CN115927644A - 一种新型多靶点胃癌检测的标志物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型多靶点胃癌检测的组合标志物及其应用，通过从胃癌组织、癌旁组织、胃炎患者样本的高深度全基因组甲基化(WGBS)数据中找到了系列新型的、能高效区分胃癌和胃炎患者的甲基化位点，可用于胃癌的高效检测；将该新型基因甲基化位点与其他胃癌检测标志物(如PGI、PGII、G17和CEA)组合，能进一步提高AUC值，提高胃癌筛查的灵敏度和特异性。

Description

一种新型多靶点胃癌检测的标志物组合及其应用

技术领域

本发明涉及癌症筛查领域，具体而言，涉及一种新型多靶点胃癌检测的标志物组合及其应用。

背景技术

临床常用的胃癌诊断方案为内镜和影像学检查。但胃癌在一般人群中发病率较低(33/10万)，若将胃镜用于胃癌普查，则需消耗大量人力、物力资源，且由于其具有侵入性，患者的接受程度普遍较低。因此，内镜检查应用于胃癌早期筛查具有一定的局限性。影像学虽有多种检测手段，但一般也只用于定位和分期诊断。CT对进展期胃癌诊断率为65％～90％，早期胃癌仅约50％，在胃癌初诊时，并不推荐使用CT作为首选方案。传统的血清肿瘤标志物(CEA、CA19-9和CA72-4等)在胃癌诊断中的特异性维持在85.1％～96.2％时，其灵敏性不足27.6％。此外，PG、G-17和H.pylori等检测对胃癌诊断也存在较大争议。作为胃癌诊断金标准的内镜下活检则不仅有很大的侵入性，且有引起肿瘤扩散的风险。不仅如此，由于肿瘤有普遍的肿瘤内异质性存在，导致很多时候穿刺活检并不能显示肿瘤的全貌。目前临床常用的诊断方案虽然在胃癌定性、定位和分期方面具有一定的诊断能力，但是这些诊断方法在早期诊断方面的性能略显不足。

基于循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)检测的液体活检技术，由于其无创、实时、灵敏的特点，使之成为癌症早筛的主要检测方法，其中ctDNA的甲基化指标凭借组织溯源、增强信噪比、特征位点数量多等优势是癌症早筛的理想标志物。Kandimalla等(Clinical Cancer Research 27.22(2021):6135-6144)对多种胃肠道癌症进行了全基因组DNA甲基化分析，通过癌组织和非癌组织的比较，获得大量的差异甲基化区域(differentially methylated regions，DMRs)。基于这些DMRs结合机器学习算法，开发了胃肠道相关癌症的Panel，整体检测的AUC值为0.88，该研究提示ctDNA甲基化检测在胃肠道癌症检测中具有可靠的诊断准确性。Miao等(Cancer Control 27.2(2020):1073274820922559)比较了血浆甲基化SFRP2和肿瘤标志物(CEA、CA72-4、CA19-9和CA242)的胃癌诊断能力，结果显示甲基化SFRP2的检测灵敏度为60.9％，特异性为86％，显著优于肿瘤标志物的灵敏度(11.4％-22.8％)，可作为一种潜在的早期胃癌筛查生物标志物。但是现有的甲基化位点的检测早期胃癌的AUC值普遍偏低，灵敏度和特异性不高，并不能很好地区分胃癌和胃炎患者，依然还需要通过进一步地检查才能确诊。

另一方面，由于技术的局限性，ctDNA甲基化检测性能也有一定的天花板，结合基因组学、表观遗传学、蛋白质组学等多组学指标已成为发展趋势。国内云南省第一人民医院进行了一项前瞻性队列研究(Epigenomics 13.19(2021):1557-1570.)，共入组151名胃癌患者，56名萎缩性胃炎患者和87名其他胃肠道疾病患者以及224名健康人对照，本研究验证了mSEPT9、mRNF180和CA724联合用于胃癌检测的可行性。仅mSEPT9、mRNF180或CA724分别检测到48.3％、37.1％和43.1％的胃癌。mSEPT9和mRNF180的组合检测到60.3％的GC，所有三种标记的组合检测出68.6％的GC。三种标记的组合检测对于所有分期的胃癌患者检测的敏感度和特异度分别为68.6％和85.1％。美国癌症早筛公司Exact Sciences在2022欧洲医学肿瘤学会(ESMO)大会上公布了其多癌种早期检测(MCED)生物标志物验证研究的数据。该研究严格评估了血液中四种不同生物标志物(包括非整倍体、蛋白质、DNA甲基化和基因突变)用于早期检测癌症的性能。研究纳入了近600个癌症样本，非癌症对照队列则包括年龄匹配的、可能是健康的个体和患有非癌症疾病个体的样本，以更有效地代表预期使用人群。Exact Sciences与约翰霍普金斯大学和梅奥诊所的研究人员证明了该测试检测来自15个器官部位的癌症信号的能力(分别是乳腺癌、膀胱癌、结直肠癌、食道癌、肾癌、胃癌、肺癌、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、非-霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和子宫癌)，在I期和II期综合灵敏度为38.7％。该项目针对胃癌部分的研究数据尚未公布。

因此亟需找到能高效区分胃癌和胃炎的标志物组合，从而实现高灵敏度和高特异性的胃癌筛查，促进胃癌的早发现和早治疗，满足临床的迫切需求。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种新型多靶点胃癌检测的组合标志物和试剂盒及其在胃癌检测中的应用。通过从胃癌组织、癌旁组织、胃炎患者样本的高深度全基因组甲基化(WGBS)数据中找到了系列新型的、能高效区分胃癌和胃炎患者的甲基化位点，可用于胃癌的高效检测；将该新型基因甲基化位点与其他胃癌检测标志物(如PGI、PGII、G17和CEA)组合，能进一步提高AUC值，提高胃癌筛查的灵敏度和特异性。

