CN116555423A - 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用 - Google Patents

肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一组生物标志物组合、检测产品及其应用。本发明提供的生物标志物包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合，所述标志物组合可用于肺癌诊断。本发明还公开了基于所述标志物组合设计的检测引物和探针，所述检测引物的序列如SEQ ID NO:1～12所示，所述检测探针的序列如SEQ ID NO:13～18所示。采用本发明所述的生物标志物和检测产品对相关基因甲基化水平的检测更加准确，敏感性和特异性高，具有广泛应用前景。

Description

肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用。
背景技术
随着生物技术的不断发展，利用基因检测来诊断疾病的方法受到了广泛的瞩目。其中DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分。甲基化状态的改变是引起癌症的一个重要因素，这种变化包括基因组整体甲基化程度低和CpG岛局部甲基化程度的异常升高，从而导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达等。
近年来肺癌表观遗传学研究进展对肺癌的早期诊断和治疗具有深远的意义。有证据表明抑癌基因启动子CpG岛高度甲基化是基因失活的一个重要机制，不同基因的转录失活将影响细胞周期、DNA修复、细胞凋亡等，与癌症的发生发展有着密切联系。临床认为，对肺癌患者的组织细胞和体液(如痰液、血清及血浆等)进行甲基化基因标志物的检测，是一项有效的肺癌辅助检测方法，具有提高肺癌检出率的价值。目前已报道的肺癌相关的甲基化基因标志物尚具敏感度低和特异性低的缺陷，使之应用于临床检测存在一定的局限。甲基化基因标志物针对某一或某些癌症的敏感度高，表示相应癌症的漏诊率低；类似地，其特异性高则表示相应癌症的误诊率低。甲基化基因标志物检测的敏感度、特异性是衡量其参考价值大小的两项重要指标。
因此，对肺癌甲基化基因标志物进行进一步深入研究，开发高敏感度、高特异性的与肺癌相关的甲基化基因及其组合的检测试剂，从而为肺癌诊断的准确性提供更有效的手段，是当前甲基化基因标志物检测技术中亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种肺癌甲基化标志物组合，并针对所述肺癌甲基化标志物的特定区域进行特异性的检测引物及探针设计，同时建立相应的检测体系，实现基于所述肺癌甲基化标志物组合用于肺癌样本高准确性、高灵敏度和高特异性等的检测目的，为肺癌诊断提供有价值的参考信息。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用。
本发明的目的之一是提供一种肺癌诊断用检测物，其包含甲基化标志物组合的特异性检测引物和/或特异性检测探针，所述标志物组合为包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合。
本发明的另一目的是提供如上所述的检测物在制备肺癌诊断产品中的应用。
本发明的另一目的是提供一种肺癌诊断产品，所述产品包括如上所述的检测物。
在一优选实施方式中，所述肺癌诊断产品为试剂盒，其包含如上所述的检测物。
本发明的另一目的是提供一种肺癌甲基化标志物组合，其包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合。
本发明的另一目的是提供如上所述的基因甲基化标志物或用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。
如上所述，本发明肺癌甲基化标志物、检测试剂盒及其应用，具有以下有益效果：
本发明提供的肺癌甲基化标志物组合及检测产品，具有的优异性能，相对于现有技术，检测性能大幅提升，具有检测准确度、灵敏度和特异性高的特点，且具有易开展，便于临床推广，可用于液体活检，成本低，能够降低液体患者的就医成本等优势。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明的目的是提供更高效的肺部肿瘤相关甲基化标志物，提高肺部肿瘤早筛早诊效率，解决肺癌早诊率低，临床治疗负担重等问题。提供一组有效的肺部肿瘤甲基化标志物，并提供高效的标志物组合。
本发明利用荧光PCR检测技术，检测白膜层(其中大部分为白细胞)、肺癌组织相关标志物甲基化的情况。初步确认该标志物用于血液检测肺癌的潜能。理想的肺癌甲基化检测标志物应该具备以下特征：
(1)白膜层DNA甲基化水平低；
(2)肺癌组织DNA甲基化水平高。
甲基化标志物检测采用甲基化特异PCR(MSP)来进行，MSP的基本原理是在检测中，只有甲基化的序列模板产生扩增信号，而非甲基化的序列模板不产生扩增信号。该方法可通过引物或者探针设计甲基化特异序列来实现，也可以同时设计甲基化特异的引物、探针对来实现。其主要步骤包括：
1)根据标志物序列，在适合进行MSP的检测区段(通常为CpG富集区域)，设计检测引物和探针；
2)进行白膜层和肺癌组织样本的核酸提取；
3)对核酸进行亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶维持序列不变；
4)进行荧光PCR检测。
经白膜层和组织样本检测，满足上述特征的标志物，证明其存在通过血液来检测肺癌的潜能。然后在血浆样本中，对这些标志物进行验证，检测样本包括对照组、肺癌组以及肺部结节、肺部炎症干扰人群等，以分析这些标志物的参考水平及标志物组合性能。
