CN114277135B

CN114277135B - 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒

Info

Publication number: CN114277135B
Application number: CN202111241138.7A
Authority: CN
Inventors: 阮微媚; 王军; 陈志伟
Original assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Current assignee: AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date: 2021-10-25
Filing date: 2021-10-25
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2041-10-25
Also published as: WO2023071890A1; CN114277135A

Abstract

本发明涉及一种可用于胃癌淋巴结转移检测的DNA甲基化分子标记物或其组合，所述DNA甲基化分子标记物包括选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示序列或其完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。本发明还提供了上述甲基化分子标记物或其组合的检测试剂盒，以及检测方法。本发明所述DNA甲基化分子标记物或其组合，通过检测其共甲基化程度，具有作为判断胃癌淋巴结转移目标的良好前景，能够较灵敏及特异地反映胃癌淋巴结转移的发生，避免了影像学检查中涉及的观测判读结果的主观性，提高了准确率。

Description

胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒。

背景技术

胃癌是全球常见的恶性肿瘤，2012年全球胃癌新发病例位列恶性肿瘤发病率第5位、其死亡率为第3位。中国是胃癌的高发国家，疾病负担严重，是癌症防治的重点。而淋巴结转移是影响胃癌预后的重要因素，也是决定手术切除范围的主要依据。研究表明，有或无淋巴结转移的胃癌术后5年生存率明显不同，分别为20.4％和51.9％，胃癌根治术彻底切除胃周禺淋巴结是提高治禽率的一个重要环节。然而，目前尚缺乏在术中或术前对肿大的淋巴结有无转移作出正确的判断的共识和规范，因此常导致手术范围过大或过小而直接影响患者的预后。据统计，胃癌初发病例伴有淋巴结转时，胃癌的复发达到70％一80％。淋巴结转移状况与原发肿瘤大小、浸润深度及分化类型密切相关。

目前，胃癌的术前淋巴结转移判断一般使用超声、增强CT、磁共振或PET-CT等影响学检查。然而，现有的影像学检查手段对于淋巴结转移判断的准确率仅有40％-70％，未能对淋巴结的转移与否作出准确判断。而进一步的术前内镜及内镜下活检作为目前诊断胃癌的金标准，其活检病理对于淋巴结转移的判断，仍与术后病理对淋巴结的判断存在较大分歧。因此需要建立高准确率的术前淋巴结转移诊断方法。

通过寻找胃癌淋巴结转移特异性DNA甲基化生物标记物的组合，可以从生物分子水平的层面上对淋巴结转移的发生与否进行准确判断，进而对胃癌患者制定术前最佳治疗策略有重大的诊疗意义。通过进行基于多个DNA甲基化区域共甲基化程度的检测克服了单个DNA甲基化信号低的问题，提高了检测的灵敏度及特异性。同时，基于DNA甲基化的检测简单易行、判读客观，避免了影像学检查中涉及的观测判读结果的主观性，提高了准确率。同时该检测联合内镜活检查，无需另取生物样本，提高患者依随性。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一组可用于判断个体胃癌淋巴结转移发生甲基化生物标记物及其组合，这些生物标记物在有胃癌淋巴结转移的癌和癌旁组织DNA中的共甲基化程度，相较于胃癌没有发生淋巴结转移的癌和癌旁组织中甲基化程度之间存在显著差异，这些甲基化区域的共甲基化程度可以较灵敏及特异地反映胃癌淋巴结转移的发生。

实现上述目的技术方案包括如下。

一种可用于胃癌淋巴结转移检测的DNA甲基化分子标记物或其组合，所述DNA甲基化分子标记物包括选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示序列或其完全互补序列中的任意一种或两种以上的组合。

本发明的另一目的提供上述DNA甲基化分子标记物或其组合和/或检测相关试剂在制备检测胃癌淋巴结转移的试剂盒中的应用。

本发明的另一目的提供一种用于检测胃癌淋巴结转移的试剂盒。

一种用于检测胃癌淋巴结转移的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述的DNA甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平的试剂。

在其中一些实施例中，所述试剂盒包括采用PCR扩增法、荧光定量PCR法、数字PCR法、甲基化特异性PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、液相芯片法、代测序法、三代测序法二代测序法、焦磷酸测序法、重亚硫酸盐转化测序法、甲基化芯片法、简化亚硫酸氢盐测序技术或它们的组合所使用的试剂。

本发明的另一目的是提供上述的DNA甲基化分子标记物或其组合的检测方法。

实现上述目的的技术方案如下。

上述的DNA甲基化分子标记物或其组合的检测方法，包括以下步骤：

(1)从待测样本中提取基因组DNA；

(2)对提取获得的基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理，得到转化后的DNA；

(3)用针对上述的DNA甲基化分子标记物的扩增引物对转化后的DNA进行多重PCR扩增，得到多重PCR扩增产物；

(4)以多重PCR扩增产物为模板，以用针对上述的DNA甲基化分子标记物的扩增引物和探针进行多重荧光定量PCR扩增或荧光定量PCR扩增，收集荧光信号，并进行分析。

上述DNA甲基化分子标记物或其组合的检测方法，包括以下步骤：

(1)从待测样本中提取基因组DNA；

(3)以转化后的DNA为模板，以用针对上述的DNA甲基化分子标记物的扩增引物和探针进行多重荧光定量PCR扩增或荧光定量PCR扩增，收集荧光信号，并进行分析。

本发明还提供一种检测或诊断或预测、治疗监测、预后或其它评价胃癌淋巴结转移的方法，包括以下步骤，

提取将待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；

对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；

对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA和对照进行如权利要求1-13任一项所述DNA甲基化标记物组合的共甲基化检测，得到甲基化图谱；

将甲基化标记物组合的甲基化图谱与从基于数据集数学建模得到的图谱判定阈值进行比较，判断生物样品中胃癌淋巴结转移的存在。

本发明提供了包括SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.13在内的胃癌淋巴结转移相关的特异性甲基化生物标记物(SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.60)，以及针对上述甲基化生物标记物的甲基化检测的相应引物和探针。这些标记物所标识的甲基化区域的共甲基化程度在预测胃癌淋巴结转移中的性能优于或与现有影像学诊断(CT)的性能相当，特别是SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.13均为首次发现的与胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物，具有作为判断胃癌淋巴结转移目标的良好前景。在与其他47种甲基化生物标记物一起，可以进一步地能够较灵敏及特异地反映胃癌淋巴结转移的发生，避免了影像学检查中涉及的观测判读结果的主观性，提高了准确率。

本发明还提供了检测目标甲基化区域共甲基化程度的一种荧光定量PCR法检测试剂盒。该试剂盒中，所设计的引物对及探针及其组合对于同时并行检测多个甲基化区域的共甲基化程度起关键作用，所述引物克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，并考虑了多个甲基化生物标记物引物及探针对组合之间的相互作用。本试剂盒的多重荧光定量PCR反应体系对反应组分作出了优化，使两个靶向片段在低模板投入量的情况下，同时具备较高的扩增效率，提高了检测方法的灵敏度。

附图说明

图1：胃癌有淋巴结转移的癌及癌旁组织与非淋巴结转移的癌及癌旁组织的多个DNA甲基化区域的共甲基化差异热图。

图2：60个DNA甲基化区域对于胃癌淋巴结转移的判断预测ROC曲线。

图3：基于DNA共甲基化组合的胃癌淋巴结转移风险得分在有淋巴结转移人群和非淋巴结转移人群中的显著差异。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。

术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。

术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列,该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。

如本发明所用，术语“核酸检测”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法。

术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。

术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”(下文定义)的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。