本研究小组找到了在胃癌和其他胃病患者中甲基化程度具有显著差异的18个甲基化位点，并从中进一步精确筛选得到6个甲基化位点的组合，实现了在较少的标志物检测情况下对于胃癌的高效检出。

一方面，本发明提供了一种标志物用于制备胃癌检测试剂的用途，所述标志物为选自如表1所示的Seq ID NO.1～Seq ID NO.18中的任意一种或多种核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

表1、胃癌检测位点

本发明通过对胃癌组织、配对的癌旁组织、胃炎患者血浆游离DNA进行甲基化测序，筛选出区分胃癌和非胃癌的基于CpG的甲基化位点，然后进一步通过大量的胃癌和非胃癌血浆样本验证，最终发现并确定了在胃癌患者中发生甲基化异常的18个靶序列。经临床验证，本发明提供的18个新型靶序列，在胃癌和其他胃病患者中甲基化程度差异显著。

18个靶序列为双链DNA，存在互补序列，可以理解的是，本发明提供的甲基化位点靶序列可以是其正义链，也可以是其反义链。

在一些方式中，所述标志物为选自如序列表Seq ID NO.1～Seq ID NO.18中的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种或18种核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

进一步地，所述标志物为包含Seq ID NO.4和/或Seq ID NO.18的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

Seq ID NO.4或Seq ID NO.18对应的甲基化位点的AUC值、检测灵敏度和特异性都明显高于其他16个甲基化位点。

进一步地，所述标志物为包含Seq ID NO.4和/或Seq ID NO.18的2种、6种或18种核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

进一步地，所述标志物为包括Seq ID NO.1和Seq ID NO.4所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.5和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.2、Seq IDNO.4、Seq ID NO.8、Seq ID NO.11、Seq ID NO.14和Seq ID NO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.10、SeqID NO.11和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq IDNO.3、Seq ID NO.7、Seq ID NO.12、Seq ID NO.14、Seq ID NO.15和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、SeqID NO.12、Seq ID NO.13和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.3、Seq ID NO.6、Seq ID NO.8、Seq ID NO.10和Seq IDNO.11所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.4、SeqID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.9和Seq ID NO.16所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.7、Seq ID NO.10、Seq ID NO.13和Seq ID NO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1～Seq IDNO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

进一步地，所述标志物为包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq IDNO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

经大量临床胃癌及胃炎样本验证，本发明从上述18个靶序列中，找到6个能够特别灵敏、特异地区分胃癌患者、胃炎患者、良性对照个体的全新的高甲基化位点，分别具有如序列表Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq IDNO.18所示的序列。通过检测胃癌及胃炎临床血浆样本的数据显示，仅仅采用这6个甲基化位点进行胃癌检测，其AUC值就能达到0.957，灵敏度达到88％，特异性达到89％；研究证明，该6个甲基化位点的胃癌诊断性能并不低于甚至还略高于18个甲基化位点组合的情况，而且检测过程更简便高效，最具应用前景。

进一步地，所述标志物还包括蛋白标志物，所述蛋白标志物由胃蛋白酶原I(PGI)、胃蛋白酶原II(PGII)、胃泌素(G17)和癌胚抗原(CEA)组成。

由于技术的局限性，单独通过甲基化位点检测癌症的性能也有一定的天花板，结合基因组学、表观遗传学、蛋白质组学等多个类别的多组学已成为发展趋势。已有多个临床研究表明，多组学标志物检测的敏感性和特异性优于单一组学标志物。因此在本发明提供的甲基化位点的基础上，结合蛋白水平检测，进一步提高胃癌检测的AUC值，提高检测灵敏度和特异性。

本发明提供的蛋白标志物PGI、PGII、G17和CEA在胃癌病人血清中的水平，与胃炎病人血清中蛋白标志物的水平比较有着较显著的差异。

研究证明，通过检测本发明提供的系列新型甲基化位点的甲基化水平，并结合血清样本中的PGI、PGII、G17和CEA蛋白水平，能够更加灵敏、特异的区分胃癌患者和非癌个体。通过检测临床胃癌及胃炎样本的数据显示，本发明提供的组合可以非常有效地区分胃癌和非癌的患者，AUC值最高能达到0.971，灵敏度达到92％，特异性达到90％。

另一方面，本发明提供了一种检测胃癌的引物组合，所述引物组合为选自如表2所示的18组引物、探针组合中的任意一组或多组。

表2、引物、探针组合

在一些方式中，所述引物组合为选自表2所示的引物、探针组合中的任意2种或6种。

进一步地，所述引物组合为如表3所示的6组引物、探针组合。

表3、6组引物、探针组合

组别	靶序列	正向引物	反向引物	探针
					4	Seq ID NO.4	Seq ID NO.32	Seq ID NO.34	Seq ID NO.33
10	Seq ID NO.10	Seq ID NO.50	Seq ID NO.52	Seq ID NO.51
					12	Seq ID NO.12	Seq ID NO.56	Seq ID NO.58	Seq ID NO.57
13	Seq ID NO.13	Seq ID NO.59	Seq ID NO.61	Seq ID NO.60
					15	Seq ID NO.15	Seq ID NO.65	Seq ID NO.67	Seq ID NO.66
18	Seq ID NO.18	Seq ID NO.74	Seq ID NO.76	Seq ID NO.75