因单个样本血浆游离DNA有限，故进行荧光PCR检测时，可先对靶点进行预扩增，以使最少量的DNA能够检测尽可能多的甲基化位点。其主要步骤包括：
1)血浆样本的核酸提取；
2)对核酸进行亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶维持序列不变；
3)进行靶点的预扩增及稀释；
4)进行荧光PCR检测。
本发明人通过大量探索性研究，提供了一组用于诊断肺癌的生物标志物，其包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合。所述生物标志物具有优良的检测敏感性和特异性，能解决当前肺癌(包括肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC))诊断准确性、灵敏度、特异性不高等的问题，在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一组用于诊断肺癌的生物标志物，其包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合。具体包含所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛、PTGER4基因的CpG岛或PTGER4基因的启动子的CpG岛、NXPH1基因的CpG岛或NXPH1基因的启动子的CpG岛、HOXD9基因的CpG岛或HOXD9基因的启动子的CpG岛，PCDH8基因的CpG岛或PCDH8基因的启动子的CpG岛，以及TBR1基因的CpG岛或TBR1基因的启动子的CpG岛的组合。通过对所述生物标志物的筛查，可以低成本、高深度、更加准确地诊断肺癌和/或评估个体是否易发肺癌。
在一些优选实施方式中，所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339-157821429的序列，或其活性片段；
所述PTGER4基因的CpG岛或PTGER4基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr5:40681083-40681165的序列，或其活性片段；
所述NXPH1基因的CpG岛或NXPH1基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr7:8482292-8482408的序列，或其活性片段；
所述HOXD9基因的CpG岛或HOXD9基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr2:176987563-176987664的序列，或其活性片段；
所述PCDH8基因的CpG岛或PCDH8基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr13:53421168-53421239的序列，或其活性片段；
所述TBR1基因的CpG岛或TBR1基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr2:162280418-162280523的序列，或其活性片段。
本发明中，所述活性片段通常指通过该物质的检测可以发现其对应的基因中相关甲基化水平的物质，具体可以是例如，DNA或其mRNA或保有其功能的同源物等，活性片段的选择方法对于本领域技术人员来说应该是已知的。所述基因的同源物可以是与所述基因具有80％(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)以上同源性的序列。
在另一些优选实施方式中，所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339-157821429的序列；
所述PTGER4基因的CpG岛或PTGER4基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr5:40681083-40681165的序列；
所述NXPH1基因的CpG岛或NXPH1基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr7:8482292-8482408的序列；
所述HOXD9基因的CpG岛或HOXD9基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr2:176987563-176987664的序列；
所述PCDH8基因的CpG岛或PCDH8基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr13:53421168-53421239的序列；
所述TBR1基因的CpG岛或TBR1基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr2:162280418-162280523的序列。
本发明人发现，SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化与肺癌的发生发展存在密切关系，发生肺癌的患者，极大概率上会同时存在上述甲基化。
本发明还提供了用于如上所述的基因甲基化标志物在制备肺癌诊断产品中的用途。所述诊断包括肺癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估等。所述肺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式，包括但不限于是引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
