CN116555422A - 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用 - Google Patents
肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116555422A CN116555422A CN202210112040.XA CN202210112040A CN116555422A CN 116555422 A CN116555422 A CN 116555422A CN 202210112040 A CN202210112040 A CN 202210112040A CN 116555422 A CN116555422 A CN 116555422A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- methylation
- lung cancer
- region
- cpg island
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 152
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 152
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 110
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 title claims abstract description 108
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 108
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 69
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 86
- 101000892878 Homo sapiens Forkhead box protein I2 Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 101000703741 Homo sapiens Short stature homeobox protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 101150075618 foxd3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 101100310647 Homo sapiens SOX17 gene Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 101150007417 SOX17 gene Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102100031976 Short stature homeobox protein 2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 7
- 101150103009 gene 17 gene Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108091029523 CpG island Proteins 0.000 claims description 52
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 22
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims description 15
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 102100041000 Forkhead box protein I2 Human genes 0.000 claims description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 238000003498 protein array Methods 0.000 claims description 4
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 claims description 3
- 101150078635 18 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 abstract description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 10
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 abstract 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 22
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 3
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 3
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101710159129 DNA adenine methylase Proteins 0.000 description 1
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 206010056342 Pulmonary mass Diseases 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011976 chest X-ray Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007608 epigenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007854 ligation-mediated PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012022 methylating agents Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007637 random forest analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一组生物标志物及相关检测试剂盒。本发明提供的生物标志物包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合,所述标志物组合可用于肺癌诊断。基于所述标志物组合设计检测引物和探针,并进一步开发的试剂盒用于诊断肺癌和/或评估肺癌风险等。采用本发明所述的生物标志物可以避免全基因组测序,大大节约测序数据量,具有优良的检测敏感性和特异性,且成本低、深度高、对相关基因甲基化水平的检测更加准确。本发明为肺癌筛查、术后及预后评估提供新思路,并对阐明肺癌相关的分子机制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种肺癌甲基化标志物组合、检测试剂盒及其应用。
