ ID NO:8)，对所述模板进行PCR扩增。

步骤四：结果分析，检测实验结果是否满足质控要求，即检测未经酶切处理的待检测样本的Ct值是否≤35；如果Ct值＞35，则样本不纳入结果统计；根据样本检测结果经酶切处理的Reprimo基因Ct值与未经酶切处理的Reprimo基因Ct值的差别，判断待检测样本Reprimo基因甲基化检测是否为阳性。具体判定标准如下：

三、检测结果^*

检测结果示于以下表1和图1。

表1

实施例2：利用酶法甲基化检测方法进行胃癌的诊断

使用实施例1中所述方法，对“材料和方法”中所述的临床样本进行检测。简单地讲，取临床样本的血浆提取游离DNA，一部分DNA样本经过未经BstUI酶消化(酶切)，而另一部分未经BstUI酶消化。然后，使用实施例1中所述的引物和探针进行，进行检测。

结果分析：检测实验结果是否满足质控要求，即检测未经酶切处理的待检测样本的Ct值是否≤35；如果Ct值＞35，则样本不纳入结果统计；根据样本检测结果经酶切处理的Reprimo基因Ct值与未经酶切处理的Reprimo基因Ct值的差别，判断待检测样本Reprimo基因甲基化检测是否为阳性。

临床样本的检测结果示于表2和图2。

表2

由上表结果可得，采用上述方法，对胃癌样本的检测灵敏度为57.14％，特异性为62.5％。

实施例3：ALU-C4在血浆中作为内参基因的优势

用“材料和方法”中所述的部分临床样本，检验ALU-C4在血浆中作为内参基因是否优于传统内参基因如ACTB。

简而言之，按照“材料和方法”中所述的方法，从临床样本的血浆中提取游离DNA。通过PCR反应，检测血浆中的ALU-C4和ACTB(即β-肌动蛋白)。PCR反应中所用的引物和探针如下：

ALU-C4正向引物F2:GGTTAGGTATAGTGGTTTATATTTGTAATTTTAGTA(SEQ ID NO:27)

ALU-C4反向引物R2:ATTAACTAAACTAATCTTAAACTCCTAACCTCA(SEQ ID NO:28)

ALU-C4检测探针P2:CCTACCTTAACCTCCC(SEQ ID NO:29)

ACTB上游引物:5’-TCTAACAATTATAAACTCCAACCACCAA-3’(SEQ ID NO:30)

ACTB下游引物:5’-GGGAAGATGGGATAGAAGGGAATAT-3’(SEQ ID NO:31)

ACTB探针:5'-CCTTCATTCTAACCCAATACCTATCCCACCTCTAAA-3’(SEQ ID NO:32)其中，ALU-C4检测探针的5′端用FAM标记作为发光基团，3′端使用MGB-NFQ作为淬灭基团；ACTB探针的5'端用TAMRA标记，3'端用BHQ2标记。

结果分析：根据样本ACTB基因与ALU-C4基因的起峰情况，判断ACTB基因与ALU-C4基因在血浆样本中作为内参基因的优劣。

临床样本的检测结果示于表3和图3-4中。

表3

由检测结果可以看出，ALU-C4在正常人及胃癌患者血浆中作为内参基因的可行性和稳定性均好于ACTB(100％vs 9.1％)，因此建议选用重复子ALU-C4作为血浆基因甲基化检测的内参基因。

实施例4：利用标准品验证阻断剂法甲基化检测的方法

在人基因组RNF180基因或Reprimo基因的启动子区域设计一对特异性的甲基化检测的引物和探针以及相应的阻断剂，然后分别用含有阻断剂及不含阻断剂的该基因引物对及探针去扩增甲基化及非甲基化标准品，根据甲基化标准品及非甲基化标准品扩增结果的相对荧光CT值的对比，验证阻断剂对保证反应特异性的必要作用及引物探针的工作稳定性。

一、引物和探针的设计与合成

针对人基因组中RNF180基因(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列,RNF180ring finger protein 180[Homo sapiens(human)]Gene ID:285671)的启动子区、Reprimo基因的启动子区和内参基因ALU-C4(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用Beacon Designer 7.0软件，分别设计特异性引物及探针以及RNF180基因或Reprimo基因相应的阻断剂。

所用序列如下表所示：

二、检测方法

按照实施例1的步骤1制备甲基化标准品及非甲基化标准品。用EZ DNAMethylation-Gold^TM试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit,Zymo Research Inc.)中提供的相关试剂，按照试剂盒中提供的相应说明，对所述标准品进行转化处理。使用用于检测RNF180基因或Reprimo基因的所述引物和探针，在加入或不加入相应阻断剂的情况下，对实施例1中所述的甲基化标准品及非甲基化标准品进行PCR扩增。RNF180检测探针和Reprimo检测探针的5′端均用VIC标记作为发光基团，3′端均使用BHQ1作为淬灭基团。ALU-C4检测探针的5′端用FAM标记作为发光基团，3′端使用MGBNFQ作为淬灭基团。

