CN110117660A

CN110117660A - 可用于肿瘤鉴定的标志物stamp-ep11及其检测试剂

Info

Publication number: CN110117660A
Application number: CN201910535548.9A
Authority: CN
Inventors: 李振艳; 罗怀兵
Original assignee: Shanghai Yipu Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Yipu Medical Laboratory Co ltd; Shanghai Epiprobe Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-06-20
Filing date: 2019-06-20
Publication date: 2019-08-13
Anticipated expiration: 2039-06-20
Also published as: CN110117660B

Abstract

本发明属于疾病诊断标记物领域。本发明提供了一种可用于肿瘤鉴定的标志物及其检测试剂或试剂盒。在多种临床肿瘤类型的测试中，本发明所述肿瘤标志物可呈现在肿瘤组织中的高度甲基化、而在对应的正常组织中则低甲基化，在肿瘤组织以及癌旁组织中，其能够呈现为具有显著性的差异，并在不同的肿瘤类型中具有广谱适用性。

Description

可用于肿瘤鉴定的标志物STAMP-EP11及其检测试剂

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，更具体地，本发明涉及一种可用于肿瘤鉴定的标志物STAMP-EP11及其检测试剂。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的疾病之一，至今缺少理想的治疗手段和药物。DNA序列改变以外的调控机制异常在肿瘤的发生、发展过程中更为普通和重要，这种不依赖于DNA序列变化的可遗传的调控机制被称为表观遗传学机制，包括组蛋白乙酰化、DNA甲基化、MicoRNA、非编码长RNA等。其中以DNA甲基化研究最为深入，无论在针对个别基因、还是在新兴的全基因组学层面以及功能调控领域都被广泛研究，并且在肿瘤临床实践的诊断和治疗中的DNA甲基化的应用前景也受到了很大的重视。

在肿瘤细胞中，一些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的基因呈现出高甲基化的状态并转录失活，受累基因包括抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期控制基因和抗凋亡基因等，由此促进了肿瘤的发生发展。DNA甲基化的研究不仅可以从新的角度使人们进一步了解肿瘤的发生发展机制，肿瘤细胞DNA呈现出的异常甲基化谱式已经成为一个新的肿瘤生物标志物的研究领域，而且由于DNA甲基化修饰的可逆性，使其也具有成为分子治疗靶点的可能。

DNA甲基化是指生物体内在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。目前研究DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐(Bisulfite)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。

尽管本领域目前已经能够通过一定的手段来检测DNA甲基化，但是本领域仍然缺少具有典型性的或具有普适性的、适于检测的肿瘤标记物。并且，人类基因组的复杂性，蛋白-蛋白、蛋白-基因、基因-基因的复杂的相互作用以及越来越多干扰性分子的存在，也使得合适的肿瘤标记物被湮没或表象所掩盖。

本发明人致力于该领域的前沿研究，在本发明人的前期研究中，找到了一部分基于甲基化修饰的肿瘤标记物。但是，仍然有必要找到更多的新型肿瘤标志物，从而为肿瘤的诊断提供更多的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于人基因组的分离的核酸，可被应用于肿瘤鉴定的标志物STAMP-EP11，本发明还提供了其获得方法，其序列以及其在制备诊断试剂方面的应用，本发明也涉及其诊断试剂或试剂盒等

在本发明的第一方面，提供来源于人基因组的核酸，包括：(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；(2)(1)的核酸的片段，且其中包括至少1个修饰的CpG位点(如2～91个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90个)；和/或(3)(1)或(2)的核酸或片段的反义链核酸。

在一个优选例中，所述的反义链核酸例如为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸。

在另一优选例中，(2)中，所述来源于人基因组的核酸的片段中存在：SEQ ID NO:1中第27～48位核苷酸序列(对应于004-006号CpG位点)；SEQ ID NO:1中第1～544位核苷酸序列(对应于001～055号CpG位点)；SEQ ID NO:1中第571～1014位核苷酸序列(对应于056～091号CpG位点)；SEQ ID NO:3中第967-988位核苷酸序列(对应于004-006号CpG位点)；SEQ ID NO:3中第471-1014位核苷酸序列(对应于001～055号CpG位点)；或SEQ ID NO:3中第1-444位核苷酸序列(对应于056～091号CpG位点)。

