CN115786502B - 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用。通过检测Chr20:21397344~21397599和Chr6:10886848~10887073这两个区域内的甲基化水平可以诊断膀胱癌,该诊断方法可以为非侵入性方法,且敏感性好。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域,特别是涉及一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用。
背景技术
膀胱癌是发病率和死亡率均较高的癌症之一。膀胱癌包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞癌、膀胱腺癌、膀胱肉瘤等,其中膀胱尿路上皮癌是最常见的病理类型,约占所有膀胱癌发病率的95%以上。由于癌细胞起源于膀胱的移行上皮,因此尿路上皮癌也称移行细胞癌。据统计,在首次确诊的膀胱癌患者中,约70%~75%的患者为非肌肉浸润性癌(NMIBC),即癌细胞还未侵袭到膀胱的肌层组织,其余25%~30%的患者为肌肉浸润性癌(MIBC),此时癌细胞已侵袭患者的膀胱壁肌肉层,甚至发生远处转移。肌肉浸润性膀胱癌恶性程度高,疾病进展快,易转移和复发,部分患者预后较差。膀胱癌的5年生存率与确诊时的疾病分期有关,原位癌的5年生存率高达95.8%,而转移性膀胱癌的5年生存率低至4.6%。可见加强膀胱癌的早期筛查和诊断,对于提高患者的生存率和生命质量来说是非常重要的。
目前常用的膀胱癌的诊断方法包括膀胱镜检查和尿液细胞学检查,但前者为侵入性操作会给患者带来巨大的不适感,后者敏感性较差。因此,迫切需要开发一种非侵入性且敏感性较好的诊断方法,用于膀胱癌的诊断。
发明内容
经本发明的研究发现,通过检测Chr20:21397344~21397599和Chr6:10886848~10887073这两个区域的甲基化水平可以诊断膀胱癌,该诊断方法为非侵入性方法,且敏感性好。基于此,本发明提供了一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域、和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域。
在其中一个实施例中,所述目标区域包括区域1~区域5中的一个或多个、和区域6~区域7中的一个或者多个,其中:所述区域1为Chr20:21397344~21397597;所述区域2为Chr20:21397363~21397589;所述区域3为Chr20:21397387~21397582;所述区域4为Chr20:21397386~21397516;所述区域5为Chr20:21397492~21397599;所述区域6为Chr6:10886848~10886991;所述区域7为Chr6:10886885~10887037。
一种诊断膀胱癌的核酸产品,所述核酸产品包括用于检测目标区域的甲基化水平的引物对,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域、和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域的目标区域。
在其中一个实施例中,所述核酸产品还包括与所述引物对对应的检测探针。
在其中一个实施例中,所述引物对包括:用于检测Chr20:21397344~21397597的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对、用于检测Chr20:21397363~21397589的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对、用于检测Chr20:21397387~21397582的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对、用于检测Chr20:21397386~21397516的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对、和用于检测Chr20:21397492~21397599的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对中的一种或者多种;以及用于检测Chr6:10886848~10886991的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对和用于检测Chr6:10886885~10887037的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对中的一种或者多种。
在其中一个实施例中,所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示;及/或,所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;及/或,所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~22所示;及/或,所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.24~25所示;及/或,所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27~28所示;及/或,所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30~31所示;及/或,所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33~34所示。
在其中一个实施例中,与所述区域1引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQID NO.17所示;及/或,与所述区域2引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示;及/或,与所述区域3引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示;及/或,与所述区域4引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示;及/或,与所述区域5引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示;及/或,与所述区域6引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示;及/或,与所述区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