三、结果分析

检测实验结果是否满足质控要求，即检查待检测样本ALU-C4的检测Ct值是否≤27；如果Ct值＞27，则实验结果不纳入结果统计。根据样本检测的Reprimo基因Ct值与ALU-C4基因Ct值的差别，判断样本Reprimo基因甲基化检测是否为阳性。

根据检测结果对样本进行判断。根据甲基化标准品及非甲基化标准品扩增结果的相对荧光CT值的对比，验证阻断剂对保证反应特异性的必要作用及引物探针的工作稳定性。具体判定标准如下：

三、检测结果^*

RNF180基因的检测结果示于以下表4和图5。

表4

由表4和图5可知，对于甲基化标准品，RNF180的引物对及其探针具有良好的扩增效果，并且在加入阻断剂之后其扩增效果没有发生显著改变；对于非甲基化标准品，RNF180的引物对及其探针在单独使用时有非特异性的扩增，但在加入阻断剂后反应特异性明显改善。因此，RNF180引物对、探针及阻断剂对于该核酸序列的扩增具有有效性和可靠性。

Reprimo的检测结果示于以下表5和图6。

表5

由表5和图6可知，对于甲基化标准品，Reprimo的引物对及其探针具有良好的扩增效果，并且在加入阻断剂之后其扩增效果没有发生显著改变；对于非甲基化标准品，Reprimo的引物对及其探针在单独使用时有非特异性的扩增，但在加入阻断剂后反应特异性明显改善。因此，Reprimo引物对、探针及阻断剂对于该核酸序列的扩增具有有效性和可靠性。

实施例5：利用阻断剂法甲基化检测方法进行胃癌的诊断

使用实施例4中所述的利用阻断剂的甲基化检测方法，对“材料和方法”中所述的临床样本中的RNF180或Reprimo进行检测，同时检测作为内参基因的ALU-C4。

RNF180基因甲基化检测结果示于表6和图7-8。

表6

由上表结果可得，试剂盒检测灵敏度为78.57％，特异性为75％(如图7所示)。作ROC曲线后，得出AUC值为0.73(如图8所示)。

Reprimo基因甲基化检测结果示于表7和图9-10。

表7

由上表结果可得，试剂盒检测灵敏度为92.86％，特异性为87.5％(如图9所示)。作ROC曲线后，得出AUC值为0.84(如图10所示)。

***

根据本公开内容，不需要过度实验就可以制备和使用本文中所公开和要求保护的所有方法、产品(包括试剂盒、阻断剂、核酸)和用途。尽管已经就优选实施方案描述了方法、试剂盒等，但本领域技术人员应显而易见，可在不背离本发明的理念、精神和范围的情况下对本文中所描述的方法、产品以及方法中的步骤或步骤顺序施加变化。更具体地说，可以用化学上和生理学上相关的某些试剂来替代本文中所描述的试剂，同时可实现相同或类似的结果。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改都在如由所附权利要求所限定的本发明精神、范围和理念之内。

序列表

<110> 深圳市晋百慧生物有限公司

<120> DNA甲基化检测方法及相关应用

<130> 20

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

cttgtctgcc tgcgcggggt caaagcccgg cgccgcccac gcgcggctcg ggtgggaacc 60

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

ctttcccacg gttccgtctg gcccgcggcg cttgtctgcc tgcgcggggt caaagcccgg 60

cgccgcccac gcgcggctcg ggtgggaacc 90

<210> 3

<211> 127

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

actttcccac ggttccgtct ggcccgcggc gcttgtctgc ctgcgcgggg tcaaagcccg 60

gcgccgccca cgcgcggctc gggtgggaac ccgcagacgt ggggcgaggc tggctgtggc 120

gggcgag 127

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 4

cttgtctgcc tgcg 14

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 5

ggttcccacc cgagc 15

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 探针(Probe)

<400> 6

gggtcaaagc ccggcg 16

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

cagatcgcgg tcatgtgcgt gctctcactc accgtggtct tcggcatctt cttcc 55

<210> 8

<211> 86

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

cagatcgcgg tcatgtgcgt gctctcactc accgtggtct tcggcatctt cttcctcggc 60

tgcaatctgc tcatcaagtc cgaggg 86

<210> 9

<211> 107

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

cagatcgcgg tcatgtgcgt gctctcactc accgtggtct tcggcatctt cttcctcggc 60

tgcaatctgc tcatcaagtc cgagggcatg atcaacttcc tcgtgaa 107

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 10

cagatcgcgg tcatgt 16

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 11

ggaagaagat gccgaag 17

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 探针(Probe)