在另一优选例中，所述修饰的CpG位点包括发生5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰的CpG位点。

在本发明的第二方面，提供一种经处理的核酸，其由前一方面所述的来源于人基因组的核酸转变而来，对应于前述第一方面的序列，其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变，非修饰的胞嘧啶转为T或U。

在一个优选例中，其由对应于前述第一方面的来源于人基因组的核酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。在另一优选例中，所述的核酸包括：(4)核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的核酸；(5)上述(4)的核酸的片段，且其中包括至少1个修饰的CpG位点；所述CpG位点的个数如2～91个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90个。

在另一优选例中，(5)中，所述的核酸的片段中存在：SEQ ID NO:2中第27～48位序列(对应于004-006号CpG位点)；SEQ ID NO:2中第1～544位序列(对应于001～055号CpG位点)；SEQ ID NO:2中第571～1014位序列(对应于056～091号CpG位点)；SEQ ID NO:4中第967-988位序列(对应于004-006号CpG位点)；SEQ ID NO:4中第471-1014位序列(对应于001～055号CpG位点)；或SEQ ID NO:4中第1-444位序列(对应于056～091号CpG位点)。

在本发明的第三方面，提供一种检测样品的甲基化谱式的方法，包括：(i)提供样品，提取核酸；(ii)检测(i)的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面所述的核酸或由其转变而来的前述第二方面所述的核酸。

在一个优选例中，步骤(ii)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR(MSP)、或它们的组合以及SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。

在另一优选例中，步骤(ii)包括：(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该核酸CpG中的C发生高度甲基化。

在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不以直接获得疾病的诊断结果为目的，或不是诊断性的方法。

在另一优选例中，所述检测样品的甲基化谱式的方法为体外方法。

在本发明的第四方面，提供前述第一方面或第二方面所述的核酸的应用，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒被用于肿瘤的诊断、检测或预后。

在一个优选例中，所述肿瘤包括(但不限于)：血液系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，消化系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，其他系统肿瘤；较佳地，所述血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

在另一优选例中，所述肿瘤的样本包括但不限于：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

在本发明的第五方面，提供一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤诊断、检测或预后，所述方法包括：提供前述第一方面或第二方面所述的来源于人基因组的核酸，以所述核酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个(如2～91个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90个)修饰的CpG位点；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针，芯片或试纸。

在本发明的第六方面，提供一种试剂或试剂组合，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面或第二方面任一所述的核酸的全长或片段，其中包括至少1个(如2～91个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90个)修饰的CpG位点。

在一个优选例中，所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：引物，探针，试纸或芯片。

在另一优选例中，所述的引物为：SEQ ID NO:3和4所示的引物；SEQ ID NO:7和8所示的引物。

在本发明的第七方面，提供前述第六方面所述的试剂或组合的试剂的应用，用于制备检测肿瘤的试剂盒。

在本发明的第八方面，提供一种用于肿瘤诊断、分型或预后的试剂盒，包括利用前述第一方面或第二方面所示序列设计的引物对以及包含该序列的基因Panel或基因群组，通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。

在本发明的第九方面，提供一种检测试剂盒，其包括前面所述的试剂或试剂组合；较佳地，每一种试剂位于一个独立的容器中，或被保留活性地相互混合。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括但不限于：DNA纯化试剂，DNA提取试剂，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，PCR扩增试剂和/或使用说明书；所述说明书用于标明检测操作步骤和结果判定标准。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、基于BSP技术检测SEQ ID NO:1区域中001-055甲基化位点，显示乳腺癌细胞中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。

图2、基于BSP技术检测SEQ ID NO:1区域中056～091甲基化位点，显示乳腺癌细胞中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。

图3、基于Pyro技术检测，显示乳腺癌组织中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常乳腺癌组织。

图4、基于Pyro技术检测，显示结直肠癌组织中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常结直肠癌组织。

图5、基于Pyro技术检测，显示食管癌组织中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常结食管癌组织。