背景技术
目前临床所使用肺部肿瘤筛查诊断方法主要是靠低剂量螺旋CT(LDCT)和胸部X射线影像学检查。除此之外,还有其他多种辅助手段帮助支持肺癌的诊断,如纤维支气管镜、痰液细胞学检查、肿瘤标志物检测等,但经长期研究发现,上述这些方法各有利弊,都分别存在费用高、投入大、敏感度低、漏诊率高、假阳性高、不能早期诊断的局限性,有的操作不便,易给患者造成痛苦和不便。因此,迫切需要敏感、特异的生物标志物。
近年来肺癌表观遗传学研究进展对肺癌的早期诊断和治疗具有深远的意义。有证据表明抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制,不同基因的转录失活将影响细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等,与癌症的发生发展有着密切联系。基因甲基化是指DNA分子上CpG双核苷中的胞嘧啶(C)在酶的作用下选择性地添加甲基形成5’-甲基胞嘧啶的过程。在肺癌患者中,基因启动子区的CpG岛甲基化是一种较为普遍的现象。目前已报道的肺癌相关的甲基化基因标志物尚具敏感度低(35.5%)和特异性低(73%)的缺陷,使之应用于临床检测存在一定的局限。甲基化基因标志物针对某一或某些癌症的敏感度高,表示相应癌症的漏诊率低;类似地,其特异性高则表示相应癌症的误诊率低。故可知,甲基化基因标志物检测的敏感度、特异性是衡量其参考价值大小的两项重要指标。
因此,对肺癌甲基化基因标志物进行进一步深入研究,开发高敏感度、高特异性的与肺癌相关的甲基化基因及其组合的检测试剂,从而为肺癌诊断的准确性提供更有效的手段,是当前甲基化基因标志物检测技术中亟待解决的问题。
发明内容
针对现有方法的局限性,本发明的目的在于提供一种肺癌甲基化标志物,并针对筛选出的肺癌甲基化标志物特定区域进行引物及探针设计,同时建立相应的检测体系,实现基于筛选出的肺癌甲基化标志物组合用于肺癌样本高准确性、高灵敏度和高特异性等的检测目的,为肺癌诊断提供有价值的参考信息。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用。
本发明的目的之一是提供一种肺癌甲基化标志物,其特征在于,其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。
本发明的另一目的是提供用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。
本发明的另一目的是提供一种肺癌诊断用检测物,其包含如上所述的基因甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
本发明的另一目的是提供如上所述的检测物在制备肺癌诊断产品中的应用。
本发明的另一目的是提供一种肺癌诊断产品,所述产品包括如上所述的检测物。
在一优选实施方式中,所述肺癌诊断产品为试剂盒,其包含如上所述的检测物。
如上所述,本发明肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用,具有以下有益效果:
本发明提供了具有优异性能的肺癌甲基化标志物及检测试剂盒,相对于已有的检测方法如荧光PCR检测方法、二代测序检测方法等,检测性能大幅提升,具有检测准确度、灵敏度和特异性高的特点,且具有易开展,便于临床推广,可用于液体活检,成本低,能够降低液体患者的就医成本等优势。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明的目的是提供更高效的肺部肿瘤相关甲基化标志物,提高肺部肿瘤早筛早诊效率,解决肺癌早诊率低,临床治疗负担重等问题。提供一组有效的肺部肿瘤甲基化标志物,并提供高效的标志物组合。
本发明利用荧光PCR检测技术,检测白膜层(其中大部分为白细胞)、肺癌组织相关标志物甲基化的情况。初步确认该标志物用于血液检测肺癌的潜能。理想的肺癌甲基化检测标志物应该具备以下特征:
(1)白膜层DNA甲基化水平低;
(2)肺癌组织DNA甲基化水平高。
甲基化标志物检测采用甲基化特异PCR(MSP)来进行,MSP的基本原理是在检测中,只有甲基化的序列模板产生扩增信号,而非甲基化的序列模板不产生扩增信号。该方法可通过引物或者探针设计甲基化特异序列来实现,也可以同时设计甲基化特异的引物、探针对来实现。其主要步骤包括:
1)根据标志物序列,在适合进行MSP的检测区段(通常为CpG富集区域),设计检测引物和探针;
2)进行白膜层和肺癌组织样本的核酸提取;
3)对核酸进行亚硫酸氢盐处理,使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶维持序列不变;
4)进行荧光PCR检测。
经白膜层和组织样本检测,满足上述特征的标志物,证明其存在通过血液来检测肺癌的潜能。然后在血浆样本中,对这些标志物进行验证,检测样本包括对照组、肺癌组以及肺部结节、肺部炎症干扰人群等,以分析这些标志物的参考水平及标志物组合性能。
因单个样本血浆游离DNA有限,故进行荧光PCR检测时,可先对靶点进行预扩增,以使最少量的DNA能够检测尽可能多的甲基化位点。其主要步骤包括:
1)血浆样本的核酸提取;
2)对核酸进行亚硫酸氢盐处理,使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶维持序列不变;
3)进行靶点的预扩增及稀释;
4)进行荧光PCR检测。
本发明人通过大量探索性研究,提供了一组用于诊断肺癌的生物标志物,其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。所述生物标志物具有优良的检测敏感性和特异性,能解决当前肺癌(包括肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC))诊断准确性、灵敏度、特异性不高等的问题,在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一组用于诊断肺癌的生物标志物,其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。具体包含所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛、FOXI2基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛、RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛、SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛,以及SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的组合。通过对所述生物标志物的筛查,可以低成本、高深度、更加准确地诊断肺癌和/或评估个体是否易发肺癌。
