CN115341031A - 一种泛癌甲基化生物标志物的筛选方法、生物标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种泛癌甲基化生物标志物及其筛选方法和应用，通过开发新的数据筛选方法，筛选出具有泛癌性质的甲基化标志物PRKCB基因。然后针对筛选出的PRKCB基因特定区域进行甲基化检测引物和探针设计，建立检测体系检测肿瘤样本中的甲基化信号，具有准确性高、特异性强的优点，在保证检测性能的情况下，能够简单、快速、低成本、标准统一地对样本进行检测。本发明为泛癌肿瘤筛查、术后及预后评估提供新思路，并对阐明肿瘤恶性行为的分子机制具有重要意义，可以根据肿瘤标志物PRKCB基因启动子区域来开发无创型泛癌甲基化诊断产品及术后、预后评估产品。

Description

一种泛癌甲基化生物标志物的筛选方法、生物标志物及应用

本申请要求2021年11月12日提交的、申请号为2021113410521、发明 名称为“泛癌甲基化生物标志物及其筛选方法和应用”的中国发明专利申请 的优先权。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种泛癌甲基化生物标志物的筛选 方法、标志物及应用，特别涉及泛癌甲基化生物标志物的筛选方法， PRKCB基因甲基化作为泛癌标志物的用途、其扩增引物、探针、检测体 系。

背景技术

根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的“全球癌症统计 2020年版”结果，2020年全球新诊断癌症1930万例，癌症死亡人数1000 万人。伴随着人口老龄化的加剧，世界范围内癌症患者的数据不断增加。 癌症发病和死亡负担正在迅速增长，给经济和社会的发展带来了巨大的影 响。为了减轻未来癌症带来的负担和风险，具有针对性的预防措施和相应 的癌症早期检测、疗效监测及治疗手段的选择是重点研究方向。

现阶段，分子检测已经广泛应用于癌症的全程管理，包括早筛早诊、 治疗选择、微小残留评估(MRD)、疗效评估、及耐药监测等。为满足多癌 种或全癌种的早筛早诊，微小残留病灶检测，动态监测，疗效评估等的需 求，要求检测方法灵敏度高、操作简单、周期短、检测费用低，适合临床 推广及实践，可降低国家在检测费用上的支出。因此，可适用于多癌种或 全癌种的生物标志物挖掘，检测体系的建立，显得尤为重要。

目前基于基因甲基化检测癌症的方法有如下几类：

(1)针对于单一癌种的特定一个基因进行检测。如检测结直肠癌 SEPT9基因的检测方法(如CN104830855A、CN110042159A)。

(2)针对单一癌种的特定基因组合进行检测；如检测肺癌RASSF1A， CDKN2A，PTGER4，SHOX2基因的检测方法(CN113186293A)，检测卵 巢癌RASSF1A，OPCML，RUNX3，TFPI2基因的检测方法 (CN113186294A)。

现有报道的针对于特定癌种相关基因甲基化位点的检测，通过设计引 物、探针，开发检测体系进行甲基化检测，一次检测一个或者多个基因， 一次检测一种特定肿瘤。如果需要检测其他肿瘤，需要再次分析基因位 点，设计引物，验证检测体系。产品开发周期长，人力、物力、财力消耗 大，资源浪费。而由于跨癌种检测所用的基因位点，引物不一致，会导致 结果的可比较性较差，很难建立统一的结果评估标准。

文章Histone-Related Genes Are Hypermethylated in Lung Cancer andHypermethylated HIST1H4F Could Serve as a Pan-Cancer Biomarker， SupplementaryTable 13报道了一种泛癌甲基化Marker HIST1H4F基因，其 中数据显示在肝细胞癌，肺癌，乳腺癌，结肠腺癌，头颈部鳞状细胞癌， 膀胱尿路上皮癌，胰腺癌，子宫内膜癌8种癌症的TCGA数据中，总体灵 敏度(Sensitivity)均值为78.2％，总体特异性(Specificity)均值为95.2％，可见 其灵敏度和特异性还不能完全满足现在检测的需求。因此，亟需开发具有 高检测性能的泛癌甲基化Marker和检测体系。