图6、基于Pyro技术检测，显示白血病骨髓样本中本发明的标记物的甲基化水平显著高于非白血病骨髓样本。

图7、基于Pyro技术检测，显示肝癌组织中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常肝癌组织。

图8、基于Pyro技术检测，显示肺癌组织中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常肺癌组织。

图9、基于Pyro技术检测，显示结胰腺癌组织中本发明的标记物的甲基化水平显著高于正常结胰腺癌组织。

具体实施方式

本发明人长期从事人体肿瘤标记物的研究筛选，在广泛研究的基础上揭示了一种通用型的DNA甲基化肿瘤标志物STAMP(Specific Tumor Aligned Methylation of Pan-cancer)-EP11。该肿瘤标志物在正常组织和肿瘤组织中表现出显著性的甲基化状态的差异，这种差异统计学意义显著，且在实体瘤以及非实体瘤等诸多肿瘤中表现出这种差异。因此，本发明的STAMP-EP11可作为临床肿瘤的诊断、检测、预后的标志物，也可作为肿瘤临床辅助诊断或预后的新型分子。

如本文所用，“样品”或“样本”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所示的样本可以包括但不限于：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

如本文所用，“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中CpG存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。例如，以甲基化特异PCR(MSP)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果即可认为该受试的DNA(基因)区处于高甲基化状态。例如，以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。

本发明人发现，STAMP-EP11基因序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到STAMP-EP11基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者罹患肿瘤或属于肿瘤高危人群。并且，STAMP-EP11呈现的这种在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存的显著差异广谱地存在于不同种类的肿瘤中，包括实体瘤如乳腺癌以及非实体瘤如白血病。

基于本发明人的上述新发现，本发明提供了来源于人基因组的核酸，其具有SEQID NO:1或SEQ ID NO:3(为SEQ ID NO:1的反义链序列)所示的核苷酸序列，在肿瘤细胞内，该核酸序列中多处5’-CpG-3’的碱基C位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。

针对本发明提供的一个或多个CpG进行检测均是可以的，因此本发明也包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个可以为2～91个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90个。上述的核酸或片段也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

作为一些优选方式，所述的核酸的片段例如是包含SEQ ID NO:1中第27～48位、1～544位或571～1014位序列，上述片段的反义链也是可用的，例如是SEQ ID NO:3中第967-988位、第471-1014位或第1-444位序列。这些片段是本发明的较佳实施方式的举例，本领域技术人员应理解，根据本发明提供的信息，也可以选择其它的片段。

此外，包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或序列片段的基因Panel或基因群组也被包含在本发明中。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。

上述的核酸可以作为基因组中人们分析甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态。任何可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中。

上述的核酸在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。

因此，本发明还提供了上述核酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的核酸，包括：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸。这些核酸也可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。

本发明也包含上述核酸或其反义链经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个例如2～91个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90个。应理解，在本发明提供了正义链的CpG编号后，反义链中各个CpG位点相应于正义链的编号是根据本发明所提供的内容易于获得的。

测定核酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。

检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法。这种方法是基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。其他可用的技术还有：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、qPCR法、二代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或HPLC法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。应理解，在本发明的新揭示的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中。

作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中核酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的PCR扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理核酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的核酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中核酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。

本发明所述的方法包括：包括：(a)提供样品，提取基因组DNA；(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在甲基化谱式异常。

本发明的方法可用于：(i)对受试者样品进行检测，分析受试者是否患有肿瘤；(ii)区分肿瘤高危人群。所述的方法也可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。

在本发明的优选实施例中，通过PCR扩增及焦磷酸测序法检测DNA甲基化，实际应用中并不限于该方法，其它DNA甲基化检测方法亦可。本领域人员应理解，在进行PCR扩增中，所应用的引物并不限于是实施例中所提供的，在本领域技术人员能力范围内，还可以设计出与本发明实施例存在不同，但仍然针对于本发明所指示的核酸或相应CpG位点的引物。

由于基因组DNA经过重亚硫酸盐处理后，非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，在后续的PCR过程中又转换为胸腺嘧啶，会降低基因组的序列复杂度，使得PCR扩增出特异目标片段的难度增大。因此优选地可采用巢式PCR扩增，设计外围与内围两对引物，进行两轮PCR扩增反应，以第一轮的扩增产物作为第二轮扩增的模板，可以有效提高扩增的效率与特异性。然而应理解，本发明中可用的检测方法并不限于此。