在一些优选实施方式中,所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr1:63785908-63785999的序列,或其活性片段;
所述FOXI2基因的CpG岛或FOXI2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr10:129534759-129534851的序列,或其活性片段;
所述RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:50378061-50378154的序列,或其活性片段;
所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339-157821429的序列,或其活性片段;
所述SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr8:55370987-55371098的序列,或其活性片段。
本发明中,所述活性片段通常指通过该物质的检测可以发现其对应的基因中相关甲基化水平的物质,具体可以是例如,DNA或其mRNA或保有其功能的同源物等,活性片段的选择方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。所述基因的同源物可以是与所述基因具有80%(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)以上同源性的序列。
在另一些优选实施方式中,所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr1:63785908-63785999的序列;
所述FOXI2基因的CpG岛或FOXI2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr10:129534759-129534851的序列;
所述RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:50378061-50378154的序列;
所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339-157821429的序列;
所述SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr8:55370987-55371098的序列。
本发明人发现,FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化与肺癌的发生发展存在密切关系,发生肺癌的患者,极大概率上会同时存在上述甲基化。
本发明还提供了用于如上所述的基因甲基化标志物在制备肺癌诊断产品中的用途。所述诊断包括肺癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估等。所述肺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式,包括但不限于是引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
本发明还提供了用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。所述诊断包括肺癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估等。所述肺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式,包括但不限于是引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
本发明中,所述肺癌的早期鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有肺癌或者更加有可能患有肺癌。例如,当个体的基因组中同时存在FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化时,则认为个体患有肺癌或者更加有可能患有肺癌。再例如,当个体的基因组中FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化至少一个未出现时,则认为个体未患有肺癌或者更加有可能未患有肺癌。由于肺癌的早期诊断通常有较大难度,所以引入上述筛选以后可以更加准确地对个体进行肺癌的诊断。
本发明中,所述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶。例如,当个体的基因组中同时存在FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化时,则认为个体残留微小病灶的可能性较大。再例如,当个体的基因组中FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化至少一个未出现时,则认为个体残留微小病灶的可能性不大。
本发明中,所述肺癌复发及预后的辅助判断是指肺癌复发的风险和预后情况预测,具体可以是用于确认个体肺癌复发的可能性或恶化倾向,可用于指导临床诊疗。例如,当个体的基因组中同时存在FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化时,则认为个体肺癌复发的可能性更大或者肺癌更加有可能恶化。再例如,当个体的基因组中FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化至少一个未出现时,则认为个体复发的可能性不大或肺癌恶化的可能性不大。
本发明中,所述的药物疗效评具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对个体有效。例如,当个体的基因组中同时存在FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化时,则认为某种药物或治疗手段对个体效果不佳。再例如,当个体的基因组中FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化,FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化,RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化,SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化,SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化至少一个未出现时,则认为某种药物或治疗手段对个体有效。
