CN117327794A - 一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域,更具体地,涉及一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒通过检测样本中基因的目标区域甲基化水平能够有效区分恶性肺结节受试者和良性肺结节受试者,实现低侵袭性、低成本、高灵敏性、高特异性的检测肺结节良恶性。具体地,上述试剂盒检测恶性肺结节血浆样本的总灵敏性可达88.7%,检测良性肺结节血浆样本的特异性可达93.7%,检测准确度高,可有效提高恶性肺结节的检出率,降低假阴性结果的检出,避免良性肺结节的过度诊疗。

Description

一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,更具体地,涉及一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用。
背景技术
低剂量螺旋CT对中国高危人群早期肺癌筛查发现肺结节阳性率高达22.9%,其中肺结节患者中恶性结节比例达6.34%,而早期肺癌(Ⅰa期)手术治疗5年生存率可达到90%以上。因此,肺结节筛查在早期肺癌诊断中具有重要意义。
近年来,随着影像学技术的进步和设备的发展,尤其是CT检查的普及,肺结节的检出率明显上升,肺结节的临床处理与决策逐渐成为困扰临床医生的重要问题。
因此,研究精确且较无创的诊断方法,精准识别良恶性肺结节,减少患者的漏检率,对肺癌的早筛、早诊、早治工作极为关键。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的在于提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒及应用,以改善现有技术对恶性肺结节的检出率低,对于肺结节良恶性检测易出现假阴性/假阳性结果、准确度低等的技术问题。
为实现上述目的,本发明提供了一种试剂在制备肺结节良恶性诊断产品中的应用,所述试剂是检测样本中基因的目标区域甲基化水平的试剂;
以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域包括Chr10:117140125-117140525正链的全长区域或部分区域,和/或Chr4:173509216-173509616负链的全长区域或部分区域,和/或Chr15:89409068-89409468正链的全长区域或部分区域。
优选地,所述诊断包括恶性肺结节的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、恶性肺结节复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测中的一种或多种。
优选地,所述肺结节良恶性诊断产品包括试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列中的至少一种。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂,其为用于检测样本中基因的目标区域甲基化水平的试剂,以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域包括Chr10:117140125-117140525正链的全长区域或部分区域,和/或Chr4:173509216-173509616负链的全长区域或部分区域,和/或Chr15:89409068-89409468正链的全长区域或部分区域。
优选地,所述Chr4:173509216-173509616负链的部分区域包括Chr4:173509393-173509480负链。
优选地,所述试剂包括用于检测所述目标区域甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对;
其中,所述试剂包括用于检测Chr10:117140125-117140525正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对;和/或,
用于检测Chr4:173509393-173509480负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对;和/或,
用于检测Chr15:89409068-89409468正链的甲基化水平的第三甲基化引物对和第三非甲基化引物对。
优选地,所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示;所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示;所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20~21所示;所述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示;所述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示。
优选地,所述试剂包括用于检测所述目标区域甲基化水平的甲基化引物对和探针;
其中,所述试剂包括用于检测Chr10:117140125-117140525正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一探针;和/或,
用于检测Chr4:173509393-173509480负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二探针;和/或,
用于检测Chr15:89409068-89409468正链的甲基化水平的第三甲基化引物对和第三探针。
进一步优选地,所述试剂包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.10~11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.28所示的第一探针;