一种诊断膀胱癌的试剂盒,所述试剂盒包括用于检测目标区域的甲基化水平的试剂,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域、和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域。
在其中一个实施例中,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区的甲基化水平的检测:
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。
在其中一个实施例中,所述试剂包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种,以及权利要求3~7任一项所述的核酸产品。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
术语解释
术语“及/或”或“和/或”均是指包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
术语“多个”指两个以上;“多种”指两种以上;“以上”与数字结合表示数量时包括本数,例如“两个以上”包括两个。
术语“膀胱癌”指发生于膀胱粘膜上的癌症,根据其组织类型可分为尿路上皮(移行)细胞癌、鳞状细胞癌、腺细胞癌以及一些少见的小细胞癌、混合型、癌肉瘤或者转移癌等,其中尿路上皮细胞癌占膀胱癌的90%以上。
术语“诊断”包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核苷酸”或“核酸”是指具有两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子,优选多于三个,并且通常多于十个。确切的大小将取决于许多因素,而所述因素又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。DNA的典型脱氧核糖核苷酸是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。RNA的典型核糖核苷酸是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。
术语“甲基化”为DNA化学修饰的一种形式,能够在不改变DNA序列的前提下,改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶第5号碳位共价结合一个甲基基团。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
术语“甲基化水平”指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数,既代表定性的概念又代表定量的概念。在实际应用中,可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平。例如在一些情况下,可根据样本检测的Ct值进行比较;在一些情况下,可计算样本中基因甲基化的比例,即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100,然后再进行比较;在一些情况下,还需要对各个指标进行统计学上的分析整合,得出最终的判定指标。
术语“引物”是指可以用在扩增方法(例如聚合酶链式反应PCR)中,基于与目标基因或其一部分区域相对应的多核苷酸序列来扩增目的序列的寡核苷酸。通常,用于扩增多核苷酸序列的PCR引物中的至少一个对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于很多因素,包括温度、引物来源以及所用方法等。例如,对于诊断和预后应用,根据靶序列的复杂度,寡核苷酸引物通常含有至少10、15、20、25或更多个核苷酸,但是也可以含有更少的核苷酸。
术语“引物对”是指能与目标DNA分子的双链杂交或能与目标DNA分子中位于待扩增核苷酸序列两翼的区域杂交的一对引物。
术语“Taqman探针”是指包含5’荧光基团和3’淬灭基团的一段寡核苷酸序列。当探针与DNA上的相应位点结合时,因为荧光基团附近存在淬灭基团,探针不会发出荧光。在扩增过程中,如果探针与被扩增的链结合,DNA聚合酶(如Taq酶)的5’~3’核酸外切酶活性会消化探针,荧光基团远离淬灭基团,其能量不被吸收,即产生荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步的指数增长的过程。
本发明经研究发现,通过检测Chr20:21397344~21397599和Chr6:10886848~10887073这两个区域的甲基化水平可以实现非侵入性地诊断膀胱癌,即无创检测,且敏感性好。因此,本申请一实施方式提供了一种检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用,以GRCh38.p14为参考,目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域、和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域。具体地,Chr20:21397344~21397599为NKX2-4基因(NCBI数据库中的Gene ID:644524)的部分区域;Chr6:10886848~10887073为SYCP2L基因(NCBI数据库中的Gene ID:221711)的部分区域。需要说明的是,“Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域”是指Chr20:21397344~21397599的全长或者Chr20:21397344~21397599的部分区域,其中Chr20:21397344~21397599的部分区域是指在Chr20:21397344~21397599范围内的一部分区域,例如Chr20:21397358~21397599、Chr20:21397358~21397500、Chr20:21397344~21397590等,其他类似处同理。