经过针对临床样本的研究验证，本发明的方法用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高。本发明可应用于肿瘤辅助诊断、疗效判定、预后监测等等领域，具有很高的临床应用价值。

在本发明人筛选所获得的肿瘤标记物的基础上，本发明还提供了基于所述的核酸序列设计的检测试剂，用于体外检测样品中核酸的甲基化谱式。本领域已知的确定基因组的序列、其变异及甲基化状态的检测方法和试剂均可被应用于本发明中。

因此，本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的核酸，以所述核酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个(例如2～91个)甲基化CpG位点。

本发明所述的检测试剂可以包括但不限于：引物，探针，等等；在获得了所述的标记物后，检测试剂的选择是本领域技术人员可以做到的。

作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物对。在本发明的优选实施例中，所述的引物为：SEQ ID NO:5和6所示的引物，其可以获得包含SEQ ID NO:1中001～055号CpG位点的扩增产物；SEQ ID NO:7和8所示的引物，其可以获得包含SEQ ID NO:1中056～091号CpG位点的扩增产物；或SEQ ID NO:9和10所示的引物，其可以获得包含SEQ ID NO:1中004-006号CpG位点的扩增产物。

在得知了核酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG互补为针对原为去甲基化的基因区)。

根据本发明的新发现，针对本发明所述的肿瘤标志物靶序列上的不同位置的CpG位点或其组合，本领域技术人员可以设计出多种引物或探针或其它类型的检测试剂，这些均应被包含在本发明的技术方案中。

所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条核酸。

本发明还提供了体外检测样品中核酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。

所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂，这些试剂是本领域技术人员易于获得的，一般可以通过商购途径获得。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、从基因组确定肿瘤标记物

针对人基因组序列，本发明人进行了深入的筛选，获得一种肿瘤标记物STAMP-EP11，其序列如下SEQ ID NO:1(chr8:99952021-99953034，Human/hg19)所示，其中下划线标示碱基为甲基化CpG位点，下划线下面的数字表该位点的编号；该序列中存在91个CpG位点。

上述SEQ ID NO:1序列经重亚硫酸盐处理后序列如下SEQ ID NO:2(其中Y代表C或U)：

上述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的反向互补序列如下SEQ ID NO:3：

上述SEQ ID NO:3序列经重亚硫酸盐处理后序列如下SEQ ID NO:4(其中Y代表C或U)：

实施例2、基于BSP技术的CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异研究

本实施例中，通过亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP-Bisulfite Sequencing PCR)测定STAMP-EP11 CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异。该亚硫酸氢盐处理后测序法步骤如下：

(1)提取乳腺癌细胞系MCF7与正常乳腺组织基因组DNA；

(2)分别用重亚硫酸盐处理提取的乳腺癌细胞系MCF7与正常乳腺组织基因组DNA，作为后续PCR扩增的模板；

(3)根据SEQ ID NO:1的序列设计扩增引物(SEQ ID NO:5-8)，常规方法设计引物进行扩增。

(4)PCR扩增之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段特异性，切胶回收目的片段，连接插入T载体，转化感受态大肠杆菌，涂菌板，第二天挑克隆测序，每个片段挑取大于10个克隆进行Sanger测序。

表1、亚硫酸氢盐处理后测序法所用引物

利用表1中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的引物，以BSP测序法对SEQ ID NO:1区域中001-055甲基化位点乳腺癌细胞与正常乳腺组织甲基化水平BSP验证。结果如图1，显示乳腺癌细胞STAMP-EP11甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。

利用表1中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的引物，以BSP测序法对SEQ ID NO:1区域中056～091甲基化位点乳腺癌细胞与正常乳腺组织甲基化水平BSP验证。结果如图2，显示乳腺癌细胞STAMP-EP11甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。

实施例3、基于焦磷酸测序技术的CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异研究

本实施例中，通过焦磷酸测序法(Pyrosequencing；Pyro)测定STAMP-EP11CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异。该测序技术的步骤如下：