术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。

术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，使得在任何检测系统中可检测。

如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。

因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。

甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。

如本文所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。

术语“甲基化测定”或“甲基化水平检测”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。

本发明的实施例中，提供了一组新的与胃癌淋巴结转移相关的特异性甲基化生物标记物(SEQ ID NO.1-13)，以及其他胃癌淋巴结转移相关的特异性甲基化生物标记物(SEQID NO.14-60)与通过检测这些生物标记物的甲基化状态，可以用于患者的判断胃癌淋巴结转移情况。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合包括SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示序列或其完全互补序列。

在其中一些实施例中，在包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列或其完全互补序列的基础上，还包括有SEQ ID NO.3所示序列或其完全互补序列，

在其中一些实施例中，在包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或在SEQ ID NO.1至SEQID NO.3的基础上，还包括有SEQ ID NO.4所示序列或其完全互补序列。

在其中一些实施例中，在包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或在SEQ ID NO.1至SEQID NO.3或SEQ ID NO.1至SEQ ID NO4的基础上，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示序列或其完全互补序列中的至少一种。

在上述基础上，在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示序列或其完全互补序列中的至少一种。

在上述基础上，在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20所示序列或其完全互补序列中的至少一种。

在上述基础上，在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30所示序列或其完全互补序列中的至少一种。

在上述基础上，在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40所示序列或其完全互补序列中的至少一种。

在上述基础上，在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.60所示序列或其完全互补序列中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.60所示序列或其完全互补序列的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合包括SEQ ID NO.1至SEQ IDNO.13所示序列或其完全互补序列的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合包括为SEQ ID NO.1至SEQID NO.13所示序列或其完全互补序列，还包括选自SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.60所示序列或其完全互补序列中的至少一种的组合。

在其中一些实施例中，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.60所示序列或其完全互补序列的组合。

本发明一些实施中，涉及上述DNA甲基化分子标记物或其组合和/或检测相关试剂在制备检测胃癌淋巴结转移的试剂盒中的应用。

本发明一些实施中，涉及一种用于检测胃癌淋巴结转移的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述的DNA甲基化分子标记物或其组合的甲基化水平的试剂。

在其中一些实施例中，所述试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针分别为：

针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.123，以及SEQ ID NO.184；

和/或针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.63和SEQ ID NO.124，以及SEQ ID NO.185；

和/或针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.64和SEQ ID NO.125，以及SEQ ID NO.186；

和/或针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.65和SEQ ID NO.126，以及SEQ ID NO.187；

和/或针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.66和SEQ ID NO.127，以及SEQ ID NO.188；

和/或针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.67和SEQ ID NO.128，以及SEQ ID NO.189；

和/或针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.68和SEQ ID NO.129，以及SEQ ID NO.190；

和/或针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.69和SEQ ID NO.130，以及SEQ ID NO.191；

和/或针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.70和SEQ ID NO.131，以及SEQ ID NO.192；

和/或针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.71和SEQ ID NO.132，以及SEQ ID NO.193；

和/或针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.72和SEQ ID NO.133，以及SEQ ID NO.194；

和/或针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.73和SEQ ID NO.134，以及SEQ ID NO.195；

和/或针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.74和SEQ ID NO.135，以及SEQ ID NO.196；

和/或针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.75和SEQ ID NO.136，以及SEQ ID NO.197；

和/或针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.76和SEQ ID NO.137，以及SEQ ID NO.198；

和/或针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.77和SEQ ID NO.138，以及SEQ ID NO.199；

和/或针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.78和SEQ ID NO.139，以及SEQ ID NO.200；

和/或针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.79和SEQ ID NO.140，以及SEQ ID NO.201；

和/或针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.80和SEQ ID NO.141，以及SEQ ID NO.202；

和/或针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.142，以及SEQ ID NO.203；

和/或针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.82和SEQ ID NO.143，以及SEQ ID NO.204；

和/或针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.83和SEQ ID NO.144，以及SEQ ID NO.205；

和/或针对SEQ ID NO.23的SEQ ID NO.84和SEQ ID NO.145，以及SEQ ID NO.206；

和/或针对SEQ ID NO.24的SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.146，以及SEQ ID NO.207；

和/或针对SEQ ID NO.25的SEQ ID NO.86和SEQ ID NO.147，以及SEQ ID NO.208；

和/或针对SEQ ID NO.26的SEQ ID NO.87和SEQ ID NO.148，以及SEQ ID NO.209；

和/或针对SEQ ID NO.27的SEQ ID NO.88和SEQ ID NO.149，以及SEQ ID NO.210；

和/或针对SEQ ID NO.28的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.150，以及SEQ ID NO.211；

和/或针对SEQ ID NO.29的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.151，以及SEQ ID NO.212；

和/或针对SEQ ID NO.30的SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.152，以及SEQ ID NO.213；

和/或针对SEQ ID NO.31的SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.153，以及SEQ ID NO.214；

和/或针对SEQ ID NO.32的SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.154，以及SEQ ID NO.215；

和/或针对SEQ ID NO.33的SEQ ID NO.94和SEQ ID NO.155，以及SEQ ID NO.216；

和/或针对SEQ ID NO.34的SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.156，以及SEQ ID NO.217；

和/或针对SEQ ID NO.35的SEQ ID NO.96和SEQ ID NO.157，以及SEQ ID NO.218；

和/或针对SEQ ID NO.36的SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.158，以及SEQ ID NO.219；

和/或针对SEQ ID NO.37的SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.159，以及SEQ ID NO.220；

和/或针对SEQ ID NO.38的SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.160，以及SEQ ID NO.221；

和/或针对SEQ ID NO.39的SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.161，以及SEQ IDNO.222；

和/或针对SEQ ID NO.40的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.162，以及SEQ IDNO.223；

和/或针对SEQ ID NO.41的SEQ ID NO.102和SEQ ID NO.163，以及SEQ IDNO.224；

和/或针对SEQ ID NO.42的SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.164，以及SEQ IDNO.225；

和/或针对SEQ ID NO.43的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.165，以及SEQ IDNO.226；

和/或针对SEQ ID NO.44的SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.166，以及SEQ IDNO.227；

和/或针对SEQ ID NO.45的SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.167，以及SEQ IDNO.228；

和/或针对SEQ ID NO.46的SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.168，以及SEQ IDNO.229；

和/或针对SEQ ID NO.47的SEQ ID NO.108和SEQ ID NO.169，以及SEQ IDNO.230；

和/或针对SEQ ID NO.48的SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.170，以及SEQ IDNO.231；

和/或针对SEQ ID NO.49的SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.171，以及SEQ IDNO.232；

和/或针对SEQ ID NO.50的SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.172，以及SEQ IDNO.233；

和/或针对SEQ ID NO.51的SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.173，以及SEQ IDNO.234；

和/或针对SEQ ID NO.52的SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.174，以及SEQ IDNO.235；

和/或针对SEQ ID NO.53的SEQ ID NO.114和SEQ ID NO.175，以及SEQ IDNO.236；

和/或针对SEQ ID NO.54的SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.176，以及SEQ IDNO.237；

和/或针对SEQ ID NO.55的SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.177，以及SEQ IDNO.238；

和/或针对SEQ ID NO.56的SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.178，以及SEQ IDNO.239；

和/或针对SEQ ID NO.57的SEQ ID NO.118和SEQ ID NO.179，以及SEQ IDNO.240；

和/或针对SEQ ID NO.58的SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.180，以及SEQ IDNO.241；

和/或针对SEQ ID NO.59的SEQ ID NO.120和SEQ ID NO.181，以及SEQ IDNO.242；

和/或针对SEQ ID NO.60的SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.182，以及SEQ IDNO.243；

或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。

在其中一些实施例中，还包括针对内参基因的荧光定量PCR检测的引物和探针：SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.183所示引物，以及SEQ ID NO.61所示探针。

可以通过以方法检测所述与胃癌淋巴结转移相关的特异性甲基化生物标记物及其组合的甲基化程序，包括如下主要步骤：

一、采用DNA提取试剂盒，提取待测者样本的基因组DNA；

二、对所述全基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化；

三、对所述经过转化的DNA进行多个甲基化区域的共甲基化检测。

所述共甲基化检测方法包括：MSP(甲基化特异性PCR)、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。具体方法如下。