在一些实施例中,以GRCh38.p14为参考,目标区域包括区域1~区域5中的一个或多个、和区域6~区域7中的一个或者多个。也即,目标区域包括选自区域1~区域5中的至少一个区域和选自区域6~区域7中的至少一个区域的组合。具体地,区域1为Chr20:21397344~21397597;区域2为Chr20:21397363~21397589;区域3为Chr20:21397387~21397582;区域4为Chr20:21397386~21397516;区域5为Chr20:21397492~21397599;区域6为Chr6:10886848~10886991;区域7为Chr6:10886885~10887037。
需要说明的是,在本文中,如未特殊说明,染色体上的位置均是以GRCh38.p14为参考;此外,因为染色体上的DNA是由正链和负链组成的双链结构,对于用染色体位置表示的区域,如果未指明是DNA的正链还是负链,则表示既可以是该区域的DNA的正链,也可以是该区域的DNA的负链,还可以是该区域的DNA的正负两条链。例如,若区域Chr20:21397344~21397597被描述为“Chr20:21397344~21397597”,则表示可以是Chr20:21397344~21397597区域内的DNA的正链,也可以是Chr20:21397344~21397597区域内的DNA的负链,还可以是Chr20:21397344~21397597区域内的DNA的正、负两条链。若区域Chr20:21397344~21397597被描述为“Chr20:21397344~21397597的正链”,则表示Chr20:21397344~21397597区域内的DNA的正链。若区域Chr20:21397344~21397597被描述为“Chr20:21397344~21397597的负链”,则表示Chr20:21397344~21397597区域内的DNA的负链。另外,区域被描述为“Chr20:21397597~21397344”时,也表示Chr20:21397344~21397597区域内的DNA的负链。
基于上述,本申请一实施方式还提供了一种诊断膀胱癌的试剂盒,该试剂盒包括用于检测目标区域的甲基化水平的试剂。具体地,目标区域如上文所述,此处不再赘述。
可选地,上述诊断膀胱癌的试剂盒通过如下方法中的一种或多种实现对目标区域的甲基化水平的检测:甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。相应地,试剂盒中包括上述检测甲基化水平的方法所必需的试剂。可以理解的是,在其他实施例中,上述诊断膀胱癌的试剂盒检测目标区域的甲基化水平的方法不限于上述。另外,需要说明的是,本文中,“可选地”表示举例。
在一些实施例中,上述试剂盒通过甲基化荧光定量PCR法检测目标区域的甲基化水平以诊断膀胱癌。具体地,用于检测目标区域的甲基化水平的试剂包括用于检测目标区域的甲基化水平的核酸产品。
进一步地,核酸产品包括用于检测目标区域的甲基化水平的引物对和与引物对对应的检测探针。具体地,用于检测目标区域的甲基化水平的引物对包括第一组引物对和第二组引物对。第一组引物对包括以下引物对中的一种或多种:用于检测Chr20:21397344~21397597的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对、用于检测Chr20:21397363~21397589的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对、用于检测Chr20:21397387~21397582的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对、用于检测Chr20:21397386~21397516的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对和用于检测Chr20:21397492~21397599的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对。第二组引物对包括以下引物对中的一种或者多种:用于检测Chr6:10886848~10886991的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对和用于检测Chr6:10886885~10887037的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对。
在一些实施例中,第一组引物对包括以下引物对中的一种或多种:用于检测Chr20:21397344~21397597的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域1引物对、用于检测Chr20:21397363~21397589的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域2引物对、用于检测Chr20:21397387~21397582的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域3引物对、用于检测Chr20:21397386~21397516的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域4引物对和用于检测Chr20:21397492~21397599的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域5引物对;第二组引物对包括以下引物对中的一种或多种:用于检测Chr6:10886848~10886991的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域6引物对和用于检测Chr6:10886885~10887037的正链的全长或部分区域的甲基化水平的区域7引物对。
可选地,区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示;区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~22所示;区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示;区域5引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.27~28所示;区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30~31所示;区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33~34所示。可以理解的是,区域1引物对~区域7引物对的具体核苷酸序列不限于上述,还可以是根据检测的区域设计的其他核苷酸序列。