SEQ ID NO.18~19所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.29所示的第二探针;
SEQ ID NO.22~23所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第三探针。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒,其包括所述试剂。
优选地,所述试剂盒还包括内参基因的上下游引物对及探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,具有以下有益效果:
本发明提供的一种用于检测肺结节良恶性的试剂、试剂盒,通过检测样本中基因的目标区域甲基化水平能够有效区分恶性肺结节受试者和良性肺结节受试者,实现低侵袭性、低成本、高灵敏性、高特异性的检测肺结节良恶性。具体地,上述试剂盒检测恶性肺结节血浆样本的总灵敏性可达88.7%,其中,检测实性结节的灵敏度可达85.7%,检测亚实性结节的灵敏度可达90.6%。此外,上述试剂盒检测良性肺结节血浆样本的特异性可达93.7%,检测准确度高,可有效提高恶性肺结节的检出率,降低假阴性结果的检出,避免良性肺结节的过度诊疗。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语“诊断”是指确定受试者的健康状态,涵盖检测疾病的存在与否、对治疗手段的反应、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。在一些情况下,术语“诊断”指的是作为一个单一因素用于确定、验证或确认患者的临床状态。一些实施例中,“检测”肺结节良恶性是指检测疾病的存在与否,即判断受试者是否患有恶性肺结节。
术语“受试者”是指接受观察、检测或实验的对象。一些实施例中,受试者可以是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类(包括人和非人灵长类)以及啮齿动物(例如,小鼠和大鼠)。一些实施例中,哺乳动物可以是人。
术语“样本”或“样品”包括从任何个体(较佳地为人)或分离的组织、细胞或体液(如血浆)中获得的、适合于DNA甲基化状态检测的物质。例如,所述样本可以包括但不限于:血液样本、组织样本(如石蜡包埋样本)、细胞样本;较佳地,所述样本包括但不限于:血液样本、血浆样本、血清样本,或其组合。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而调控基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应,PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。在本发明公开内容中,术语“引物”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。“引物对”是指上游引物和下游引物组成的组。
术语“甲基化特异性PCR”是目前研究甲基化最敏感的实验技术之一,能发现最低约50pg DNA的甲基化。单链DNA经亚硫酸氢盐转化后,所有未甲基化的胞嘧啶脱氨转变为尿嘧啶,而CpG位点中甲基化的胞嘧啶保持不变,因此分别设计两对针对甲基化和非甲基化序列的引物,通过PCR扩增即可将甲基化与非甲基化的DNA序列区分开来。在本公开内容中,进行实时定量甲基化特异性PCR时加入甲基化引物,若Ct值满足所述要求(例如在血浆样本中Ct≤45),则表明目标序列是甲基化的。
术语“甲基化特异性荧光定量PCR(qMSP)”是将荧光定量PCR技术和甲基化特异性PCR技术相结合的实验技术。该技术基于不同甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后的序列差异来设计合适的引物对,从而将甲基化和未甲基化的序列区分开来,qMSP最终的检测指标为荧光信号,因此,在qMSP反应系统中,除加入甲基化检测引物以外,还需要加入荧光探针或者荧光染料。与传统的甲基化特异性PCR技术相比,qMSP检测DNA甲基化水平的灵敏度和特异性更高,更适合检测癌症早期患者DNA中混合的痕量的发生异常甲基化的DNA片段,且该技术不需要凝胶电泳检测,操作更加简便。
术语“TaqMan探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’-3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
“结节”是一种病因未明的多系统多器官的肉芽肿性疾病,常侵犯肺、双侧肺门淋巴结、眼、皮肤等器官。肺结节的“良性”和“恶性”表示肺结节的性质,肺结节包括实性或部分实性或磨玻璃结节,一些实施例中,肺结节为实性或部分实性。“恶性”肺结节通常指具有癌变。
本发明提供了一种试剂在制备肺结节良恶性诊断产品中的应用,上述试剂是检测样本中基因的目标区域甲基化水平的试剂;
以GRCh38.p14为参考基因组,上述目标区域包括Chr10:117140125-117140525正链的全长区域或部分区域,和/或Chr4:173509216-173509616负链的全长区域或部分区域,和/或Chr15:89409068-89409468正链的全长区域或部分区域。
可以理解的是,在检测上述目标区域的甲基化水平时,可以针对其全长区域进行检测,还可以针对其部分区域进行检测。
一些实施例中,上述Chr4:173509216-173509616负链的部分区域包括Chr4:173509393-173509480负链。
上述诊断包括但不限于恶性肺结节的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、恶性肺结节复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测等。其中,上述恶性肺结节的鉴别诊断具体可以是用于确认个体是否患有恶性肺结节或者更加有可能患有恶性肺结节;上述微小病灶残留评估及动态监测具体可以是用于确认个体中是否残留微小病灶;上述恶性肺结节复发及预后的辅助判断是指恶性肺结节复发的风险和预后情况预测,具体可以是用于确认个体恶性肺结节复发的可能性或恶化倾向,可用于指导临床诊疗;上药物疗效评耐药监测具体可以是用于确认某种药物或治疗手段是否对个体有效。