本发明还提供了用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质在制备肺癌诊断产品中的用途。所述诊断包括肺癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估等。所述肺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式，包括但不限于是引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
本发明中，所述肺癌的早期鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有肺癌或者更加有可能患有肺癌。例如，当个体的基因组中同时存在SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化时，则认为个体患有肺癌或者更加有可能患有肺癌。再例如，当个体的基因组中SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化至少一个未出现时，则认为个体未患有肺癌或者更加有可能未患有肺癌。由于肺癌的早期诊断通常有较大难度，所以引入上述筛选以后可以更加准确地对个体进行肺癌的诊断。
本发明中，所述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶。例如，当个体的基因组中同时存在SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化时，则认为个体残留微小病灶的可能性较大。再例如，当个体的基因组中SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化至少一个未出现时，则认为个体残留微小病灶的可能性不大。
本发明中，所述肺癌复发及预后的辅助判断是指肺癌复发的风险和预后情况预测，具体可以是用于确认个体肺癌复发的可能性或恶化倾向，可用于指导临床诊疗。例如，当个体的基因组中同时存在SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化时，则认为个体肺癌复发的可能性更大或者肺癌更加有可能恶化。再例如，当个体的基因组中SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化至少一个未出现时，则认为个体复发的可能性不大或肺癌恶化的可能性不大。
本发明中，所述的药物疗效评具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对个体有效。例如，当个体的基因组中同时存在SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化时，则认为某种药物或治疗手段对个体效果不佳。再例如，当个体的基因组中SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化，PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化，NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化，HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化，PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化，以及TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化至少一个未出现时，则认为某种药物或治疗手段对个体有效。
本发明中，所述物质具体为用于检测外周或瘤内血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰、新鲜组织、新鲜组织或粪类物质的提取物、石蜡切片、粗针穿刺样本等样品中所述基因或其活性片段中甲基化水平的物质。本领域技术人员可采用合适的方法，检测上述样品中所存在的甲基化，例如，具体可采用的方法可以是Sanger测序、全基因组测序、全外显子测序、靶向测序等方法。用于检测基因或其活性片段中甲基化的物质通常与检测方法是相对应的，
例如，所述用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针，再例如，所述用于检测PTGER4基因chr5:40681083-40681165区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测PTGER4基因chr5:40681083-40681165区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针，再例如，所述用于检测NXPH1基因chr7:8482292-8482408区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测NXPH1基因chr7:8482292-8482408区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针，再例如，所述用于检测HOXD9基因chr2:176987563-176987664区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测HOXD9基因chr2:176987563-176987664区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针；再