CN110229913A - 基于甲基化水平检测肿瘤的广谱性标记物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种广谱性肿瘤标记物核酸，该核酸及其经特定处理后获得的核酸可作为临床肿瘤的诊断、分型、检测、预后的标志物，以及作为肿瘤临床辅助诊断或预后的新型分子。

Description

基于甲基化水平检测肿瘤的广谱性标记物及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤学及诊断学领域，更具体地，本发明涉及基于甲基化水平检测肿瘤的广谱性标记物及其应用。
背景技术
肿瘤标志物(肿瘤标记物)是指特征性存在于恶性肿瘤细胞，或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质，或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质，并能反映肿瘤发生、发展，监测肿瘤对治疗反应的一类物质。肿瘤标志物存在于肿瘤患者的组织、体液和排泄物中，能够用免疫学、生物学及化学的方法检测到。
现有技术中常见的肿瘤标记物的来源包括但不限于：肿瘤细胞的代谢产物如糖酵解产物、组织多肽抗原、核酸分解产物；分化紊乱的细胞基因产物如异位的ACTH片段，甲胎蛋白、癌胚抗原、胎儿同工酶；肿瘤细胞坏死崩解释放进入血液循环的物质如某些细胞骨架蛋白成分，如细胞角质素片段抗原21-1、多胺类物质；肿瘤宿主细胞的细胞反应性产物如VCA-IgA、EA-IgA。
随着诊断技术的不断进步，越来越多的肿瘤标记物被探索和研究，但是本领域仍然缺少一些具有广谱性的标记物。同时，准确性、灵敏度更高的标记物的开发也是本领域已知探索的。
DNA甲基化是指生物体内在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。
目前研究DNA甲基化的方法主要有：1.甲基化敏感性内切酶法；2.重亚硫酸盐(Bisulfite)修饰法；3.特异性识别甲基化抗体分析法；4.质谱或色谱分析法等。尽管本领域目前已经能够通过一定的手段来检测DNA甲基化，但是本领域仍然缺少具有典型性的或具有普适性的、适于检测的肿瘤标记物。并且，人类基因组的复杂性，蛋白-蛋白、蛋白-基因、基因-基因的复杂的相互作用以及越来越多干扰性分子的存在，也使得合适的肿瘤标记物被湮没或表象所掩盖。
本发明人致力于该领域的前沿研究，在本发明人的前期研究中，找到了一部分基于甲基化修饰的肿瘤标记物。但是，仍然有必要找到更多的新型肿瘤标志物，从而为肿瘤的诊断提供更多的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供基于甲基化水平检测肿瘤的广谱性标记物，本发明还提供了其获得方法，其序列以及其在制备诊断试剂方面的应用，本发明也涉及其诊断试剂或试剂盒等。
在本发明的第一方面，提供来源于人的广谱性肿瘤标记物，其甲基化水平在肿瘤和非肿瘤中存在显著性差异，并且其具有广谱可用性。所述肿瘤标记物包括：包括SEQ IDNO:1所示核苷酸序列中至少1个(如2～40个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，35个)修饰的CpG位点的核酸，如包括2～40个修饰的CpG位点的核酸；和/或(2)与上述(1)的核酸在序列上互补的核酸。
在一个优选例中，所述的反义链核酸例如为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸。
在另一优选例中，所述修饰的CpG位点包括发生5-羟甲基化修饰、5-甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰的CpG位点。
在另一优选例中，(2)中，所述广谱性肿瘤标记物的片段中存在：SEQ ID NO:1中第399～421位核苷酸序列或其互补的序列的核酸片段；较佳地，该互补序列为SEQ ID NO:3中第14-36位核苷酸序列。
在本发明的第二方面，提供一种经处理的核酸，其由前一方面所述的广谱性肿瘤标记物转变而来，对应于前述第一方面的序列，其非修饰的胞嘧啶转为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
在一个优选例中，所述第二方面的经处理的核酸由对应于前述第一方面的广谱性肿瘤标记物经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理转变而来。
在另一优选例中，所述的核酸包括：(4)核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的核酸；(5)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸的片段，且其中包括至少1个修饰的CpG位点，如包括2～40个修饰的CpG位点，更具体如3，5，10，15，20，25，30，35个。
在另一优选例中，(5)中，所述的核酸的片段中存在：SEQ ID NO:2中第399～421位核苷酸序列或其互补的序列的核酸片段；较佳地，该互补序列为SEQ ID NO:4中第14-36位核苷酸序列(对应本发明中031-038号CpG位点)。
在本发明的第三方面，提供一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤诊断、检测或预后，所述方法包括：提供前述第一方面或第二方面所述的广谱性肿瘤标记物，以所述核酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个；该CpG位点的个数也可以为2～40个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，35个；较佳地，所述的检测试剂包括(但不限于)：引物，探针，芯片或试纸。