进一步地，所述引物组合中还包含内参基因的引物和探针，所述内参基因COL2A1具有如序列表Seq ID NO.19所示的序列，其正向引物具有如序列表Seq ID NO.20所示的序列，反向引物具有如序列表Seq ID NO.22所示的序列，探针具有如序列表Seq ID NO.21所示的序列。

再一方面，本发明提供了一种用于检测胃癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的任一种引物和探针组合。

进一步地，所述试剂盒或芯片还包括用于检测蛋白的试剂或材料，所述蛋白包括PGI、PGII、G17和CEA。

再一方面，本发明提供了一种用于检测胃癌的标记物组合，所述标记物组合包括甲基化位点和蛋白标志物，所述甲基化位点为选自如序列表Seq ID NO.1～Seq ID NO.18中的任意一种或多种；所述蛋白标志物包括PGI、PGII、G17和CEA。

在一些方式中，所述标志物组合中的甲基化位点为包含Seq ID NO.4和/或Seq IDNO.18的2种、6种或18种核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

在一些方式中，所述标志物组合中的甲基化位点为包括Seq ID NO.1和Seq IDNO.4所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.5和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.2、Seq ID NO.4、Seq ID NO.8、Seq ID NO.11、Seq ID NO.14和SeqID NO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.3、Seq ID NO.7、Seq ID NO.12、Seq ID NO.14、Seq IDNO.15和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.3、Seq ID NO.6、Seq IDNO.8、Seq ID NO.10和Seq ID NO.11所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.9和Seq ID NO.16所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.7、Seq ID NO.10、Seq ID NO.13和Seq ID NO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1～Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

在一些方式中，所述标志物组合中的甲基化位点为包括Seq ID NO.4、Seq IDNO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

再一方面，本发明提供了一种用于检测胃癌的标记物组合，所述标记物组合包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

通过本发明提供的甲基化位点进行体外检测胃癌的方法包括以下步骤：

1)分离待测生物样本中的基因组DNA或血浆游离DNA；

2)检测所述甲基化位点或者甲基化位点组合的甲基化状态；

3)通过所述目标基因甲基化位点状态，进行生物样品状态的判断，并实现对胃癌的体外检测。

通过本发明提供的甲基化位点和蛋白组合进行体外检测胃癌的方法包括以下步骤：

1)分离待测生物样本中的基因组DNA或血浆游离DNA和血清；

2)检测所述甲基化位点或者甲基化位点组合的甲基化状态和血清PGI、PGII、G17和CEA蛋白水平；

3)通过所述目标基因甲基化位点状态以及蛋白标志物水平，进行生物样品状态的判断，并实现对胃癌的体外检测。

在一些方式中，所述方法还包括以下步骤：

1)分离待测生物样本的血清和血浆，提取待测生物样本的血浆游离DNA；

2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，转化为尿嘧啶以后的碱基在杂交能力上不同于5位未甲基化的胞嘧啶，并且是可以检测的；

3)将步骤2)处理过的DNA样品与聚合酶链式反应体系组合，聚合酶链式反应体系包含以下一种等几种组分：DNA聚合酶、所述目标靶序列的引物或者引物组合、相对应的探针或探针组合、聚合酶链式反应缓冲液，发生聚合酶链式反应后，产生扩增产物；

4)用被荧光标记的一种探针或几种探针的组合检测扩增产物，如果探针和扩增产物结合，则可以产生荧光信号；如果探针无法和扩增产物结合，则不能产生荧光信号；

5)基于是否产生荧光信号，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG的甲基化状态；

6)采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中PGI、PGII、G17和CEA的浓度；

在一些方式中，所述的聚合酶链式反应体系中，DNA聚合酶包括耐热DNA聚合酶、热启动的DNA聚合酶、或缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶。

所述目标基因靶序列中至少一个CpG的甲基化状态是由PCR反应的循环阈值Ct值或靶基因的Ct值之间的差值进行确定。通过利用PCR反应分析生物样本中DNA的甲基化状态，能够方便地实现一个或多个目标基因靶序列的甲基化状态的检测。

在一些方式中，所述将DNA的5位未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，优选采用的试剂为亚硫酸氢盐。

胞嘧啶5号位的甲基化修饰，是广泛存在于真核细胞生物中的一种DNA修饰方式，DNA上的甲基化修饰不仅在生物的生长发育中起到重要作用，在细胞的原癌化过程中也起着非常重要的作用。由于和胞嘧啶具有一样的碱基互补配对性质，5-甲基胞嘧啶无法通过一代测序或高通量测序的方式来直接测定。目前最常用的检测5-甲基胞嘧啶的方法是将待测DNA通过亚硫酸氢盐转化，在碱性水解后，未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶则不会发生转化。尿嘧啶在碱基互补配对的时候会与腺嘌呤互补配对，区别于胞嘧啶与鸟嘌呤的互补配对，因此通过对经过亚硫酸氢盐处理的DNA进行检测时，借助测序技术、聚合酶链式反应技术或者DNA分子杂交相关的技术，可以确定剩余的未发生转化的胞嘧啶，从而确定在原始DNA分子中，哪些胞嘧啶发生了甲基化。因此，本发明优选采用亚硫酸氢盐作为甲基化转化试剂，对待检的DNA样本进行处理后，通过测序、聚合酶链式反应或DNA分子杂交等相关技术，确定目标基因靶序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。