发明内容

为克服现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种泛癌甲基化生物 标志物及其筛选方法和应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种泛癌甲基化生物标 志物及其筛选方法和应用。通过本发明提供的泛癌甲基化标志物筛选流 程，挖掘TCGA数据库中甲基化数据，筛选具有泛癌特征的甲基化标志物 信息，最终获得PRKCB基因特定区域甲基化可以作为泛癌标志物，针对得 到的泛癌甲基化标志物PRKCB基因甲基化区域进行引物及探针设计，同时 建立相应检测体系，基于PRKCB基因泛癌甲基化标志物对肿瘤样本的检 测，采用已知病理诊断信息的临床样本对PRKCB基因泛癌甲基化标志物整 体检测性能进行评估，测定灵敏度，特异性，阳性预测值，阴性预测值等 评价指标。

本发明一方面提供了PRKCB基因甲基化在作为泛癌诊断及预后的肿瘤 标志物中的应用。

本发明一方面提供了一种泛癌甲基化标志物的筛选方法，所述方法包 括以下步骤：

1)获取TCGA数据库中肿瘤和对应的正常样本的检测位点的甲基化检 测数据，每个位点的甲基化信号强度用beta value表示；

2)针对于每一个癌种,计算每个位点的beta value的最大值，最小值， 中位数，上四分位数和下四分位数，P-value；其中，所述P-value通过比较 该位点的beta value在肿瘤样本和对应的正常样本中的分布获得；

3)对每个位点的P-value，在正常样本中的beta value上四分位数 (Normal 0.75value,Normal Q3)，以及在肿瘤样本中的下四分位数(Tumor 0.25value,Tumor Q1)进行过滤，获得符合条件的位点；对于不符合条件的 位点，覆盖区域长度为0；

4)对于符合条件的位点，评估该位点所在基因区域内的上下游位点是 否符合过滤条件，进行迭代评估，直到在其上下游无法找到符合过滤条件 的位点为止，统计所有连续符合过滤条件的位点所覆盖的区域长度；

若该位点所在基因区域内无符合过滤条件的上下游位点，则该位点的 覆盖区域长度为1；

若该位点所在基因区域内有符合过滤条件的上下游位点，则进行步骤 5)；

5)如果区域长度>＝200bp，且该区域中包含至少在三个癌种中出现的 长度>＝200bp的片段，判定该片段为潜在泛癌甲基化标志物；反之，则判 定为非泛癌甲基化标志物(例如，如果区域长度＜200bp，则判定为非泛癌 甲基化标志物；或者如果区域长度>＝200bp，但仅在少于三个癌种中出现， 判定为非泛癌甲基化标志物，获得最终筛选结果)。

所述步骤1)中，所述450K数据为通过芯片法检测的样本甲基化数据, 共计约450,000探针,每条探针对应一个检测位点,每个位点的甲基化信号 强度用beta value表示；

所述步骤3)中，过滤条件为P-value＜0.01，在正常样本中的beta value 上四分位数＜0.2，在肿瘤样本中的下四分位数＞0.3。

所述步骤4)中，过滤条件为P-value＜0.01，在正常样本中的beta value 上四分位数＜0.2，在肿瘤样本中的下四分位数＞0.3。

所述步骤5)还包括提供泛癌甲基化标志物的信息，所述泛癌甲基化标 志物的信息包括下述内容中的一项或多项：基因名、位点ID、位点位置、 符合过滤条件的片段区域长度、泛癌标志物：YES/NO。

所述步骤5)中，获得的作为泛癌甲基化标志物的片段用于检测产品的设 计，如采用qPCR检测时，所述作为泛癌甲基化标志物的片段用于qPCR检测引 物及探针设计。

本发明另一方面提供了一种如上所述的泛癌甲基化标志物的筛选系 统，所述系统包括：

数据提取模块，用于获取TCGA数据库中肿瘤和对应的正常样本的检测位 点的甲基化检测数据，每个位点的甲基化信号强度用beta value表示；

统计分析模块，用于针对于每一个癌种,计算每个位点的beta value 的最大值，最小值，中位数，上四分位数和下四分位数，P-value；其中，所 述P-value通过比较该位点的beta value在肿瘤样本和对应的正常样本中的 分布获得；