可选地,与区域1引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示;与区域2引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示;与区域3引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示;与区域4引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示;与区域5引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示;与区域6引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示;与区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。可以理解的是,与区域1引物对~区域7引物对对应的检测探针的具体核苷酸序列不限于上述,还可以是根据检测的区域设计的其他核苷酸序列。
在一些实施例中,采用甲基化荧光定量PCR法检测的上述试剂盒还包括内参引物对和与内参引物对对应的检测探针。可选地,内参引物对包括针对ACTB基因设计的ACTB引物对。在一个可选地具体示例中,ACTB引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.36~37所示,与ACTB引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。可以理解的是,在其他实施例中,还可以选择其他基因作为内参基因,此时,内参引物对和内参探针对应设计即可。
可选地,检测探针上连接有荧光基团。在一些实施例中,检测探针为Taqman探针。进一步地,检测探针上连接有荧光基团和淬灭基团。可选地,荧光基团位于探针的5’端,淬灭基团位于探针的3’端。可选地,检测探针上连接的荧光基团分别独立的选自FAM、HEX、VIC、CY5、ROX、Texsa Red、JOE及Quasar 705中的一种。当然,在同一个反应体系中有两种以上的探针时,不同探针上连接的荧光基团不同。可以理解的是,目标区域的检测探针和内参基因的检测探针上连接的荧光基团不限于上述,还可以是其他荧光基团。
在一些实施例中,上述的任一实施例的试剂盒还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或多种。核酸提取试剂用于提取核酸;甲基化转化试剂用于将DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变;质控试剂用于质控,例如阳性质控品和阴性质控品;PCR反应试剂用于构建PCR扩增反应体系;核酸测序试剂用于测序。
在一些实施例中,上述的诊断膀胱癌的试剂盒适用的样本包括组织样本或尿液样本。可以理解的是,在其他实施例中,上述的诊断膀胱癌的试剂盒适用的样本不限于上述,还可以是其他样本,例如血液样本。
经验证,上述诊断膀胱癌的试剂盒可以通过检测目标区域的甲基化水平诊断膀胱癌,对于尿液样本,其诊断膀胱癌的灵敏度可达86.54%,其在健康人尿液样本中的特异性为95.51%。
此外,本申请一实施方式还提供了一种膀胱癌的诊断方法,该方法通过检测目标区域的甲基化水平进行膀胱癌的诊断。具体地,目标区域如上文所述。
在一些实施例中,上述的诊断方法采用上述任一实施例的核酸产品或上述任一实施例的诊断膀胱癌的试剂盒检测待测样本(例如待测者的血液样本、尿液样本或组织样本)的目标区域的甲基化水平,并根据目标区域的甲基化水平确定是否患有膀胱癌。进一步地,上述的诊断方法包括:提取待测样本中的DNA并转化和纯化;将经转化、纯化后的DNA与上述任一实施例的核酸产品混合后进行甲基化荧光定量PCR反应;及根据qPCR结果确定待测样本是否为膀胱癌样本。
上述膀胱癌的诊断方法为非侵入性诊断方法,并且可以无创检测(例如采用尿液样本进行检测),且敏感性好,其诊断膀胱癌的灵敏度可达86.54%,其在健康人尿液样本中的特异性为95.51%。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明,则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
分析NKX2-4基因和SYCP2L基因中的目标区域诊断膀胱癌组织样本的性能
发明人发现,通过检测膀胱癌组织样本中选自Chr20:21397344~21397599内的部分区域和选自Chr6:10886848~10887073内的部分区域的组合的甲基化水平,可以有效区分膀胱癌组织样本和正常的癌旁组织样本,且灵敏度和特异性高,具体的检测过程如下所示:
1.组织样本的收集
共收集了96例经病理检测确诊为膀胱癌患者的癌组织样本和对应的癌旁正常组织样本96例,所有的样本均为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织样本。其中,非肌肉浸润性癌((NMIBC))组织样本共42例,肌肉浸润性癌((MIBC))组织样本54例。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA的提取
使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(Cat:56404)提取组织样本的DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA的转化和纯化
样本DNA的转化和纯化所用试剂盒均为武汉艾米森生命科技有限公司核酸转化试剂(鄂汉械备20200843号),具体操作按照试剂盒说明书进行。
4.甲基化荧光定量PCR反应