在本发明的第四方面，提供一种试剂或试剂组合，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面或第二方面任一所述的核酸的全长或片段，其中包括至少1个本发明的CpG位点；该CpG位点的个数也可以为2～40个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，35个。所述的检测试剂可以包括但不限于：引物，探针，试纸或芯片。
在一个优选例中，所述的试剂或组合的试剂针对包含所述靶序列的基因序列(基于所述基因序列而设计)，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。
在另一优选例中，所述的引物为SEQ ID NO:3和4所示的引物。
在另一优选例中，所述的引物为SEQ ID NO:7和8所示的引物。
在本发明的第五方面，提供前述第四方面所述的试剂或试剂组合的应用，用于制备对肿瘤进行分型、诊断、检测或预后的试剂盒。
在本发明的第六方面，提供一种用于肿瘤诊断、分型、检测或预后的试剂盒，包括利用前述第一方面或第二方面所示序列设计的引物对以及包含该序列的基因Panel或基因群组，通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。
在本发明的第七方面，提供一种检测试剂盒，其包括前面所述的试剂或试剂组合；较佳地，每一种试剂位于一个特定的容器中，或被保留活性地相互混合；所述试剂包括但不限于：引物，探针，芯片或试纸。
在一个优选例中，所述的试剂盒中还可包括但不限于：DNA纯化试剂，DNA提取试剂，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，PCR扩增试剂。
在优选例中，所述的试剂盒中还包括：用于标明检测操作步骤和结果判定标准的说明书。
在本发明的第八方面，提供一种检测样品的甲基化水平的方法，包括：(i)提供样品，提取核酸；(ii)检测(i)的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是前述第一方面所述的核酸或由其转变而来的前述第二方面所述的核酸。
在一个优选例中，步骤(ii)中，分析的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR(MSP)、或它们的组合以及SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。并且，其它其他甲基化检测方法及未来新开发的甲基化检测方法也可被应用于本发明中。
在另一优选例中，步骤(ii)包括：(1)对(i)的产物进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；(2)分析经(1)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
在另一优选例中，所述的甲基化谱式异常是指该核酸CpG中的C发生高度甲基化。
在另一优选例中，所述的甲基化谱式的方法不是诊断性的方法，也即其不以直接获得疾病的诊断结果为目的。
在另一优选例中，所述检测样品的甲基化谱式的方法为体外方法。
在本发明的第九方面，提供前述核酸或转变的核酸的在制备用于肿瘤的诊断、分型、检测或预后的诊断试剂中的应用。或者，提供前述核酸或转变的核酸的在制备用于肿瘤的诊断、分型、检测或预后的诊断试剂盒中的应用。
在一个优选例中，所述肿瘤的样本包括但不限于：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。
根据前面任一方面所述，所述肿瘤是广谱的肿瘤；较佳地，所述肿瘤包括(但不限于)：血液系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，消化系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，其他系统肿瘤；较佳地，所述血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、乳腺癌细胞STAMP-EP12甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。
图2、本发明的肿瘤标志物STAMP-EP12在实验组白血病临床样本中甲基化值显著高于非癌样本，p值小于0.01，统计学差异非常显著。
图3、在乳腺癌临床样本中，本发明的肿瘤标志物在实验组乳腺癌临床样本中甲基化值显著高于癌旁样本，p值小于0.01，统计学差异非常显著。
图4、在结直肠癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，统计学差异显著，p值小于0.05。
图5、显示在食管癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，统计学差异显著，p值小于0.05。
图6、在肝癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，统计学差异显著，p值小于0.05。
图7、在肺癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织，p值小于0.05，统计学差异显著。
图8、在胰腺癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。统计学差异非常显著，p值小于0.01。
具体实施方式
