CN112501293B

CN112501293B - 一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN112501293B
Application number: CN202011288235.7A
Authority: CN
Inventors: 陈明; 郭鑫武; 洪梅; 刘让蛟; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2020-11-17
Filing date: 2020-11-17
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2040-11-17
Also published as: CN112501293A

Abstract

本发明提供了一种用于检测肝癌的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测OTX1基因的以下甲基化位点中至少一个的甲基化水平的检测试剂：cg23229261、cg10122865。与此同时，本发明还提供了该试剂组合的用途，以及包括该试剂组合的试剂盒。使用本发明的试剂组合，在组织样本中能以至少0.846的特异性和0.860的灵敏度以及0.914的曲线下面积对肝癌进行预测，在血浆的游离DNA样本中，能以至少0.8298的特异性和0.778的灵敏度以及0.8823的曲线下面积对肝癌进行预测，本发明试剂组合以较少的标志物就能够在临床上以高灵敏度和好特异性对肝癌进行检测，成本和时间均得到节约；在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

Description

一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于肝癌检测领域，更具体地，涉及肝癌基因标志物的甲基化水平的检测。

背景技术

肝癌是世界上最常见的和最致命的疾病之一，危害极大的恶性肿瘤。肝癌起病隐匿，早期无特异性症状，大多数肝癌患者在就诊时已是中晚期，手术治愈率低，生存期短。

目前，血清甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)和超声检查是当前临床上诊断肝癌常用而又重要的方法，然而其灵敏度和特异度并不理想。AFP筛查的灵敏度只能达到40-60％，许多早期肝癌患者的AFP水平总是维持在一个正常水平；而在相当一部分肝病患者中也存在着AFP异常升高的情况；超声检测则非常依赖于仪器和人为操作，受医疗资源分布的限制和医生的经验影响；超声造影和穿刺等检查则存在操作复杂、创伤等缺点，不适用于早筛早诊。寻找准确、稳定、有效的肝癌分子标志物对肝癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。

肿瘤标志物检测是近年发展起来的用于检测疾病的方法，而寻找准确、稳定、有效的肝癌分子标志物对肝癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。而随着科学界对肿瘤的认识逐渐深入，越来越多的研究证实细胞表观遗传水平的改变是肿瘤发生与发展的关键事件。DNA甲基化、组蛋白修饰及miRNA表达异常均属于表观遗传学改变，而肿瘤发生的核心环节也与DNA异常甲基化相关。DNA甲基化检测稳定性好，易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关，是最具肿瘤早筛潜力的标志物，目前已有基于DNA甲基化检测的结直肠癌、胃癌等肿瘤辅助诊断产品获得FDA或CFDA的认证，但尚无肝癌的筛查产品获批上市。

很多研究通过检测外周血中的肿瘤细胞或DNA甲基化变化，寻找用于肝癌早期诊断的标志物。美国Exact Sciences公司基于甲基化检测的早期肝癌筛查临床研究显示，在135例HCC(Hepatocellular Carcinoma)病例和308例对照参与的临床试验中，这一血液检测在诊断早期HCC患者时达到了71％的灵敏度度和90％的特异性。该项目获得了FDA突破性医疗器械认定，但其临床研究主要基于欧美人群且存在灵敏度偏低的缺陷；专利CN107164508A通过检测9个基因的5-羟甲基胞嘧啶含量检测肝癌，其具有较优良的检测性能，灵敏度为90％，特异性为91.3％，但其入组的样本并不包含肝硬化、肝炎等肝癌高风险人群，因此可能存在特异性偏低的不足。

因此，本领域需求一种基于DNA甲基化检测的兼具高灵敏度高特异性的肝癌诊断产品，在肝癌的早期阶段即能进行检出。

发明内容

本发明通过在TCGA和GEO数据库搜集和构建肝癌相关的甲基化大数据集，采用生物信息学方法筛选出有应用开发潜力的肝癌DNA甲基化标志物，通过大量研究，申请人发现OTX1基因的甲基化位点的甲基化水平与肝癌有着密切的联系。

第一方面，本发明提供一种用于检测肝癌的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测OTX1基因的以下甲基化位点中至少一个的甲基化水平的检测试剂： cg23229261、cg10122865。