在一些方式中，本发明的方法适用于分析混合状态的样本，例如血液、粪便或组织中存在的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这类样本中的CpG二核苷酸序列的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定的方法来确定CpG二核苷酸序列的甲基化水平，如百分比、比率、分数或程度等，而不是单核苷酸分子的甲基化修饰状态。相应的，本发明中所述的甲基化状态应被认为是包括单核苷酸分子的甲基化修饰状态在内的，包含定量甲基化水平来反应的甲基化状态。

在一些方式中，本发明采用实时荧光定量PCR方式来测定甲基化状态，诸如：使用Taqman探针的实时荧光定量PCR，使用荧光染料的实时荧光定量PCR，使用甲基化特异性PCR(MSP)等方法，用于测定目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。由于不同甲基化状态的基因目标靶序列的碱基互补配对能力不同，因此可以通过实时荧光定量PCR进行基因组DNA样品中甲基化状态的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。

作为对照，本发明中使用COL2A1基因，通过设计引物探针均不覆盖任何CpG二核苷酸的位置，对于投入的经试剂处理后的基因组DNA进行检测。

实时荧光定量PCR可以与任何适合的探针一起使用，如Taqman探针、MGB探针、蝎形探针等。所述的荧光探针常规包含一个发光基团、一段核酸序列、一个猝灭基团，及有必要时所进行的一些化学修饰或者特殊核苷酸，如硫代核苷酸、锁核酸等。

一般实时荧光定量PCR检测过程中，探针会被设计成熔解温度超过正向和反向引物10℃，这使得探针在退火及延伸过程中会完全结合在PCR产物上。典型的，例如Taqman探针，会在具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，在延伸过程中发生探针的水解，使得探针中的荧光基团和猝灭基团远离，从而破坏荧光基团和猝灭基团间的共振能量传递，使得荧光基团发出的荧光可以被仪器检测到，同时随着PCR产物的逐渐增多，荧光信号会在一定时间内呈现指数级别的上升，最后在荧光定量PCR仪上呈现“S”型的扩增曲线。

用于实时荧光定量PCR的反应试剂包括但不限于：目标基因靶序列的正反向引物、Taqman荧光探针、优化的PCR缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸以及具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶等。

本发明检测目标蛋白水平采用但不限于磁微粒化学发光免疫分析夹心法，其他常用的检测方法例如流式荧光发光法、酶联免疫吸附法等。

在一些方式中，通过结合上述位点或者位点组合的甲基化以及蛋白标志物水平的状态来判断所检测生物样本是否呈阳性。

本发明提供的用于筛查胃癌的甲基化位点具有以下有益效果：

1、提供了18个全新的差异甲基化位点，其在胃癌血浆游离DNA中的甲基化状态，与胃炎病人血浆游离DNA的甲基化状态有显著差异；

2、从18个甲基化位点中，任选2、6种组合的甲基化位点，都能用于高灵敏度、高特异性地检测胃癌；

3、从18个甲基化位点中，找到Seq ID NO.4、Seq ID NO.18两个甲基化位点的胃癌检测AUC值较高，灵敏度和特异性较好；

4、找到6个甲基化位点(Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq IDNO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18)与蛋白标志物PGI、PGII、G17和CEA组合，用于胃癌的无创、快速体外检测，能够更有效地区分胃癌和其余胃病患者，AUC值最高能达到0.971，灵敏度达到92％，特异性达到90％；5、方便、快捷、检测结果与临床金标准检测结果高度一致。

附图说明

图1为实施例1中的胃癌、癌旁组织以及正常人血液WGBS测序数据热图，其中，tumor为胃癌组织样本；adjacent为癌旁组织样本，normal为正常人cfDNA样本；

图2为实施例1中的18个甲基化位点在不同类型样本中甲基化水平对比的箱线图；

图3为实施例2中的胃癌患者样本荧光定量PCR反应检测结果示意图；

图4为实施例2中的胃炎患者样本荧光定量PCR反应检测结果示意图；

图5为实施例2中的2个甲基化位点结合PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测归一化结果获得的ROC曲线；

图6为实施例3中的6个甲基化位点结合PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测归一化结果获得的ROC曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中使用的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1基因甲基化位点的筛选

本实施例从产品的实际临床应用出发，发现并确定了18个在胃癌患者中发生甲基化异常的靶序列。胃癌甲基化qPCR候选靶标的具体筛选过程如下：

筛选过程包括两个阶段，第一阶段：从9对胃癌组织及其癌旁组织样本的WGBS数据、20例正常人cfDNA样本的WGBS数据(见图1)出发筛选在胃癌组织中表现出高甲基化而在癌旁组织中表现出去甲基化的区域(即胃癌panel区域)，设计并合成相应的捕获探针；第二阶段：使用探针捕获并测序440例cfDNA样本(包括221例胃癌cfDNA样本、177例胃炎cfDNA样本，以及42例正常人cfDNA样本)，通过分析这些数据，从胃癌panel区域筛选出最能区分胃癌cfDNA样本与非胃癌cfDNA样本、互补性好且连续的32个CpG位点作为qPCR候选靶标。