本发明中,所述物质具体为用于检测外周或瘤内血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰、新鲜组织、新鲜组织或粪类物质的提取物、石蜡切片、粗针穿刺样本等样品中所述基因或其活性片段中甲基化水平的物质。本领域技术人员可采用合适的方法,检测上述样品中所存在的甲基化,例如,具体可采用的方法可以是Sanger测序、全基因组测序、全外显子测序、靶向测序等方法。用于检测基因或其活性片段中甲基化的物质通常与检测方法是相对应的,
例如,所述用于检测FOXD3基因chr1:63785908-63785999区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测FOXD3基因chr1:63785908-63785999区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针,再例如,所述用于检测FOXI2基因chr10:129534759-129534851区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测FOXI2基因chr10:129534759-129534851区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针,再例如,所述用于检测RASSF1A基因chr3:50378061-50378154区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测RASSF1A基因chr3:50378061-50378154区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针,再例如,所述用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针;再例如,所述用于检测SOX17基因chr8:55370987-55371098区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测SOX17基因chr8:55370987-55371098区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针;再例如,所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸,从而可以与靶标序列杂交,实现对靶标上是否存在特定甲基化进行检测。用于检测基因或其活性片段中甲基化水平的物质还可以包括其他各种相关的检测试剂。
在一些优选实施方式中,所述用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质包括用于检测FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化的物质、用于检测FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化的物质、用于检测RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化的物质、用于检测SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化的物质、和用于检测SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化的物质的组合。
在一些优选实施方式中,所述用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质包括检测如上所述的基因甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
所述特异性检测引物包括以下引物对A~E至少任一:
针对FOXD3基因的甲基化区域的引物对A,其序列如SEQ ID NO:1~2所示;
针对FOXI2基因的甲基化区域的引物对B,其序列如SEQ ID NO:3~4所示;
针对RASSF1A基因的甲基化区域的引物对C,其序列如SEQ ID NO:5~6所示;
针对SHOX2基因的甲基化区域的引物对D,其序列如SEQ ID NO:7~8所示;
针对SOX17基因的甲基化区域的引物对E,其序列如SEQ ID NO:9~10所示;
所述特异性检测探针包括以下探针A~E至少任一:
针对FOXD3基因的甲基化区域的探针A,其序列如SEQ ID NO:11所示;
针对FOXI2基因的甲基化区域的探针B,其序列如SEQ ID NO:12所示;
针对RASSF1A基因的甲基化区域的探针C,其序列如SEQ ID NO:13所示;
针对SHOX2基因的甲基化区域的探针D,其序列如SEQ ID NO:14所示;
针对SOX17基因的甲基化区域的探针E,其序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明还提供了一种肺癌检测用检测物,其包含如上所述的基因甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
在一些优选实施方式中,所述特异性检测引物包括以下引物对A~E至少任一:
针对FOXD3基因的甲基化区域的引物对A,其序列如SEQ ID NO:1~2所示;
针对FOXI2基因的甲基化区域的引物对B,其序列如SEQ ID NO:3~4所示;
针对RASSF1A基因的甲基化区域的引物对C,其序列如SEQ ID NO:5~6所示;
针对SHOX2基因的甲基化区域的引物对D,其序列如SEQ ID NO:7~8所示;
针对SOX17基因的甲基化区域的引物对E,其序列如SEQ ID NO:9~10所示;
所述特异性检测探针包括以下探针A~E至少任一:
针对FOXD3基因的甲基化区域的探针A,其序列如SEQ ID NO:11所示;
针对FOXI2基因的甲基化区域的探针B,其序列如SEQ ID NO:12所示;
针对RASSF1A基因的甲基化区域的探针C,其序列如SEQ ID NO:13所示;
针对SHOX2基因的甲基化区域的探针D,其序列如SEQ ID NO:14所示;
针对SOX17基因的甲基化区域的探针E,其序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明还提供了一种肺癌诊断产品,所述产品包括如上所述的检测物。
本发明中,所述肺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式,包括但不限于是试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
当所述肺癌诊断产品为试剂盒时,其包含如上所述的检测物,其用于对甲基化区域进行扩增,即包括用于检测FOXD3基因的chr1:63785908-63785999区域甲基化的物质、用于检测FOXI2基因的chr10:129534759-129534851区域甲基化的物质、用于检测RASSF1A基因的chr3:50378061-50378154区域甲基化的物质、用于检测SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化的物质、和用于检测SOX17基因的chr8:55370987-55371098区域甲基化的物质;对甲基化区域进行处理的试剂;以及用于对扩增产物进行测序的引物。