1、获取临床样本：从临床获取癌旁/非癌-癌组织样本，癌旁/非癌样本作为对照组，癌组织样本作为肿瘤检测实验组；

2、DNA提取：分别提取实验组和对照组DNA；本实验用酚氯仿抽提法，但不限于该方法；

3、重亚硫酸盐处理：以重亚硫酸盐处理提取的DNA样本，严格按照步骤操作；本实验中用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit，货号D5006，但不限于该试剂盒；

4、引物设计：根据STAMP-EP11序列SEQ ID NO：1特点，设计PCR扩增引物与焦磷酸测序引物，检测004-006号CpG位点的甲基化值，作为STAMP-EP11甲基化值的代表，PCR引物扩增序列、焦磷酸测序引物序列、焦磷酸测序上机检测序列以及检测位点如SEQ ID NO 9-12所示；

5、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：以重亚硫酸盐处理后的样本作为PCR的模板，进行PCR扩增，扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的特异性；

6、焦磷酸测序：通过QIAGEN公司的Pyro Mark Q96 ID焦磷酸测序仪进行检测，严格按照说明书步骤进行操作；

7、STAMP-EP11甲基化值计算：焦磷酸测序可以独立检测出目标区域内单个CpG位点的甲基化情况，计算所有CpG位点甲基化平均值作为STAMP-EP11在该样本中的甲基化值；

8、结果分析：比较癌旁/非癌对照组与肿瘤实验组STAMP-EP11甲基化值。

表2、焦磷酸测序法所用引物

实施例4、乳腺癌及癌旁样本的显著性差异比较

本发明人从临床获取5例乳腺癌癌旁样本作为对照组，同时获取5例乳腺癌组织样本作为实验组。

按照前述实施例3所述的焦磷酸检验步骤，本发明人比较了对照组与实验组的样本中，STAMP-EP11甲基化水平。

结果如图3所示，在乳腺癌临床样本中，本发明的肿瘤标志物STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，在乳腺癌样本中甲基化水平约为50％。而在癌旁样本中甲基化水平约为10％，统计学差异非常显著。

实施例5、结直肠癌及癌旁样本的显著性差异比较

本发明人从临床获取了8例结直肠癌癌旁样本作为对照组，同时获取8例结直肠癌样本作为实验组。

进一步地，本发明人按照实施例3中所述的焦磷酸检验步骤，分析STAMP-EP11甲基化水平。

结果如图4所示，在结直肠癌临床样本中，本发明的肿瘤标志物STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，在结直肠癌样本中甲基化水平约为12％，而在癌旁样本中约为6％，统计学差异显著。

实施例6、食管癌及癌旁样本的显著性差异比较

本发明人从临床获取了10例食管癌癌旁样本作为对照组，同时获取10例食管癌样本作为实验组。

结果如图5所示，在食管癌临床样本中，本发明的肿瘤标志物STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，在食管癌样本中甲基化水平约为55％，而在癌旁样本中约为17％，统计学差异非常显著。

实施例7、白血病骨髓样本及非白血病骨髓样本的差异性比较

本发明人从临床获取8例非白血病骨髓涂片样本作为对照组，同时获取8例白血病骨髓涂片样本作为实验组。

进一步地，本发明人按照实施例3中所述的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组STAMP-EP11甲基化水平。

结果如图6所示，在白血病临床样本中，STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于非白血病组织，在白血病样本中甲基化水平约为26-27％，而在非白血病样本中约为3-4％，统计学差异极其显著。

实施例8、肝癌及癌旁样本的显著性差异比较

本发明人从临床获取8例肝癌癌旁样本作为对照组，同时获取8例肝癌样本作为实验组。

结果如图7所示，在肝癌临床样本中，STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，在肝癌样本中甲基化水平约为30-32％，而在癌旁样本中约为8％，统计学差异显著。

实施例9、肺癌及癌旁样本的显著性差异比较

本发明人从临床获取4例肺癌癌旁样本作为对照组，同时获取4例肺癌样本作为实验组。

结果如图8所示，在肺癌临床样本中，STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，在肺癌样本中甲基化水平约为60-61％，而在癌旁样本中则约为20-21％，统计学差异非常显著。