例如，所述用于检测PCDH8基因chr13:53421168-53421239区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测PCDH8基因chr13:53421168-53421239区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针；再例如，所述用于检测TBR1基因162280418-162280523区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测TBR1基因162280418-162280523区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针；再例如，所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸，从而可以与靶标序列杂交，实现对靶标上是否存在特定甲基化进行检测。用于检测基因或其活性片段中甲基化水平的物质还可以包括其他各种相关的检测试剂。
在一些优选实施方式中，所述用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质包括用于检测SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化的物质、用于检测PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化的物质、用于检测NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化的物质、用于检测HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化的物质、用于检测PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化的物质、以及用于检测TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化的物质的组合。
在一些优选实施方式中，所述用于检测如上所述的基因甲基化标志物的物质包括检测如上所述的基因甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
所述特异性检测引物包括以下引物对A～F至少任一：
针对SHOX2基因的甲基化区域的引物对A，其序列如SEQ ID NO：1～2所示；
针对PTGER4基因的甲基化区域的引物对B，其序列如SEQ ID NO：3～4所示；
针对NXPH1基因的甲基化区域的引物对C，其序列如SEQ ID NO：5～6所示；
针对HOXD9基因的甲基化区域的引物对D，其序列如SEQ ID NO：7～8所示；
针对PCDH8基因的甲基化区域的引物对E，其序列如SEQ ID NO：9～10所示；
针对TBR1基因的甲基化区域的引物对F，其序列如SEQ ID NO：11～12所示；
所述特异性检测探针包括以下探针A～F至少任一：
针对SHOX2基因的甲基化区域的探针A，其序列如SEQ ID NO：13所示；
针对PTGER4基因的甲基化区域的探针B，其序列如SEQ ID NO：14所示；
针对NXPH1基因的甲基化区域的探针C，其序列如SEQ ID NO：15所示；
针对HOXD9基因的甲基化区域的探针D，其序列如SEQ ID NO：16所示；
针对PCDH8基因的甲基化区域的探针E，其序列如SEQ ID NO：17所示；
针对TBR1基因的甲基化区域的探针F，其序列如SEQ ID NO：18所示。
本发明还提供了一种肺癌检测用检测物，其包含如上所述的基因甲基化标志物的特异性检测引物和/或特异性检测探针。
在一些优选实施方式中，
所述特异性检测引物包括以下引物对A～F至少任一：
针对SHOX2基因的甲基化区域的引物对A，其序列如SEQ ID NO：1～2所示；
针对PTGER4基因的甲基化区域的引物对B，其序列如SEQ ID NO：3～4所示；
针对NXPH1基因的甲基化区域的引物对C，其序列如SEQ ID NO：5～6所示；
针对HOXD9基因的甲基化区域的引物对D，其序列如SEQ ID NO：7～8所示；
针对PCDH8基因的甲基化区域的引物对E，其序列如SEQ ID NO：9～10所示；
针对TBR1基因的甲基化区域的引物对F，其序列如SEQ ID NO：11～12所示；
所述特异性检测探针包括以下探针A～F至少任一：
针对SHOX2基因的甲基化区域的探针A，其序列如SEQ ID NO：13所示；
针对PTGER4基因的甲基化区域的探针B，其序列如SEQ ID NO：14所示；
针对NXPH1基因的甲基化区域的探针C，其序列如SEQ ID NO：15所示；
针对HOXD9基因的甲基化区域的探针D，其序列如SEQ ID NO：16所示；
针对PCDH8基因的甲基化区域的探针E，其序列如SEQ ID NO：17所示；
针对TBR1基因的甲基化区域的探针F，其序列如SEQ ID NO：18所示。
本发明还提供了一种肺癌诊断产品，所述产品包括如上所述的检测物。
本发明中，所述肺癌诊断产品可以是任意合适的产品形式，包括但不限于是试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
当所述肺癌诊断产品为试剂盒时，其包含如上所述的检测物，其用于对甲基化区域进行扩增，即包括用于检测SHOX2基因的chr3:157821339-157821429区域甲基化的物质、用于检测PTGER4基因的chr5:40681083-40681165区域甲基化的物质、用于检测NXPH1基因的chr7:8482292-8482408区域甲基化的物质、用于检测HOXD9基因的chr2:176987563-176987664区域甲基化的物质、用于检测PCDH8基因的chr13:53421168-53421239区域甲基化的物质和用于检测TBR1基因的chr2:162280418-162280523区域甲基化的物质；对甲基化区域进行处理的试剂；以及用于对扩增产物进行测序的引物。