1、MSP检测方法的主要步骤包括：

1)利用特异性引物对SEQ ID NO.62-121，123-182对经过转化的DNA分别进行选定目的区域共甲基化片段的扩增；

2)利用特异性引物对对经过转化的DNA分别进行选定目的区域非甲基化片段的扩增；

3)对所述1)和2)的扩增产品进行琼脂凝胶电泳分析；

4)根据电泳结果条带的有无及密度判断选定目的区域的共甲基化程度。

2、DNA甲基化芯片检测方法的主要步骤包括：

1)对经过转化的DNA进行全基因组的扩增；

2)使用SEQ ID NO.1至60或其在序列上互补的核酸序列作为目标区域在芯片上合成共甲基化及非甲基化的捕获探针；

3)对所述2)中的扩增产物在芯片中进行靶向捕获，并进行带有标记的单碱基延伸反应；

4)根据荧光染色反应将捕获的序列信号进行放大及读取，计算目的区域的共甲基化程度。

3、靶向DNA甲基化测序的主要步骤包括：

1)对经过转化的DNA进行全基因组的扩增；

2)对所述1)中的扩增产物进行接头连接；

3)对所述2)中的建库产物进行靶向捕获，其中所用捕获探针为包含SEQ ID NO.1-60或与其反向互补配对序列的经过转化的DNA序列；

4)对所述3)的捕获产物进行测序；

5)根据测序结果计算选定目的区域的共甲基化程度。

4、数字PCR法的主要步骤包括：

1)利用特异性引物及探针SEQ ID NO.62-121，123-182，184-243对经过转化的DNA分别进行选定目的区域共甲基化程度的绝对定量；

2)利用特异性引物及探针对经过转化的DNA分别进行选定目的区域的非甲基化程度的绝对定量；

3)根据每个区域的非甲基化程度及共甲基化程度的绝对定量计算该区域的甲基化率。

所述待测者样本为血液、血浆、唾液、血清、胃部灌洗液、尿液或组织，优选地，所述组织包括胃癌组织和/或胃癌旁组织。

本发明还提供了检测目标甲基化区域甲基化程度的检测试剂盒。试剂盒中，引物对及探针的设计及其组合设计对于同时并行检测多个甲基化区域的共甲基化程度起关键作用，本试剂盒的引物对组合在引物序列设计上克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，并考虑了多个甲基化生物标记物引物对组合之间的相互作用。本试剂盒的多重PCR反应体系对反应组分作出了优化，在保证目标片段扩增效率的前提下，可同时扩增最多60个目标片段。本试剂盒的多重荧光定量PCR反应液，可实现最多3-4个目标区域共甲基化程度的检测。

本发明提供了使用所述检测试剂盒进行目标甲基化区域共甲基化程度测定的检测方法。该检测方法可并行检测多至60个甲基化区域的共甲基化程度，同时处理多个样本，具有高通量、简单易行的优势。

所述检测方法包括以下步骤：

1)选用多对PCR引物对亚硫酸氢盐转化后的全基因组DNA或游离DNA进行靶向PCR扩增，得到PCR扩增产物

2)对应的PCR引物及探针对PCR扩增产物进行荧光定量PCR反应，所得Ct值通过内参校正后，用于衡量目标区域的共甲基化程度，根据逻辑回归计算胃癌淋巴结转移风险得分。

本发明提供了一种基于上述甲基化区域共甲基化程度判断胃癌淋巴结转移的方法。根据胃癌有淋巴结转移人群及胃癌无淋巴结转移人群的多个甲基化区域的共甲基化程度进行逻辑回归方程拟合，通过拟合的逻辑回归方程算出胃癌淋巴结转移的风险得分，该得分在胃癌淋巴结转移人群和非淋巴结转移人群中存在显著的差异(图3)，可明显将淋巴结转移人群从非淋巴结转移人群中检出。本发明判断胃癌淋巴结转移的方法完全基于生物分子水平的检测，采用统计学的数学公式，避免了任何在影像学及活检病理中涉及人为判定结果的主观性，使得判读上更准确、稳定、可靠。

以下通过具体实施例对本申请做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

用于胃癌淋巴结转移诊断的甲基化区域的共甲基化，包括表1.1所列核酸序列中由[CG]指示的多个甲基化位点的共甲基化以及与表1.1中的由[CG]指示的核酸在序列上互补的核酸的多个甲基化位点的共甲基化。

表1 DNA甲基化区域的共甲基化组成.

实施例2

一种用于胃癌淋巴结转移诊断的多个甲基化区域的共甲基化测试试剂盒，包括多个甲基化区域共甲基化的特异性引物对及探针，如表2.1所示：

表2.1 60个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合

内参引物和探针如表2.2所示：

本发明所述引物探针购于Thermo Fisher或金唯智生物科技有限公司或生工生物工程股份有限公司，多重PCR反应试剂购于NEB公司，多重荧光定量PCR试剂购于NEB公司或TAKARA公司或诺唯赞公司。

实施例3多重荧光定量PCR对于2-3个甲基化区域的共甲基化检测

使用商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品(购自QIAGEN公司)对60个甲基化区域(SEQ ID NO.1-60)进行每2-3个甲基化区域的共甲基化检测。

具体流程如下：

1、DNA提取

提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。

2、DNA亚硫酸氢盐转化

DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。

3、多重PCR扩增

采用60个甲基化区域(SEQ ID NO.1-60)的引物对，在1个反应孔(引物序列见表2.1)中进行多重PCR，扩增出含目标区域的目标序列，产物大小在70-130bp左右。

1)配置单个引物浓度为5μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个甲基化区域的正向和反向引物，共1个反应孔。

2)PCR混合液配置：根据表3.1配制PCR混合液，DNA不要加在其中。

表3.1 PCR混合液配置方案

试剂	终浓度	体积(μL)
			DEPC水	/	18.0
5x PCR Buffer	1X	10.0
			25mM MgCl<sub>2</sub>	0.25mM	0.5
25mM dNTP混合物	250μM	0.5
			5μM Primer混合物	0.5μM	5.0
5U/μl PCR酶	5Unit	1.0
			体积[μl]	/	35.0

3)加入DNA样本：加35μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量25ng，PCR反应总体积50μL。涡旋震荡和离心。

4)PCR反应程序：98℃30秒；98℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，20个循环；72℃5分钟；4℃保存备用

4、多重荧光定量PCR测定

1)60个甲基化区域的引物及探针(序列见表2.1)，及内参的引物及探针中的每个甲基化区域按照每个引物浓度10μM,每个探针浓度5μM的终浓度配制成一套混合液，60个甲基化区域的60套混合液可等比进行每2-3个甲基化区域的混合。其中列举的一些3个甲基化区域组合如表3.2所示：

表3.2 60个甲基化区域(SEQ ID NO.1-60)的引物探针混合液组合方案(组合内的3个甲基化区域可选任意2-3个进行组合)

2)多重qPCR反应液配置：根据表3.2的组合方案将选定的2-3个甲基化区域的引物探针混合液等比混合配制PCR混合液，DNA不要加在其中。

表3.3 PCR混合液配置方案

试剂	体积(μL)
		DEPC水	1.5-2
2X PCR Master Mix	5.00
		2种或3种标记物的引物和探针	0.5(每套)
体积[μl]	8.00

3)加入DNA样本：加8μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入2μL经过两倍稀释的多重PCR产物。PCR反应总体积10μL。涡旋震荡和离心。

4)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃20秒，62℃60秒，于62℃收集荧光信号，40个循环。