一些实施例中,上述肺结节良恶性诊断产品可以是任意合适的产品形式,包括但不限于是引物、探针、试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列等。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂,其为用于检测样本中基因的目标区域甲基化水平的试剂,以GRCh38.p14为参考基因组,上述目标区域包括Chr10:117140125-117140525正链的全长区域或部分区域,和/或Chr4:173509216-173509616负链的全长区域或部分区域,和/或Chr15:89409068-89409468正链的全长区域或部分区域。
可以理解的是,在检测上述目标区域的甲基化水平时,可以针对其全长区域进行检测,还可以针对其部分区域进行检测。
一些实施例中,上述Chr4:173509216-173509616负链的部分区域包括Chr4:173509393-173509480负链。
一些实施例中,上述试剂包括用于检测上述目标区域甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对。
较佳实施例中,上述试剂包括用于检测Chr10:117140125-117140525正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对;和/或,
用于检测Chr4:173509393-173509480负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对;和/或,
用于检测Chr15:89409068-89409468正链的甲基化水平的第三甲基化引物对和第三非甲基化引物对。
更佳实施例中,上述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示;上述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示;上述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;上述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.20~21所示;上述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.22~23所示;上述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示。
需要说明的是,若一种引物对与上述第一甲基化引物对、上述第一非甲基化引物对、上述第二甲基化引物对、上述第二非甲基化引物对、上述第三甲基化引物对、上述第三非甲基化引物对所示的核苷酸序列具有至少85%(例如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%等)以上的序列一致性,且该引物对同样具有一定的肺结节良恶性诊断功能(特异性或灵敏性与本申请引物对相比,相当或略有下降或略有提高或大幅提高等),也在本发明保护范围内。
一些实施例中,上述试剂包括用于检测上述目标区域甲基化水平的甲基化引物对和探针。
较佳实施例中,上述试剂包括用于检测Chr10:117140125-117140525正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一探针;和/或,
用于检测Chr4:173509393-173509480负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二探针;和/或,
用于检测Chr15:89409068-89409468正链的甲基化水平的第三甲基化引物对和第三探针。
更佳实施例中,上述试剂包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.10~11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.28所示的第一探针;
SEQ ID NO.18~19所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.29所示的第二探针;
SEQ ID NO.22~23所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第三探针。
在本发明优选实施例中,上述试剂包括SEQ ID NO.10~11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.28所示的第一探针,和/或,SEQ ID NO.22~23所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第三探针。
本发明还提供了一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒,其包括上述试剂。
一些实施例中,上述试剂盒还包括内参基因的上下游引物对及探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
一些实施例中,上述内参基因可以为但不限于ACTB。在一个可选地具体示例中,内参基因ACTB的检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.26~27所示,检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.31。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他内参基因,此时,内参引物对对应设计即可。