本发明所提供的检测试剂盒中，用于检测基因或其活性片段中甲基化的物质通常与检测方法是相对应的，例如，所述用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测SHOX2基因chr3:157821339-157821429区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针，再例如，所述用于检测PTGER4基因chr5:40681083-40681165区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测PTGER4基因chr5:40681083-40681165区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针，再例如，所述用于检测NXPH1基因chr7:8482292-8482408区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测NXPH1基因chr7:8482292-8482408区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针，再例如，所述用于检测HOXD9基因chr2:176987563-176987664区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测HOXD9基因chr2:176987563-176987664区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针；再例如，所述用于检测PCDH8基因chr13:53421168-53421239区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测PCDH8基因chr13:53421168-53421239区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针；再例如，所述用于检测TBR1基因162280418-162280523区域或其活性片段中甲基化的物质包括用于检测TBR1基因162280418-162280523区域或其活性片段中甲基化的特异性引物和/探针；再例如，所述特异性探针优选包括至少部分与靶标序列互补的分离的多核苷酸，从而可以与靶标序列杂交，实现对靶标上是否存在特定甲基化进行检测。
可选的，所述试剂盒还可以包括其他各种相关的检测试剂，包括但不限于是核酸提取试剂，用于扩增靶标的试剂，重亚硫酸盐转化试剂，用于评估靶标的甲基化状态的试剂，内参基因，阴性对照和阳性对照等中的一种或几种。
其中，用于扩增靶标的试剂包含酶，例如，用于多核苷酸扩增反应的酶，所述多核苷酸扩增反应选自下组：聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、引物延伸、滚环扩增(RCA)、自主序列复制(3SR)和环介导等温扩增(LAMP)。
其中，用于评估靶标的甲基化状态的试剂是要用于多核苷酸甲基化检测方法的试剂，所述检测方法选自下组：质谱法、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP或mDIP)、焦磷酸测序法、通过连接介导的PCR测定HpaII小片段富集(HELP测定法)、地标基因组扫描(RLGS)、DNA腺嘌呤甲基转移酶活性的分子断裂光测定法、甲基敏感的Southern印迹和高分辨率溶解(HRM)分析等。
在一实施方式中，用于评估靶标的甲基化状态的试剂是化学试剂，例如亚硫酸氢盐或亚硫酸氢钠。
在一实施方式中，用于评估靶标的甲基化状态的试剂是生物试剂，例如多肽或酶。在另一实施方式中，其中所述酶是多核苷酸聚合酶；所述多核苷酸聚合酶被配置为用于PCR；所述多核苷酸聚合酶可以是DNA聚合酶，例如不具有3′至5′核酸外切酶活性的DNA聚合酶。
在一实施方式中，所述内参基因为ACTB。
本发明提供的试剂盒还包含用于一个或多个组分的单独容器(例如小瓶)和/或用于使用所述试剂盒或系统的说明书。
本发明还提供了如上所述的试剂盒的用途，用于肺癌的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。
本发明所述的引物、探针、试剂盒、检测体系、系统或制品等可以被配置用于任何适当的用途或目的。例如，本发明所述的引物、探针、试剂盒、检测体系、系统或制品等可以被配置成用于评估受试者中的肺癌的存在，或用于受试者的肺癌分析或概况分析。
本发明人通过大量实验研究，通过高通量筛选方法，提供了一组包括SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的生物标志物。本发明所提供的生物标志物可以避免全基因组测序，大大节约需要的测序数据量。针对筛选出的生物标志物甲基化区域进行检测引物和探针设计，通过一次性检测肺癌相关的主要致病基因的甲基化水平，具有优良的检测敏感性和特异性，操作简单、快速，且成本低、深度高、对相关甲基化的检测更加准确。基于所述生物标志物，可以进一步开发相应的检测试剂盒，用于肺癌的临床分子诊断，可以潜在应用于肺癌的早期鉴别诊断(早筛早诊)、微小病灶残留评估(MRD)及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等，还可通过生物信息学等技术手段进一步探究肺癌相关基因的功能及内在机制，为肺癌的早期发现、早期预防、早期诊断、早期治疗、未来相关的靶向治疗提供理论依据。此外，在靶点组合分析时，也可引入机器学习的数学模型，如线性回归、支持向量回归、脊回归、随机森林等等。