进一步地，所述试剂组合包括用于检测OTX1基因的以下两个甲基化位点的甲基化水平的检测试剂：cg23229261和cg10122865。

进一步地，所述试剂组合还包括用于检测OTX1基因的甲基化位点cg21472506的甲基化水平的检测试剂。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合检测以下区域的甲基化水平：

CGATTTTGCTCCACGCCTGCCGGCCAGAGCCTCCCGGCGTTTCTTCCG CCCCAGCGGAGTGCGCTGGGGCGCGCCAGGGCTAGGCCCGCCGGAGGAG CGCGTCCCCAGCCTTCCGCGCACAGAGCCGCATCCCGCCCCGCCCTGCGC TGGACTGGTTCAAGCTTCCGCCTCG(SEQ ID NO:1)。

使用本发明的试剂组合，在组织中能以至少0.846的特异性和0.860的灵敏度以及0.914的曲线下面积对肝癌进行预测，在血浆的游离DNA中，能以至少 0.8298的特异性和0.778的灵敏度以及0.8823的曲线下面积对肝癌进行预测，本发明试剂组合以较少的标志物就能够在临床上以高灵敏度和好特异性对肝癌进行检测，成本和时间均得到节约；在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测以下基因中任意至少一个的甲基化水平的检测试剂：

GRASP、PAK1、PPFIA1，以及ZNF397OS。

所述试剂组合进一步包括用于检测以下基因中任意至少两个的甲基化水平的检测试剂：

GRASP、PAK1、PPFIA1，以及ZNF397OS。

所述试剂组合进一步包括用于检测以下基因中任意至少三个的甲基化水平的检测试剂：

GRASP、PAK1、PPFIA1，以及ZNF397OS。

所述试剂组合进一步包括用于检测以下四个基因的甲基化水平的检测试剂：

GRASP、PAK1、PPFIA1，以及ZNF397OS。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂可以是检测整个基因平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测一个基因片段的平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测一个基因启动子区域或其片段的平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂还可以是检测基因的一个或多个甲基化位点的检测试剂。

本领域技术人员能够选择检测GRASP、PAK1、PPFIA1，以及ZNF3970S 的甲基化水平的检测试剂。例如，中国专利CN110904225提及了GRASP与肝癌相关、中国专利CN106947830提及了PPFIA1与肝癌相关、中国专利 CN1659287提及了PAK1与肝癌相关。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测GRASP基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测中国专利CN110904225中GRASP基因扩增片段的平均甲基化水平的检测试剂：

CGCAGCCGCCACCCCTGGGCCCCCAGCGGACGAGCTGTACGCGGCG CTGGAGGACTATCACCCTGCCGAGCTGTACCGCGC(SEQ ID NO:2)。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测GRASP基因以下基因片段的平均甲基化水平的检测试剂：

CGGTCCCGACCCCGGGACCCCCTGCCGCAGCCGCCACCCCTGGGCCC CCAGCGGACGAGCTGTACGCGGCGCTGGAGGACTATCACCCTGCCGAGCT GTACCGCGCGCTCGCCGTGTCCGGGGGCACCCTGCCCCGCCGAAAGGTGC GTCCCCCGCCCGCCTTCAGGATCTGCTCAGCCCCTCTCCGACTCCCTACAG GGCCTGCTGACTCCGCAGTGCCCTCTCCTCGGCGTCCGCGGAGTCCCCCA CCTTCTTCCCCGGCCCGCTGGGTGCCTCGACTCCCCGCGTTCCCCGCTGCT GCGAAGGCCGTGGCCCTCGCCTGCACACCGCGCCCAGGCTCG(SEQ ID NO:3)。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测GRASP基因甲基化位点cg04034767、cg00817367中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测PPFIA1基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。

在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测PPFIA1基因以下基因片段的平均甲基化水平的检测试剂：