本发明人致力于DNA表观修饰领域的疾病标志物的研究筛选，在大量筛选以及结合临床研究的基础上，揭示一种广谱型的DNA甲基化肿瘤标志物STAMP(Specific TumorAligned Methylation of Pan-cancer)-EP12。该肿瘤标志物在正常组织和肿瘤组织中表现出显著性的甲基化状态的差异，这种差异统计学意义显著，且在实体瘤以及非实体瘤等诸多肿瘤中表现出这种差异，所述的非实体瘤如血液肿瘤。因此，本发明的肿瘤标志物可作为临床肿瘤的诊断、分型、检测、预后的标志物，也可作为肿瘤临床辅助诊断或预后的新型分子。
如本文所用，“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中CpG存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。例如，以甲基化特异PCR(MSP)分析手段而言，以甲基化特异性引物所进行的PCR反应可获得阳性的PCR结果即可认为该受试的DNA(基因)区处于高甲基化状态。例如，以实时定量甲基化特异性PCR而言，高甲基化状态的判定可根据其对照样品的甲基化状态的相对值分析统计学差异。
如本文所用，“样品”或“样本”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如，所示的样本可以包括但不限于：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。
本发明人发现，STAMP-EP12基因序列区域的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存在显著的差异，只要检测到STAMP-EP12基因序列区域存在异常高甲基化状态，即可判定该受检者罹患肿瘤或属于肿瘤高危人群。并且，STAMP-EP12呈现的这种在肿瘤组织和非肿瘤组织之间存的显著差异广谱地存在于不同种类的肿瘤中，包括实体瘤如乳腺癌、肝癌，同时也包括非实体瘤如白血病。实体瘤以及非实体瘤的研究结果在统计学有意义的临床研究中得以证实。
因此，本发明提供了来源于人基因组的核酸，其具有SEQ ID NO:1；本发明也包括其反义链，具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。在肿瘤细胞内，该核酸序列中多处5’-CpG-3’的碱基C位置上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)，因此其可被应用于作为肿瘤标志物。
针对本发明提供的一个或多个CpG进行检测均是可以的，因此本发明也包含SEQID NO:1或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个可以为2～40个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，35个。
作为一些优选方式，所述的核酸的片段例如是包含SEQ ID NO:1中第399～421位核苷酸序列或其互补的序列的核酸片段，例如是为SEQ ID NO:3中第14-36位核苷酸序列。这些片段是本发明的较佳实施方式的举例，本领域技术人员应理解，根据本发明提供的信息，也可以选择其它的片段。当然，本发明所具体列举的片段可作为优选的技术方案。
本发明也包括SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列或序列片段的基因Panel或基因群组。针对所述的基因Panel或基因群组，也可以通过DNA甲基化状态检测获取正常细胞和肿瘤细胞的特征。
本发明提供的核酸可以作为基因组中分析甲基化状态的关键区域，通过各种本领域已知的技术来分析它们的甲基化状态，进而分析肿瘤的发生或发展情况。应理解，任何可用于分析甲基化状态的技术均可被应用于本发明中，本发明对此类检测技术没有特别的限制。
本发明的SEQ ID NO:1核酸或其片段或它们的反义链，可在经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。因此，本发明还提供了上述核酸(包括其互补链(反义链))经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的核酸，包括：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸。这些核酸可作为设计检测试剂或检测试剂盒的基础。
本发明也包含上述核酸或其反义链经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的核酸的片段，且其中包括至少1个甲基化CpG位点。所述的至少一个例如2～40个，更具体如3，5，10，15，20，25，30，35个。应理解，在本发明提供了正义链的CpG编号后，反义链中各个CpG位点相应于正义链的编号是根据本发明所提供的内容易于获得的。
测定核酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylight)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。
在本发明的新揭示的基础上，本领域公知的这些技术以及即将发展的一些技术，均可被应用于本发明中，来实施甲基化水平的检测。例如，检测甲基化水平时可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法，其基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。此外，其他可用的技术还有：qPCR法、二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术或HPLC法以及组合基因群组检测法等该领域常规方法。尽管本发明的实施例中提供了一些优选的方式，但本发明的总体方案并不限于此。