本发明针对筛选获得的特定肺癌甲基化标志物区域设计特定的引物和探针，构建检测体系，并针对收集的肺癌样本和正常样本，检测筛选获得的肺癌标志物的性能。检测发现，本发明的生物标志物能够高准确性、高特异性地检测肺癌，提示所述生物标志物组合具备作为无创型肺癌诊断及预后标志物的潜能。
本发明还提供了一种检测体系，所述检测体系包括：10μL甲基化试剂处理后得到的转化的DNA，2.5μL包含检测区域的引物和探针预混液；12.5μL PCR试剂；其中所述引物和探针预混液中，引物序列如SEQ ID NO:1～12所示，每条引物的终浓度为500nM，探针序列如SEQ ID NO:13～18所示，每条探针的终浓度为200nM。
本发明还提供了一种检测体系，所述检测体系包括：10μL亚硫酸氢盐处理后得到的转化的DNA，2.5μL包含检测区域的引物和探针预混液；12.5μL PCR试剂(Probe qPCR Master Mix(NEB)；其中所述引物和探针预混液中，引物序列如SEQ ID NO:1～12所示，每条引物的终浓度为500nM，探针序列如SEQ ID NO:13～18所示，每条探针的终浓度为200nM。
本发明还提供了一种体外检测方法，所述方法包括收集待测样品；提取纯化所述样品中的DNA；针对纯化的DNA样品用重亚硫酸盐转化；利用引物及探针组合物对样品进行扩增；对扩增结果进行分析，确定样本的甲基化水平；基于所述样本的甲基化水平判读所述个体的患病情况。
在一实施方式中，所述个体可以是疑似患有肺癌的对象。
在一实施方式中，所述PCR扩增采用的引物如SEQ ID NO:1～12所示。
在一实施方式中，所述探针包括靶向肺癌特异性区域的如SEQ ID NO:13～18所示的探针。
本发明中，通过PCR扩增反应检测各标志物基因；
设定每个基因的Ct阳性判读区间，当任一基因阳性即将待测样本判读为阳性；所有基因均为阴性时，将待测样本判读为阴性；
其中，所述各基因的阳性判读区间为，SHOX2基因：Ct≤28.12，PTGER4基因：Ct≤25.58，NXPH1基因：Ct≤23.94，HOXD9基因：Ct≤24.59，PCDH8基因：Ct≤24.08和TBR1基因：Ct≤23.42。
如本文所用，DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种相对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肺癌的发生关系密切。
在一些实施方案中，术语“甲基化状态(methylationstate)”或“甲基化状态(methylationstatus)”是指在DNA序列内的一个或多个CpG二核苷酸处存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mC”或“5-mCyt”)。DNA序列内一个或多个特定CpG甲基化位点(每个都有两个CpG二核苷酸序列)处的甲基化状态包括“未甲基化”、“完全甲基化”和“半甲基化”。
如本文所用，术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本发明中可互换地使用，并且表示期望对其进行诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，特别是人。“受试者”可以是对之施用或施加所提供的组合物、方法、试剂盒、装置和系统的生物体或所述生物体的一部分或组分。例如，所述受试者可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。
如本文所用，术语“样品”是指可能包含需要进行分析的靶分子的任何物质，包括生物样品。
如本文所用，“引物”可以是天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体后能够充当核酸合成的起始点并从其3'端沿模板延伸，从而形成延伸的双链体。在延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。引物通常通过聚合酶如DNA聚合酶延伸。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1甲基化生物标志物组合、特异引物和探针设计
从基因注释数据库(NCBI、Ensemble、UCSC等)中导出基因注释区段及其上下游5kb的序列，挑选其中CpG富集区域进行引物探针设计。将CpG富集区域序列(或其互补序列)进行手工或软件辅助转化为模拟亚硫酸氢盐处理后序列，根据甲基化特异的PCR引物、探针设计原则，其中CpG的C认为存在甲基化修饰，非CpG的C认为不存在甲基化修饰。得到模拟亚硫酸氢盐处理序列后，可用常规引物、探针设计手段进行设计，并进行合成。
本实施例中，所述生物标志物组合如表1所示，包括基因名称、基因注释位置、PCR检测区段。针对所述生物标志物组合设计的引物和探针序列如表2所示。
表1.本发明涉及的基因名称、基因注释位置、PCR检测区段
Gene Gene Hg19 Pos. PCR region
SHOX2 chr3:157814948-157824292 chr3:157821339-157821429
PTGER4 chr5:40679600-40693837 chr5:40681083-40681165
NXPH1 chr7:8473585-8792593 chr7:8482292-8482408