5、数据分析

以商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品对60个甲基化区域的共甲基化程度按照表格4按照表3.2所示混合方式(组合A-Z)进行多重荧光定量PCR测定，与60个甲基化区域的单个甲基化荧光定量PCR测定(单个定量)的C_T值比较，其中阴性对照在所有组合及单个定量中均无检出，阳性对照的C_T值如表3.4所示：

表3.4阳性对照在2-4个甲基化区域组合方案的多重荧光定量PCR与单个甲基化区域荧光定量PCR测定的C_T值比较

表3.4的结果显示，按照这些组合方案中的组合内任意2-3个甲基化区域的引物探针混合物进行混合所进行的多重荧光定量PCR所得的C_T值与单个区域定量的C_T值相近，没有显著差异，由此判断多重荧光定量的组合方案中的60个甲基化区域的扩增效率没有相互干扰，定量性能与单个区域定量等同，可实现2-3个甲基化区域的同时定量检测。

实施例4对胃癌有淋巴结转移的癌和癌旁组织及非淋巴结转移的癌和癌旁组织60个甲基化区域的共甲基化检测。

使用实施例3中所述的检测方法对有淋巴结转移的癌和癌旁组织及非淋巴结转移的癌和癌旁组织进行60个甲基化区域的共甲基化检测，以验证这些甲基化区域在胃癌淋巴结转移诊断中的应用。其中，胃癌有淋巴结转移人群的癌和癌旁样本共40例；无淋巴结转移人群的癌和癌旁样本共59例；所有样本的病理及临床信息组成如表4.1所示。

表4.1组织DNA样本病理及临床组成信息

使用实施例3中所述的检测方法对上述99例组织DNA进行60个甲基化区域的共甲基化检测。其中，检测所得每个甲基化区域的C_T值通过内参C_T值进行校正，得到目标区域的相对循环数d-C_T＝C_T(目标区域)-C_T(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数d-C_T＝35。

检测所得的99例组织DNA样本的60个甲基化区域的共甲基化程度在非淋巴结转移人群及有淋巴结转移人群中的差异性分布热图如图1所示。每个甲基化区域相对于标准手术后淋巴结转移诊断的判断性能ROC曲线如图2所示，其预测性能AUC如表4.2所示。

表4.2 60个甲基化区域对于99例临床组织样本中淋巴结转移的预测性能

图1的结果表明，非胃癌淋巴结转移人群相较于胃癌淋巴结转移人群在60个甲基化区域中存在明显差异。而现有影像学诊断(CT)在99例临床样本中的根据ROC曲线得到的预测性能AUC为0.61。根据图2及表4.2显示，每个甲基化区域与现有影像学诊断淋巴结转移的预测性能相比，60个甲基化区域大部分的预测性能优于现有影像学诊断性能，或与现有影像学诊断性能类似。因此，这些甲基化区域可以作为诊断胃癌淋巴结转移的特异性甲基化标记物。

此外，本发明中的60个甲基化区域，其中的SEQ ID No.1-13这13个区域均为首次发现在胃癌淋巴结转移及非转移人群中存在差异性，可作为胃癌淋巴结转移的预测判断特异性生物标记物。

同时，该实施例描述的检测方法按照实施例3的组合方案，可用于2-60个甲基化区域的并行检测，检测方法对于甲基化区域的组合搭配灵活、简单易行。

实施例5 60个甲基化区域中任意1-3个甲基化区域的共甲基化并行检测

当目标甲基化区域的共甲基化并行检测为60个甲基化区域的任意1-3个时，使用实施例3表3.2中的组合方案，可以采用以下的检测方法。具体检测流程如下：

1、DNA提取

提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。

2、DNA亚硫酸氢盐转化

3、荧光定量PCR测定

选用1-3个甲基化区域的引物及探针及内参的引物及探针，在1个反应孔进行测定(引物探针序列见实施例2表2.1，甲基化区域的组合方案见实施例3表3.2)

1)qPCR反应液配置：根据表5.1配制PCR混合液，DNA不要加在其中。

表5.1 PCR混合液配置方案

2)加入DNA样本：加15μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量25ng，转化产物作为一个PCR反应孔。PCR反应总体积20μL。涡旋震荡和离心。

3)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃15秒，62℃40秒，于62℃收集荧光信号，60个循环。

4、数据处理与分析

将目标区域的检测所得每个甲基化区域的C_T值通过内参C_T值进行校正，得到目标区域的相对循环数d-C_T＝C_T(目标区域)-C_T(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数d-C_T＝35。

以阳性对照、甲基化区域引物探针组合方案A和B(实施例3)的检测为例，对照实施例3的检测方法，所得到的甲基化区域的相对循环数d-C_T值与实施例3中的对比如5.2。

表5.2阳性对照任意1-3个甲基化区域的共甲基化并行检测与60个甲基化区域检测方法的d-C_T值比较

	1-4个区域并行检测法d-C<sub>T</sub>值	60个区域检测法d-C<sub>T</sub>值
			SEQ ID NO.1	4.86	3.97
SEQ ID NO.2	6.9	4.9
			SEQ ID NO.3	5.27	4.21
SEQ ID NO.4	0.31	1.57

表5.2的结果表明，使用该实施例所述检测方法检测所得的d-C_T值与检测60个甲基化区域所述检测方法(实施例3)得到的d-C_T值高度一致，对这些区域两种检测方法的d-C_T值做相关性分析，其相关系数为R＝0.999(Pearson R)，因此可以判定这两种检测方法在检测同一个甲基化区域的共甲基化程度上没有差别。

当目标甲基化区域的共甲基化并行检测为60个甲基化区域的任意1-3个时，本实施例所述检测方法可以减少多重PCR预扩增目标片段的步骤，使少于4个甲基化区域的并行检测更为方便快捷。

实施例6

对实施例4中得到的99例组织DNA样本的60个甲基化区域(SEQ ID NO.1-60)的共甲基化相对循环数数d-C_T值进行甲基化区域组合的数学建模分析，以探讨60个甲基化区域作为生物标记物组合对于胃癌淋巴结转移判断预测的应用，对比使用单个甲基化区域作为标记物的判断性能优越性。

首先，如实施例4所述，对比99例组织样本标准手术后淋巴结转移的诊断信息，根据60个甲基化区域共甲基化在淋巴结非转移人群及淋巴结转移人群中的相对循环数d-C_T值建立单个甲基化区域判别淋巴结转移发生的诊断模型ROC曲线，并根据ROC曲线计算AUC值及划分该区域的判定阈值。根据阈值对比标准诊断计算该甲基化区域的判别灵敏度、特异性及Youden指数。同时，根据60个甲基化区域共甲基化的相对循环数d-C_T值选择2-60个甲基化生物标记物进行穷举阈值组合或逻辑回归或随机森林模型拟合，拟合方程可用于计算每个样本的淋巴结转移风险得分，用于判断淋巴结转移的发生。根据不同的2-60个甲基化区域的组合，可以产生多个用于判断胃癌淋巴结转移发生的模型及方程。使用这些方程计算的胃癌淋巴结转移风险得分对比标准诊断得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC及Youden指数。列举其中的一些组合的模型对于胃癌淋巴结转移的发生的判定性能参数对比单个甲基化区域如表6.1所示。

另外，图3列举了使用60个甲基化区域中的其中3个(SEQ ID NO.1-3)组合模型的风险得分在胃癌淋巴结转移及非转移人群中的分布。

如图3所示，采用3个甲基化区域组合判别模型得到的胃癌淋巴结转移风险得分可以将淋巴结转移人群及非转移人群作出明显的区分，再次说明这些甲基化区域的组合可以作为用于判断胃癌淋巴结转移发生的生物标记物组合。