一些实施例中,上述第一探针、上述第二探针、上述第三探针、上述内参基因的探针的5’端均含有荧光报告基团,3’端均含有荧光淬灭基团,上述各探针的荧光报告基团独立地选自FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3和CY5中的任意一种;上述各探针的荧光淬灭基团独立地选自TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的任意一种。在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。各探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的举例各自独立地包括但不限于上述所列举。
一些实施例中,上述甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。本发明对甲基化转化试剂无特别限制,现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以,如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或多种。
一些实施例中,上述扩增试剂包括但不限于扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和Mg2+中的一种或多种。一些实施例中,上述阳性对照是指其中包含甲基化的目标区域,用于监测试剂盒中试剂的检测性能。上述阴性对照是指其中不包含甲基化的目标区域,用于监测实验是否受到污染。
一些实施方式中,上述样本包括但不限于分离自受试者的器官、组织、细胞和/或体液的组合物。一些实施方式中,上述器官包括肺;上述组织包括上皮组织、结缔组织、肌肉组织和神经组织;上述细胞包括肺结节细胞;上述体液包括血液、血浆、血清、细胞外液、组织液、淋巴液等,或其组合。
基于本发明公开的内容,本领域技术人员可以采用任何本领域熟知的技术对上述目标区域的甲基化水平进行检测,对肺结节良恶性进行诊断,无论采用何种技术,其都是属于本发明的保护范围。上述检测样本中目标区域的甲基化水平的方法包括但不限于甲基化敏感性随机引物聚合酶链反应(MS AP-PCR)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(qMSP)、甲基化敏感性DNA限制酶分析、基于限制酶的测序、基于限制酶的微阵列分析、联合亚硫酸氢盐限制性分析(COBRA)、甲基化CpG岛扩增(MCA)、甲基化CpG岛扩增和微阵列(MCAM)、通过连接介导PCR进行的HpaII小片段富集(HELP)、亚硫酸氢盐测序(BSP)、亚硫酸氢盐微阵列分析、甲基化特异性焦磷酸测序、HELP测序(HELP-seq)、TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)、Gal水解和连接衔接子依赖性PCR(GLAD-PCR)、甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)或甲基化DNA免疫沉淀-微阵列分析(MeDIP-chip)、使用甲基敏感性限制酶的Southern印迹法和基于甲基化特异性巨磁阻传感器的微阵列分析。
本发明还提供了上述试剂盒在检测恶性肺结节或用在检测患有恶性肺结节的风险提高、疑似患有恶性肺结节或已经患有恶性肺结节的受试者的用途。
本发明还提供了一种通过检测样本中目标区域的甲基化水平进而检测肺结节良恶性的方法,包括如下步骤:提取受试者血浆样本的DNA,采用甲基化转化试剂对其进行转化,然后对转化后的DNA进行纯化,并采用本发明提供的上述试剂盒进行qPCR扩增,通过qMSP法检测样本中目标区域的甲基化水平,进而判断待测血浆样本是否为恶性肺结节。
基于人类疾病诊断的复杂性,本申请上述的试剂盒所获得的结果仅作为肺结节良恶性诊断的中间结果或提示患者患有恶性肺结节的可能性或风险,还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患恶性肺结节的结论。除非另有说明,以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品,或者可以通过本领域已知方法制备。
以下结合具体实施例,对上述技术方案详细说明。
实施例1肺结节样本的收集及处理
石蜡组织的收集:共收集临床确诊为恶性肺结节的癌组织样本48例和癌旁组织样本48例作为训练集样本。
血液样本的收集:1)共收集60例肺结节血液样本,包括30例结节直径为5~10mm的恶性肺结节受试者的血液样本,30例良性肺结节受试者的血液样本。将收集的血液样本室温静置后离心,获得血浆样本和血白细胞样本。将30例恶性肺结节血浆样本、30例良性肺结节血浆样本、30例良性肺结节的血白细胞样本作为测试集样本。2)共收集212例肺结节血液样本,其中病理诊断明确为恶性结节的53例,病理诊断明确为良性结节的159例,将上述样本经编盲处理后作为验证集样本。本研究经本院伦理委员会审核满足展开标准,且患者均签署知情同意书文件。
上述样本的提取、转化及纯化处理过程如下:
1)提取DNA样品
DNA样品为肺部组织样本和血白细胞样本时,采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP304)提取各样本的细胞基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
DNA样品为血液样本时,将收集的血液样本离心,分离血浆层和血细胞,备用。血浆层采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(目录号:DP709)进行血浆cfDNA提取,所用血浆体积为1.5mL,具体操作参见试剂盒说明书,提取完成后,用50μL纯化水进行洗脱。血白细胞使用采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(目录号:DP304)提取各样本的细胞基因组DNA,具体操作参见试剂盒说明书。
2)亚硫酸氢盐转化和纯化处理
将上述提取好的各个样本的基因组DNA分别进行亚硫酸氢盐转化,所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20200843),具体实验操作参见试剂盒说明书,转化完成后,用30μL纯化水进行洗脱,于-20℃保存备用。