HOXD9 chr2:176987088-176989853 chr2:176987563-176987664
PCDH8 chr13:53418109-53422775 chr13:53421168-53421239
TBR1 chr2:162272605-162282381 chr2:162280418-162280523
表2.本发明涉及的基因名称、引物和探针序列
实施例2用于血浆样本肺癌标志物的检测性能评估
选取90个肺部未见异常健康对照血浆样本、95个肺癌患者术前血浆样本。
使用商业化Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit抽提上述血浆样本中的细胞外游离DNA。使用商业化亚硫酸氢盐转化试剂MethylCodeTM BisulfiteConversion Kit对抽提出的细胞外游离DNA进行亚硫酸盐转化处理，得到转化后的DNA。
可选地，将上述转化后的DNA用于预扩增，用含有表2所示的靶点引物和内参(ACTB)引物对的预混液(引物池)，以转化后的DNA为模板，进行PCR扩增，其中每条引物的终浓度为100nM。
PCR反应体系包含：10μL亚硫酸氢盐处理后得到的转化的DNA，2.5μL包含上述引物的预混液；12.5μL PCR试剂(Probe qPCR Master Mix(NEB)。
PCR反应条件如下：95℃5分钟；95℃30秒，56℃60秒，进行15个循环。
将获得的预扩增产物稀释10倍后用于荧光PCR检测。使用如表2所示的引物和探针序列，并且同时对内参基因ACTB进行检测(作为对照)。
引物和探针预混液中，引物终浓度为500nM，探针终浓度为200nM。
PCR反应体系包含：10μL预扩增稀释产物，包含检测位点的引物和探针预混液2.5μL；12.5μL PCR试剂(Probe qPCR Master Mix(NEB)。
PCR反应条件如下：95℃5分钟；95℃15秒，56℃40秒(采集荧光)，50个循环。不同基因探针设计不同荧光修饰，针对不同基因探针修饰荧光，选择相应检测荧光通道。未检测到扩增信号的靶点Ct值被设定为50。Ct值是指PCR反应中荧光信号达到所设定的阈值时的循环数。
将各靶点的特异性统一要求约90％时，各靶点的检测灵敏性和特异性统计数据如下表5。
表3.各个靶点在约90％特异性时，检测性能统计
基因 灵敏度 特异性 阳性判读区间
SHOX2 71.58％ 90.00％ Ct≤28.12
PTGER4 52.63％ 88.89％ Ct≤25.58
NXPH1 68.42％ 91.11％ Ct≤23.94
HOXD9 65.26％ 90.00％ Ct≤24.59
PCDH8 62.11％ 88.89％ Ct≤24.08
TBR1 66.32％ 90.00％ Ct≤23.42
在对靶点进行组合分析时，数据分析可采用对单一靶点设定阳性判读阈值，联合靶点时，任一靶点阳性即样本综合判读为阳性；所有检测靶点均为阴性时，样本综合判读为阴性。为平衡灵敏度和特异性，对各个靶点的阳性判读区间进行了调整，具体判读为：
表4.综合判读时，各靶点阳性区间
基因 阳性判读区间
SHOX2 Ct≤25.0
PTGER4 Ct≤24.1
NXPH1 Ct≤23.1
HOXD9 Ct≤23.4
PCDH8 Ct≤23.2
TBR1 Ct≤22.1
联合所有检测靶点时，可使肺癌检测灵敏性达到81.05％，健康对照特异性为88.89％。
综上所述，本发明提供的可用于肺癌诊断的甲基化标志物组合，可用于肺癌的早期筛查、预后等，具有更高的准确度、灵敏度和特异性，能够实现肺癌实时监测，有效延长患者生存期。本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 四川大学华西医院
上海鹍远生物科技股份有限公司
成都华西精准医学产业技术研究院有限公司
江苏鹍远生物技术有限公司
<120> 肺癌甲基化标志物组合、检测产品及其应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttttttgga tagttaggta attt 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctttaaac aaccaacata acgtaa 26
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttagttatt attatgttta tttt 24
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaataatcac taaactattc aa 22
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtatttgtg tttttataaa tttgt 25
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
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<400> 8
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<400> 10
caccaacgtc aaattatact 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgagatcgtt cgaggttatt tgcga 25
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tggtcgtcga gcgttcgt 18

Claims (12)