在第一阶段，我们首先将人类基因组(hg19)分割成100bp长度(50bp overlap)的滑动窗口，统计位于每个滑动窗口内CpG位点(位于DNA上按照5‘至3’方向排列的连续胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸)的个数，选择至少包含5个CpG位点的滑动窗口用做后续分析；第二，对于每一个组织样本的WGBS数据，计算其在每个滑动窗口内的平均甲基化率(用比对到该窗口的reads上甲基化的CpG数目除以比对到该窗口reads上的所有CpG数目)并将该甲基化率标准化(计算出每100个CpG位点中，甲基化和去甲基化CpG位点各有多少个)。最后，对于每一对肿瘤组织及其癌旁组织，利用每一个滑动窗口内标准化后得到的甲基化和去甲基化CpG位点的个数(即一个2×2列联表)，进行fisher精确性检验(FDR多重假设检验校正)，仅保留p-value小于0.01的滑动窗口。在这些滑动窗口中，挑选那些在正常人cfDNA样本的WGBS数据中平均甲基化率小于0.01且能注释到基因启动子的部分作为捕获探针区域。

在第二阶段分析测序数据时，考虑到相互临近的CpG位点往往表现出相似的甲基化变化，在每一个候选差异甲基化区域内，我们把任意连续的5个CpG位点作为一个marker(5CpG)，并以每一个marker中5个CpG位点均被甲基化的比例(methylation rate)作为特征值。具体地，首先，选择出5CpG maker覆盖度(至少10X)大于90％的样本，第二，在这些样本中，比较每一个5CpG marekr在肿瘤cfDNA样本和非肿瘤cfDNA样本中甲基化率的差异，选择在两种样本中甲基化率差异最大、对肿瘤cfDNA样本累积覆盖最好且连续的5CpG marker作为候选的qPCR靶标。完成靶标筛选后，用5CpG maker覆盖度(至少10X)小于90％但大于80％的样本作为训练集，对所选靶标进行独立验证。

根据区域设定，从NCBI数据库网站下载序列，并使用Methyl Primer Expressv1.0软件将序列转化为甲基化修饰后的序列。为保证设计区域序列有较平衡的GC含量分布，在序列选择时同时考虑将反义链作为模板设计。根据通用引物设计原则，对32个高甲基化区域设计相应的检测引物和探针。使用以下浓度的模板对设计的引物进行筛选验证：

1)选择纯阳性模板MJ，该模板为经SSSI酶处理后纯化得到，所有CG位点均有甲基化修饰，是最佳的甲基化试验验证的阳性物质模板，选择100pg/μl及10pg/μl表征中浓度及低浓度水平。

2)选择纯阴性模板WBC，该模板取自健康人群的外周血白细胞gDNA，含有整套gDNA背景，经超声打断后，较好的模拟人cfDNA的状态。选择1ng/μl作为模拟真实高浓度样本。

3)低丰度混合模板MJ/WBC，该模板用于模拟真实样本中的混合状态，通常将5％作为模拟低丰度样本的状态。

根据引物筛选的设计组合，每种组合分别配制甲基化检测体系进行比较，以100pg/μl及10pg/μl甲基化阳性模板、1ng/μl甲基化阴性模板及5％丰度甲基化混合模板做综合筛选，筛选标准如下表4所示。最终以特异性、检出率以及扩增效果Ct值为判定指标，对引物组合进行选择，筛选结果如表5所示。

表4、序列组合筛选标准

编号	模板类型	浓度	性能要求
				1	WBC	1ng/μl	不检出
2	MJ	100pg/μl	CT值在29-31之间
				3	MJ	10pg/μl	可检出
4	5％MJ/WBC	1ng/μl	可检出

表5、筛选结果

(UD表示未检出)

经过筛选，其中区域11、12、29、30存在非特异性扩增问题，区域7、8、23、24存在扩增灵敏度不足问题，将以上8个区域排除。剩余24个区域在检测性能上均达到较优水平(见表6)。随后在30例胃癌和30例胃炎临床样本中进行靶点的临床性能验证，对检测结果进行单区域的ROC分析，将AUC<0.7的区域排除，既缩小了检测区域数量，更适合qPCR检测临床应用，同时又保持了较佳的临床性能。

表6、筛选的24个区域的检测性能

编号	区域组合个数	AUC
			1	区域1	0.722
2	区域2	0.703
			3	区域3	0.848
4	区域4	0.875
			5	区域5	0.806
6	区域6	0.778
			7	区域9	0.814
8	区域10	0.796
			9	区域13	0.802
10	区域14	0.753
			11	区域15	0.52
12	区域16	0.601
			13	区域17	0.769
14	区域18	0.745
			15	区域19	0.638
16	区域20	0.61
			17	区域21	0.743
18	区域22	0.782
			19	区域25	0.74
20	区域26	0.795
			21	区域27	0.843
22	区域28	0.882
			23	区域31	0.622
24	区域32	0.603

经过上述筛选，最终发现并确定了18个在胃癌患者中高甲基化的靶序列(具有如Seq ID NO.1～Seq ID NO.18所示的核苷酸序列，详见说明书中表1)。这18个异常甲基化位点在胃癌组织、癌旁组织、胃炎血浆、胃癌血浆、正常血浆5种不同类型样本中甲基化水平对比的箱线图如图2所示，可见本发明筛选获得的18个甲基化位点对于不同类型样本的甲基化水平差异明显，能够高效区分胃癌和其余胃病患者及正常人。

实施例2采用2个甲基化位点(或结合蛋白标志物)筛查胃癌

本实施例从实施例1筛选的18个甲基化位点中选择其中2个用于胃癌的检测。并分别采用两种方式进行检测：一、采用2个甲基化位点检测胃癌；二、采用2个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌。

一、采用2个甲基化位点检测胃癌

采用2个甲基化位点检测胃癌的具体方法包括如下步骤：

第1步，分离血液样本的血清和血浆，使用磁珠法提取试剂，提取待测生物样本的血浆游离DNA，其中20例为胃癌患者，20例为胃炎患者。

第2步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对步骤1中提取的血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入5ng血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。