本发明所提供的检测试剂盒中,用于检测基因或其活性片段中甲基化的物质通常与检测方法是相对应的,例如,所述用于检测FOXD3基因chr1:63785908-63785999区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测FOXD3基因chr1:63785908-63785999区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针,再例如,所述用于检测FOXI2基因chr10:129534759-129534851区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测FOXI2基因chr10:129534759-129534851区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针,再例如,所述用于检测RASSF1A基因chr3:50378061-50378154区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测RASSF1A基因chr3:50378061-50378154区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针,再例如,所述用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针;再例如,所述用于检测SOX17基因chr8:55370987-55371098区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测SOX17基因chr8:55370987-55371098区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针;再例如,所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸,从而可以与靶标序列杂交,实现对靶标上是否存在特定甲基化进行检测。
可选的,所述试剂盒还可以包括其他各种相关的检测试剂,包括但不限于是核酸提取试剂,用于扩增靶标的试剂,重亚硫酸盐转化试剂,用于评估靶标的甲基化状态的试剂,内参基因,阴性对照和阳性对照等中的一种或几种。
其中,用于扩增靶标的试剂包含酶,例如,用于多核苷酸扩增反应的酶,所述多核苷酸扩增反应选自下组:聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自主序列复制(3SR)和环介导等温扩增(LAMP)。
其中,用于评估靶标的甲基化状态的试剂是要用于多核苷酸甲基化检测方法的试剂,所述检测方法选自下组:质谱法、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP或mDIP)、焦磷酸测序法、通过连接介导的PCR测定HpaII小片段富集(HELP测定法)、地标基因组扫描(RLGS)、DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的分子断裂光测定法、甲基敏感的Southern印迹和高分辨率溶解(HRM)分析等。
在一实施方式中,用于评估靶标的甲基化状态的试剂是化学试剂,例如亚硫酸氢盐或亚硫酸氢钠。
在一实施方式中,用于评估靶标的甲基化状态的试剂是生物试剂,例如多肽或酶。在另一实施方式中,其中所述酶是多核苷酸聚合酶;所述多核苷酸聚合酶被配置为用于PCR;所述多核苷酸聚合酶可以是DNA聚合酶,例如不具有3′至5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
在一实施方式中,所述内参基因为ACTB。
本发明提供的试剂盒还包含用于一个或多个组分的单独容器(例如小瓶)和/或用于使用所述试剂盒或系统的说明书。
本发明还提供了如上所述的试剂盒的用途,用于肺癌的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。
本发明所述的引物、探针、试剂盒、检测体系、系统或制品等可以被配置用于任何适当的用途或目的。例如,本发明所述的引物、探针、试剂盒、检测体系、系统或制品等可以被配置成用于评估受试者中的肺癌的存在,或用于受试者的肺癌分析或概况分析。
本发明人通过大量实验研究,通过高通量筛选方法,提供了一组包括FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的生物标志物。本发明所提供的生物标志物可以避免全基因组测序,大大节约需要的测序数据量。针对筛选出的生物标志物甲基化区域进行检测引物和探针设计,通过一次性检测肺癌相关的主要致病基因的甲基化水平,具有优良的检测敏感性和特异性,操作简单、快速,且成本低、深度高、对相关甲基化的检测更加准确。基于所述生物标志物,可以进一步开发相应的检测试剂盒,用于肺癌的临床分子诊断,可以潜在应用于肺癌的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等,还可通过生物信息学等技术手段进一步探究肺癌相关基因的功能及内在机制,为肺癌的早期发现、早期预防、早期诊断、早期治疗、未来相关的靶向治疗提供理论依据。此外,在靶点组合分析时,也可引入机器学习的数学模型,如线性回归、支持向量回归、脊回归、随机森林等等。
本发明针对筛选获得的特定肺癌甲基化标志物区域设计特定的引物和探针,构建检测体系,并针对收集的肺癌样本和正常样本,检测筛选获得的肺癌标志物的性能。检测发现,本发明的生物标志物能够高准确性、高特异性地检测肺癌,提示所述生物标志物组合具备作为无创型肺癌诊断及预后标志物的潜能。
本发明还提供了一种检测体系,所述检测体系包括:10μL甲基化试剂处理后得到的转化的DNA,2.5μL包含检测区域的引物和探针预混液;12.5μL PCR试剂;其中所述引物和探针预混液中,引物序列如SEQ ID NO:1~10所示,每条引物的终浓度为500nM,探针序列如SEQ ID NO:11~15所示,每条探针的终浓度为200nM。
本发明还提供了一种检测体系,所述检测体系包括:10μL亚硫酸氢盐处理后得到的转化的DNA,2.5μL包含检测区域的引物和探针预混液;12.5μL PCR试剂(Universal Probe qPCR Master Mix(NEB);其中所述引物和探针预混液中,引物序列如SEQID NO:1~10所示,每条引物的终浓度为500nM,探针序列如SEQ ID NO:11~15所示,每条探针的终浓度为200nM。
本发明还提供了一种体外检测方法,所述方法包括收集待测样品;提取纯化所述样品中的DNA;针对纯化的DNA样品用重亚硫酸盐转化;利用引物及探针组合物对样品进行扩增;对扩增结果进行分析,确定样本的甲基化水平;基于所述样本的甲基化水平判读所述个体的患病情况。
在一实施方式中,所述个体可以是疑似患有肺癌的对象。
在一实施方式中,所述PCR扩增采用的引物如SEQ ID NO:1~10所示。
在一实施方式中,所述探针包括靶向肺癌特异性区域的如SEQ ID NO:11~15所示的探针。
本发明中,通过PCR扩增反应检测各标志物基因;
设定每个基因的Ct阳性判读区间,当任一基因阳性即将待测样本判读为阳性;所有基因均为阴性时,将待测样本判读为阴性;