1.一种肺癌诊断用检测物，其特征在于，所述检测物为用于肺癌甲基化标志物组合的特异性检测引物和/或特异性检测探针；所述甲基化标志物组合是包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合。
2.如权利要求1所述的检测物，其特征在于，
所述特异性检测引物包括以下引物对A～F至少任一：
针对SHOX2基因的甲基化区域的引物对A，其序列如SEQ ID NO：1～2所示；
针对PTGER4基因的甲基化区域的引物对B，其序列如SEQ ID NO：3～4所示；
针对NXPH1基因的甲基化区域的引物对C，其序列如SEQ ID NO：5～6所示；
针对HOXD9基因的甲基化区域的引物对D，其序列如SEQ ID NO：7～8所示；
针对PCDH8基因的甲基化区域的引物对E，其序列如SEQ ID NO：9～10所示；
针对TBR1基因的甲基化区域的引物对F，其序列如SEQ ID NO：11～12所示；
所述特异性检测探针包括以下探针A～F至少任一：
针对SHOX2基因的甲基化区域的探针A，其序列如SEQ ID NO：13所示；
针对PTGER4基因的甲基化区域的探针B，其序列如SEQ ID NO：14所示；
针对NXPH1基因的甲基化区域的探针C，其序列如SEQ ID NO：15所示；
针对HOXD9基因的甲基化区域的探针D，其序列如SEQ ID NO：16所示；
针对PCDH8基因的甲基化区域的探针E，其序列如SEQ ID NO：17所示；
针对TBR1基因的甲基化区域的探针F，其序列如SEQ ID NO：18所示。
3.如权利要求1或2所述的检测物在制备肺癌诊断产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述诊断包括肺癌的早期鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、肺癌复发及预后的辅助判断、药物疗效评估。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，用于肺癌诊断的样本来源于外周或瘤内血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰、新鲜组织、新鲜组织或粪类物质的提取物、石蜡切片、穿刺样本。
6.一种肺癌诊断产品，其特征在于，所述产品包括如权利要求1或2所述的检测物。
7.如权利要求6所述的肺癌诊断产品，其特征在于，所述肺癌诊断产品为试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列之任一；和/或，
所述肺癌诊断产品为试剂盒，其包含如权利要求1或2所述的检测物，用于对甲基化区域进行扩增；对甲基化区域进行处理的试剂；以及用于对扩增产物进行测序的引物。
8.一种用于肺癌诊断的DNA甲基化标志物组合，其特征在于，其包含SHOX2基因、PTGER4基因、NXPH1基因、HOXD9基因、PCDH8基因和TBR1基因的组合。
9.如权利要求8所述的甲基化标志物组合，其特征在于，其包含所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛、PTGER4基因的CpG岛或PTGER4基因的启动子的CpG岛、NXPH1基因的CpG岛或NXPH1基因的启动子的CpG岛、HOXD9基因的CpG岛或HOXD9基因的启动子的CpG岛，PCDH8基因的CpG岛或PCDH8基因的启动子的CpG岛，以及TBR1基因的CpG岛或TBR1基因的启动子的CpG岛的组合。
10.如权利要求9所述的甲基化标志物组合，其特征在于，
所述SHOX2基因的CpG岛或SHOX2基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr3:157821339-157821429的序列，或其活性片段；
所述PTGER4基因的CpG岛或PTGER4基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr5:40681083-40681165的序列，或其活性片段；
所述NXPH1基因的CpG岛或NXPH1基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr7:8482292-8482408的序列，或其活性片段；
所述HOXD9基因的CpG岛或HOXD9基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr2:176987563-176987664的序列，或其活性片段；
所述PCDH8基因的CpG岛或PCDH8基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr13:53421168-53421239的序列，或其活性片段；
所述TBR1基因的CpG岛或TBR1基因的启动子的CpG岛的甲基化区域为chr2:162280418-162280523的序列，或其活性片段。
11.用于检测如权利要求8～10任一项所述的甲基化标志物组合的物质在制备肺癌诊断产品中的应用。
12.如权利要求3～5任一项所述的应用或如权利要求6或7所述的肺癌诊断产品或如权利要求11所述的应用，其特征在于，通过PCR扩增反应检测各标志物基因；
设定每个基因的Ct阳性判读区间，当任一基因阳性即将待测样本判读为阳性；所有基因均为阴性时，将待测样本判读为阴性；
其中，所述各基因的阳性判读区间为，SHOX2基因：Ct≤28.12，PTGER4基因：Ct≤25.58，NXPH1基因：Ct≤23.94，HOXD9基因：Ct≤24.59，PCDH8基因：Ct≤24.08和TBR1基因：Ct≤23.42。
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