第3步，将转化后的血浆游离DNA投入到含有检测基因靶序列的实时荧光定量PCR的反应体系中。其中用于检测2个靶序列的荧光探针分别使用FAM和ROX荧光染料标记、用于检测内参基因COL2A1的荧光探针使用VIC荧光染料标记。其中，上游引物、下游引物和探针是指如表2所示的，分别对应这2个靶序列的上游引物、下游引物和探针。

荧光定量PCR检测时的体系是多个目的基因和内参COL2A1的引物探针混合，形成一个多重PCR体系，多个目的基因都与内参COL2A1同时检测。单管最多4个靶基因与内参同时检测，检测靶基因数量更多时则分多管进行检测。反应体系中，靶基因序列的正反向引物投入浓度为0.167μM，探针投入浓度为0.167μM，实时荧光定量PCR反应体系为30μL，内参基因序列的正反向引物投入浓度为0.083μM。

第4步，设置荧光定量PCR反应检测程序如表7：

表7、多重PCR反应程序

第5步，获得荧光定量PCR反应检测结果。

本实施例分别选用如下几组包含2个甲基化位点的组合进行检测：

1、Seq ID NO.1、Seq ID NO.4

2、Seq ID NO.4、Seq ID NO.18

3、Seq ID NO.5、Seq ID NO.18

当选用第2组Seq ID NO.4、Seq ID NO.18所示的核苷酸序列对应的两个甲基化位点时，检测结果如图3、4所示，其中图3为胃癌患者样本结果，所有待检测甲基化位点的荧光信号都有检出，为阳性；图4为胃炎患者样本，仅有对照基因COL2A1的荧光信号被检出，其余待检测位点荧光信号未检出，为阴性。

采用两个甲基化位点检测胃癌的结果分析判定方法：1)记录软件自动输出的各甲基化位点Ct值；2)分别计算样本中每个位点与内参COL2A1的Ct值，而后对Ct进行归一化处理：ΔCt(靶序列)＝|Ct(COL2A1)-Ct(靶序列)|；3)M个甲基化位点，第i个甲基化位点的score为Mi。Mi的取值分别为0或1，根据ΔCt(靶序列)值以及对应的Youden's index来判别Mi。如果ΔCt(靶序列)＞Youden's index设Mi＝1，如果ΔCt(靶序列)＜Youden's index设Mi＝0。甲基化的M-score＝sum_i^m(Mi)。检测结果如表5所示。

根据logistic regression分析对使用所述试剂盒检测获得的结果进行校正和分析计算。M-score的阈值设定根据ROC曲线来设定。并通过综合两个目标甲基化位点的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，获得分类ROC曲线，计算AUC值、检测灵敏度和特异性。

通过综合两个靶序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.18甲基化的检测结果见表8，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，获得分类ROC曲线。

表8、2个甲基化位点甲基化水平检测结果

针对本次的样品检测结果，采用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.18的两个甲基化位点的组合的胃癌检测水平，其AUC＝0.913，灵敏度为74％，特异性为91％，效果明显好于其他两个甲基化位点组合。第1、2、3组的检测分析结果详见后续实施例5及表11。

二、采用两个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌

本实施例还分别采用1、2、3组的两个甲基化位点，再结合蛋白标志物的方法检测胃癌，其中，蛋白标志物包括PGI、PGII、G17和CEA。

其中2个甲基化位点的检测方法参照上述的第1步～第5步，蛋白标志物PGI、PGII、G17和CEA的检测还需增加第6步：取第1步分离的血清样本，采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中蛋白标志物的浓度。

磁微粒化学发光免疫分析夹心法过程：将R1(分别采用PGI、PGII、G17和CEA相对应的抗体)、待测样本、M磁微粒混合孵育。样本中蛋白标志物的不同位点与磁珠上偶联的抗体结合，形成固相抗体-抗原复合物；通过清洗，后加入R2试剂(分别采用PGI、PGII、G17和CEA相对应的二抗)混合孵育，上述复合物和经标记的肿瘤标志物抗体结合，形成固相抗体-抗原-抗体夹心复合物；通过洗涤，未被结合的抗体以及其它物质被去除。在反应复合物中加入化学发光底物1和化学发光底物2，通过相对发光强度测定化学发光反应，所产生的发光强度与样本中肿瘤标志物的浓度成正比。对所述样品中的蛋白标志物进行磁微粒化学发光免疫分析夹心法测试并将得分确定为P值。检测结果如表9所示。

分析判定方法：在结合上述的单独采用2个甲基化位点检测胃癌的结果分析判断方法，还需：

1)分别对每个样本的PGI、PGII、G17和CEA检测值进行归一化处理：P1＝log10P_PGI/PGII,P2＝log10P_G17，P3＝log10P_CEA；蛋白的P-score＝sum(a*P1+b*P2+c*P3)，其中a＝-3.22，b＝4.83，c＝1.24；

2)根据logistic regression分析对使用所述试剂盒检测获得的结果进行校正和分析计算。M-score和P-score的阈值设定根据ROC曲线来设定。

通过整合甲基化和蛋白标志物两个互补的维度来提高检测性能。整合后的模型为GC-score＝M-score+P-score。在一些实施方案中，在GC-score值等于或大于设定阈值时，结果表明患者中胃癌和/或早期胃癌的阳性检测。在一些实施方案中，在GC-score值小于阈值时，结果表明患者中胃癌和/或早期胃癌的阴性检测。