其中,所述各基因的阳性判读区间为,FOXD3基因:Ct≤26.02,FOXI2基因:Ct≤23.26,RASSF1A基因:Ct≤23.43,SHOX2基因:Ct≤28.18,和SOX17基因:Ct≤28.60。
如本文所用,DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程,作为一种相对稳定的修饰状态,在DNA甲基转移酶的作用下,可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA,是一种重要的表观遗传机制,DNA甲基化时,基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂,因此它与肺癌的发生关系密切。
在一些实施方案中,术语“甲基化状态(methylationstate)”或“甲基化状态(methylationstatus)”是指在DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mC”或“5-mCyt”)。DNA序列内一个或多个特定CpG甲基化位点(每个都有两个CpG二核苷酸序列)处的甲基化状态包括“未甲基化”、“完全甲基化”和“半甲基化”。
如本文所用,术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本发明中可互换地使用,并且表示期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者,特别是人。“受试者”可以是对之施用或施加所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体或所述生物体的一部分或组分。例如,所述受试者可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。
如本文所用,术语“样品”是指可能包含需要进行分析的靶分子的任何物质,包括生物样品。
如本文所用,“引物”可以是天然的或合成的寡核苷酸,其在与多核苷酸模板形成双链体后能够充当核酸合成的起始点并从其3'端沿模板延伸,从而形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。引物通常通过聚合酶如DNA聚合酶延伸。
须知,下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。
此外应理解,本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤,除非另有说明;还应理解,本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置,除非另有说明。而且,除非另有说明,各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具,而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围,其相对关系的改变或调整,在无实质变更技术内容的情况下,当亦视为本发明可实施的范畴。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1甲基化生物标志物组合、特异引物和探针设计
从基因注释数据库(NCBI、Ensemble、UCSC等)中导出基因注释区段及其上下游5kb的序列,挑选其中CpG富集区域进行引物探针设计。将CpG富集区域序列(或其互补序列)进行手工或软件辅助转化为模拟亚硫酸氢盐处理后序列,根据甲基化特异的PCR引物、探针设计原则,其中CpG的C认为存在甲基化修饰,非CpG的C认为不存在甲基化修饰。得到模拟亚硫酸氢盐处理序列后,可用常规引物、探针设计手段进行设计,并进行合成。
本实施例中,所述生物标志物组合如表1所示,包括基因名称、基因注释位置、PCR检测区段。针对所述生物标志物组合设计的引物和探针序列如表2所示。
表1.本发明涉及的基因名称、基因注释位置、PCR检测区段
Gene | Gene Hg19 Pos. | PCR region |
FOXD3 | chr1:63778730-63790797 | chr1:63785908-63785999 |
FOXI2 | chr10:129525499-129539450 | chr10:129534759-129534851 |
RASSF1A | chr3:50367219-50378411 | chr3:50378061-50378154 |
SHOX2 | chr3:157814948-157824292 | chr3:157821339-157821429 |
SOX17 | chr8:55370495-55373448 | chr8:55370987-55371098 |
表2.本发明涉及的基因名称、引物和探针序列
实施例2用于血浆样本肺癌标志物的检测性能评估
选取120个肺部未见异常健康对照血浆样本、120个肺癌患者术前血浆样本。
使用商业化Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提上述血浆样本中的细胞外游离DNA。使用商业化亚硫酸氢盐转化试剂MethylCodeTM BisulfiteConversion Kit对抽提出的细胞外游离DNA进行亚硫酸盐转化处理,得到转化后的DNA。
可选地,将上述转化后的DNA用于预扩增,用含有表2所示的靶点引物和内参(ACTB)引物对的预混液(引物池),以转化后的DNA为模板,进行PCR扩增,其中每条引物的终浓度为100nM。
PCR反应体系包含:10μL亚硫酸氢盐处理后得到的转化的DNA,2.5μL包含上述引物的预混液;12.5μL PCR试剂(Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。
PCR反应条件如下:95℃5分钟;95℃30秒,56℃60秒,进行15个循环。
将获得的预扩增产物稀释10倍后用于荧光PCR检测。使用如表2所示的引物和探针序列,并且同时对内参基因ACTB进行检测(作为对照)。
引物和探针预混液中,引物终浓度为500nM,探针终浓度为200nM。
PCR反应体系包含:10μL预扩增稀释产物,包含检测位点的引物和探针预混液2.5μL;12.5μL PCR试剂(Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)。
PCR反应条件如下:95℃5分钟;95℃15秒,56℃40秒(采集荧光),50个循环。不同基因探针设计不同荧光修饰,针对不同基因探针修饰荧光,选择相应检测荧光通道。未检测到扩增信号的靶点Ct值被设定为50。Ct值是指PCR反应中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。
将各靶点的特异性统一要求约90%时,各靶点的检测灵敏度和特异性统计数据如下表5。
表3.各个靶点在约90%特异性时,检测性能统计
Gene | 灵敏度 | 特异性 | 阳性判读区间 |
FOXD3 | 60.83%% | 90.00%% | Ct≤26.02 |
FOXI2 | 59.17% | 90.00% | Ct≤23.26 |