CGACCCAGTGTTAACAGGGAATGGTTATTCTGTACGGGCATCTGAACT GAAAAGTGAGAAGAGCGAACTTTGCCTCCTCGGCCCCTTCTCTGTGCCTG TGGCTTATGCGTGTGCCCCTCTCCTCTTTGTCACTGCTTCCCTTGCCCTGGA TGTGGTTGGTGCACTGGGGTCACCTTAGACCACAGGAAATGTCTGGTTAA CACACGAAGAGATGGAAACGCTCGCAGCCACG(SEQ ID NO:4)。

在一些具体的实施方案中，所述PPFIA1基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测PPFIA1基因甲基化位点cg14999168、cg14088196、cg25574765 中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测PAK1基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述PAK1基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测PAK1基因甲基化位点cg17202086、cg26996201、cg12269002、 cg18309286中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测ZNF397OS 基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。

在一些具体的实施方案中，所述ZNF397OS基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测ZNF397OS基因甲基化位点cg27249419、cg16657538，和 cg00487232中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。

在一个优选的实施方案中，所述ZNF397OS基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测覆盖ZNF397OS基因甲基化位点cg16657538片段中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。

使用上述方案的试剂组合，能够以更高的灵敏度和更好的特异性对肝癌进行检测；在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。

在一些实施方案中，使用本发明的检测试剂，可以对样本中所存在的相应基因的甲基化水平进行检测。

在本发明中，“样本”为选自个体的生物样本。具体地，例如，选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

优选地，本发明的“样本”为血浆，即血浆中的游离DNA。

血浆中的游离DNA能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此，在用于癌症检测时普遍存在灵敏度较低的问题。使用本发明的检测试剂，能够使用血浆中的游离DNA作为样本进行检测，具有较高的灵敏度和特异性。

在本发明中，“检测试剂”指的是对样本中的基因的甲基化水平进行检测的试剂。其中，所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片、甲基化荧光定量PCR的方式测量。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物、测序Tag序列，用于通过扩增-测序测量甲基化水平。

在一个具体的实施方案中，所述扩增-测序是通过将样本中的核酸进行重亚硫酸盐处理，随后构建预文库，再构建终文库，最后进行测序评价的方法进行的。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。所述芯片可以是包括但不限于例如安捷伦的Human CpG Island Microarrays和Human DNA Methylation Microarrays、Illumina的Infinium HumanMethylation27 BeadChip、Infinium HumanMethylation450BeadChip和GoldenGate Methylation Assay以及 Roche NimbleGen的Human DNAMethylation 2.1M Deluxe Promoter Array、 Human DNA Methylation Array等，用于通过芯片测量甲基化水平。

在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物以及核酸探针，用于通过甲基化荧光定量PCR测量甲基化水平。

进一步地，所述检测试剂还包括内标引物以及内标探针。

进一步地，上述试剂组合还可以包括其余的试剂，具体地，例如，各种对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。例如，提取样本核酸的样本释放剂，纯化样本核酸的纯化剂，转化所用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐等。

进一步地，上述试剂组合还包括提取血浆游离DNA的试剂。

第二方面，本发明提供了上述试剂组合在制备用于检测肝癌的试剂盒中的用途。

进一步地，本发明提供了上述试剂组合在制备使用血浆游离DNA检测肝癌的试剂盒中的用途。

第三方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的试剂组合。

进一步地，所述试剂盒还包括但不限于提取核酸的试剂、纯化核酸的试剂、重亚硫酸盐、T4多聚核苷酸激酶、T4连接酶中的至少一种。

进一步地，所述提取核酸的试剂是提取组织DNA的试剂和血浆游离DNA 的试剂。

进一步地，所述提取核酸的试剂是提取血浆游离DNA的试剂。

附图说明

图1为OTX1基因甲基化位点在外周血游离DNA样本中鉴别癌与非癌的 ROC图；

图2为OTX1基因甲基化位点在外周血游离DNA样本中不同分组的甲基化水平；

图3为OTX1基因甲基化位点在组织样本中不同分组的甲基化水平比较；

图4为OTX1基因对比例甲基化位点在组织样本中不同分组的甲基化水平比较。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、甲基化基因的筛选

本发明从UCSC Xena网站的TCGA数据集(https://tcga.xenahubs.net)和美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库中共收集到785例癌组织、 461例癌旁组织或正常对照组织和656例健康全血甲基化数据。以肝癌和对照数据进行差异分析，对差异位点进行物理位置和基因信息注释，为保证筛选片段具有一致的甲基化水平，甲基化基因片段的筛选需要同时符合以下几点要求：1) 要求所选基因片段具有不少于2个的相邻位点具有一致的甲基化水平；2)以肝癌和癌旁组织或正常对照组织进行差异分析，挑选肝癌样品中一致性高且差异高甲基化的基因片段；3)以肝癌和健康样本全血甲基化检测数据进行差异分析，挑选肝癌差异高甲基化的基因片段；4)最后再从中进行逐个甲基化位点的分析，从而得出候选甲基化位点。

实施例2、临床样本的基因甲基化水平检测

收集样本的外周血各10ml，用于检测分析DNA甲基化标志物在样本中的甲基化水平。实验过程如下所述：

1、样本制备

本发明的样本制备是通过MagMAX^TMCell-Free DNA Isolation Kit提取4ml 血浆，45μL洗脱液洗脱。提取的游离核酸需满足以下质控条件：提取的核酸总量大于20ng。

2、文库制备

本发明将质控合格的全部游离核酸采用EZ DNA Methylation-Lightning TM Kit(Zymo Research,Irvine,CA,USA)进行重亚硫酸盐处理。随后，重亚硫酸盐处理后的样本DNA采用单链建库方法构建预文库，预文库质检合格后通过液态芯片杂交捕获富集目标区域而完成终文库的构建。

预文库构建步骤：1)磷酸化：T4多聚核苷酸激酶将重亚硫酸盐处理后的 DNA的5端磷酸化；2)SS1连接：T4 DNA Ligase(Rapid)将SS1接头连接在磷酸化的DNA的5端；3)核酸纯化：使用2倍体积的Agencourt AMPure XP system(Beckman CouLter,CA,USA)去除剩余的接头；4)SS2连接：T4 DNA Ligase(Rapid)将SS2接头连接在磷酸化的DNA的3端；5)核酸纯化：使用 2倍体积的Agencourt AMPure XP system(Beckman CouLter,CA,USA)去除剩余的接头；6)扩增：采用NEBNext Q5U Master Mix以及primer1.0(通用引物) 和Bacard序列扩增上一步的核酸；7)核酸纯化：使用1.2倍体积的Agencourt AMPure XP system(BeckmanCouLter,CA,USA)去引物二聚体和多余的引物； 8)质检：纯化处理后的预文库采用

dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies,CA,USA)进行文库总量质检，采用LabChip GXII Touch进行文库片段分布质检。

芯片(Twist Bioscience)杂交捕获步骤：1)芯片杂交：将质检合格混合好的1.5ug的文库预先真空浓缩成粉末状再和Panel、Hybridization Mix、Blocker Solution、Universal Blockers、Hybridization Enhancer试剂混匀(芯片杂交用到的试剂均由TwistBioscience提供)，放置在PCR仪中70度孵育16hours过夜 (热盖温度为85度)；2)磁珠捕获：预先使用Streptavidin Binding Buffer将捕获磁珠洗涤3次，将杂交完成的产物加入捕获磁珠中，孵育30分钟，Wash Buffer I清洗一次，Wash Buffer 2清洗3次，最后42μl超纯水洗脱；3)扩增：采用 KAPA HiFi HotStart ReadyMix以及通用引物扩增捕获后的文库；4)纯化：采用 1倍体积的Agencourt AMPure XP system(Beckman CouLter,CA,USA)去引物二聚体和多余的引物。

纯化处理后的文库采用

dsDNA HS Assay Kit(Life Technologies,CA,USA)和LabChip GXII Touch进行文库核酸总量、片段分布和引物二聚体比例质检。

3、测序

将文库总量、扩增产物的片段大小分布和引物二聚体比例质检均合格的待测文库，按照1:1的物质的量进行混合，使用

dsDNA HS Assay Kit(LifeTechnologies,CA,USA)对混合文库进行精确定量，将文库变性稀释后使用 NextSeq500台式测序仪采用PE75进行上机测序。

4、肝癌分类模型的建立和评价

对于测序得到的原始fastq数据，对原始数据过滤后使用bismark甲基化分析软件对芯片捕获片段进行甲基化分析，获得候选基因单个位点的甲基化水平和基因片段的甲基化水平。利用候选基因单个位点的甲基化水平和基因片段的甲基化水平，针对肝癌和对照样品进行差异分析和模型构建。本发明通过对数据采用Logistics回归分析进行了肝癌分类模型的构建和评价。

实施例3、本发明试剂组合检测临床样本的甲基化水平

收集63例原发性肝癌患者、25例肝硬化患者、15例肝炎患者和7例健康人的样本，按照实施例2所述的方法检测分析OTX1基因在样本中的甲基化水平，以验证其检验肝癌的效果。肝细胞癌、肝硬化、肝炎和健康人的诊断均以最终的医院病理诊断为依据。检测结果如表1、图1和图2所示。

表1 OTX1基因甲基化位点在Logistics肝癌分类模型中的预测性能

从表1中可以看出，在组织中OTX1基因的各甲基化位点能以至少0.846 的特异性和0.860的灵敏度以及0.914的曲线下面积对肝癌进行预测。而在血浆的游离DNA中，所有试剂组合均能以至少0.8298的特异性和0.778的灵敏度以及0.8823的曲线下面积对肝癌进行预测。

实施例4、本发明试剂组合检测临床样本的甲基化水平

收集63例原发性肝癌患者、25例肝硬化患者、15例肝炎患者和7例健康人的样本，按照实施例2所述的方法检测分析OTX1基因与其余基因的组合在样本中的甲基化水平，以验证其检验肝癌的效果。检测结果如下表2所示：

表2 OTX1基因与其余基因的组合在Logistics肝癌分类模型中的预测性能

其中，1代表GRASP基因(检测SEQ ID NO:3所示片段的平均甲基化水平)， 2代表PAK1基因(检测cg17202086、cg26996201、cg12269002、cg18309286 四个甲基化位点的甲基化水平)，3代表PPFIA1基因(检测SEQ ID NO:4所示片段的平均甲基化水平)，4代表OTX1基因(检测cg21472506、cg23229261、 cg10122865三个甲基化位点的平均甲基化水平)，5代表ZNF397OS基因(检测cg16657538甲基化位点的甲基化水平)。

从表中可以看出，在组织样本中，所有试剂组合均能以至少0.9024的特异性和0.8904的灵敏度以及0.9398的曲线下面积对肝癌进行预测。而在血浆游离 DNA样本中，所有试剂组合均能以至少0.8723的特异性和0.8571的灵敏度以及0.9132的曲线下面积对肝癌进行预测。因此，本发明的试剂组合具有对肝癌很好的预测效果，特别地，在使用血浆游离DNA作为样本时，具有优异的特异性和灵敏度。

对比例1

为了考察OTX1基因上其他甲基化位点能否统一作为检测肝癌的标志物，选取了OTX1基因中所选靶区段上游甲基化位点，比较其在癌与非癌样品中甲基化差异，结果如图3和图4所示。从图3和图4中可以看出，OTX1基因中在所选靶区段上游的甲基化位点在癌与非癌组织中不具有显著差异，不适合作为检测肝癌的标志物。

对比例2

为了考察OTX1基因能否作为检测肝癌的标志物，进一步选取了本领域知晓的常见与肝癌相关的基因PLAC8和ATXN1(参见Xu RH,Wei W,Krawczyk M, Wang W,Luo H,FlaggK,et al.Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis andprognosis for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. NatureMaterials,2017和中国专利CN106947830B)。同样按照上述实施例的方法进行检测，检测结果如下表3 所示。

表3 对比基因及其组合在Logistics肝癌分类模型中的预测性能

其中，6代表PLAC8基因(检测该基因的cg11606215甲基化水平)，7代表ATXN1基因(检测该基因的cg24067911甲基化水平)。

从表3中可以看出，在组织样本中对照基因单个的最高曲线下面积为0.858，在游离DNA样本中最高曲线下面积为0.75，低于本发明的OTX1基因的曲线下面积。而基因组合模型的曲线下面积也低于本发明试剂相关组合模型的曲线下面积的值。