实施例2肺结节良恶性差异甲基化的检测区域的确定
以GRCh38.p14为参考基因组,本发明提供了分离的多核苷酸,所述多核苷酸为SEQID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3,所述核苷酸序列中有多处甲基化的位点,发生在胞嘧啶的C-5位,产物称为5-甲基胞嘧啶(5-mC)。根据多核苷酸SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3筛选出能区分肺结节良恶性的差异甲基化区域,选取多个基因甲基化区域构成标记物组合,设计多重荧光PCR体系引物。在组织样本(训练集样本)上初步筛选出特异性和灵敏性均大于等于85%的目标区域。
SEQ ID NO.1的物理位置为Chr10:117140125-117140525正链,DNA序列为(5’-3’):GACGCCGACTGGGCGCCCGGGGAAAGTGCCTTTGATTACGAG CTCTGCTCCGGCGGGTTGGTGAGGCGGGTGGGAGCAGAGACGGGTAAGAGGGGTAAGGGACTTTGCGGCCACCCTGTTCTGAAGATGTAGAGTGGGATTGTGTTAAAATCCGGCGAACTCTCCTGTTACCTCCCGCAACGCTCAAAAGCCCAGACTGGCGCCTTGAGGCACCGAGGGCTTTGCTCCCATGCGGCCAAGCCGTCGGGGGTGCAGCCGCCGGGTCTTGACTCCCACTACCGCGTCGCGGGTGCGGGTCCCTGGGATTCGGGTCCTCCTGATGGGGGTCCCTGCAGCAGATGGGGCATTCACTTCCCTGCAGAGCTCGGCCCGAGGGAGCTCCTGGGCCTCCTTGGGCAGGG。
SEQ ID NO.2的物理位置为Chr4:173509216-173509616负链,DNA序列为(5’-3’):AGGAAGTGAGCTCACTCGGGAAGGAAGGAAATAAATGAGG TTTTTGCCCGGCAGCCGCCAGGCCGAAGCGCACAGCCCTGGGGAGAGGCTGCGAGCGCAGGTCCCGCTACCGCCCTCCAAGGAGGCCGGGGGCAGAGGCCGGCTTTGCAAAGCGCTGCGGCCCCCGCTACCGACACCGTCTCGACCCCGCGCATTCTATCCGTCGTGCTCCCGGGGAGGAAAAGCGCCAGGCTCTACTCGCGAGGTTCAGGCCTCCAGGACAGAGTGGGAGGCTCAGAGCGCGCGAGGGCTTTATTCAGGCAGATGCCGCCTTCAGTCCCCACGCGTCCCATCCTCCCCGCGAGTGAGATTTAGCTTCCGAAGCTCCCGCACGCGCGCGCGCAACCCTCTCTTCTTTCTCC。
SEQ ID NO.3的物理位置为Chr15:89409068-89409468正链,DNA序列为(5’-3’):CGGGATGTTTAGAAAATCGCTGCATATCGGAGTTTCCTAGCA CGTTCCATTTATACTGAACGCAGGCGGCCGCTGAAAATCCAGCCTCGAC TCTTGCTAATGACTGGGTAGGACCCTCGGGGTCCTGCGACGGTGCTGGAGGGTGTTCCCGGCTCCGATGTGGGGAGGCCTGCGCGGGGACTAGGTTCTCGAGAGGCGAGCGGGCGCGCCAGAGAACCCGAGACTGCTGCGGGGCCGGATGCGGGATCCCTGGGCTGCGGTTCTACGCAGAAACGCCAATGGCCATGCCTCCCCAGCTCCTCCCAGCCCCAGTCACTAGGCCGGCGCCTGGCCCGGAGATCCTCCCAGAGCCCTGGCGGTGCCATCATGCCGGAGAAGACAAGCTCGGCCCCGCTGGAATT。
SEQ ID NO.1经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸包括SEQ IDNO.4(完全甲基化序列)和SEQ ID NO.5(未甲基化序列)。
SEQ ID NO.4的序列信息为(5’-3’):
GACGTCGATTGGGCGTTCGGGGAAAGTGTTTTTGATTACGAGTTTTGTTTCGGCGGGTTGGTGAGGCGGGTGGGAGTAGAGACGGGTAAGAGGGGTAAGGGATTTTGCGGTTATTTTGTTTTGAAGATGTAGAGTGGGATTGTGTTAAAATTCGGCGAATTTTTTTGTTATTTTTCGTAACGTTTAAAAGTTTAGATTGGCGTTTTGAGGTATCGAGGGTTTTGTTTTTATGCGGTTAAGTCGTCGGGGGTGTAGTCGTCGGGTTTTGATTTTTATTATCGCGTCGCGGGTGCGGGTTTTTGGGATTCGGGTTTTTTTGATGGGGGTTTTTGTAGTAGATGGGGTATTTATTTTTTTGTAGAGTTCGGTTCGAGGGAGTTTTTGGGTTTTTTTGGGTAGGG。
SEQ ID NO.5的序列信息为(5’-3’):
GATGTTGATTGGGTGTTTGGGGAAAGTGTTTTTGATTATGAGTTTTGTTTTGGTGGGTTGGTGAGGTGGGTGGGAGTAGAGATGGGTAAGAGGGGTAAGGGATTTTGTGGTTATTTTGTTTTGAAGATGTAGAGTGGGATTGTGTTAAAATTTGGTGAATTTTTTTGTTATTTTTTGTAATGTTTAAAAGTTTAGATTGGTGTTTTGAGGTATTGAGGGTTTTGTTTTTATGTGGTTAAGTTGTTGGGGGTGTAGTTGTTGGGTTTTGATTTTTATTATTGTGTTGTGGGTGTGGGTTTTTGGGATTTGGGTTTTTTTGATGGGGGTTTTTGTAGTAGATGGGGTATTTATTTTTTTGTAGAGTTTGGTTTGAGGGAGTTTTTGGGTTTTTTTGGGTAGGG。