过滤模块一，用于对每个位点的P-value，在正常样本中的beta value 上四分位数，以及在肿瘤样本中的下四分位数进行过滤,获得符合条件的位 点；

过滤模块二，用于对于符合条件的位点，评估该位点所在基因区域内的 上下游位点是否符合过滤条件，进行迭代评估，直到在其上下游无法找到符 合过滤条件的位点为止，统计所有符合过滤条件的位点所覆盖的区域长度；

筛选模块，用于判定泛癌甲基化标志物，如果区域长度>＝200bp，且该 区域中包含至少在三个癌种中出现的长度>＝200bp的片段，判定该片段为潜 在泛癌甲基化标志物；反之，则判定为非泛癌甲基化标志物。

本发明另一方面还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算 机程序，该程序被处理器执行时实现如上任一所述方法的步骤。

本发明另一方面还提供了一种计算机处理设备，包括处理器及所述的 计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算 机程序，实现如上任一所述方法的步骤。

本发明另一方面提供了PRKCB基因在作为泛癌标志物中的用途。

本发明另一方面提供了PRKCB基因特定区域甲基化在作为泛癌标志物 中的用途。

本发明另一方面提供了检测PRKCB基因的甲基化区域的试剂在制备用 于泛癌检测的产品中的用途；所述试剂或产品用于泛癌的早期鉴别诊断、 微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物 疗效评估及耐药监测等。

其中，所述PRKCB基因的甲基化区域为PRKCB基因启动子区域甲基 化。在一优选实施方式中，所述PRKCB基因的甲基化区域为 chr16:23,846,893-23,848,003(cg08406370-cg21370856)；即，甲基化区域位 于16号染色体上，起始位置为23,846,893，终止位置为23,848,003，450K 芯片对应所述起始位置的探针编号为cg08406370，450K芯片对应所述终止位置的探针编号为cg21370856。

本发明另一方面提供了一对泛癌检测用检测物，其为PRKCB基因甲基 化区域的特异性检测引物和/或特异性检测探针。

所述检测引物包括上游引物和下游引物，序列包括如下：

F:5’-CGAGTGATAGTTTCGGTTTCG-3’(SEQ ID NO：1)；

R:5’-ACCGCTACTACACCCGAAAC-3’(SEQ ID NO：2)。

所述检测探针包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列：

P:5’-VIC-GCGGTCGTTAGAGTCGGCGTA-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)。

本发明另一方面提供了所述的检测引物和/或所述的检测探针在制备泛 癌诊断产品中的应用。

本发明另一方面提供了一种用于靶向泛癌标志物PRKCB基因的特异性 区域甲基化的产品，所述产品包括如上所述的检测引物和/或检测探针。

本发明中，所述诊断包括泛肿瘤的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估 (MRD)及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监 测等。

如上所述，本发明的泛癌甲基化生物标志物及其筛选方法和应用，具有 以下有益效果：

本发明筛选获得了针对多种癌症的诊断标志物，检测便捷，具有高灵敏 度和高特异性的特点，对早期癌症敏感。

本发明以非侵入性的方式用于高风险人群的早期筛查，以及癌症患者的 预后检测，降低了侵入性检测造成的危害。

本发明利用一对引物和一个探针即可以完成对主要癌症的检测，节约了 引物和探针的合成成本，普适性广。

本发明操作简单；可用于早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评 估(MRD)及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监 测等。

本发明为肿瘤筛查及预后监测提供新思路，并对阐明肿瘤恶性行为的 分子机制具有重要意义，并且可以根据肿瘤标志物PRKCB基因甲基化来开 发无创型泛癌诊断及预后评估产品。

附图说明

图1为本发明的算法流程。

图2为本发明的检测体系及结果评估流程。

图3为PRKCB在LUAD(肺腺癌)中的甲基化分布。

图4为PRKCB在COAD(肠癌)中的甲基化分布。

图5为PRKCB在BRCA(乳腺癌)中的甲基化分布。

图6为阳性结果：Sample1，病理诊断：肺癌。

图7为阴性结果：Sample5，病理诊断：右半结肠高分化腺癌。

图8为阳性质控品结果。

图9为阴性质控品结果。

图10为实施例1中的检测体系。

图11为实施例1中的样本分布。

图12为实施例1中41例样本中1～15号样本的检测结果。

图13为实施例1中41例样本中16～30号样本的检测结果。

图14为实施例1中41例样本中31～41号样本的检测结果。

图15为实施例1中标志物性能评估结果。

其中，图6-9中(Amplification Plot)，横坐标的数值从左至右依次为 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、38、40、42。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可 由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还 可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细 节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰 或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不 局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语 是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本 发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、 “一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范 围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本 发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义 相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术 人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述 的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现 本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采 用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、 细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