根据表6.1的诊断效能比较可以看出，使用单个甲基化区域作为诊断模型，虽然对比现有影像学(CT),对于淋巴结转移有较优越的诊断性能，但对比多个甲基化区域组合模型诊断性能较低，2-60个甲基化区域的组合在判别淋巴结转移的发生上有更高的灵敏度或特异性，反映灵敏度及特异性的总体性能参数Youden指数明显高于单个甲基化区域的判别，更优越的判别优势，对于胃癌的诊疗及手术治疗方案均具有更精确的指导意义。

表6.1单个甲基化区域的模型与多个甲基化区域的模型对于诊断胃癌淋巴结转移的比较

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州市基准医疗有限责任公司

<120> 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒

<160> 243

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacgcaagat ccatctcaga ccccccagcc ccgagatcca ggctgccgat ccgcctactc 60

cgcggcctac tcgcgcgtct gcctggcggg gcaagtccga gagcagccg 109

<210> 2

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgcagccac acgacgaggc cggcacgcag gcgccgccgc tggccacgaa gcctgggagg 60

cacacgcagc cctccacgca ggggcgcccg gagcagttgg acg 103

<210> 3

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaggcgttc tctcgcagca cctggtcaac gctctcctcg caggtgtcca gctgctccga 60

gagcagcgcg tgttcgcgtt gcaggtactg cgcgcgctcc gatagcggct gctcggcacc 120

cgc 123

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actgggcatg tggttgtcag agccgctctg acccgcctca cctcccactc gcaggtggtg 60

acggctctgg gccgcgcctg gcaccccgag cacttcgttt gcgga 105

<210> 5

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agatggagtc tcgctcttgt cgcctaggcg gccccaatcc tgggagcgtg gtgccgcggg 60

cctgtccatg cctgatctgt gcctggaggc g 91

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgagtagcca taaatatcct cgaagtagcg gaaacgcgcc acgcggcccc gggccccagc 60

cccctcctct gcgccgccac cttctgcttt cttcttggat ggctttggct tcttcacgga 120

agttga 126

<210> 7

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccagcccg tgatccttct tgaagcgcac attgaacggg gcgcaggcgg acagcgccag 60

tagctgttcc cgcactgctt tggggcgc 88

<210> 8

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggccccgg ggttgcgggc ggcaggaggg accgccactc cacggctgcg ggcgcgcgtg 60

aacacacggc tgaaggtcat aggcagcgca tccaggcaac agcattcg 108

<210> 9

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcagcgccaa tgtgagcctg cgcgtgttgg tgggcgaccg taacgacaac gcaccgcggg 60

tgctgtaccc tgcgctgggt cccgacggct c 91

<210> 10

<211> 128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatctgagtc cgcagaggag gcggctggtc ccctcacccc tcccagcgcg gaactctgcc 60

gccgagtgcc ctccaagcgg agcgcggcgc tgccaggccg ggtcgcgaaa aaggataagc 120

cgccgcgg 128

<210> 11

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cctggaggac gggcagtagc atcgaaggcg aacactcgcc ccaccagccc gtgatccttc 60

ttgaagcgca cattgaacgg ggcgcaggcg gacagcgcca gtagctgttc ccgcactgct 120

ttggggcgcc 130

<210> 12

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gggcgaagcg gcaagcgcgg ggcgcaggcg gaccggcggc cgggctgctg ggctgctggg 60

ctgccgggga ggaaggctgt gtgtggtcac gttgtgcgct acg 103

<210> 13

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggaagatgac gaggttagcc agcaggaggc gcacggtctt ccgccgccgc tggctctgcg 60

tggcgtcggg gcgcgccagc gtccagaaga ctcggcccga 100

<210> 14

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acggtgagcg tggccgtgta ggcgaagtcc atgagcgcgg tgagcgcctc ggcgctgacg 60

aagtcgatct cgtacacgtt ctgctggtcc acca 94

<210> 15

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aatacctttg ccgtcttctg taccaaggca gccaaaaaca caggcccgtt gtctgagccg 60

atccgtaagg gcggtcgaaa tctaggaatc acatctcgaa gaa 103

<210> 16

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttcccgcatg gcgctttggc tcctggggtt ctgcttgcag cccacagggg ccctgaagtg 60

ccaggggggg accttgggcc accaggagcg aggcaggcca cgatttgagg gcttaggtcc 120

agagc 125

<210> 17

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cgggcacgaa cagccgccta gcgcaccctc atggcgcccg gcgcccggcg gcgccaccag 60

cccagggtgg acatctcccg cgcctcccaa acctctcctc ccgcagctgc ccagacttct 120

gcac 124

<210> 18

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gggctcaggc gccggccctg ggggcccctt ctcctcatcc gggagcacgg gcggcgtcgg 60

ctccgcttcc ttcgggacac tgcgttctgg cccg 94

<210> 19

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gcgaggaccg gtccaggctg cggcggagtc gagggcgagg gagaggccgc gtgagtgagc 60

agagtccaga gccgtgcgcc cccagaactg cgcgtccgcc ccg 103

<210> 20

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccaggggcac gaaggaacgg cggccgaggg aagtccacgc gggctctggc gcagcagcga 60

agctggaggc gtttgctccg ctctgcccgg agcaaggg 98

<210> 21

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ccagttccgc ccgctgccag tggatctgcg ctaggtccac gcggttctgc tcgtccagcc 60

ggacgatggc tttggcgcag cgctgggcgc gcgcgctcac gtagctggcg tagagccggg 120

<210> 22

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggcgagcggg tctcccgctg cctctgcaga gccccgcggg ccggattgcc agctttgctc 60

tgcgcctggc gaggtgcgcg gcccgcgggg gcagagagcg cggcggctcc gggggcgccc 120

ctgggc 126

<210> 23

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caaattgtgt ctgaaagccc cgccgccgag cggagggcgg ccgccgcagt cggcgcgcga 60

ttgcggatcc gggcgcagcc gggagccggg cgcctgcgag caccgggcag aggagc 116

<210> 24

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccacaacaac actgcagcag cggccacaca gagtgcactc ccgacgccga gccgggcgac 60

gagcggagac gcgcgcgcac gctcgggcgc tgaagccggt gtccgggaa 109

<210> 25

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cacattcttc aaaacgacaa taaacgaaaa cacaccaaaa atctcaacga aatacgaacc 60

gccgaatacc acccaatacc gttactacta ctcctcgata atcatctt 108

<210> 26

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acgtccgccc cactctaggt gcaggacccc ttttccccgc tcgcactctc cggcccggag 60

ctcctgggcg atcgcacagg gaagcgaggc cactgtcctc ctctgtcc 108

<210> 27

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tactcgaggc gtcgcagcac cgggtcgtcg cgcacgcctt ccgggctgcg gcccgcggcc 60

accgcagcca cggcggccgc cgcctcgcgg gcctggtact cgggcaggct gtggatgcac 120

atggcggcg 129

<210> 28

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caaacagccg cggccgaagg cgcgggtcgc cgagtgggcg gcggccgccc gcgaggcgag 60

cctggaagca gtatctgaac cgtctggagg gtgaccaggt tgcgcggcga gctttgcgac 120

tgacacggc 129

<210> 29

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggcggccagg agccagctcc acggaaggca aggtggccgg cgcggccccc agcccgcggg 60

gtgggtgccc cagtgtcgga gccaacaggt acgggaggcg ctgtctgcca 110

<210> 30

<211> 131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tcctggagga cgggcagtag catcgaaggc gaacactcgc cccaccagcc cgtgatcctt 60

cttgaagcgc acattgaacg gggcgcaggc ggacagcgcc agtagctgtt cccgcactgc 120

tttggggcgc c 131

<210> 31

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gaggctgggc tggtgcggcg cggggggcgc gggcgcgggc tctgcgcctt taaggcccgc 60

gtcggcagag cgagcgcagg ggccgggcgg cggggcgggg cctcggcggg gcg 113

<210> 32

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tgctggcggc caagctggat gggtcgccag tgagtttcgg tgcggcaccg ctggcccagg 60