SEQ ID NO.2经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸包括SEQ IDNO.6(完全甲基化序列)和SEQ ID NO.7(未甲基化序列)。
SEQ ID NO.6的序列信息为(5’-3’):
AGGAAGTGAGTTTATTCGGGAAGGAAGGAAATAAATGAGGTTTTTGTTCGGTAGTCGTTAGGTCGAAGCGTATAGTTTTGGGGAGAGGTTGCGAGCGTAGGTTTCGTTATCGTTTTTTAAGGAGGTCGGGGGTAGAGGTCGGTTTTGTAAAGCGTTGCGGTTTTCGTTATCGATATCGTTTCGATTTCGCGTATTTTATTCGTCGTGTTTTCGGGGAGGAAAAGCGTTAGGTTTTATTCGCGAGGTTTAGGTTTTTAGGATAGAGTGGGAGGTTTAGAGCGCGCGAGGGTTTTATTTAGGTAGATGTCGTTTTTAGTTTTTACGCGTTTTATTTTTTTCGCGAGTGAGATTTAGTTTTCGAAGTTTTCGTACGCGCGCGCGTAATTTTTTTTTTTTTTTTT。
SEQ ID NO.7的序列信息为(5’-3’):
AGGAAGTGAGTTTATTTGGGAAGGAAGGAAATAAATGAGGTTTTTGTTTGGTAGTTGTTAGGTTGAAGTGTATAGTTTTGGGGAGAGGTTGTGAGTGTAGGTTTTGTTATTGTTTTTTAAGGAGGTTGGGGGTAGAGGTTGGTTTTGTAAAGTGTTGTGGTTTTTGTTATTGATATTGTTTTGATTTTGTGTATTTTATTTGTTGTGTTTTTGGGGAGGAAAAGTGTTAGGTTTTATTTGTGAGGTTTAGGTTTTTAGGATAGAGTGGGAGGTTTAGAGTGTGTGAGGGTTTTATTTAGGTAGATGTTGTTTTTAGTTTTTATGTGTTTTATTTTTTTTGTGAGTGAGATTTAGTTTTTGAAGTTTTTGTATGTGTGTGTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTT。
SEQ ID NO.3经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸包括SEQ IDNO.8(完全甲基化序列)和SEQ ID NO.9(未甲基化序列)。
SEQ ID NO.8的序列信息为(5’-3’):
CGGGATGTTTAGAAAATCGTTGTATATCGGAGTTTTTTAGTACGTTTTATTTATATTGAACGTAGGCGGTCGTTGAAAATTTAGTTTCGATTTTTGTTAATGATTGGGTAGGATTTTCGGGGTTTTGCGACGGTGTTGGAGGGTGTTTTCGGTTTCGATGTGGGGAGGTTTGCGCGGGGATTAGGTTTTCGAGAGGCGAGCGGGCGCGTTAGAGAATTCGAGATTGTTGCGGGGTCGGATGCGGGATTTTTGGGTTGCGGTTTTACGTAGAAACGTTAATGGTTATGTTTTTTTAGTTTTTTTTAGTTTTAGTTATTAGGTCGGCGTTTGGTTCGGAGATTTTTTTAGAGTTTTGGCGGTGTTATTATGTCGGAGAAGATAAGTTCGGTTTCGTTGGAA TT。
SEQ ID NO.9的序列信息为(5’-3’):
TGGGATGTTTAGAAAATTGTTGTATATTGGAGTTTTTTAGTATGTTTTATTTATATTGAATGTAGGTGGTTGTTGAAAATTTAGTTTTGATTTTTGTTAATGATTGGGTAGGATTTTTGGGGTTTTGTGATGGTGTTGGAGGGTGTTTTTGGTTTTGATGTGGGGAGGTTTGTGTGGGGATTAGGTTTTTGAGAGGTGAGTGGGTGTGTTAGAGAATTTGAGATTGTTGTGGGGTTGGATGTGGGATTTTTGGGTTGTGGTTTTATGTAGAAATGTTAATGGTTATGTTTTTTTAGTTTTTTTTAGTTTTAGTTATTAGGTTGGTGTTTGGTTTGGAGATTTTTTTAGAGTTTTGGTGGTGTTATTATGTTGGAGAAGATAAGTTTGGTTTTGTTGGAATT。
对上述完全甲基化序列、未甲基化序列分别设计特异性核酸组合(包括甲基化引物对和非甲基化引物对),并进行人工合成,稀释到合适的工作浓度备用,甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列见表1。
表1甲基化引物对和非甲基化引物对的核苷酸序列
以亚硫酸氢盐转化后的组织样本DNA为模板,加入SYBR Green PCR Mix、目标区域的甲基化引物对和非甲基化引物对、内参基因ACTB的上下游引物进行PCR扩增。其中,上述内参基因ACTB的上游引物的序列为SEQ ID NO.26:5’-AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG-3’,下游引物的序列为SEQ ID NO.27:5’-AATAACACCCCCACCCTGC-3’。PCR反应体系见表2,PCR反应条件见表3。将PCR扩增产物送至测序公司进行Sanger测序,分析测序峰图、以Sanger测得目标区域内单个CpG位点的甲基化状态为准。
表2SYBR Green PCR反应体系
组分 用量(μL)
SYBR Green PCR Mix 17.5
甲基化(非甲基化)上游引物(10μM) 0.5
甲基化(非甲基化)下游引物(10μM) 0.5
ACTB上游引物(10μM) 0.5
ACTB下游引物(10μM) 0.5
模板DNA 5
超纯水 补至25
表3SYBR Green PCR反应程序