<400> 12

cgtgctctca ctcaccgtg 19

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

cgcttgtctg cctgcgcggg gtcaaagccc ggcgccgccc acgcgcggct cgggtgggaa 60

<210> 14

<211> 82

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

cacggttccg tctggcccgc ggcgcttgtc tgcctgcgcg gggtcaaagc ccggcgccgc 60

ccacgcgcgg ctcgggtggg aa 82

<210> 15

<211> 130

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

actttcccac ggttccgtct ggcccgcggc gcttgtctgc ctgcgcgggg tcaaagcccg 60

gcgccgccca cgcgcggctc gggtgggaac ccgcagacgt ggggcgagca gggccgctgg 120

ctgtggcggg 130

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 16

cgtttgtttg tttgcg 16

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 17

ttcccacccg aacc 14

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 探针(Probe)

<400> 18

gggttaaagt tcggcgtcgt t 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 阻断剂(obstructore proscriptionum)

<400> 19

ttcccaccca aaccacacat 20

<210> 20

<211> 56

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

ctcgtgaagg accggaggcc gtctaaggag gtggaggcgg tggtcgtggg gcccta 56

<210> 21

<211> 90

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

agtccgaggg catgatcaac ttcctcgtga aggaccggag gccgtctaag gaggtggagg 60

cggtggtcgt ggggccctac tgacccgccc 90

<210> 22

<211> 112

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

tcggctgcaa tctgctcatc aagtccgagg gcatgatcaa cttcctcgtg aaggaccgga 60

ggccgtctaa ggaggtggag gcggtggtcg tggggcccta ctgacccgcc ct 112

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 23

ttcgtgaagg atcgga 16

<210> 24

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 24

taaaacccca cgacc 15

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 探针(Probe)

<400> 25

ccgcctccac ctccttaaac ga 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 阻断剂(obstructore proscriptionum)

<400> 26

taaaacccca caaccaccac c 21

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 27

ggttaggtat agtggtttat atttgtaatt ttagta 36

<210> 28

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 28

attaactaaa ctaatcttaa actcctaacc tca 33

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 探针(Probe)

<400> 29

cctaccttaa cctccc 16

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 30

tctaacaatt ataaactcca accaccaa 28

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 引物(Primers)

<400> 31

gggaagatgg gatagaaggg aatat 25

<210> 32

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(ordo artificialis)

<220>

<223> 探针(Probe)

<400> 32

ccttcattct aacccaatac ctatcccacc tctaaa 36

Claims

1.一种DNA甲基化检测试剂盒，所述试剂盒用于胃癌的诊断，其特征在于所述试剂盒中包含：

(1)对待测DNA进行转化处理的试剂，所述试剂包括亚硫酸氢盐和/或重亚硫酸盐；

(2)用于待测DNA扩增和检测的试剂，其中所述待测DNA为Reprimo基因，所述试剂包括用于扩增和检测Reprimo基因的上游引物、下游引物和检测探针，所述上游引物、下游引物和检测探针的序列分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；

(3)用于检测内参基因ALU-C4的试剂，其包括用于扩增ALU-C4的正向引物和反向引物以及ALU-C4检测探针，所述正向引物、反向引物和检测探针的序列分别为SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29，和

(4)阻断剂，其中所述阻断剂序列为SEQ ID NO:26，且所述阻断剂的3’端基团使得所述阻断剂在DNA扩增时无法被延伸。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述阻断剂的3’端基团选自磷酸基团、间隔子C3(Spacer C3)、间隔子C9(Spacer C9)、间隔子18(Spacer 18)中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述检测探针用标记物标记。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述标记物为荧光标记物。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括PCR反应试剂、阳性对照品和/或阴性对照品。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶，所述阳性对照品为Reprimo合成DNA，所述阴性对照品为纯化水。

7.(1)对待测DNA进行转化处理的试剂、(2)用于待测DNA扩增和检测的试剂、(3)用于检测内参基因ALU-C4的试剂和(4)阻断剂在制备DNA甲基化检测试剂盒中的用途，所述试剂盒用于胃癌的诊断，所述待测DNA为Reprimo基因，其特征在于:

所述(1)对待测DNA进行转化处理的试剂包括亚硫酸氢盐和/或重亚硫酸盐；

所述(2)用于待测DNA扩增和检测的试剂包括用于扩增和检测Reprimo基因的上游引物、下游引物和检测探针，所述上游引物、下游引物和检测探针的序列分别为SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；

所述(3)用于检测内参基因ALU-C4的试剂包括用于扩增ALU-C4的正向引物和反向引物以及ALU-C4检测探针，所述正向引物、反向引物和检测探针的序列分别为SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29；

所述(4)阻断剂序列为SEQ ID NO:26，且所述阻断剂的3’端基团使得所述阻断剂在DNA扩增时无法被延伸。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述阻断剂的3’端基团选自磷酸基团、间隔子C3(Spacer C3)、间隔子C9(Spacer C9)、间隔子18(Spacer 18)中的一种。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其中所述检测探针用标记物标记。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述标记物为荧光标记物。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述试剂盒中包括PCR反应试剂、阳性对照品和/或阴性对照品。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶，所述阳性对照品为Reprimo合成DNA，所述阴性对照品为纯化水。