3)通过综合两个目标甲基化位点，以及PGI/PGII、G17和CEA蛋白检测结果的归一化结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，获得分类ROC曲线。

当选用第2组的Seq ID NO.4、Seq ID NO.18所示的核苷酸序列对应的两个甲基化位点时，结合PGI/PGII、G17和CEA蛋白检测后的归一化结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，获得分类ROC曲线如图5所示，其中PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测结果如表9所示。

表9、不同样本蛋白水平检测结果

当采用第2组的两个甲基化位点，并结合PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测后归一化结果，可以进一步提升胃癌检测效果，其AUC＝0.938，灵敏度为78％，特异性为94％(图5)。

第1、2、3组的2个甲基化位点，结合PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测后的归一化结果，详见后续实施例5。

实施例3采用6个甲基化位点(或结合蛋白标志物)筛查胃癌

本实施例从实施例1筛选的18个甲基化位点中选择6个用于胃癌的检测。并分别采用两种方式进行检测：一、采用6个甲基化位点检测胃癌；二、采用6个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌。

一、采用6个甲基化位点检测胃癌

本实施例分别选用如下几组包含6个甲基化位点的组合进行检测：

4、Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18

5、Seq ID NO.2、Seq ID NO.4、Seq ID NO.8、Seq ID NO.11、Seq ID NO.14和SeqID NO.15

6、Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11和SeqID NO.17

7、Seq ID NO.3、Seq ID NO.7、Seq ID NO.12、Seq ID NO.14、Seq ID NO.15和SeqID NO.17

8、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13和SeqID NO.17

9、Seq ID NO.1、Seq ID NO.3、Seq ID NO.6、Seq ID NO.8、Seq ID NO.10和SeqID NO.11

10、Seq ID NO.1、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.9和SeqID NO.16

11、Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.7、Seq ID NO.10、Seq ID NO.13、SeqID NO.15

采用6个甲基化位点检测胃癌的具体方法包括如下步骤：

第一步，得到40名胃炎及胃癌患者，其中胃炎样本为20例，胃癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。

第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。

第三步，指如表2所示的分别对应这6个靶序列的上游引物、下游引物和探针，按照实施例2的方法进行实时荧光定量PCR检测。

针对本次的样品检测结果，采用第7组的6个甲基化位点的效果明显好于其他组的胃癌检测水平。根据ROC曲线可得，其AUC＝0.957，灵敏度为89％，特异性为89％。

第4-11组的6个甲基化位点的检测分析结果详见后续实施例5。

二、采用6个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌

在上述检测采用6个甲基化位点检测胃癌的基础上，还需增加：

第四步，取第一步分离的血清样本，采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中PGI、PGII、G17和CEA蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。

第五步，将所检测到的结果中各基因甲基化和蛋白的值进行归一化，通过综合6个甲基化位点的ΔCt(靶基因)结果以及三个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，获得分类ROC曲线(图6)。

第4-11组的6个甲基化位点，结合PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测后的归一化结果详见后续实施例5。

当采用第7组的6个甲基化位点，并结合PGI、PGII、G17和CEA蛋白检测后的归一化结果，可以进一步提升胃癌检测效果，其AUC＝0.971，灵敏度为92％，特异性为90％。

实施例4采用18个甲基化位点(或结合蛋白标志物)筛查胃癌

本实施例采用实施例1筛选的18个甲基化位点进行胃癌的检测。并分别采用两种方式进行检测：一、采用18个甲基化位点检测胃癌；二、采用18个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌。

一、采用18个甲基化位点检测胃癌

采用18个甲基化位点检测胃癌的具体方法包括如下步骤：

第一步，得到40名胃炎及胃癌患者，其中胃炎样本为20例，胃癌样本为20例。分离提取样本的血清和游离血浆DNA。

第二步，使用亚硫酸氢盐为主要成分的甲基化转化试剂，对血浆游离DNA样本进行甲基化转化处理，投入血浆游离DNA，将未发生甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。

第三步，指如表2所示的18个靶序列的上游引物、下游引物和探针，按照实施例2的方法进行实时荧光定量PCR检测。

采用18个甲基化位点进行检测的AUC达到0.956，详见实施例5。

二、采用18个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌

采用18个甲基化位点和蛋白标志物组合的方法检测胃癌的具体方法包括如下步骤：在上述检测采用18个甲基化位点检测胃癌的基础上，还需增加：

第四步，取第一步分离的血清样本，采用磁微粒化学发光免疫分析夹心法，测定人血清中PGI、PGII、G17和CEA蛋白标志物水平的检测，并对结果进行分析。

第五步，将所检测到的结果中各基因甲基化和蛋白的值进行归一化，通过综合18个靶基因的ΔCt(靶基因)结果以及三个蛋白标志物水平的检测结果，对这40个样本进行10乘交叉验证，并取平均值，获得分类ROC曲线，其AUC-甲基化+蛋白＝0.970，灵敏度达到91％，特异性达到90％，详见实施例5。

实施例5采用不同甲基化位点组合的性能比较分析

对实施例1中得到的40例胃癌和胃炎患者样本的18个甲基化位点(SEQ ID NO.1～18)的相对循环数ΔCT值进行不同位点组合的数学建模分析，以探讨18个甲基化位点和蛋白作为生物标记物组合对于检测胃癌的应用。

首先，我们分别评估了上述18个甲基化位点中单个位点的模型对于诊断胃癌发生的性能，分别计算其AUC值，结果如表10所示。

表10、单个甲基化位点诊断胃癌的性能比较

SEQ ID NO	AUC
		1	0.732
2	0.713
		3	0.760
4	0.880
		5	0.837
6	0.862
		7	0.813
8	0.811
		9	0.832
10	0.815
		11	0.843
12	0.839
		13	0.837
14	0.838
		15	0.834
16	0.827
		17	0.819
18	0.871