结果分析:剔除测序失败的样本,保留测序成功的样本进行结果分析。根据不同扩增子的测序峰图中CpG位点的甲基化情况,计算所有CpG位点的甲基化值。若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胸腺嘧啶,则其为非甲基化的;若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果为胞嘧啶,则其为完全甲基化的;若CpG二核苷酸中胞嘧啶测序结果既有胞嘧啶也有胸腺嘧啶(双峰),则其为部分甲基化的。本实施例中,如果某多核苷酸中95%以上的CpG二核苷酸中胞嘧啶是甲基化的,则认为此样本中该基因标记物是甲基化阳性。计算不同基因标记物的灵敏度和特异性。灵敏度(阳性符合率)=病理结果为阳性的样本检出甲基化阳性的比例;特异性(阴性符合率)=病理结果为阴性的样本检出甲基化阴性的比例。检测结果见表4,选择灵敏度≥85%,特异性≥85%的目标区域进行下一步验证。
表4区域1、2、3、4在训练集样本上的检测灵敏度和特异性
由表4可知,区域2在训练集样本(组织样本)上的检测灵敏度(阳性符合率)为83.3%,检测特异性(阴性符合率)为87.5%,不满足灵敏度≥85%的筛选条件。区域1、区域3、区域4均满足灵敏度≥85%,特异性≥85%的筛选条件,可以进行下一步验证。
根据上述结果在区域1、区域3、区域4中设计探针(表5),所用探针均为TaqMan探针,探针的5’端为荧光报告基团,如FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、CY3、CY5等,探针的3’端为荧光淬灭基团,如TAMRA、MGB、BHQ、BHQ1、BHQ2、BHQ3等。本实施例中,区域1的探针其5’端荧光报告基团为ROX,3’端荧光淬灭基团为BHQ1;区域3的探针其5’端荧光报告基团为VIC,3’端荧光淬灭基团为MGB;区域4的探针其5’端荧光报告基团为CY3,3’端荧光淬灭基团为MGB;内参基因ACTB的探针其5’端荧光报告基团为FAM,3’端荧光淬灭基团为MGB。
表5目标区域的甲基化引物对和探针
区域 甲基化引物对(5’-3’) 探针(5’-3’)
区域1 SEQ ID NO.10~11 SEQ ID NO.28:GCATAAAAACAAAACCCTC
区域3 SEQ ID NO.18~19 SEQ ID NO.29:CGAATAAAACCTAACGCTTT
区域4 SEQ ID NO.22~23 SEQ ID NO.30:CCTCTCGAAAACCTAATC
在30例恶性肺结节受试者的血液样本、30例良性肺结节受试者的血浆样本和30例良性肺结节受试者的血白细胞样本上测试目标区域的特异性和灵敏度。将表5中的核酸组合(包括甲基化引物对和探针)进行人工合成,并稀释至合适的浓度备用。以经过亚硫酸氢盐转化和纯化的组织样本DNA为模板,加入表5中的甲基化引物对和探针,同时加入内参基因ACTB的上下游引物和探针(GGAGTGGTTTTTGGGTTTG,SEQ ID NO.31),用以监测样本质量,ACTB的上下游引物和探针扩增目标序列的Ct值小于等于34,表明样本质量合格。按照表6配置TaqMan PCR扩增体系,同时还设置阴性对照和阳性对照。阴性对照的模板为TE缓冲液,阳性对照的模板为103copies/μL含目标区域序列(完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后序列)的质粒和103copies/μL含完全甲基化且经亚硫酸氢盐转化后ACTB序列的质粒等体积混合而成。然后再按照表7设置的TaqMan PCR程序进行qMSP。
表6TaqMan PCR反应体系
组分 规格 体积(μL)
Platinum IIPCR缓冲液 5
dNTPs 各2.5mM 3
每一目标区域的甲基化上游引物 10μM 0.5
每一目标区域的甲基化下游引物 10μM 0.5
每一目标区域的探针 10μM 0.5
ACTB基因上游引物 10μM 0.5
ACTB基因下游引物 10μM 0.5
ACTB基因的探针 10μM 0.5
DNA聚合酶 / 0.5
待测样本DNA / 5
纯化水 / 补至25
表7TaqMan PCR程序
qPCR反应结束后,需手动调整基线和设置合适的阈值,基线通常是3~15个循环的荧光信号。根据质量控制的要求剔除检测不成功的样本,读取合格样本的Ct值。所述质量控制的标准为:1)阴性对照无扩增;2)阳性对照管扩增曲线呈S型,且所有基因的Ct值在26~30之间;3)实验管内参基因的Ct值小于等于34。若不满足上述质量控制要求,则此样本需重新检测。若样本均满足上述要求,可以对待测样本进行结果分析:对于血白细胞样本和血浆样本,阳性判断值为45,若使用某一对甲基化引物对和探针进行扩增的Ct值≤45,认为该样本在此扩增区域为甲基化阳性,该样本为恶性肺结节样本;若使用某一对甲基化引物对和探针进行扩增的Ct值>45,认为该样本在此扩增区域为甲基化阴性,该样本为良性肺结节样本。具体检测结果见表8。
表8区域1、区域3、区域4在测试集样本上的检测灵敏度和特异性
区域 血浆样本的灵敏度 血浆样本的特异性 血白细胞样本的特异性
区域1 80.0%(24/30) 90.0%(27/30) 96.7%(29/30)
区域3 80.0%(24/30) 86.7%(26/30) 83.3%(25/30)
区域4 83.3%(25/30) 96.7%(29/30) 100%(30/30)
在恶性肺结节发生高甲基化的目标区域需要排除在血白细胞中的干扰,目标区域检测良性肺结节受试者的血白细胞样本的特异性大于等于95%才满足筛选条件。由表8可以看出,区域3检测良性肺结节受试者的血白细胞样本的特异性为83.3%,不满足上述筛选要求;区域1、区域4检测良性肺结节受试者的血白细胞样本的特异性分别为96.7%、100%,说明针对区域1、区域4设计的核酸组合(甲基化引物对和探针)在良性肺结节受试者的血白细胞样本中具备良好的特异性。此外,区域1、区域4在血浆样本上检测恶性肺结节的灵敏度分别为80.0%、83.3%,检测良性肺结节的特异性分别为90.0%、96.7%。因此,进一步验证区域1、区域4检测恶性肺结节的性能。
实施例3基于qMSP法在验证集样本上验证目标区域的检测性能