本发明通过开发新的数据筛选方法，筛选出具有泛癌性质的甲基化标 志物(PRKCB基因)。然后针对筛选出的PRKCB基因启动子区域进行甲 基化检测引物和探针设计，建立检测体系检测肿瘤样本中的甲基化信号， 具有准确性高、特异性强的优点，在保证检测性能的情况下，能够简单、 快速、低成本、标准统一地对样本进行检测。该泛癌甲基化标志物可以潜 在应用于泛肿瘤的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD) 及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。

本发明所述诊断标志物能解决当前肺癌(肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞 癌(LUSC))，结肠腺癌(COAD)，直肠癌(READ)，食管癌(ESCA)，肝细胞 癌(LIHC)，胆管癌(CHOL)，肾癌(KICH)，胆囊癌(GBC)，胃癌(STAD)，胰 腺癌(PAAD)，诊断标志物准确性、特异性不高等的问题。

针对现有方法的局限性，本发明提供了一种泛癌甲基化标志物筛选方法 和流程，并针对筛选出的泛癌甲基化标志物特定区域进行引物及探针设计， 同时建立相应的检测体系，实现基于筛选出的泛癌甲基化标志物用于肿瘤样 本高准确性和高特异性等的检测目的。

本发明提供的泛癌甲基化标志物的筛选方法，通过设置特定的步骤和筛 选条件，挖掘TCGA数据库中甲基化数据，最终获得具有泛癌特征的甲基化 标志物信息，所述筛选方法基于癌症基因组图谱TCGA下的450K数据，运用 统计分析和机器学习算法，对基因甲基化数据进行分析处理，识别与多种肿 瘤相关的基因；流程如图1所示，包括步骤：

1)获取TCGA数据库中肿瘤和对应的正常样本的检测位点的甲基化检 测数据，每个位点的甲基化信号强度用beta value表示；

2)针对于每一个癌种,计算每个位点的beta value的最大值，最小值， 中位数，上四分位数和下四分位数，P-value；其中，所述P-value通过比较 该位点的beta value在肿瘤样本和对应的正常样本中的分布获得；

3)对每个位点的P-value，在正常样本中的beta value上四分位数 (Normal 0.75value,Normal Q3)，以及在肿瘤样本中的下四分位数(Tumor 0.25 value,Tumor Q1)进行过滤，获得符合条件的位点；对于不符合条件的 位点，覆盖区域长度为0；

4)对于符合条件的位点，评估该位点所在基因区域内的上下游位点是 否符合过滤条件，进行迭代评估，直到在其上下游无法找到符合过滤条件 的位点为止，统计所有连续符合过滤条件的位点所覆盖的区域长度；

若该位点所在基因区域内无符合过滤条件的上下游位点，则该位点的 覆盖区域长度为1；

若该位点所在基因区域内有符合过滤条件的上下游位点，则进行步骤 5)；

5)如果区域长度>＝200bp，且该区域中包含至少在三个癌种中出现的 长度>＝200bp的片段，判定该片段为潜在泛癌甲基化标志物；反之，则判 定为非泛癌甲基化标志物(例如，如果区域长度＜200bp，则判定为非泛癌 甲基化标志物；或者如果区域长度>＝200bp，但仅在少于三个癌种中出现， 判定为非泛癌甲基化标志物，获得最终筛选结果)。

所述步骤1)中，所述450K数据为通过芯片法检测的样本甲基化数据, 共计约450,000探针,每条探针对应一个检测位点,每个位点的甲基化信号 强度用beta value表示；

所述步骤1)中，所述肿瘤的种类可以是3个以上，例如本发明一实施方 式中，所述多个癌种为13个。

所述步骤3)中，过滤条件为P-value＜0.01，Normal 0.75 value(Normal Q3)＜0.2，Tumor 0.25value(Tumor Q1)＞0.3；