实施例10、胰腺癌及癌旁样本的显著性差异比较

本发明人从临床获取4例胰腺癌癌旁样本作为对照组，获取4例胰腺癌样本作为实验组。

结果如图9所示，在胰腺癌临床样本中，STAMP-EP11在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，在胰腺癌样本中甲基化水平约为38％，而在癌旁样本中则约为12％，统计学差异非常显著。

根据上述实施例4～10的结果，本发明的肿瘤标记物在白血病样本以及非白血病样本中甲基化水平差异最为显著；在乳腺癌、食管癌、肺癌、胰腺癌样本以及相应的非癌样本中甲基化水平差异非常显著；在其它的肿瘤中也呈现了显著性的差异，可见其具有多种肿瘤的广谱适用性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海奕谱生物科技有限公司

<120> 可用于肿瘤鉴定的标志物STAMP-EP11及其检测试剂

<130> 192650

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

cgtctaccca cgttgagcac gacagccggg ccagtcccgc cctgggcggt tggggccttc 60

ccagaggggc ccggtgcgga gagcccccct ctccccggat gtgtctgggg cctgtccttc 120

actgcgatgt catcggtaaa cctggtcttc cttgtcacgg acactgaagc gcttggttcg 180

aaaagcacca tgaattcgaa gcagccttgg acgcgggatc atgggcgtta gcctggctct 240

ctccgacgag gcaaactgca ggagatcccc ttccctggag tcaccggaag gcgaaagcac 300

gctctgtgcc cgcgcgccgc cccgggagcc cgctcctacc ccctcggcgt gcggcgcggg 360

cctggagacc gcggagcccg agccgtatcc agcttgtgca ggagccggtg cgcccttccg 420

cccgctcctc ccccgggacc atcctcacgc tccagggtcg cggaggcatc ttgcgactag 480

cgaggggctg acggtggcct gggtggcctt gcgccggctc tgggctccgc cgctgcggca 540

gccgagggcc tcagctggga aatccaaacc cgggctggac ctgggctcaa ggaggtttct 600

gtccccaggc tagaccacca cggccacggc cacgcaactt gccctgagac cccgtgctcg 660

gccttcccac tgagctcccc ttccctgtga ctcagtgcct cgcaggctgg tggccggaag 720

ggtgcctgcg gctggctggc ccggcccgat tccgggtggc ggggttcctg cagtgaggaa 780

cgaccctcag ctcccgcaga cgcgggaagg cccccgcgcc atccgtggga gtggggcagc 840

ctgtctgcac gcggtcccct gggaaacccc tctgcatctc ccgcccggac aaggtccccg 900

gccttggaat ctgcgccgcc ccgcacgcga ccgcctgcga actccctgcg ctggggtcag 960

aactggtatc tttctcctcc tctggggaag tcagggcagc ccggagtggc gtcg 1014

<210> 2

<211> 1014

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1014)

<223> 经重亚硫酸盐处理后序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1014)