为了保证荧光定量PCR反应的扩增效率位于95%~105%之间,且没有非特异性扩增和引物二聚体出现,分别以亚硫酸氢盐转化后的Chr20:21397344~21397599部分区域的序列和Chr6:10886848~10887073部分区域的序列为模板,设计多对用于甲基化荧光定量PCR反应的引物对,然后对所述引物对进行验证,使用SYBR Green PCR体系扩增目的片段,并通过溶解曲线和标准曲线分析,筛选到满足上述要求的5对用于扩增Chr20:21397344~21397599的部分区域的引物对、和2对用于扩增Chr6:10886848~10887073的部分区域的引物对,并针对每对引物设计对应的Taqman检测探针,用于Taqman PCR反应体系。各个引物对和探针所检测的目标区域如表1所示,检测各目标区域的引物对和检测探针如表2所示,其可检测的甲基化的胞嘧啶位点如表3所示。
表1目标区域的核苷酸序列
表2检测引物对和探针的核苷酸序列
表3检测引物对和探针可检测的甲基化的胞嘧啶位点
检测区域1~区域7中某个区域的甲基化水平时,以转化后的组织样本的DNA为模板,用表2中该区域对应的检测引物对来扩增目标区域。此时,每个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外,只加入单个区域的检测引物对和探针和内参基因ACTB的检测引物对和探针。
若同时检测区域1~区域5中任一个区域和区域6~区域7中任一个区域的组合的甲基化水平,则需要加入组合对应的检测引物对和检测探针,同时扩增两个不同目标区域。在这种情况下,根据检测的目标区域不同,共有10种组合方式(如表4所示)。扩增时,每个PCR管中除加入必须的反应成分和模板以外,还需按照表4的组合方式加入两个目标区域对应的检测引物对和探针,且内参基因ACTB的检测引物对和探针也必不可少。
检测探针均为TaqMan探针,目标区域的检测探针5’端的荧光报告基团为FAM或ROX,3’端的荧光淬灭基团均为MGB,ACTB基因的检测探针5’端的荧光报告基团为VIC,3’端的荧光淬灭基团为BHQ-1。采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶(Invitrogen,Cat:14966005)进行PCR扩增,PCR反应体系的配置如表5所示(若检测单个区域,则不加入另一区域的检测引物对及探针,其体积用双蒸水补足),按照表6展示的扩增程序进行PCR扩增。
表4不同区域的组合方式
表5荧光定量PCR反应体系
组分 | 规格 | 体积(μL) |
Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
dNTPs | 各2.5mM | 3 |
一个区域的上游引物 | 10μM | 0.5 |
一个区域的下游引物 | 10μM | 0.5 |
一个区域的3探针 | 10μM | 0.5 |
另一个区域的上游引物 | 10μM | 0.5 |
另一个区域的下游引物 | 10μM | 0.5 |
另一个区域的探针 | 10μM | 0.5 |
ACTB上游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB下游引物 | 10μM | 0.5 |
ACTB探针 | 10μM | 0.5 |
Taq酶 | / | 0.5 |
待测样本DNA | / | 5 |
纯化水 | / | 补至25 |
表6荧光定量PCR反应程序
阴性对照和阳性对照:在进行PCR反应检测样本时,阴性对照和阳性对照也应同时进行检测,阴性对照管的DNA模板为TE缓冲液。阳性对照管的DNA模板的制备方法为:将ACTB基因扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成,并克隆至载体上,形成人工合成质粒;将如SEQ ID NO.8~14所示的区域进行人工合成,并分别克隆至载体,形成人工合成质粒。若只检测单一区域的甲基化水平,阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含检测区域的人工合成质粒,二者1:1混合而成;若按照表4检测组合区域的甲基化水平,则阳性对照DNA模板为103拷贝/微升的含转化后ACTB的人工合成质粒、103拷贝/微升的含一个目标区域的人工合成质粒和103拷贝/微升的含另一个目标区域的人工合成质粒,三者1:1:1混合而成。
Ct值读取:PCR完成后,调整基线,将一次PCR中样本最小Ct值提前1~2个循环前的荧光值设置为基线值,将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处,得到样本各个基因的Ct值。
质量控制:阴性对照要无扩增,阳性对照要有明显的指数增长期,且阳性对照各基因的Ct值应在26~30之间。待检样本的内参基因的Ct值应≤35,阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后,表明本次实验有效,可进行下一步样本结果的判定。否则,当次实验无效,须重新进行检测。
5.PCR结果分析
根据各个目标区域检测的Ct值来判断待测样本的甲基化水平。对于组织样本,若扩增某一区域的Ct值≤38,则认为该样本此区域为甲基化阳性,若扩增某一区域的Ct值>38,则认为该样本此区域为甲基化阴性。在检测单一区域时,若待测样本在该区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,若待测样本在该区域为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。在检测组合区域时,若待测样本在组合区域中的至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,仅当待测样本在两个区域都为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法,通过检测区域1~区域7的甲基化水平来诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性的结果如表7所示;通过检测区域1~区域5中任一个区域和区域6~区域7的任一个区域的组合的甲基化水平来诊断膀胱癌癌组织样本、癌旁组织样本的灵敏度和特异性的结果如表8所示。
表7区域1~区域7在组织样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
表8两区域的组合在组织样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