序列表

<110> 圣湘生物科技股份有限公司

<120> 一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 172

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

cgattttgct ccacgcctgc cggccagagc ctcccggcgt ttcttccgcc ccagcggagt 60

gcgctggggc gcgccagggc taggcccgcc ggaggagcgc gtccccagcc ttccgcgcac 120

agagccgcat cccgccccgc cctgcgctgg actggttcaa gcttccgcct cg 172

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

cgcagccgcc acccctgggc ccccagcgga cgagctgtac gcggcgctgg aggactatca 60

ccctgccgag ctgtaccgcg c 81

<210> 3

<211> 341

<212> DNA

<213> 智人

<400> 3

cggtcccgac cccgggaccc cctgccgcag ccgccacccc tgggccccca gcggacgagc 60

tgtacgcggc gctggaggac tatcaccctg ccgagctgta ccgcgcgctc gccgtgtccg 120

ggggcaccct gccccgccga aaggtgcgtc ccccgcccgc cttcaggatc tgctcagccc 180

ctctccgact ccctacaggg cctgctgact ccgcagtgcc ctctcctcgg cgtccgcgga 240

gtcccccacc ttcttccccg gcccgctggg tgcctcgact ccccgcgttc cccgctgctg 300

cgaaggccgt ggccctcgcc tgcacaccgc gcccaggctc g 341

<210> 4

<211> 232

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

cgacccagtg ttaacaggga atggttattc tgtacgggca tctgaactga aaagtgagaa 60

gagcgaactt tgcctcctcg gccccttctc tgtgcctgtg gcttatgcgt gtgcccctct 120

cctctttgtc actgcttccc ttgccctgga tgtggttggt gcactggggt caccttagac 180

cacaggaaat gtctggttaa cacacgaaga gatggaaacg ctcgcagcca cg 232

Claims

1.一种用于检测肝癌的试剂组合，所述试剂组合由第一组合物和第二组合物组成：

第一组合物：用于检测OTX1基因的以下甲基化位点的甲基化水平的检测试剂：cg23229261、cg10122865；

第二组合物：用于检测以下基因中至少一个的甲基化水平的检测试剂：GRASP、PAK1、ZNF397OS、PPFIA1，以及OTX1；

其中，

GRASP检测试剂为检测SEQ ID NO:3所示片段的平均甲基化水平的检测试剂；

PAK1检测试剂为检测cg17202086、cg26996201、cg12269002、cg18309286四个甲基化位点的甲基化水平

ZNF397OS检测试剂为检测ZNF397OS基因甲基化位点cg16657538的甲基化水平的检测试剂；

PPFIA1检测试剂为检测SEQ ID NO:4所示片段的平均甲基化水平的检测试剂；

OTX1检测试剂为检测OTX1基因的甲基化位点cg21472506的甲基化水平的检测试剂。

2.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述第二组合物为用于检测以下基因中至少两个的甲基化水平的检测试剂：GRASP、PAK1、ZNF397OS、PPFIA1，以及OTX1。

3.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述第二组合物为用于检测以下三个基因的甲基化水平的检测试剂：GRASP、PAK1、ZNF397OS、PPFIA1，以及OTX1。

4.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述第二组合物为用于检测以下四个基因的甲基化水平的检测试剂：GRASP、PAK1、ZNF397OS、PPFIA1，以及OTX1。

5.根据权利要求1所述的试剂组合，其中，所述第二组合物为用于检测以下五个基因的甲基化水平的检测试剂：GRASP、PAK1、ZNF397OS、PPFIA1，以及OTX1。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂组合，其中，所述检测试剂为核酸引物、测序Tag序列、甲基化芯片、核酸探针中的任意一种或多种。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂组合，其中，所述试剂组合进一步包括提取血浆游离DNA的试剂。

8.如权利要求1-7中任一项所述的试剂组合在制备用于检测肝癌的试剂盒中的用途。

9.一种用于检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒由如权利要求1-7中任一项所述的试剂组合和其余试剂组成，所述其余试剂为提取核酸的试剂、纯化核酸的试剂、重亚硫酸盐、T4多聚核苷酸激酶、T4连接酶中的至少一种。