<223> 其中y代表c或u

<400> 2

ygtutauuua ygttgaguay gauaguyggg uuagtuuygu uutgggyggt tgggguuttu 60

uuagaggggu uyggtgygga gaguuuuuut utuuuyggat gtgtutgggg uutgtuuttu 120

autgygatgt uatyggtaaa uutggtuttu uttgtuaygg auautgaagy guttggttyg 180

aaaaguauua tgaattygaa guaguuttgg aygygggatu atgggygtta guutggutut 240

utuygaygag guaaautgua ggagatuuuu ttuuutggag tuauyggaag gygaaaguay 300

gututgtguu ygygyguygu uuygggaguu ygutuutauu uuutyggygt gyggygyggg 360

uutggagauy gyggaguuyg aguygtatuu aguttgtgua ggaguyggtg yguuuttuyg 420

uuygutuutu uuuygggauu atuutuaygu tuuagggtyg yggagguatu ttgygautag 480

ygaggggutg ayggtgguut gggtgguutt gyguyggutu tgggutuygu ygutgyggua 540

guygaggguu tuagutggga aatuuaaauu ygggutggau utgggutuaa ggaggtttut 600

gtuuuuaggu tagauuauua ygguuayggu uayguaautt guuutgagau uuygtgutyg 660

guuttuuuau tgagutuuuu ttuuutgtga utuagtguut yguaggutgg tgguyggaag 720

ggtguutgyg gutggutggu uygguuygat tuygggtggy ggggttuutg uagtgaggaa 780

ygauuutuag utuuyguaga ygygggaagg uuuuygyguu atuygtggga gtgggguagu 840

utgtutguay gyggtuuuut gggaaauuuu tutguatutu uyguuyggau aaggtuuuyg 900

guuttggaat utgyguyguu uyguaygyga uyguutgyga autuuutgyg utggggtuag 960

aautggtatu tttutuutuu tutggggaag tuaggguagu uyggagtggy gtyg 1014

<210> 3

<211> 1014

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

cgacgccact ccgggctgcc ctgacttccc cagaggagga gaaagatacc agttctgacc 60

ccagcgcagg gagttcgcag gcggtcgcgt gcggggcggc gcagattcca aggccgggga 120

ccttgtccgg gcgggagatg cagaggggtt tcccagggga ccgcgtgcag acaggctgcc 180

ccactcccac ggatggcgcg ggggccttcc cgcgtctgcg ggagctgagg gtcgttcctc 240

actgcaggaa ccccgccacc cggaatcggg ccgggccagc cagccgcagg cacccttccg 300

gccaccagcc tgcgaggcac tgagtcacag ggaaggggag ctcagtggga aggccgagca 360

cggggtctca gggcaagttg cgtggccgtg gccgtggtgg tctagcctgg ggacagaaac 420

ctccttgagc ccaggtccag cccgggtttg gatttcccag ctgaggccct cggctgccgc 480

agcggcggag cccagagccg gcgcaaggcc acccaggcca ccgtcagccc ctcgctagtc 540

gcaagatgcc tccgcgaccc tggagcgtga ggatggtccc gggggaggag cgggcggaag 600

ggcgcaccgg ctcctgcaca agctggatac ggctcgggct ccgcggtctc caggcccgcg 660

ccgcacgccg agggggtagg agcgggctcc cggggcggcg cgcgggcaca gagcgtgctt 720

tcgccttccg gtgactccag ggaaggggat ctcctgcagt ttgcctcgtc ggagagagcc 780

aggctaacgc ccatgatccc gcgtccaagg ctgcttcgaa ttcatggtgc ttttcgaacc 840

aagcgcttca gtgtccgtga caaggaagac caggtttacc gatgacatcg cagtgaagga 900

caggccccag acacatccgg ggagaggggg gctctccgca ccgggcccct ctgggaaggc 960

cccaaccgcc cagggcggga ctggcccggc tgtcgtgctc aacgtgggta gacg 1014

<210> 4

<211> 1014

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1014)

<223> 经重亚硫酸盐处理后序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1014)

<223> 其中y代表c或u

<400> 4

ygayguuaut uygggutguu utgauttuuu uagaggagga gaaagatauu agttutgauu 60

uuagyguagg gagttyguag gyggtygygt gyggggyggy guagattuua agguygggga 120

uuttgtuygg gygggagatg uagaggggtt tuuuagggga uygygtguag auaggutguu 180

uuautuuuay ggatggygyg gggguuttuu ygygtutgyg ggagutgagg gtygttuutu 240

autguaggaa uuuyguuauu yggaatyggg uyggguuagu uaguyguagg uauuuttuyg 300

guuauuaguu tgygagguau tgagtuauag ggaaggggag utuagtggga agguygagua 360

yggggtutua ggguaagttg ygtgguygtg guygtggtgg tutaguutgg ggauagaaau 420

utuuttgagu uuaggtuuag uuygggtttg gatttuuuag utgagguuut yggutguygu 480

agyggyggag uuuagaguyg gyguaagguu auuuagguua uygtuaguuu utygutagty 540

guaagatguu tuygygauuu tggagygtga ggatggtuuy gggggaggag ygggyggaag 600

ggyguauygg utuutguaua agutggatay ggutygggut uygyggtutu uagguuygyg 660

uyguayguyg agggggtagg agygggutuu yggggyggyg ygyggguaua gagygtgutt 720

tyguuttuyg gtgautuuag ggaaggggat utuutguagt ttguutygty ggagagaguu 780

aggutaaygu uuatgatuuy gygtuuaagg utguttygaa ttuatggtgu ttttygaauu 840

aagyguttua gtgtuygtga uaaggaagau uaggtttauy gatgauatyg uagtgaagga 900

uagguuuuag auauatuygg ggagaggggg gututuygua uyggguuuut utgggaaggu 960

uuuaauyguu uagggyggga utgguuyggu tgtygtgutu aaygtgggta gayg 1014

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ggatgttttt ttttgttatt tat 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