所述步骤4)中，过滤条件为P-value＜0.01，Normal 0.75 value(Normal Q3)＜0.2，Tumor 0.25 value(Tumor Q1)＞0.3；

所述步骤4)中，迭代次数无限制，迭代停止设为在该基因区域中无法找 到满足过滤条件的位点为止。

所述步骤5)还包括提供泛癌甲基化标志物的信息，所述泛癌甲基化标 志物的信息包括下述内容中的一项或多项：基因名、位点ID、位点位置、 符合过滤条件的片段区域长度、泛癌标志物：YES/NO。

所述步骤5)中，获得的作为泛癌甲基化标志物的片段用于检测产品的设 计，如采用qPCR检测时，所述作为泛癌甲基化标志物的片段用于qPCR检测引 物及探针设计。

在一优选实施方式中，所述泛癌标志物为PRKCB基因。进一步地，所 述PRKCB基因的甲基化区域为启动子区域。进一步地，所述PRKCB基因的 甲基化区域为chr16:23,846,893-23,848,003(cg08406370-cg21370856)；即，甲 基化区域位于16号染色体上，起始位置为23,846,893，终止位置为 23,848,003，450K芯片对应所述起始位置的探针编号为cg08406370，450K 芯片对应所述终止位置的探针编号为cg21370856。在另一实施方式中，所述 PRKCB基因的chr16:23,846,893-23,848,003(cg08406370-cg21370856)在肺癌、 肠癌、乳腺癌中的甲基化分布情况分别如图3～5所示。

通过本发明的方法，能够简便、快速、准确地获得泛癌甲基化标志物。

本发明还提供了PRKCB基因作为泛癌标志物中的用途，所述PRKCB基 因可以用于泛肿瘤的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD) 及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。

本发明还提供了PRKCB基因甲基化在制备用于泛癌检测的产品中的用 途，所述产品用于早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD) 及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。

本发明还提供了检测PRKCB基因甲基化的试剂在制备用于泛癌检测的 产品中的用途，所述产品用于泛癌的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶 残留评估(MRD)及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及 耐药监测等。

可选的，所述泛癌为TCGA数据中的癌种。

可选的，所述肿瘤复发及预后的辅助判断是指肿瘤复发的风险和预后情 况预测，可用于指导临床诊疗。

可选的，所述产品包括用于检测所述PRKCB基因的引物、探针、试剂、 试剂盒、检测系统等。

可选的，所述产品为针对所述PRKCB基因的启动子区域进行检测。

本发明针对筛选获得的特定泛癌标志物区域设计特定的引物和探针，构 建检测体系，并针对收集的肿瘤样本和正常样本，检测筛选获得的泛癌标志 物的性能。其中，肺癌(肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC))11例，结 肠腺癌(COAD)3例，直肠癌(READ)5例，食管癌(ESCA)1例，肝细胞癌(LIHC)3 例，胆管癌(CHOL)1例，肾癌(KICH)1例，胆囊癌(GBC)1例，胃癌(STAD)2 例，胰腺癌(PAAD)1例，正常样本12例。检测发现，PRKCB能够高准确性、 高特异性地检测多种癌症，提示PRKCB具备作为无创型泛癌诊断及预后标 志物的潜能。

本发明还提供了一种检测体系，所述检测体系如表1所示。采用该检测 体系的检测流程如图2所示。

本发明还提供了一种试剂盒，包含检测标志物的试剂，所述标志物包括 PRKCB基因。

在一实施方式中，所述试剂盒包含单个所述探针及引物，例如，所述试 剂盒可以是含有如上所述的用于泛癌标志物PRKCB基因的如SEQ ID NO:l 或SEQ ID NO:2所示的检测引物，或所述试剂盒含有如上所述的用于泛癌标 志物PRKCB基因的如SEQ ID NO:3所示的检测探针。

可选的，所述试剂盒还可以包含如下试剂中的一种或几种：核酸提取试 剂，用于扩增靶标的试剂，重亚硫酸盐转化试剂，用于评估靶标的甲基化状 态的试剂，内参基因，阴性对照和阳性对照等。

其中，用于扩增靶标的试剂包含酶，例如，用于多核苷酸扩增反应的酶， 所述多核苷酸扩增反应选自下组：聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增 (SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的 扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自主序列复制(3SR)和环介导 等温扩增(LAMP)。

其中，用于评估靶标的甲基化状态的试剂是要用于多核苷酸甲基化检测 方法的试剂，所述检测方法选自下组：质谱法、亚硫酸氢盐测序、甲基化特 异性PCR(MSP)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP或mDIP)、焦磷酸测序法、通 过连接介导的PCR测定HpaII小片段富集(HELP测定法)、地标基因组扫描 (RLGS)、DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的分子断裂光测定法、甲基敏感的 Southern印迹和高分辨率溶解(HRM)分析等。

在一实施方式中，用于评估靶标的甲基化状态的试剂是化学试剂，例如 亚硫酸氢盐或亚硫酸氢钠。

在一实施方式中，用于评估靶标的甲基化状态的试剂是生物试剂，例如 多肽或酶。在另一实施方式中，其中所述酶是多核苷酸聚合酶；所述多核苷 酸聚合酶被配置为用于PCR；所述多核苷酸聚合酶可以是DNA聚合酶，例如 不具有3′至5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

在一实施方式中，所述内参基因为COL2A1。

在一实施方式中，所述阴性对照为Human HCT116 non-methylation样 本。

在一实施方式中，所述阳性对照为Human HCT116样本。

本发明提供的试剂盒还包含用于一个或多个组分的单独容器(例如小 瓶)和/或用于使用所述试剂盒或系统的说明书。

本发明还提供了如上所述的试剂盒的用途，用于泛肿瘤的早期鉴别诊断 (早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肿瘤复发及预后的辅 助判断、药物疗效评估及耐药监测等。

本发明所述的引物、探针、试剂盒、系统或制品等可以被配置用于任何 适当的用途或目的。例如，本发明所述的引物、探针、试剂盒、系统或制品 等可以被配置成用于评估受试者中的癌症或肿瘤存在，例如，用于评估受试 者中的肺癌或结肠直肠癌，或用于受试者的泛癌分析或概况分析。

其中，所述样品但不限于体液(例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、 痰)、FFPE样本、新鲜组织或粪类物质的提取物。

所述方法用于受试者中泛癌分析或概况分析的诊断、预后、风险评估或 治疗监测。

在一实施方式中，本发明涉及体外检测方法，包括以下步骤：采集个体 样品；提取纯化所述样品中的DNA；针对纯化的DNA样品用重亚硫酸盐转 化；利用引物及探针组合物对样品进行扩增；对扩增结果进行分析，确定样 本的甲基化水平；基于所述样本的甲基化水平判读所述个体的患病情况。

在一实施方式中，所述个体可以是疑似患有癌症的对象。

在一实施方式中，所述PCR扩增采用的引物如SEQ ID NO:1～2所示。

在一实施方式中，所述探针包括靶向泛癌特异性区域的如SEQ ID NO:3 所示的探针。

如本文所用，泛癌特异性区域是指在大部分癌症种类中，与正常的对照 组织相比，该区域的甲基化水平存在显著提升。

如本文所用，DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳 原子的甲基化过程，作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的 作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观 遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉 寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。

如本文所用，如本文所用，术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患 者”在本发明中可互换地使用，并且表示期望对其进行诊断、治疗或疗法的 任何哺乳动物受试者，特别是人。“受试者”可以是对之施用或施加所提供 的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体或所述生物体的一部分或组 分。例如，所述受试者可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官 或一部分。

如本文所用，术语“样品”是指可能包含需要进行分析的靶分子的任何 物质，包括生物样品。

如本文所用，“引物”可以是天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷 酸模板形成双链体后能够充当核酸合成的起始点并从其3'端沿模板延伸，从 而形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的 序列决定。引物通常通过聚合酶如DNA聚合酶延伸。

在一些实施方案中，术语“甲基化状态(methylationstate)”或“甲基化 状态(methylationstatus)”是指在DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处 存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mC”或“5-mCyt”)。DNA序列内一个或多个特 定CpG甲基化位点(每个都有两个CpG二核苷酸序列)处的甲基化状态包括 “未甲基化”、“完全甲基化”和“半甲基化”。

实施例1PRKCB性能验证

1、引物、探针信息如下：

靶标基因：PRKCB

F:5’-CGAGTGATAGTTTCGGTTTCG-3’(SEQ ID NO.1)；

P:5’-VIC-GCGGTCGTTAGAGTCGGCGTA-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)；

R:5’-ACCGCTACTACACCCGAAAC-3’(SEQ ID NO.2)。

内参基因：COL2A1

F:5’-GTAATGTTAGGAGTATTTTGTGGGTA-3’(SEQ ID NO.4)；

R:5’-CTAGCCCAAAAAAACCCAATCCTA-3’(SEQ ID NO.5)；

PROBE:5’-CY5-AGAAGAAGGGAGGGGTGTTAGGAGAGG-BHQ2-3’ (SEQ ID NO.6)。

2、检测体系如图10：20ul体系，仪器ABI7500；

反应程序如下：

95℃3min，95℃3sec，60℃40sec(采集荧光)，40cycles。

3、性能验证

采用已知病理诊断结果的组织样本进行PRKCB泛癌甲基化标志物的性 能验证。

样本分布如图11(总计41例)。

3.1检测流程：

核酸提取：美基核酸提取试剂：D3018(HiPure Tissue&Blood DNA Kit)， 实验流程参考试剂盒说明书。

使用500ng DNA样本进行重亚硫酸盐转化，转化试剂盒为EZ DNA Methylation-Gold^TMKit，实验流程参考试剂盒说明书。

对转化后的DNA样本进行qMSP检测，使用ABI7500仪器，每个样本进 行复孔检测，引物、探针、检测体系如上。

阳性对照为Human HCT116甲基化样本；阴性对照为Human HCT116non-methylation样本。

检测结果判读：

阳性：

PRKCB基因：Ct<40，至少一个孔检出；

内参基因：Ct＜40。

阴性：

PRKCB基因：Ct值未检出；

内参基因：CT＜40。

重做实验：

内参基因：CT未检出。

4、部分结果如下：

阳性样本：Sample1：

病理诊断：肺癌；检测结果如图6所示。

阴性样本：Sample5：

病理诊断：右半结肠高分化腺癌；检测结果如图7所示。

阳性质控品结果，检测结果如图8所示。

阴性质控品结果，检测结果如图9所示。

5、性能评估

41例样本检测结果总览，如图12～图14所示：

BS编号：内部编号

检测结果：实际检测结果：阴性/阳性

期望结果：根据病理信息获得的结果。肿瘤，阳性；正常人，阴性。

病理：实际病理结果。

PRKCB(Well1)及后3列：实际检测CT值。Well 1、Well 2：第一个孔， 第二个孔结果。

性能评估结果：

评估PRKCB基因甲基化作为泛癌检测标志物的灵敏度、特异性、阳性 预测值、阴性预测值，结果如下图13所示。

综上所述，针对目前多癌检测产品的缺乏和技术限制，本文提供了一 种泛癌标志物的筛选方法，筛选获得的PRKCB基因，针对该基因特定区域 设计的引物和探针，可用于肺癌(肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌 (LUSC))，结肠腺癌(COAD)，直肠癌(READ)，食管癌(ESCA)，肝细胞癌 (LIHC)，胆管癌(CHOL)，肾癌(KICH)，胆囊癌(GBC)，胃癌(STAD)，胰腺 癌(PAAD)等癌症的早期筛查，具有更高的灵敏度和准确性，能够实现实时 监测，有效延长患者生存期。本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而 具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发 明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述 实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未 脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍 应由本发明的权利要求所涵盖。

序列表

<110> 慧算基因科技(上海)有限公司

上海津熙医学检验实验室有限公司

<120> 一种泛癌甲基化生物标志物的筛选方法、生物标志物及应用

<150> 2021113410521

<151> 2021-11-12

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgagtgatag tttcggtttc g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accgctacta cacccgaaac 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggtcgtta gagtcggcgt a 21

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtaatgttag gagtattttg tgggta 26

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctagcccaaa aaaacccaat ccta 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaagaaggg aggggtgtta ggagagg 27

Claims (10)

1.检测PRKCB基因的甲基化区域的试剂在制备用于泛癌检测的产品中的用途，其特征在于，所述PRKCB基因的甲基化区域为PRKCB基因启动子区域甲基化；优选所述PRKCB基因的甲基化区域为chr16:23,846,893-23,848,003。

2.一对泛癌检测用检测物，其特征在于，其为如权利要求1所述的用途中所述的PRKCB基因甲基化区域的特异性检测引物和/或特异性检测探针；

所述特异性检测引物包括上游引物和下游引物，序列包括如下：

F:5’-CGAGTGATAGTTTCGGTTTCG-3’(SEQ ID NO：1)；

R:5’-ACCGCTACTACACCCGAAAC-3’(SEQ ID NO：2)；

所述特异性检测探针序列包括如下：

P:5’-VIC-GCGGTCGTTAGAGTCGGCGTA-BHQ1-3’(SEQ ID NO：3)。

3.如权利要求2所述的检测物在制备泛癌诊断产品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断包括泛癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肿瘤复发及预后的辅助判断、药物疗效评估。

5.一种用于泛癌标志物PRKCB基因的甲基化区域的检测产品，其特征在于，所述产品包括如权利要求2所述的检测物。

6.一种泛癌甲基化标志物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)获取TCGA数据库中肿瘤和对应的正常样本的检测位点的甲基化检测数据，每个位点的甲基化信号强度用beta value表示；

2)针对于每一个癌种,计算每个位点的beta value的最大值，最小值，中位数，上四分位数和下四分位数，P-value；其中，所述P-value通过比较该位点的beta value在肿瘤样本和对应的正常样本中的分布获得；

3)对每个位点的P-value，在正常样本中的beta value上四分位数，以及在肿瘤样本中的下四分位数进行过滤,获得符合条件的位点；

4)对于符合条件的位点，评估该位点所在基因区域内的上下游位点是否符合过滤条件，进行迭代评估，直到在其上下游无法找到符合过滤条件的位点为止，统计所有连续符合过滤条件的位点所覆盖的区域长度；

5)如果区域长度>＝200bp，且该区域中包含至少在三个癌种中出现的长度>＝200bp的片段，判定该片段为潜在泛癌甲基化标志物；反之，则判定为非泛癌甲基化标志物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，包括以下至少任一项：

a)所述步骤3)或步骤4)中，过滤条件为P-value＜0.01，在正常样本中的beta value上四分位数＜0.2，在肿瘤样本中的下四分位数＞0.3；

b)所述步骤5)还包括提供泛癌甲基化标志物的信息，所述泛癌甲基化标志物的信息包括下述内容中的一项或多项：基因名、位点ID、位点位置、符合过滤条件的片段区域长度、泛癌标志物：YES/NO。

8.一种泛癌甲基化标志物的筛选系统，其特征在于，所述系统包括：

数据提取模块，用于获取TCGA数据库中肿瘤和对应的正常样本的检测位点的甲基化检测数据，每个位点的甲基化信号强度用beta value表示；

统计分析模块，用于针对于每一个癌种,计算每个位点的beta value的最大值，最小值，中位数，上四分位数和下四分位数，P-value；其中，所述P-value通过比较该位点的betavalue在肿瘤样本和对应的正常样本中的分布获得；

过滤模块一，用于对每个位点的P-value，在正常样本中的beta value上四分位数，以及在肿瘤样本中的下四分位数进行过滤,获得符合条件的位点；

过滤模块二，用于对于符合条件的位点，评估该位点所在基因区域内的上下游位点是否符合过滤条件，进行迭代评估，直到在其上下游无法找到符合过滤条件的位点为止，统计所有符合过滤条件的位点所覆盖的区域长度；

筛选模块，用于判定泛癌甲基化标志物，如果区域长度>＝200bp，且该区域中包含至少在三个癌种中出现的长度>＝200bp的片段，判定该片段为潜在泛癌甲基化标志物；反之，则判定为非泛癌甲基化标志物。

9.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于，该程序被处理器执行时实现权利要求6或7所述方法的步骤。

10.一种计算机处理设备，包括处理器及权利要求9所述的计算机可读存储介质，其特征在于，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序，实现权利要求6或7所述方法的步骤。

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