cccgggcgcg gctggacatg gccacctact gcg 93

<210> 33

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ctggccgcac tgtccctcta caacatgagc agcgccggcg gcgaccgcct gggccgcggc 60

aagtcggccc gctgcggcct caccttctcc gtggg 95

<210> 34

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ctgcgctagg tccacgcggt tctgctcgtc cagccggacg atggctttgg cgcagcgctg 60

ggcgcgcgcg ctcacgtagc tggcgtagag ccggttctcc tcg 103

<210> 35

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caaagtgggg cgctcaggcg aagcgcacgg agcggccgct gccgctgctc tggccgcagg 60

gcgcacacag gccggtgctc ac 82

<210> 36

<211> 117

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gctgcggacg ccgtcggtaa gcagctcgcc cagctgccgc cattctcctg atccatgccg 60

gcgttcatat tcgaggtact tgaagcccga agaagccagt gccttgcccg gctcccg 117

<210> 37

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cccaggcggc gtgcaaggcg gttgcggcgt gcgggccgcc gacctgcgga gtgcgcgggt 60

tgggctaggg gctgtccctg gagcgccggg tggccctggg tcccgcac 108

<210> 38

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ttcctggagg agctgcggcc gggctccctg gagagggagt gcaaggagga gcagtgctcc 60

ttcgaggagg cccgggagat cttcaaggac gcggagagga cggtgagccc agcctcgggg 120

cgccccg 127

<210> 39

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

cctggagcgc tagtacttgc ttctcgactc cccggccgcc gcctccggcc gccccgggga 60

ttccgccacc aaacgcacgc gtcccaggtg ggcacccgcc tcggtccgtc tttgagtctg 120

accct 125

<210> 40

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ggggacccca ggagcccagg ttcccgctcc ggcggagaga agcccgcagt gcagtcgttg 60

ctgggccgcg tagagagggc tctg 84

<210> 41

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

attcaacgtg aggaagcaag tgacaaggac gcccgaagca cagtggacgg tcatgaagga 60

gcgggggtgt ggcaggcggg tgacgtccag gag 93

<210> 42

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

ggattaccgt gacgtcacat tgagcctctg gccaccttgg actgggacac ctccggagcc 60

tcacagcccc gcgccgcgcc gcgcctcacc tcgccaccac gcgcctttgg gaacccgcat 120

cttc 124

<210> 43

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ggaccgggag atgctggaaa tgcaaccgcc tgttccccga ggagccgctg cccccgggac 60

cccctggcac tgtgcgcacc ctggtcag 88

<210> 44

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cggccgagca cgagtgatcc gtgagcgagt ccacgtgcag gctgatccct gtgggggcgc 60

gggcacggtg ggtggcacga ggggacagcg caggcacctg 100

<210> 45

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tccaaacaat ctcgtatcta tgagacagtg gccggcagcg tgactcagcc tgaccccagc 60

ctcagtaaca aactctggca aagacacgcg gggagaggct gcagcgctta gaacttggag 120

ccatggtcac 130

<210> 46

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tgcagctcct cctgccgctc ccggtcggcc gcctcctgcc tgcacagccg cttgttctcc 60

agctgaagcc gcaggagcgt ctccctgcag acccggga 98

<210> 47

<211> 113

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ttcaccgtga tagccaggat ggtctcgatc tgagctcgtg atcctcccgc ctcggcctcc 60

caaagtgctg agattacagg cgtgagccac cgcgaccggc cgaggtaagg ttt 113

<210> 48

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tcgccttcgt ccggtttcac taccggagcg acgcgcaaga cgccgaggcc gccatggact 60

gggcggtgct ggacggacgc gagctgcggg tgcagatggc gcgctatggc cgccgggacc 120

tgcctc 126

<210> 49

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

gagcagcact cacctgggtc tgtgcgcgcc gcgatgcgcc ggggctcctg cgctgtcctg 60

cgctccgctc tcggcaccac ctttcgtggc tcca 94

<210> 50

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

agatcaagta cgccttcagc ctgctggtga ggacgcgccc gcccctgggc cggggcgcgg 60

gcacgacgaa cctgtcccgt 80

<210> 51

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gtacccctgc ggctcaagct gccccggatt cgcttctccg gccgtgcagc ccggcgcggg 60

ccgctgtcca cagtgggagg tgctgaaagc agggagcggg tgcgggggcg gcgaggcgg 119

<210> 52

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

caaggccagg gcgaaattag aattactgat gaggttccat gtcccacggg gcacgcattt 60

tcattgataa acatcttaac aggaaacagg gtttgagagc agacaatcag tctgactaga 120

attcg 125

<210> 53

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

gctgtgtcgc ccaggttgga gtgctgtgcc ttgatcttgg ctcactgtaa cctccgcctc 60

cgggttcaag cgattctcct gcctcaacct cccaagtagc tgggattaca gggacgcgcc 120

accac 125

<210> 54

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

tagccagcgg ggctcttgca cggacagggg ccgacacgga ccgcagacca tctggtcagc 60

agccaagcga gtaaactcgt cttctcaggt ttatctccac agg 103

<210> 55

<211> 92

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ccaagttatt gaccaacgtt tccagctgct tcggtagcag cttctaacca gtccccacat 60

aaagcctcca ataccataca catagcgtgt gt 92

<210> 56

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gggcgggcca ggacttgggg acgcggctcg ggaagagccg gggcgggcgg cggcggcggc 60

ggcacgggcg cgagggtgcg cgcactggga ctgg 94

<210> 57

<211> 114

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgttcattct gcatggattt gttgagtcct gacaagtgcc aggtcttgtt cttggtgctg 60

gcgtgcagca gcgaacaaaa taaccctccc tcggggagga agcagacaat aatc 114

<210> 58

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cggcgggcga gtggcgcctt cgcgatcgcg gccgcccctc taggcggagg caccggggac 60

cgaacccgtg acttcgagct ccactgc 87

<210> 59

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gggccccaga gagccccgca ctcggccgcg cctcagttac gctgactcgg ctgtgcccgc 60

agtgtcgcgc tgtcgcgtag ccaggtgtcg ccgggctg 98

<210> 60

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

acagggtctt ctttccccgc tgattccgcc aagcccgttc ccttggctgt ggtttcgctg 60

gatagtaggt agggacagtg ggaatctcgt tcatccattc 100

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

tatgtggaag tgtaataatg 20

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

aacgcaaaat ccatctcaaa c 21

<210> 63

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

tacaaccaca cgacgaaacc g 21

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

aaacgttctc tcgcaacacc taa 23

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

attgggtatg tggttgttag agtcg 25

<210> 66

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

agatggagtt tcgtttttgt cgttta 26

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

aaataaccat aaatatcctc gaaataacga 30

<210> 68

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

caccaacccg taatccttct taaa 24

<210> 69

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

gacgaccccg aaattacgaa c 21

<210> 70

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

ctcgagttta cgttgtaggt tcgc 24

<210> 71

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

ggtgagtcgt gtgggtagtc g 21

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

tttggaggac gggtagtagt atcg 24

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

aaacgaaacg acaaacgcga 20

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

ggaagatgac gaggttagtt agtaggaggc 30

<210> 75

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acgataaacg taaccgtata aacgaaa 27