由表7可以看出,单独检测区域1~区域7中某一区域的甲基化水平,来区分膀胱癌癌组织样本和癌旁正常组织样本的效果并不好,这些区域检测膀胱癌组织样本的总灵敏度范围为56.25%~73.96%,存在灵敏度较低的问题。但由表8可以看出,若改用同时检测选自区域1~区域5中任一区域和选自区域6~区域7中任一区域的组合的甲基化水平时,其诊断膀胱癌癌组织样本的灵敏度得到了较大的提升,而且不同的组合方式(即检测不同区域的组合)对诊断的性能影响较小。利用检测这些组合区域的甲基化水平检测非浸润性膀胱癌(NMIBC)组织样本的灵敏度范围为71.43%~80.95%,其检测浸润性膀胱癌(MIBC)组织样本的灵敏度范围为92.59%~98.15%,其检测膀胱癌组织样本的总灵敏度范围为83.33%~90.63%,其在癌旁组织中的特异性均高于86.4%。
实施例2
分析NKX2-4基因和SYCP2L基因中的目标区域诊断膀胱癌患者尿液样本的性能
为了实现无创的检测方式,发明人发现,通过检测膀胱癌患者尿液样本中选自Chr20:21397344~21397599内的部分区域和选自Chr6:10886848~10887073内的部分区域的组合的甲基化水平,可以有效区分膀胱癌患者和健康人,且灵敏度和特异性高,具体的检测过程如下所示:
1.尿液样本的收集
共收集156例经病理检测确诊的膀胱癌患者及178例进行常规体检的健康人的尿液样本,其中,非肌肉浸润性癌患者的样本共74例,肌肉浸润性癌患者的样本共82例。此外,还收集了常见的泌尿系统良性疾病(包括腺性膀胱炎、泌尿道感染、前列腺增生、肾结石、肾积水等)患者的尿液样本72例。所有收集到的每份尿液样本的体积大于10mL。所有样本的收集过程经过伦理委员会的审批,所有志愿者都签署了知情同意书,所有样本均采用匿名化处理。
2.样本DNA提取
利用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20210740号)进行尿液样本DNA的提取,具体步骤按照试剂盒说明书进行。
3.样本DNA转化、纯化方法同实施例1。
4.甲基化荧光定量PCR的检测方法同实施例1。
由于单独检测区域1~区域7中某一区域的甲基化水平来区分癌组织样本和正常组织样本的效果并不好(见表7),因此,在本实施例的尿液样本中,不再单独检测某一区域的甲基化水平,而是检测组合区域的甲基化水平。
5.甲基化荧光定量PCR结果分析
Ct值的读取、质量控制等同实施例1。
PCR结果分析和判读方法:对于尿液样本,若待测样本在某一检测区域的Ct值≤45时,即认为该样本在此区域为甲基化阳性,若待测样本在某一检测区域的Ct值>45,则认为该样本在此区域为甲基化阴性。若待测样本在组合区域中的至少一个区域为甲基化阳性,则该样本为癌症阳性样本,仅当待测样本在两个区域都为甲基化阴性,则该样本为癌症阴性样本。
利用甲基化荧光定量PCR检测的方法,通过检测区域1~区域5中任一个区域和区域6~区域7的任一个区域的组合的甲基化水平来诊断膀胱癌患者、健康人、良性泌尿系统疾病患者尿液样本的灵敏度和特异性的结果如表9所示。
表9两区域的组合在尿液样本中的甲基化状态及诊断的灵敏度和特异性
由表9可以看出,利用甲基化荧光定量PCR的方法,在同时检测选自区域1~区域5中任一区域和区域6~区域7中任一区域的组合的甲基化水平时,其诊断膀胱癌患者、健康人、泌尿系统良性疾病患者的效果良好,而且不同的组合方式(即检测不同区域的组合)诊断效果相差较小。利用检测这些组合区域的甲基化水平检测非浸润性膀胱癌(NMIBC)患者尿液样本的灵敏度范围为70.27%~75.68%,其检测浸润性膀胱癌(MIBC)患者尿液样本的灵敏度范围为91.46%~96.34%,其检测膀胱癌患者尿液样本的总灵敏度为82.05%~86.54%,其在健康人尿液样本中的特异性均高于92%,最高可达95.51%,其在泌尿系统良性疾病患者尿液样本中的特异性均高于91.6%,最高可达95.83%。另外,可以看出,利用组合方式C即区域3和区域6的组合的甲基化水平,其诊断性能最佳。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是,在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (5)
1.检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用,其特征在于,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域;
所述目标区域包括区域1~区域5中的一个或多个和区域6~区域7中的一个或者多个,其中:
所述区域1为Chr20:21397344~21397597;
所述区域2为Chr20:21397363~21397589;
所述区域3为Chr20:21397387~21397582;
所述区域4为Chr20:21397386~21397516;
所述区域5为Chr20:21397492~21397599;
所述区域6为Chr6:10886848~10886991;
所述区域7为Chr6:10886885~10887037;
所述试剂还包括用于检测目标区域的甲基化水平的引物对和与所述引物对对应的检测探针;
所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示;所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~22所示;所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示;所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27~28所示;所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30~31所示;所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33~34所示;
所述区域1引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示;与所述区域2引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示;与所述区域3引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示;与所述区域4引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示;与所述区域5引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示;与所述区域6引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示;与所述区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