作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中核酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是：亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，在后续的PCR扩增过程中转变为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理核酸后，甲基化的位点产生类似于一个C/T的核酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中核酸的甲基化谱式，可以有效区分出甲基化与非甲基化的胞嘧啶。
本发明所述的方法包括：包括：(a)提供样品，提取基因组DNA；(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在甲基化谱式异常。
本发明的方法可用于：(i)对受试者样品进行检测，分析受试者是否患有肿瘤；(ii)区分肿瘤高危人群。所述的方法也可以是不以获得直接的疾病诊断结果为目的的情形。
在本发明的优选实施例中，通过PCR扩增及焦磷酸测序法检测DNA甲基化，实际应用中并不限于该方法，其它DNA甲基化检测方法亦可。本领域人员应理解，在进行PCR扩增中，所应用的引物并不限于是实施例中所提供的，在本领域技术人员能力范围内，还可以获得与本发明实施例所提供的引物在序列上存在不同，但仍然针对于本发明所指示的核酸或相应CpG位点的引物。
作为PCR扩增技术的优选方式，可采用巢式PCR扩增，设计外围与内围两对引物，进行两轮PCR扩增反应，以第一轮的扩增产物作为第二轮扩增的模板，可以有效提高扩增的效率与特异性。然而应理解，本发明中可用的检测方法并不限于此。
围绕本发明所提供的标记物核酸，本发明还提供了基于所述的核酸序列设计的检测试剂，用于体外检测样品中核酸的甲基化谱式。本领域已知的确定基因组的序列、其变异及甲基化状态的检测方法和试剂均可被应用于本发明中。
本发明提供了一种制备肿瘤检测试剂的方法，包括：提供所述的核酸，以所述核酸的全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个(例如2～40个)甲基化CpG位点。
本发明所述的检测试剂可以包括但不限于：引物，探针，等等；在获得了所述的标记物后，检测试剂的选择是本领域技术人员可以做到的。
作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物对。在本发明的优选实施例中，所述的引物为：SEQ ID NO:5和6所示的引物，其可以获得包含SEQ ID NO:1中001～055号CpG位点的扩增产物；SEQ ID NO:7和8所示的引物，其可以获得包含SEQ ID NO:1中056～091号CpG位点的扩增产物；或SEQ ID NO:9和10所示的引物，其可以获得包含SEQ ID NO:1中004-006号CpG位点的扩增产物。
在得知了核酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG互补为针对原为去甲基化的基因区)。
除了引物，其它的诊断或检测试剂也是可以制备的，例如探针、芯片等。
根据本发明的新发现，针对本发明所述的肿瘤标志物靶序列上的不同位置的CpG位点或其组合，本领域技术人员可以设计出多种引物或探针或其它类型的检测试剂，这些均应被包含在本发明的技术方案中。
所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条核酸。
本发明还提供了体外检测样品中核酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括：容器，以及位于容器中的上述引物对。
所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂以及其它试剂，例如样本处理试剂。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。
经过针对多种疾病临床样本的验证，本发明的方法及试剂用于诊断临床肿瘤时，准确性非常高。本发明可应用于肿瘤前期筛查、疗效判定、辅助诊断、预后监测等等领域，具有广泛性。
下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实施本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。
材料和方法
1、亚硫酸氢盐处理后测序方法
采用亚硫酸氢盐处理后测序法(BSP-Bisulfite Sequencing PCR)来进行甲基化差异分析，判别STAMP-EP12 CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异。
该方法的操作步骤包括如下：
(1)提取乳腺癌细胞系MCF7与正常乳腺组织基因组DNA；
(2)分别用重亚硫酸盐处理提取的乳腺癌细胞系MCF7与正常乳腺组织基因组DNA，作为后续PCR扩增的模板；
(3)根据SEQ ID NO:1的序列物，常规方法设计引物进行扩增；
(4)PCR扩增之后，2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片段特异性，切胶回收目的片段；
(5)将前面获得的目的片段连接插入T载体，转化感受态大肠杆菌，涂菌板，第2天选择阳性克隆；
(6)测序，每个片段挑取大于10个克隆进行Sanger测序。
2、焦磷酸测序法
采用焦磷酸测序法(Pyrosequencing)来进行分析，判别STAMP-EP12 CpG位点在肿瘤细胞与非肿瘤细胞的甲基化差异。该方法的操作步骤包括如下：
(1)获取临床样本：从临床获取癌旁/非癌-癌组织样本，癌旁/非癌样本作为对照组，癌组织样本作为肿瘤检测实验组；
(2)DNA提取：分别提取实验组和对照组DNA；本实验用酚氯仿抽提法；
(3)重亚硫酸盐处理：以重亚硫酸盐处理提取的DNA样本，严格按照步骤操作；本实验中用ZYMO Research公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit，货号D5006，但不限于该试剂盒；
(4)引物设计：根据STAMP-EP12序列SEQ ID NO：1特点，设计PCR扩增引物与焦磷酸测序引物；
(5)PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳：以重亚硫酸盐处理后的样本作为PCR的模板，进行PCR扩增，扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增的特异性；
(6)焦磷酸测序：通过QIAGEN公司的Pyro Mark Q96 ID焦磷酸测序仪进行检测，严格按照说明书步骤进行操作；
(7)STAMP-EP12甲基化值计算：焦磷酸测序可以独立检测出目标区域内单个CpG位点的甲基化情况，计算所有CpG位点甲基化平均值作为STAMP-EP12在该样本中的甲基化值；
(8)结果分析：比较癌旁/非癌对照组与肿瘤实验组STAMP-EP12甲基化值。
实施例1、临床有意义的核酸分子标志物的获得
为了获得在肿瘤以及非肿瘤中甲基化存在显著差异的分子，本发明人经过大量的研究筛选，去伪存真，获得一种肿瘤标记物，本发明人将该标记物命名为“STAMP-EP12”。其序列SEQ ID NO:1(chr13:100623915-100624348，Human/hg19)所示：
SEQ ID NO:1中，双下划线标示碱基为甲基化CpG位点，双下划线下面的数字代表位点的编号；框线内的位置为后续部分实施例中所针对的位置。
上述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的反向互补序列如SEQ ID NO:3：
CGCGCCCTCTGCCCGCGTGCCGGCGCGCGCTCCGCGAGGTGCGTCAAGGAAGAGCGGGGCGCTGCGCGCGCAGGCCAGGCTCAAACTTTCTGCAAGTGCAACTTGGGCATCCCCGGGGAGGCGGGGACGTGTGGCTCCAGCGGAGGAGGGGGCGCGAAGCGAAAGCGCAGGCGGCCGCAAGCACGGGGGCGAATCCCCGCTGGGTCGAGGGCCTGAACGGGAGCCAATCGAGCAGCCGAGGCTACTGCCAATCACGCGGCTCCCTCCAATCCCACCCGTGCCATTTCCAAAATCTCGGTCCCACTGTGCAGCTCAAATGTGGTGTTCACTCTGCCAATCGCTGGAGGATAGAGTGGGAACAGGAATAAGCAGAGTTAAGAGGCCAGGACAAAAGAAGTTAAAGAGCGCCCAATACATACATGTTTTTGAAGGCG
上述SEQ ID NO:1序列，进行重亚硫酸盐处理后序列如SEQ ID NO:2(其中Y代表C或U)：
上述反向互补序列(SEQ ID NO:3)，进行重亚硫酸盐处理后序列如SEQ ID NO:4：
YGYGUUUTUTGUUYGYGTGUYGGYGYGYGUTUYGYGAGGTGYGTUAAGGAAGAGYGGGGYGUTGYGYGYGUAGGUUAGGUTUAAAUTTTUTGUAAGTGUAAUTTGGGUATUUUYGGGGAGGYGGGGAYGTGTGGUTUUAGYGGAGGAGGGGGYGYGAAGYGAAAGYGUAGGYGGUYGUAAGUAYGGGGGYGAATUUUYGUTGGGTYGAGGGUUTGAAYGGGAGUUAATYGAGUAGUYGAGGUTAUTGUUAATUAYGYGGUTUUUTUUAATUUUAUUYGTGUUATTTUUAAAATUTYGGTUUUAUTGTGUAGUTUAAATGTGGTGTTUAUTUTGUUAATYGUTGGAGGATAGAGTGGGAAUAGGAATAAGUAGAGTTAAGAGGUUAGGAUAAAAGAAGTTAAAGAGYGUUUAATAUATAUATGTTTTTGAAGGYG
上述序列中，Y代表C或U。
上述肿瘤标志物在肿瘤及非瘤组织的甲基化水平差异，在后续实施例中进一步论证。
实施例2、乳腺癌细胞与正常乳腺组织细胞的甲基化水平比较
根据SEQ ID NO:1的序列设计BSP引物(SEQ ID NO:5～6)，如表1所示。所述的BSP引物用于检测SEQ ID NO：1中001～040号CpG位点。
表1
引物名称 5’～3’引物序列 SEQ ID NO:
STAMP-EP12-Sanger-Primer-F ATTGGGGGGATTTTATTTTTTTTGT 5
STAMP-EP12-Sanger-Primer-R ACTACCCCTCRAAAATCCTCAAC 6
按照前述材料和方法中所述进行BSP检测，结果如图1。
根据图1，以SEQ ID NO:1序列中001-040甲基化位点分析乳腺癌细胞与正常乳腺组织甲基化水平，结果显示乳腺癌细胞STAMP-EP12甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。图中，深色小方块标示相应位点呈现“甲基化”，而浅色小方块标示相应位点呈现“非甲基化”。
因此，乳腺癌细胞STAMP-EP12甲基化水平显著高于正常乳腺组织细胞。
实施例3、用于焦磷酸测序方法的检测试剂的设计
根据STAMP-EP12序列SEQ ID NO：1特点，设计PCR扩增引物与焦磷酸测序引物，检测031-038号CpG位点的甲基化值，作为STAMP-EP12甲基化值的代表，PCR引物扩增序列、焦磷酸测序引物序列、焦磷酸测序上机检测序列以及检测位点如表2中SEQ ID NO 7～10所示。
表2
实施例4、白血病临床样本及非癌样本的比较
本发明人从医院获取受试者的临床样本，进行白血病临床样本及非癌样本的比较。
从临床获取8例非白血病骨髓涂片样本作为对照组，获取8例白血病骨髓涂片样本作为实验组，按照前述材料和方法中的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组STAMP-EP12甲基化水平。
结果显示，在白血病临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于非癌组织，如图2。
根据图2，本发明的肿瘤标志物STAMP-EP12在实验组白血病临床样本中甲基化值显著高于非癌样本，在白血病临床样本中甲基化水平约为60％；而在非癌样本中甲基化水平约为20％，统计学差异非常显著，p值小于0.01。
实施例5、乳腺癌临床样本及非癌样本的比较
从临床获取5例乳腺癌癌旁样本作为对照组，获取5例乳腺癌组织样本作为实验组，按照前述材料和方法中的焦磷酸检验步骤，比较对照组与实验组STAMP-EP12甲基化水平。
结果显示，在乳腺癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。如图3，本发明的肿瘤标志物STAMP-EP12在实验组乳腺癌临床样本中甲基化值显著高于癌旁样本，在乳腺癌临床样本中甲基化水平约为58％；而在非癌样本中甲基化水平约为20％，统计学差异非常显著，p值小于0.01。
实施例6、结直肠癌临床样本及非癌样本的比较
临床获取8例结直肠癌癌旁样本作为对照组，获取8例结直肠癌样本作为实验组，利用焦磷酸检验方法，分析对照组以及实验组的STAMP-EP12甲基化水平，观测其差异情况是否显著。
结果显示于图4，在结直肠癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。在结直肠癌临床样本中甲基化水平约为55％；而在非癌样本中甲基化水平约为34％，统计学差异显著，p值小于0.05。
实施例7、食管癌临床样本及非癌样本的比较
临床获取10例食管癌癌旁样本作为对照组，获取10例食管癌样本作为实验组，按照焦磷酸检验步骤，分析STAMP-EP12甲基化水平.
结果呈现于图5中，显示在食管癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。在食管癌临床样本中甲基化水平约为49％；而在非癌样本中甲基化水平约为29％，统计学差异显著，p值小于0.05。
实施例8、肝癌临床样本及非癌样本的比较
临床获取8例肝癌癌旁样本作为对照组，获取8例肝癌样本作为实验组，按照焦磷酸检验步骤，分析STAMP-EP12甲基化水平。
结果显示于图6中，在肝癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。在肝癌临床样本中甲基化水平约为41％；而在非癌样本中甲基化水平约为24％，统计学差异显著，p值小于0.05。
实施例9、肺癌临床样本及非癌样本的比较
临床获取4例肺癌癌旁样本作为对照组，获取4例肺癌样本作为实验组，按照焦磷酸检验步骤，分析STAMP-EP12甲基化水平。
结果显示如图7。在肺癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。在肺癌临床样本中甲基化水平约为54％；而在非癌样本中甲基化水平约为38％，统计学差异显著，p值小于0.05。
实施例10、胰腺临床样本及非癌样本的比较
临床获取4例胰腺癌癌旁样本作为对照组，获取4例胰腺癌样本作为实验组，按照焦磷酸检验步骤，分析STAMP-EP12甲基化水平。
结果显示于图8，在胰腺癌临床样本中，STAMP-EP12在实验组中甲基化值显著高于癌旁组织。在胰腺癌临床样本中甲基化水平约为38.5％；而在非癌样本中甲基化水平约为23.5％，统计学差异非常显著，p值小于0.01。
虽然上文实施方式中揭示了本发明的具体实施例，但是其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海奕谱生物科技有限公司
<120> 基于甲基化水平检测肿瘤的广谱性标记物及其应用
<130> 192651
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 434
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
cgccttcaaa aacatgtatg tattgggcgc tctttaactt cttttgtcct ggcctcttaa 60
ctctgcttat tcctgttccc actctatcct ccagcgattg gcagagtgaa caccacattt 120
gagctgcaca gtgggaccga gattttggaa atggcacggg tgggattgga gggagccgcg 180
tgattggcag tagcctcggc tgctcgattg gctcccgttc aggccctcga cccagcgggg 240
attcgccccc gtgcttgcgg ccgcctgcgc tttcgcttcg cgccccctcc tccgctggag 300
ccacacgtcc ccgcctcccc ggggatgccc aagttgcact tgcagaaagt ttgagcctgg 360
cctgcgcgcg cagcgccccg ctcttccttg acgcacctcg cggagcgcgc gccggcacgc 420
gggcagaggg cgcg 434
<210> 2
<211> 434
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(434)