ttaaatttcc caactaaaac cctc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

gagggtttta gttgggaaat ttaa 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

accaataaac ttctccacac ccacc 25

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

gaggatgttt ttttttgtta tttatygttt attta 35

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 10

caccraaccc ctctaaaaaa accccracc 29

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 11

gtttatttay gttgagtayg atagt 25

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> 焦磷酸测序上机检测序列

<400> 12

ygggttagtt tygttttggg yggtyggggt 30

Claims

1.一种来源于人基因组的核酸，选自：

(1)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；

(2)(1)的核酸的片段，且其中包括至少1个修饰的CpG位点，如包括2～91个修饰的CpG位点；和/或

(3)(1)或(2)的核酸或片段的反义链核酸。

2.如权利要求1所述的分离的核酸，其特征在于，(2)中，所述的核酸的片段中存在：

SEQ ID NO:1中第27～48位核苷酸序列；

SEQ ID NO:1中第1～544位核苷酸序列；

SEQ ID NO:1中第571～1014位核苷酸序列；

SEQ ID NO:3中第967-988位核苷酸序列；

SEQ ID NO:3中第471-1014位序核苷酸列；或

SEQ ID NO:3中第1-444位核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的来源于人基因组的核酸，其特征在于，所述修饰的CpG位点包括发生5-羟甲基化修饰、5-甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰的CpG位点。

4.一种由权利要求1～3任一所述的来源于人基因组的核酸转变而来的核酸，对应于权利要求1或3的序列，其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变，非修饰的胞嘧啶转变为T或U。

5.如权利要求4所述的由来源于人基因组的核酸转变而来的核酸，其特征在于，包括：

(4)如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸；

(5)来自于(4)的核酸的片段，且其中包括至少1个修饰的CpG位点，如包括2～91个修饰的CpG位点。

6.如权利要求5所述的核酸，其特征在于，(5)中，所述的核酸的片段中存在：

SEQ ID NO:2中第27～48位序列；

SEQ ID NO:2中第1～544位序列；

SEQ ID NO:2中第571～1014位序列；

SEQ ID NO:4中第967-988位序列；

SEQ ID NO:4中第471-1014位序列；或

SEQ ID NO:4中第1-444位序列。

7.检测待测样品的甲基化谱式的方法，其特征在于，包括：提取待测样品的核酸；以及检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求3～6任一所述的核酸。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合以及SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：

(1)对所提取的核酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；

(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。

10.权利要求1～6任一所述的来源于人基因组的核酸的应用，其特征在于，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒被用于肿瘤的诊断、检测或预后；较佳地，所述肿瘤包括：血液系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，消化系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，其他系统肿瘤；较佳地，所述血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述肿瘤的样本包括：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。

12.一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤诊断、检测或预后，所述方法包括：提供权利要求1～6任一所述的来源于人基因组的核酸，以所述核酸全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个修饰的CpG位点；较佳地，所述的检测试剂包括：引物，探针，芯片或试纸。

13.一种试剂或试剂组合，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求1～6任一所述的核酸的全长或片段，其中包括至少1个修饰的CpG位点；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。

14.如权利要求13所述的试剂或试剂组合，其特征在于，所述的试剂或组合的试剂包括：引物；较佳地，所述的引物为：SEQ ID NO:5和6所示；SEQ ID NO:7和8所示；或SEQ IDNO:9和10所示。

15.权利要求13或14所述的试剂或试剂组合的应用，用于制备肿瘤诊断、检测或预后的试剂盒；较佳地，所述的肿瘤包括：所述肿瘤包括：血液系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，消化系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，其他系统肿瘤。

16.一种用于进行肿瘤诊断、检测或预后的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：权利要求13或14任一所述的试剂或试剂组合。