<210> 76

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

ccaatacctt taccgtcttc tataccaa 28

<210> 77

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

tcgtatggcg ttttggtttt tg 22

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

acacgaacaa ccgcctaacg 20

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

gaactcaaac gccgacccta a 21

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

atcgcgagga tcggtttagg 20

<210> 81

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

ttaggggtac gaaggaacgg c 21

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

tagtttcgtt cgttgttagt ggatttg 27

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

cgaacgaatc tcccgctacc 20

<210> 84

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

taaattgtgt ttgaaagttt cgtcgt 26

<210> 85

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

aaccacaaca acactacaac aacga 25

<210> 86

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

aagatgatta tcgaggagta gtagtaacg 29

<210> 87

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

acgtccgccc cactctaaat ac 22

<210> 88

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

tactcgaaac gtcgcaacac c 21

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

aaacaaccgc gaccgaaaac 20

<210> 90

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

ggcggttagg agttagtttt acgg 24

<210> 91

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

ttttttcgta ggtgtttagt tgtttcg 27

<210> 92

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

caaaaactaa actaatacga cgcgaaa 27

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

actaacgacc aaactaaata aatcgcc 27

<210> 94

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

gctaaccgca ctatccctct aca 23

<210> 95

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

ctacgctaaa tccacgcgat tc 22

<210> 96

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

aaaataaaac gctcaaacga aacg 24

<210> 97

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

aactacgaac gccgtcgata aa 22

<210> 98

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

cccaaacgac gtacaaaacg a 21

<210> 99

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

gtttttggag gagttgcggt c 21

<210> 100

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

cctaaaacgc taatacttac ttctcgactc 30

<210> 101

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

gggattttag gagtttaggt tttcgt 26

<210> 102

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

acgtgaggaa gtaagtgata aggacg 26

<210> 103

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

cgggattatc gtgacgttat attga 25

<210> 104

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

aaaccgaaaa atactaaaaa tacaaccg 28

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

cggtcgagta cgagtgattc g 21

<210> 106

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

tccaaacaat ctcgtatcta taaaacaata ac 32

<210> 107

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

tacaactcct cctaccgctc cc 22

<210> 108

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

ttcaccgtaa taaccaaaat aatctcg 27

<210> 109

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

cgttttcgtt cggttttatt atcg 24

<210> 110

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

aacaacactc acctaaatct atacgcg 27

<210> 111

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

aaaatcaaat acgccttcaa cctactaata 30

<210> 112

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

cctacgactc aaactacccc gaat 24

<210> 113

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

cacaaaacca aaacgaaatt aaaattacta a 31

<210> 114

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

cgctatatcg cccaaattaa aatactatac 30

<210> 115

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

taaccaacga aactcttaca cgaaca 26

<210> 116

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

ccaaattatt aaccaacgtt tcca 24

<210> 117

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

cgcgaaacga accaaaactt aa 22

<210> 118

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

cgtttatttt gtatggattt gttgagtt 28

<210> 119

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

gacgaacgaa taacgccttc g 21

<210> 120

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

gggttttaga gagtttcgta ttcgg 25

<210> 121

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

aacaaaatct tctttccccg ctaa 24

<210> 122

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

tttgtatgtg gtgggagggt tt 22

<210> 123

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

cggttgtttt cggatttgtt tc 22

<210> 124

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

gtcgtttaat tgtttcgggc g 21

<210> 125

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

gcgggtgtcg agtagtcgtt a 21

<210> 126

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

cctccgcaaa cgaaatactc g 21

<210> 127

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

acgcctccaa acacaaatca aa 22

<210> 128

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

aattttcgtg agaagaagtt aaagttattt aaga 34

<210> 129

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

gcgttttaaa gtagtgcggg aatag 25

<210> 130

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 130

gaatgttgtt gtttggatgc gtt 23

<210> 131

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 131

ccgcgatacg ttatcgttac g 21

<210> 132

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 132

gtcgctccta caacgctatc g 21

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 133

aacgccccaa aacaatacga a 21

<210> 134

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 134

agtacgtagc gtataacgtg attatatata gtttt 35

<210> 135

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 135

tcgaaccgaa tcttctaaac gcta 24

<210> 136

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 136

tggtggatta gtagaacgtg tacgag 26

<210> 137

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 137

tttttcgaga tgtgattttt agatttcg 28

<210> 138

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 138

aaatactcta aacctaaacc ctcaaatcg 29

<210> 139

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 139

gtgtagaagt ttgggtagtt gcgg 24

<210> 140

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 140

cgggttagaa cgtagtgttt cgaa 24

<210> 141

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 141

gaaacgaacg cgcaattcta a 21

<210> 142

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 142

cccttactcc gaacaaaacg aaa 23

<210> 143

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 143

aaaccgactc tacgccaact acg 23

<210> 144

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 144

ttcgtttagg ggcgttttcg 20

<210> 145

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 145

actcctctac ccgatactcg ca 22

<210> 146

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 146

ttttcggata tcggttttag cg 22

<210> 147

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 147

cacattcttc aaaacgacaa taaacg 26

<210> 148

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 148

ggatagagga ggatagtggt ttcgtt 26

<210> 149

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 149

cgtcgttatg tgtatttata gtttgttcg 29

<210> 150

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 150

gtcgtgttag tcgtaaagtt cgtcg 25

<210> 151

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 151

taacaaacaa cgcctcccgt ac 22

<210> 152

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 152

aaccaaccaa ataatacgac gacc 24

<210> 153

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 153

ttcgtcgagg tttcgtttcg t 21

<210> 154

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 154

tcgtagtagg tggttatgtt tagtcgc 27

<210> 155

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 155

gtttacggag aaggtgaggt cg 22

<210> 156

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 156

cgaggagaat cggttttacg ttag 24

<210> 157

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 157

gtgagtatcg gtttgtgtgc gtt 23

<210> 158

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 158

cgggagtcgg gtaaggtatt g 21

<210> 159

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 159

gtgcgggatt tagggttatt cg 22

<210> 160

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 160

gaaacgcccc gaaactaaac tc 22

<210> 161

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 161

ggttagattt aaagacggat cgagg 25

<210> 162

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 162

caaaaccctc tctacgcgac c 21

<210> 163

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 163

tcctaaacgt cacccgccta c 21

<210> 164

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 164

aaaatacgaa ttcccaaaaa cgc 23

<210> 165

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 165

gttgattagg gtgcgtatag tgttagg 27

<210> 166

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 166

caaataccta cgctatcccc tcg 23

<210> 167

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 167

gtgattatgg ttttaagttt taagcgttg 29

<210> 168

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 168

tttcgggttt gtagggagac g 21

<210> 169

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 169

aaattttatt tcggtcggtc gc 22

<210> 170

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 170

gaaacaaatc ccgacgacca ta 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 171

ggagttacga aaggtggtgt cg 22

<210> 172

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 172

cgggataggt tcgtcgtgtt c 21

<210> 173

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 173

cgtttcgtcg ttttcgtatt cg 22

<210> 174

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 174

gcgaatttta gttagattga ttgtttgttt 30

<210> 175

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 175

gtggcgcgtt tttgtaattt tagt 24

<210> 176

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 176

gtttgtggag ataaatttga gaagacg 27

<210> 177

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 177

gtatatacgt tatgtgtatg gtattggagg t 31

<210> 178

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 178

tagttttagt gcgcgtattt tcgc 24

<210> 179

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 179

aattattatc tacttcctcc ccgaaaa 27

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<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 180