为了实现精准且无创的诊断方法识别良恶性结节,本实施例收集共纳入212例肺结节样本,其中病理诊断明确恶性肺结节53例(包括实性结节21例、亚实性结节32例),良性肺结节159例。将上述样本编盲处理,再由试验操作者进行试验,根据判读标准进行判读,将检测结果与病理结果(金标准)进行比对。
目标区域联合诊断良恶性肺结节血浆样本时,判断标准如下所示:1)若扩增区域1的Ct值≤45,认为区域1为甲基化阳性,若扩增区域1的Ct值>45,认为区域1为甲基化阴性,区域4的判定同上;2)若某一待测样本中区域1或区域4中至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为恶性肺结节样本;若某一待测样本中区域1和区域4均为甲基化阴性,则该样本为良性肺结节样本。具体检测结果见表9。
表9qMSP法检测不同目标区域诊断恶性肺结节血浆样本的性能
由表9可知,通过qMSP法检测区域1、区域4的甲基化水平诊断恶性肺结节受试者血浆样本的总灵敏度分别为83.0%、84.9%,检测良性肺结节受试者血浆样本的特异性分别为93.1%、93.7%。
进一步地,通过qMSP法检测区域1+区域4的甲基化水平检测实性结节、亚实性结节血浆样本的灵敏度可达85.7%、90.6%,诊断恶性肺结节血浆样本的总灵敏度可达88.7%,优于单一区域的检测效果。区域1+区域4联合检测良性肺结节血浆样本的特异性为92.5%,较单区域检测略有下降,但仍处于较高水平,检测准确度高,可有效提高恶性肺结节的检出率,降低假阴性结果的检出,避免良性肺结节的过度诊疗。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种试剂在制备肺结节良恶性诊断产品中的应用,其特征在于,所述试剂是检测样本中基因的目标区域甲基化水平的试剂;
以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域包括Chr10:117140125-117140525正链的全长区域或部分区域,和/或Chr4:173509216-173509616负链的全长区域或部分区域,和/或Chr15:89409068-89409468正链的全长区域或部分区域。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述诊断包括恶性肺结节的鉴别诊断、微小病灶残留评估及动态监测、恶性肺结节复发及预后的辅助判断、药物疗效评估及耐药监测中的一种或多种;
所述肺结节良恶性诊断产品包括试剂盒、芯片、膜条、蛋白阵列中的至少一种。
3.一种用于检测肺结节良恶性的试剂,其特征在于,其为用于检测样本中基因的目标区域甲基化水平的试剂,以GRCh38.p14为参考基因组,所述目标区域包括Chr10:117140125-117140525正链的全长区域或部分区域,和/或Chr4:173509216-173509616负链的全长区域或部分区域,和/或Chr15:89409068-89409468正链的全长区域或部分区域。
4.根据权利要求3所述的试剂,其特征在于,所述Chr4:173509216-173509616负链的部分区域包括Chr4:173509393-173509480负链。
5.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,其包括用于检测所述目标区域甲基化水平的甲基化引物对和非甲基化引物对;
其中,所述试剂包括用于检测Chr10:117140125-117140525正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一非甲基化引物对;和/或,
用于检测Chr4:173509393-173509480负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二非甲基化引物对;和/或,
用于检测Chr15:89409068-89409468正链的甲基化水平的第三甲基化引物对和第三非甲基化引物对。
6.根据权利要求5所述的试剂,其特征在于,所述第一甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示;所述第一非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.12~13所示;所述第二甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;所述第二非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.20~21所示;所述第三甲基化引物对的核苷酸序列如SEQID NO.22~23所示;所述第三非甲基化引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示。
7.根据权利要求4所述的试剂,其特征在于,其包括用于检测所述目标区域甲基化水平的甲基化引物对和探针;
其中,所述试剂包括用于检测Chr10:117140125-117140525正链的甲基化水平的第一甲基化引物对和第一探针;和/或,
用于检测Chr4:173509393-173509480负链的甲基化水平的第二甲基化引物对和第二探针;和/或,
用于检测Chr15:89409068-89409468正链的甲基化水平的第三甲基化引物对和第三探针。
8.根据权利要求7所述的试剂,其特征在于,其包括如下组合中的至少一组:
SEQ ID NO.10~11所示的第一甲基化引物对和SEQ ID NO.28所示的第一探针;
SEQ ID NO.18~19所示的第二甲基化引物对和SEQ ID NO.29所示的第二探针;
SEQ ID NO.22~23所示的第三甲基化引物对和SEQ ID NO.30所示的第三探针。
9.一种用于检测肺结节良恶性的试剂盒,其特征在于,其包括权利要求3至8任一项所述的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于,其还包括内参基因的上下游引物对及探针、DNA提取试剂、DNA纯化试剂、甲基化转化试剂、扩增试剂、阳性对照品和阴性对照品中的一种或多种。
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