<223> seq id no:1 经重亚硫酸盐处理后序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(434)
<223> 其中y代表c或u
<400> 2
yguuttuaaa aauatgtatg tattgggygu tutttaautt uttttgtuut gguututtaa 60
ututguttat tuutgttuuu aututatuut uuagygattg guagagtgaa uauuauattt 120
gagutguaua gtgggauyga gattttggaa atgguayggg tgggattgga gggaguygyg 180
tgattgguag taguutyggu tgutygattg gutuuygttu agguuutyga uuuagygggg 240
attyguuuuy gtguttgygg uyguutgygu tttyguttyg yguuuuutuu tuygutggag 300
uuauaygtuu uyguutuuuy ggggatguuu aagttguaut tguagaaagt ttgaguutgg 360
uutgygygyg uagyguuuyg ututtuuttg ayguauutyg yggagygygy guygguaygy 420
ggguagaggg ygyg 434
<210> 3
<211> 434
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
cgcgccctct gcccgcgtgc cggcgcgcgc tccgcgaggt gcgtcaagga agagcggggc 60
gctgcgcgcg caggccaggc tcaaactttc tgcaagtgca acttgggcat ccccggggag 120
gcggggacgt gtggctccag cggaggaggg ggcgcgaagc gaaagcgcag gcggccgcaa 180
gcacgggggc gaatccccgc tgggtcgagg gcctgaacgg gagccaatcg agcagccgag 240
gctactgcca atcacgcggc tccctccaat cccacccgtg ccatttccaa aatctcggtc 300
ccactgtgca gctcaaatgt ggtgttcact ctgccaatcg ctggaggata gagtgggaac 360
aggaataagc agagttaaga ggccaggaca aaagaagtta aagagcgccc aatacataca 420
tgtttttgaa ggcg 434
<210> 4
<211> 434
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(434)
<223> seq id no:3 经重亚硫酸盐处理后序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(434)
<223> 其中y代表c或u
<400> 4
ygyguuutut guuygygtgu yggygygygu tuygygaggt gygtuaagga agagyggggy 60
gutgygygyg uagguuaggu tuaaautttu tguaagtgua auttggguat uuuyggggag 120
gyggggaygt gtggutuuag yggaggaggg ggygygaagy gaaagyguag gygguyguaa 180
guaygggggy gaatuuuygu tgggtygagg guutgaaygg gaguuaatyg aguaguygag 240
gutautguua atuaygyggu tuuutuuaat uuuauuygtg uuatttuuaa aatutyggtu 300
uuautgtgua gutuaaatgt ggtgttuaut utguuaatyg utggaggata gagtgggaau 360
aggaataagu agagttaaga gguuaggaua aaagaagtta aagagyguuu aatauataua 420
tgtttttgaa ggyg 434
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
attgggggga ttttattttt tttgt 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
actacccctc raaaatcctc aac 23
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
tgtatttgta gaaagtttga gtttggtttg 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
acccctcacc accccrcrcc ctctaccc 28
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 9
gtagygttty gttttttttt gaygtattt 29
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 10
ygyggagygy gygtyggtay gygggtagag ggygyggggt 40

Claims (16)

1.一种广谱性肿瘤标记物，其特征在于，所述广谱性肿瘤标记物包括：
(1)包括SEQ ID NO:1所示核苷酸序列中至少1个修饰的CpG位点的核酸，如包括2～40个修饰的CpG位点的核酸；和/或