由表10可以看出，实施例1提供的18个甲基化位点用于诊断胃癌的AUC值都较高，都具有较好的诊断性能，尤其是其中的Seq ID NO.4和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列对应的甲基化位点，是全新发现的可用于高效区分胃癌与其他胃病的高甲基化位点。

其次，对比实施例2～4列举的不同组合甲基化位点，或结合蛋白标志物组合的诊断效能，结果如表11所示。

表11、不同组合甲基化位点的模型对于诊断胃癌发生的比较

由表10和11可以看出，使用单个甲基化位点作为诊断模型的对比多个甲基化位点组合模型诊断性能较低，使用2个甲基化位点组合作为诊断模型比6个甲基化位点组合模型诊断性能要低，甲基化结合蛋白标志物的多组学模型的诊断性能要显著优于单一组学标志物。

当选用2个甲基化位点组合作为诊断模型时，第2组的AUC-甲基化和AUC-甲基化+蛋白都是最高的，可见第2组采用Seq ID NO.4、Seq ID NO.18所示的核苷酸序列对应的2个甲基化位点时，诊断性能明显高于其他2个甲基化位点组合。

当选用6个甲基化位点组合作为诊断模型时，第4组的AUC-甲基化和AUC-甲基化+蛋白都是最高的，可见第4组采用Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq IDNO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列对应的6个甲基化位点时，诊断性能明显高于其他6个甲基化位点组合。

当选用18个甲基化位点组合作为诊断模型时，其诊断性能与第4组的6个甲基化位点组合的诊断性能非常接近，因此最优选采用第4组的6个甲基化位点组合。

本实施例进一步对从中优选的不同的甲基化位点组合的诊断性能分别进行分析，结果如表12所示。

表12、优选的多个甲基化位点的模型对于诊断胃癌发生的比较

组合(SEQ ID NO)	AUC	灵敏度	特异度	Youden指数
					4+蛋白	0.880	71％	93％	0.64
18+蛋白	0.871	70％	93％	0.63
					4+18+蛋白	0.938	78％	94％	0.72
4+10+12+13+15+18+蛋白	0.971	92％	90％	0.82
					2+4+8+11+14+15+蛋白	0.957	90％	89％	0.79
1+5+8+10+11+17+蛋白	0.944	88％	89％	0.77
					3+7+12+14+15+17+蛋白	0.958	90％	89％	0.79
4+5+8+12+13+17+蛋白	0.960	91％	89％	0.80
					1+3+6+8+10+11+蛋白	0.942	87％	89％	0.76
1+4+5+8+9+16+蛋白	0.954	88％	90％	0.78
					1+5+7+10+13+15+蛋白	0.940	85％	90％	0.75
1～18+蛋白	0.970	91％	90％	0.81

由表12可见，本实施例优选的几组甲基化位点+蛋白的组合都能够用于胃癌的高效检测，其中AUC最高能达到0.971，灵敏度达到92％，特异性达到90％，真正实现无创、全局、具有更高灵敏度和特异性的胃癌筛查，完全满足临床需求。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (10)

1.一种标志物用于制备胃癌检测试剂的用途，其特征在于，所述标志物为选自Seq IDNO.1～Seq IDNO.18中的任意一种或多种所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标志物为包含Seq ID NO.4和/或Seq IDNO.18的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述标志物为包括Seq ID NO.1和Seq IDNO.4所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.5和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.2、Seq ID NO.4、Seq ID NO.8、SeqID NO.11、Seq ID NO.14和Seq IDNO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括SeqID NO.1、Seq ID NO.5、SeqID NO.8、Seq ID NO.10、Seq ID NO.11和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.3、Seq ID NO.7、Seq ID NO.12、Seq ID NO.14、Seq ID NO.15和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.4、Seq IDNO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13和Seq ID NO.17所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.3、Seq ID NO.6、Seq ID NO.8、SeqID NO.10和Seq ID NO.11所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq IDNO.1、Seq ID NO.4、Seq ID NO.5、Seq ID NO.8、Seq ID NO.9和Seq ID NO.16所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1、Seq ID NO.5、Seq ID NO.7、Seq IDNO.10、Seq ID NO.13和Seq ID NO.15所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合，或包括Seq ID NO.1～Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述标志物为包括Seq ID NO.4、Seq IDNO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

5.如权利要求1～4任一项所述的用途，其特征在于，所述标志物还包括蛋白标志物，所述蛋白标志物由PGI、PGII、G17和CEA组成。

6.一种检测胃癌的引物组合，其特征在于，所述引物组合为选自如下表所示的18组引物、探针组合中的任意一组或多组：

7.如权利要求6所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合为如下表所示的6组引物、探针组合：

8.一种用于检测胃癌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求6或7所述的引物和探针组合。

9.一种用于检测胃癌的标记物组合，其特征在于，包括甲基化位点和蛋白标志物，所述甲基化位点为选自如序列表Seq ID NO.1～Seq ID NO.18中的任意一种或多种；所述蛋白标志物包括PGI、PGII、G17和CEA。

10.一种用于检测胃癌的标记物组合，其特征在于，包括Seq ID NO.4、Seq ID NO.10、Seq ID NO.12、Seq ID NO.13、Seq ID NO.15和Seq ID NO.18所示的核苷酸序列或其完全互补序列的组合。

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