gtagtggagt tcgaagttac gggtt 25

<210> 181

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 181

aacccgacga cacctaacta cg 22

<210> 182

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 182

atggatgaac gagattttta ttgttttta 29

<210> 183

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 183

acaaaaaaac acaccactcc caa 23

<210> 184

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 184

cgaaatccaa actaccgatc cgcctactc 29

<210> 185

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 185

gccgccgcta accacgaaac cc 22

<210> 186

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 186

aacgctctcc tcgcaaatat ccaactactc c 31

<210> 187

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 187

aacgcgaccc aaaaccgtca ccac 24

<210> 188

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 188

gacaccacgc tcccaaaatt aaaaccgc 28

<210> 189

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 189

cacgcgaccc cgaaccccaa c 21

<210> 190

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 190

acgaaacgca aacgaacaac gccaata 27

<210> 191

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 191

aaccgccact ccacgactac gaacg 25

<210> 192

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 192

accaacacgc gcaaactcac attaacg 27

<210> 193

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 193

gctaacatct tcccgaacac cgaaatccc 29

<210> 194

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 194

caactactaa cgctatccgc ctacgcccc 29

<210> 195

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 195

cgcaaacgaa ccgacgaccg aactacta 28

<210> 196

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 196

cccgacgcca cgcaaaacca 20

<210> 197

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 197

aaacgcgata aacgcctcga cgctaac 27

<210> 198

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 198

ccaaaaacac aaacccgtta tctaaaccga tcc 33

<210> 199

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 199

cctacctcgc tcctaataac ccaaaatccc c 31

<210> 200

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 200

ataacgcccg acgcccgacg 20

<210> 201

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 201

ccttctcctc atccgaaaac acgaacga 28

<210> 202

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 202

gcacgactct aaactctact cactcacgcc g 31

<210> 203

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 203

cgcctccaac ttcgctacta cgccaa 26

<210> 204

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 204

cgcccaacgc tacgccaaaa cc 22

<210> 205

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 205

caaaaccccg cgaaccgaat tacca 25

<210> 206

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 206

ctcccgacta cgcccgaatc cg 22

<210> 207

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 207

aatacactcc cgacgccgaa ccga 24

<210> 208

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 208

acgaaatacg aaccgccgaa taccaccc 28

<210> 209

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 209

cttttccccg ctcgcactct ccg 23

<210> 210

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 210

cgcacgcctt ccgaactacg acc 23

<210> 211

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 211

cgccgaataa acgacgaccg cc 22

<210> 212

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 212

aactccgaca ctaaaacacc caccccg 27

<210> 213

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 213

cgaataccga acaaccgcta tcgaaacg 28

<210> 214

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 214

cgcgaacgcg aactctacgc ctttaa 26

<210> 215

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 215

gatacgacac cgctaaccca aacccga 27

<210> 216

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 216

aacgccgacg acgaccgcct 20

<210> 217

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 217

ccaaccgaac gataacttta acgcaacgct a 31

<210> 218

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 218

aaacgaccgc taccgctact ctaaccgc 28

<210> 219

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 219

ctcgcccaac taccgccatt ctcctaat 28

<210> 220

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 220

tacgaaccgc cgacctacga aatacgc 27

<210> 221

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 221

ccgtcctctc cgcgtcctta aaaatctc 28

<210> 222

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 222

cgaccgccgc ctccgacc 18

<210> 223

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 223

aacgactaca ctacgaactt ctctccgccg 30

<210> 224

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 224

ccgctccttc ataaccgtcc actatacttc g 31

<210> 225

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 225

acgaaataaa acgcgacgcg acgc 24

<210> 226

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 226

cccgaaaaac cgctaccccc ga 22

<210> 227

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 227

accacccacc gtacccgcgc 20

<210> 228

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 228

cgacaacgta actcaaccta accccaacct c 31

<210> 229

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 229

ccgcctccta cctacacaac cgcttattct c 31

<210> 230

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 230

cgtaatcctc ccgcctcgac ctcc 24

<210> 231

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 231

cgccatctac acccgcaact cgc 23

<210> 232

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 232

ccgaaactcc tacgctatcc tacgctccg 29

<210> 233

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 233

cccgccccta aaccgaaacg c 21

<210> 234

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 234

cgcttctccg accgtacaac ccga 24

<210> 235

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 235

attccatatc ccacgaaaca cgcattttca 30

<210> 236

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 236

cttaactcac tataacctcc gcctccgaat tcaa 34

<210> 237

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 237

aaaccgacac gaaccgcaaa ccatctaat 29

<210> 238

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 238

acttcgataa caacttctaa ccaatcccca ca 32

<210> 239

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 239

aaccgaaacg aacgacgacg acgac 25

<210> 240

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 240

ttattcgcta ctacacgcca acaccaaaaa ca 32

<210> 241

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 241

ccgcccctct aaacgaaaac accgaa 26

<210> 242

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 242

gcgacactac gaacacaacc gaatcaacg 29

<210> 243

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 243

tccgccaaac ccgttccctt aactataatt tc 32

Claims

1.一种检测DNA甲基化分子标记物组合的试剂在制备胃癌淋巴结转移检测试剂盒中应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括SEQID NO.3～SEQ ID NO.60所示序列中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.3所示序列。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.4所示序列。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示序列中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示序列中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20所示序列中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.21～-SEQ ID NO.30所示序列中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40所示序列中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合还包括有SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.60所示序列中的至少一种。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合包括SEQID NO.1至SEQ ID NO.13所示序列的组合。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合包括为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.13所示序列，还包括选自SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.60所示序列中的至少一种的组合。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述DNA甲基化分子标记物组合为SEQID NO.1～SEQ ID NO.60所示序列的组合。

14.一种用于检测胃癌淋巴结转移的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测权利要求1～13任一项中所述的DNA甲基化分子标记物组合的甲基化水平的试剂；所述试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针。

15.根据权利要求14所述的用于检测胃癌淋巴结转移的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括针对DNA甲基化分子标记物的荧光定量PCR检测的引物和探针，所述引物和探针分别为：

针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.62和SEQ ID NO.123，以及SEQ ID NO.184；

和/或针对SEQ ID NO.39的SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.161，以及SEQ ID NO.222；

和/或针对SEQ ID NO.40的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.162，以及SEQ ID NO.223；

和/或针对SEQ ID NO.41的SEQ ID NO.102和SEQ ID NO.163，以及SEQ ID NO.224；

和/或针对SEQ ID NO.42的SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.164，以及SEQ ID NO.225；

和/或针对SEQ ID NO.43的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.165，以及SEQ ID NO.226；

和/或针对SEQ ID NO.44的SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.166，以及SEQ ID NO.227；

和/或针对SEQ ID NO.45的SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.167，以及SEQ ID NO.228；

和/或针对SEQ ID NO.46的SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.168，以及SEQ ID NO.229；

和/或针对SEQ ID NO.47的SEQ ID NO.108和SEQ ID NO.169，以及SEQ ID NO.230；

和/或针对SEQ ID NO.48的SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.170，以及SEQ ID NO.231；

和/或针对SEQ ID NO.49的SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.171，以及SEQ ID NO.232；

和/或针对SEQ ID NO.50的SEQ ID NO.111和SEQ ID NO.172，以及SEQ ID NO.233；

和/或针对SEQ ID NO.51的SEQ ID NO.112和SEQ ID NO.173，以及SEQ ID NO.234；

和/或针对SEQ ID NO.52的SEQ ID NO.113和SEQ ID NO.174，以及SEQ ID NO.235；

和/或针对SEQ ID NO.53的SEQ ID NO.114和SEQ ID NO.175，以及SEQ ID NO.236；

和/或针对SEQ ID NO.54的SEQ ID NO.115和SEQ ID NO.176，以及SEQ ID NO.237；

和/或针对SEQ ID NO.55的SEQ ID NO.116和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.238；

和/或针对SEQ ID NO.56的SEQ ID NO.117和SEQ ID NO.178，以及SEQ ID NO.239；

和/或针对SEQ ID NO.57的SEQ ID NO.118和SEQ ID NO.179，以及SEQ ID NO.240；

和/或针对SEQ ID NO.58的SEQ ID NO.119和SEQ ID NO.180，以及SEQ ID NO.241；

和/或针对SEQ ID NO.59的SEQ ID NO.120和SEQ ID NO.181，以及SEQ ID NO.242；

和/或针对SEQ ID NO.60的SEQ ID NO.121和SEQ ID NO.182，以及SEQ ID NO.243。

16.根据权利要求15所述的用于检测胃癌淋巴结转移的试剂盒，其特征在于，还包括针对内参基因的荧光定量PCR检测的引物和探针：SEQ ID NO.122和SEQ ID NO.183所示引物，以及SEQ ID NO.61所示探针。