RASSF1A | 56.67% | 90.00% | Ct≤23.43 |
SHOX2 | 67.50%% | 89.17%% | Ct≤28.18 |
SOX17 | 60.00%% | 90.00%% | Ct≤28.60 |
在对靶点进行组合分析时,数据分析可采用对单一靶点设定阳性判读阈值,联合靶点时,任一靶点阳性即样本综合判读为阳性;所有检测靶点均为阴性时,样本综合判读为阴性。为平衡灵敏度和特异性,对各个靶点的阳性判读区间进行了调整,具体判读为:
表4.综合判读时,各靶点阳性区间
Gene | 阳性判读区间 |
FOXD3 | Ct≤25.2 |
FOXI2 | Ct≤22.6 |
RASSF1A | Ct≤23.4 |
SHOX2 | Ct≤24.8 |
SOX17 | Ct≤24.2 |
以此方式发现组合上述所有基因,可使肺癌检测灵敏度达到80.0%,健康对照特异性为89.2%。
综上所述,针对目前肺癌检测产品的技术限制,本发明提供了一种可用于肺癌诊断的标志物组合,用于肺癌的早期筛查具有更高的准确度、灵敏度和特异性,能够实现肺癌实时监测,有效延长患者生存期。本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 四川大学华西医院
上海鹍远生物科技股份有限公司
成都华西精准医学产业技术研究院有限公司
江苏鹍远生物技术有限公司
<120> 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggagttta gagagttag 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctacaaaact cccctcac 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgttttgaa ttgttgggg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaacaacga actaacatct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgttaacgc gttgcgtatc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaccccgcga actaaaaacg a 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttttttgga tagttaggta attt 24
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccctttaaac aaccaacata acgtaa 26
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagttgagta agatgttgg 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaaactcgc aaaaaacaat tt 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttgcggacgg cggaatcga 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttcgtgggg tacgcgcga 19
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accaactacc gtataaaatt acacgcgata 30
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctcgtacgac cccgatcg 18
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgagtcgta gatttaggcg gtcgg 25
Claims (12)
1.一种用于肺癌诊断的基因甲基化标志物,其特征在于,其包含FOXD3基因、FOXI2基因、RASSF1A基因、SHOX2基因和SOX17基因的组合。
2.如权利要求1所述的甲基化标志物,其特征在于,其包含所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛、FOXI2基因的CpG岛或FOXI2基因的启动子的CpG岛、RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛、SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛,以及SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的组合。
3.如权利要求1所述的甲基化标志物,其特征在于,
所述FOXD3基因的CpG岛或FOXD3基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr1:63785908-63785999的序列,或其活性片段;
所述FOXI2基因的CpG岛或FOXI2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr10:129534759-129534851的序列,或其活性片段;
所述RASSF1A基因的CpG岛或RASSF1A基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:50378061-50378154的序列,或其活性片段;
所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339-157821429的序列,或其活性片段;
所述SOX17基因的CpG岛或SOX17基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr8:55370987-55371098的序列,或其活性片段。
4.用于检测如权利要求1~3任一项所述的甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,通过PCR扩增反应检测各标志物基因;
设定每个基因的Ct阳性判读区间,当任一基因阳性即将待测样本判读为阳性;所有基因均为阴性时,将待测样本判读为阴性;
其中,所述各基因的阳性判读区间为,FOXD3基因:Ct≤26.02,FOXI2基因:Ct≤23.26,RASSF1A基因:Ct≤23.43,SHOX2基因:Ct≤28.18,和SOX17基因:Ct≤28.60。
6.一种肺癌诊断用检测物,其特征在于,其包含如权利要求1~3任一项所述的甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
7.如权利要求6所述的检测物,其特征在于,
所述特异性检测引物包括以下引物对A~E至少任一:
针对FOXD3基因的甲基化区域的引物对A,其序列如SEQ ID NO:1~2所示;
针对FOXI2基因的甲基化区域的引物对B,其序列如SEQ ID NO:3~4所示;