2.一种诊断膀胱癌的核酸产品,其特征在于,所述核酸产品包括用于检测目标区域的甲基化水平的引物对,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域;
所述目标区域包括区域1~区域5中的一个或多个和区域6~区域7中的一个或者多个,其中:
所述区域1为Chr20:21397344~21397597;
所述区域2为Chr20:21397363~21397589;
所述区域3为Chr20:21397387~21397582;
所述区域4为Chr20:21397386~21397516;
所述区域5为Chr20:21397492~21397599;
所述区域6为Chr6:10886848~10886991;
所述区域7为Chr6:10886885~10887037;
所述核酸产品还包括用于检测目标区域的甲基化水平的引物对和与所述引物对对应的检测探针;
所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示;所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~22所示;所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示;所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27~28所示;所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30~31所示;所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33~34所示;
所述区域1引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示;与所述区域2引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示;与所述区域3引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示;与所述区域4引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示;与所述区域5引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示;与所述区域6引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示;与所述区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
3.一种诊断膀胱癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括用于检测目标区域的甲基化水平的试剂,以GRCh38.p14为参考,所述目标区域包括Chr20:21397344~21397599的全长或部分区域和Chr6:10886848~10887073的全长或部分区域;
所述目标区域包括区域1~区域5中的一个或多个和区域6~区域7中的一个或者多个,其中:
所述区域1为Chr20:21397344~21397597;
所述区域2为Chr20:21397363~21397589;
所述区域3为Chr20:21397387~21397582;
所述区域4为Chr20:21397386~21397516;
所述区域5为Chr20:21397492~21397599;
所述区域6为Chr6:10886848~10886991;
所述区域7为Chr6:10886885~10887037;
所述试剂盒还包括用于检测目标区域的甲基化水平的引物对与所述引物对对应的检测探针;
所述区域1引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~16所示;所述区域2引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.18~19所示;所述区域3引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.21~22所示;所述区域4引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.24~25所示;所述区域5引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.27~28所示;所述区域6引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.30~31所示;所述区域7引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.33~34所示;
所述区域1引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示;与所述区域2引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示;与所述区域3引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示;与所述区域4引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示;与所述区域5引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.29所示;与所述区域6引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示;与所述区域7引物对对应的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂通过如下方法中的一种或多种实现对所述目标区域的甲基化水平的检测:
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和甲基化荧光定量PCR法。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、质控试剂、PCR反应试剂和测序试剂中的一种或者多种,以及权利要求2所述的核酸产品。
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