(2)与上述(1)的核酸在序列上互补的核酸。
2.如权利要求1所述的广谱性肿瘤标记物，其特征在于，所述修饰的CpG位点包括发生5-醛甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-甲基化修饰或5-羧甲基化修饰的CpG位点。
3.如权利要求1所述的广谱性肿瘤标记物，其特征在于，包括选自下组的核酸：
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；
SEQ ID NO:1中第399～421位核苷酸序列或其互补的序列的核酸；较佳地，该互补序列为SEQ ID NO:3中第14-36位核苷酸序列。
4.一种由权利要求1～3任一所述的广谱性肿瘤标记物转变而来的核酸，对应于权利要求1或3的核酸，其非修饰的胞嘧啶转变为T或U，而其修饰的CpG位点的胞嘧啶C不变。
5.如权利要求4所述的广谱性肿瘤标记物转变而来的核酸，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸；
SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的核酸的片段，且其中包括至少1个修饰的CpG位点，如包括2～40个修饰的CpG位点。
6.如权利要求5所述的核酸，其特征在于，所述的核酸的片段中包括：SEQ ID NO:2中第399～421位核苷酸序列或其互补的序列的核酸片段；较佳地，该互补序列为SEQ ID NO:4中第14-36位核苷酸序列。
7.一种制备试剂的方法，所述试剂用于肿瘤诊断、检测、分型或预后，所述方法包括：提供权利要求1～6任一所述的广谱性肿瘤标记物或其转变而来的核酸，以所述核酸全长或片段作为靶序列，设计特异性检测该靶序列的CpG位点修饰情况的检测试剂；其中，所述的靶序列中包括至少1个修饰的CpG位点；较佳地，所述的检测试剂包括：引物，探针，芯片或试纸。
8.一种试剂或试剂组合，其特异性检测靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求1～6任一所述的核酸的全长或片段，其中包括至少1个修饰的CpG位点；较佳地，所述的试剂或试剂组合针对包含所述靶序列的基因序列，所述的基因序列包括基因Panel或基因群组。
9.如权利要求8所述的试剂或试剂组合，其特征在于，所述的试剂或试剂组合包括引物；较佳地，所述的引物包括：
SEQ ID NO:5和6所示核苷酸序列的引物；或
SEQ ID NO:7和8所示核苷酸序列的引物。
10.权利要求8或9所述的试剂或试剂组合的应用，用于制备肿瘤诊断、检测分型或预后的试剂盒。
11.一种用于进行肿瘤检测、分型、诊断或预后的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：权利要求8或9任一所述的试剂或试剂组合。
12.检测待测样品的甲基化水平的方法，其特征在于，包括：提取待测样品的核酸；以及检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况，所述的靶序列是权利要求4～6任一所述的核酸。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、qPCR法、数字PCR法、二代测序法、三代测序法、全基因组甲基化测序法、DNA富集检测法、简化亚硫酸氢盐测序技术、HPLC法、MassArray、甲基化特异PCR、或它们的组合；或SEQ ID NO:1所示序列中部分或全部甲基化位点的组合基因群组体外检测方法及体内示踪检测方法。
14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述检测所提取的核酸中靶序列的CpG位点修饰情况的方法包括：
(i)对所提取的核酸进行处理，使其中未发生修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；较佳地，所述修饰包括5-甲基化修饰、5-羟甲基化修饰、5-醛甲基化修饰或5-羧甲基化修饰；较佳地，利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(i)所述的核酸；
(ii)分析经(i)处理的核酸中所述的靶序列的修饰情况。
15.权利要求1～6任一所述的广谱性肿瘤标记物或其转变而来的核酸的应用，其特征在于，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒被用于肿瘤的诊断、检测或预后；较佳地，所述肿瘤的样本包括：组织样本、石蜡包埋样本、血液样本、胸腔积液样本以及肺泡灌洗液样本、腹水及灌洗液样本、胆汁样本、粪便样本、尿液样本、唾液样本、痰液样本、脑脊液样本、细胞涂片样本、宫颈刮片或刷片样本、组织及细胞活检样本。
16.如权利要求1、7、8、11、12任一所述，其特征在于，所述肿瘤包括：消化系统肿瘤，神经系统肿瘤，泌尿系统肿瘤，血液系统肿瘤，妇科及生殖系统肿瘤，其他系统肿瘤；较佳地，所述消化系统肿瘤如食道癌，胃癌，结直肠癌，肝癌，胰腺癌，胆管及胆囊癌；呼吸系统肿瘤如肺癌，胸膜瘤；神经系统肿瘤如胶质瘤，神经母细胞瘤，脑膜瘤；头颈部肿瘤如口腔癌，舌癌，喉癌，鼻咽癌；泌尿系统肿瘤如肾癌，膀胱癌，皮肤癌；血液系统肿瘤如白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤；妇科及生殖系统肿瘤如乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，外阴癌，睾丸癌，前列腺癌，阴茎癌；及其他系统如皮肤癌、黑色素瘤、骨肉瘤，脂肪肉瘤，甲状腺癌。
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