针对RASSF1A基因的甲基化区域的引物对C,其序列如SEQ ID NO:5~6所示;
针对SHOX2基因的甲基化区域的引物对D,其序列如SEQ ID NO:7~8所示;
针对SOX17基因的甲基化区域的引物对E,其序列如SEQ ID NO:9~10所示;
所述特异性检测探针包括以下探针A~E至少任一:
针对FOXD3基因的甲基化区域的探针A,其序列如SEQ ID NO:11所示;
针对FOXI2基因的甲基化区域的探针B,其序列如SEQ ID NO:12所示;
针对RASSF1A基因的甲基化区域的探针C,其序列如SEQ ID NO:13所示;
针对SHOX2基因的甲基化区域的探针D,其序列如SEQ ID NO:14所示;
针对SOX17基因的甲基化区域的探针E,其序列如SEQ ID NO:15所示。
8.如权利要求6或7所述的检测物在制备肺癌诊断产品中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述诊断包括肺癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估。
10.如权利要求8所述的应用,其特征在于,用于肺癌诊断的样本来源于外周或瘤内血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰、新鲜组织、新鲜组织或粪类物质的提取物、石蜡切片、穿刺样本。
11.一种肺癌诊断产品,其特征在于,所述产品包括如权利要求6或7所述的检测物。
12.如权利要求11所述的肺癌诊断产品,其特征在于,所述肺癌诊断产品为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列之任一;和/或,
所述肺癌诊断产品为试剂盒,其包含如权利要求6或7所述的检测物,用于对甲基化区域进行扩增;对甲基化区域进行处理的试剂;以及用于对扩增产物进行测序的引物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210112040.XA CN116555422A (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210112040.XA CN116555422A (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116555422A true CN116555422A (zh) | 2023-08-08 |
Family
ID=87490375
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210112040.XA Pending CN116555422A (zh) | 2022-01-27 | 2022-01-27 | 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116555422A (zh) |
-
2022
- 2022-01-27 CN CN202210112040.XA patent/CN116555422A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6369857B2 (ja) | 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
JP6269494B2 (ja) | 子宮体癌に関する情報の取得方法、ならびに子宮体癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
JP6269492B2 (ja) | 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
CN111676292A (zh) | 一种用于检测肝癌的组合物,试剂盒及其用途 | |
JP6381020B2 (ja) | 大腸癌に関する情報の取得方法、ならびに大腸癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット | |
CN115341031A (zh) | 一种泛癌甲基化生物标志物的筛选方法、生物标志物及应用 | |
CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
KR20210096509A (ko) | 특정 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 방광암 진단용 조성물 및 이의 용도 | |
CN113999901A (zh) | 心肌特异性甲基化标记物 | |
JP2023500923A (ja) | 大腸癌検出方法 | |
CN116555423A (zh) | 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用 | |
EP3625370A1 (en) | Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
US11542559B2 (en) | Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis | |
CN116555422A (zh) | 肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用 | |
CN117106899A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的引物对、引物探针组合、试剂盒及应用 | |
CN117778572A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌的核酸组合、检测试剂盒及应用 | |
CN117778573A (zh) | 一种用于检测甲状腺癌生物标志物的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN117568480A (zh) | 一种用于乳腺癌或癌前病变检测的试剂、试剂盒及应用 | |
CN117327794A (zh) | 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用 | |
CN117535415A (zh) | 一种用于乳腺癌检测的核酸组合物和试剂盒 | |
CN117402973A (zh) | 一种用于检测乳腺癌的核酸试剂、试剂盒及应用 | |
CN118064592A (zh) | 用于检测前列腺癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN116751863A (zh) | 一种用于检测咽部恶性肿瘤分子标志物甲基化水平的试剂盒及应用 | |
CN118308481A (zh) | 用于诊断卵巢癌的生物标志物、引物对、核酸产品、试剂盒及应用 | |
CN116356027A (zh) | 一种用于食管鳞癌或癌前病变检测的试剂、试剂盒及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |