CN105624279A - 胃癌标记物、其表达和甲基化检测方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胃癌标记物，所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQ？NO：1所示。本发明还公开了一种胃癌标记物在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用，一种胃癌标记物的表达检测方法、用于胃癌标记物的表达检测的试剂盒、胃癌标记物的甲基化检测方法、用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒和胃癌标记物在制备用于胃癌标记物的表达检测、胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒中的应用。本发明的胃癌标记物、其表达和甲基化检测方法、试剂盒可用于胃癌的早期的快速的无创性诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和肿瘤学领域，具体涉及一种胃癌标记物、胃癌标记物、其表达和甲基化检测方法、试剂盒及应用。
背景技术
在人类癌症中，受损的表观遗传学调节与基因突变同样普遍。这些机理在数量上和质量上发生了会导致选择性生长优势的基因表达变化，而这可能产生癌性转变的结果。与转录失活有关的基因启动子区CpG岛异常高甲基化是癌症中最常见的表观遗传学变化(epigeneticchange)。由于疾病的早期测定可能提高大多类型癌症的临床疗效结果，因此，对与癌症有关的异常的基因甲基化的确定反映了具有前景的新型生物标记物。
胃癌是第四大最常见的癌症，世界范围内其病死率居各种癌症死因第二位。[1Jemal,A.,etal.,Globalcancerstatistics.CACancerJClin.61(2):p.69-90.2.Coupland,V.H.,etal.,Hospitalvolume,proportionresectedandmortalityfromoesophagealandgastriccancer:apopulation-basedstudyinEngland,2004-2008.Gut.62(7):p.961-6.].虽然外科治疗和辅助治疗方法不断改进，但胃癌患者的预后仍不乐观，5年总体生存率少于25％[Camargo,M.C.,etal.,ImprovedsurvivalofgastriccancerwithtumourEpstein-Barrviruspositivity:aninternationalpooledanalysis.Gut.63(2):p.236-43.]。越来越多的证据表明启动子高甲基化导致的肿瘤抑制基因或肿瘤相关基因的失活对胃癌的发展起着十分重要的作用[Choi,I.S.andT.T.Wu,Epigeneticalterationsingastriccarcinogenesis.CellRes,2005.15(4):p.247-54.]。因此，研究胃癌的分子机制，明确其诊断和治疗靶点对早期诊断和治疗胃癌十分重要和紧迫。
MDGA2(MAMdomaincontainingglycosylphosphatidylinositolanchor2，MDGA2)位于染色体上肿瘤抑制基因区14q21.3(E.D.Litwack,etal.Mol.CellNeurosci.25(2004)263–274.)，可能参与细胞间相互作用(E.D.Litwack,etal.Mol.CellNeurosci.25(2004)263–274.S.Sano,etal.Genesis47(2009)505–513.)，目前对MDGA2的研究主要局限在神经系统领域(Sano,S.,etal.,CharacterizationofteleostMdga1usingagene-trapapproachinmedaka(Oryziaslatipes).Genesis,2009.47(8):p.505-13.Pettem,K.L.,etal.,Interactionbetweenautism-linkedMDGAsandneuroliginssuppressesinhibitorysynapsedevelopment.JCellBiol.200(3):p.321-36.Lee,K.,etal.,MDGAsinteractselectivelywithneuroligin-2butnototherneuroliginstoregulateinhibitorysynapsedevelopment.ProcNatlAcadSciUSA.110(1):p.336-41.Joset,P.,etal.,RostralgrowthofcommissuralaxonsrequiresthecelladhesionmoleculeMDGA2.NeuralDev.6:p.22.)，而在肿瘤特别是在胃癌发生发展过程中MDGA2的作用及临床应用价值尚不清楚。
发明内容
本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种胃癌标记物，可用于胃癌的早期判断。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种胃癌标记物在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用，可以用于制备诊断胃癌的试剂盒。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种胃癌标记物的表达检测方法，可以检测胃癌标记物的表达情况。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种用于胃癌标记物的表达检测的试剂盒，可以用于检测胃癌标记物的表达情况。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种胃癌标记物的甲基化检测方法，可以检测胃癌标记物的甲基化情况。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，可以用于检测胃癌标记物的甲基化情况。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供另一种胃癌标记物的甲基化检测方法，可以检测胃癌标记物的甲基化情况。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供另一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，可以用于检测胃癌标记物的甲基化情况。
本发明实施例的另一目的在于克服想有技术的上述不足，提供又一种胃癌标记物的甲基化检测方法，可以检测胃癌标记物的甲基化情况。
本发明实施例的另一目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种胃癌标记物在制备用于胃癌标记物的表达检测、胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种胃癌标记物，所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。
一种胃癌标记物在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用，所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。
一种胃癌标记物的表达检测方法，用于检测MDGA2的表达情况，包括：
提取RNA，包括提取胃癌细胞株的RNA，和从胃癌患者获得的胃癌组织及其癌旁正常组织中抽提RNA；
对所述RNA进行RT逆转录得到cDNA第一链；
以所述cDNA第一链作为模板，用PCR反应液进行PCR扩增得到PCR产物，所述PCR反应液中MDGA2的上游引物为：5’-TGGGCTGGATATGTTCATGTT-3’F，MDGA2的下游引物为5’-CTGATCTGTGGACGTGGATG-3’-R；
将所述PCR产物mRNA进行琼脂糖电泳，检测MDGA2的mRNA的表达情况，如果有观察到特异性条带，则表示MDGA2的mRNA有表达；如果没有观察到特异性条带，则表示MDGA2的mRNA没有表达。
一种用于胃癌标记物的表达检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述试剂盒用于检测MDGA2的表达情况，所述PCR反应液包括MDGA2的上游引物5’-TGGGCTGGATATGTTCATGTT-3’F和MDGA2的下游引物5’-CTGATCTGTGGACGTGGATG-3’-R。
一种胃癌标记物的甲基化检测方法，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，包括：
从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA；
将抽提的所述DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA；
用所述mDNA作为模板，用PCR反应液进行甲基化特异性PCR扩增得到扩增后的PCR产物，所述PCR反应液中甲基化上游引物为：5’-CGGTTTTCGGGTATTTCGG-3’F，甲基化下游引物为5’-TCGCGATTCCACTCACCG-3’R；非甲基化上游引物为：5’-AGTGGTTTTTGGGTATTTTGG-3’F,非甲基化下游引物为5’-CATCACAATTCCACTCACCA-3’R；
将所述扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，判断MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，如果只有甲基化引物有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为完全甲基化状态；如果只有非甲基化引物有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为完全非甲基化状态；如果甲基化引物和非甲基化引物均有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为不完全或半甲基化状态。
一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述试剂盒用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，所述PCR反应液包括甲基化上游引物5’-CGGTTTTCGGGTATTTCGG-3’F和甲基化下游引物5’-TCGCGATTCCACTCACCG-3’R；非甲基化上游引物5’-AGTGGTTTTTGGGTATTTTGG-3’F和非甲基化下游引物5’-CATCACAATTCCACTCACCA-3’R。
一种胃癌标记物的甲基化检测方法，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，包括：
从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA；
将抽提的所述DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA；
用所述mDNA作为模板，用PCR反应液进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增得到扩增后的PCR产物，所述PCR反应液中亚硫酸氢盐测序上游引物为5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物为5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R；
将所述扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，如果观察到有特异性条带，则通过亚硫酸氢盐测序测定MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化水平。
一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，包括PCR反应液，所述试剂盒用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，所述PCR反应液包括：亚硫酸氢盐测序上游引物5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R。
一种胃癌标记物的甲基化检测方法，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，包括：
从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA；
将抽提的所述DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA；
用所述mDNA作为模板，用PCR反应液进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增得到扩增后的PCR产物，所述PCR反应液中亚硫酸氢盐测序上游引物为5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物为5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R；
用联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法COBRA酶切所述扩增后的PCR产物得到COBRA酶切后的产物；
将所述COBRA酶切后的产物进行凝胶电泳，如果只观察到一条条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点没有甲基化；如果观察到两条或三条条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点有甲基化。
以及，一种胃癌标记物在制备用于胃癌标记物的表达检测、胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒中的应用，所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。
本发明明确证实了MDGA2是胃癌特异性甲基化异化基因，因此提示胃组织特异性表达基因MDGA2可用于胃癌的早期诊断。
本发明实施例的癌标记物在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用，可以根据胃癌标记物MDGA2在正常组织和癌组织中的基因表达不同、甲基化情况不同，使该试剂盒用于诊断胃癌，特别是胃癌的早期诊断。
本发明实施例的胃癌标记物的表达检测方法，针对特定的胃癌标记物MDGA2，通过选择适合的引物可以测定其表达情况，为胃癌的临床诊断和胃癌患者的预后提供科学依据。
本发明实施例的用于胃癌标记物的表达检测的试剂盒，可以方便地检测胃癌标记物MDGA2的表达情况。该试剂盒还可以根据胃癌标记物MDGA2的表达情况诊断胃癌。
本发明实施例的胃癌标记物的甲基化检测方法，针对特定的胃癌标记物MDGA2，通过采用特定的引物，采用MSP(Methylation-specificPCR，甲基化特异性PCR法)可以测定其甲基化情况。
本发明实施例的用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，可以方便地检测胃癌标记物MDGA2的甲基化情况。该试剂盒还可以根据胃癌标记物MDGA2的甲基化情况诊断胃癌。
本发明实施例的胃癌标记物的甲基化检测方法，针对特定的胃癌标记物MDGA2，通过采用特定的引物，采用BGS(bisulfitegenomicsequencing，亚硫酸氢盐测序)处理后再进行PCR扩增，可以测定其甲基化情况。
本发明实施例的用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，可以方便地检测胃癌标记物MDGA2的甲基化情况。该试剂盒还可以根据胃癌标记物MDGA2的甲基化情况诊断胃癌。
本发明实施例的胃癌标记物的甲基化检测方法，针对特定的胃癌标记物MDGA2，通过采用特定的引物，采用BGS(bisulfitegenomicsequencing，亚硫酸氢盐测序)处理后再进行PCR扩增，然后对COBRA酶切后的产物进行分析，可以测定其甲基化情况。
本发明实施例的胃癌标记物在制备用于胃癌标记物的表达检测、胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒中的应用，可以方便地检测胃癌标记物的表达情况和甲基化情况。
附图说明
图1为本发明实施例的胃癌细胞株的PCR产物电泳测试结果；
图2为本发明实施例的9对胃癌组织及其癌旁正常组织的PCR产物电泳测试结果；
图3为免疫组化处理后的MDGA2表达结果；
图4为免疫组化处理后的MDGA2染色结果；
图5为本发明实施例的胃癌细胞株去甲基化后的PCR产物电泳测试结果；
图6为本发明实施例的10对胃癌组织及其癌旁正常组织MSP扩增后的PCR产物电泳测试结果；
图7为本发明实施例的胃癌细胞株的亚硫酸氢盐测序PCR产物分析结果；
图8为本发明实施例的10对胃癌组织及其癌旁正常组织的亚硫酸氢盐测序PCR产物分析结果；
图9为本发明实施例的10对胃癌组织及其癌旁正常组织的甲基化结果；
图10为本发明实施例的非配对胃癌组织及正常胃组织的亚硫酸氢盐测序PCR产物分析结果；
图11为本发明实施例的胃癌组织及正常胃组织用亚硫酸氢盐测序引物扩增后的PCR产物进行联合亚硫酸氢钠限制性内切酶酶切后的产物进行凝胶电泳的测试结果；
图12为本发明实施例的218例胃癌患者的Kaplan-Meier曲线生存分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种胃癌标记物MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。该胃癌标记物基因由ensembl基因编号ENSG00000139915、entrez编号161357所确定。
本发明实施例还提供了一种胃癌标记物在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用。该胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。该诊断胃癌的试剂盒利用正常组织和胃癌组织中MDGA2基因表达的不同，或者MDGA2甲基化的情况来诊断胃癌。该试剂盒包括特殊设计的引物。该引物可以是用于检测MDGA2基因表达的引物，也可以是用于检测MDGA2甲基化的情况的引物。
本发明实施例还提供了一种胃癌标记物的表达检测方法，用于检测MDGA2的表达情况，包括：
步骤S01：提取RNA，包括提取胃癌细胞株的RNA，和从胃癌患者获得的胃癌组织及其癌旁正常组织中抽提RNA。
提取胃癌细胞株RNA时，每一种细胞株优选用约106个细胞构成的细胞团提RNA。
当从胃癌患者获得胃癌组织及其癌旁正常组织中抽提RNA时，步骤S01应用TRIzol试剂抽提胃癌组织及其癌旁正常组织的RNA，具体包括如下过程：
步骤S011：自液氮中取出胃癌组织及其癌旁正常组织，并分别向上述组织中加入TRI-zol试剂1ml。上述组织可以置于匀浆器中。
步骤S012：分别将胃癌组织及其癌旁正常组织充分研磨，加入氯仿200μl，充分震荡混匀，室温放置3分钟，然后在4℃的温度下，以12000rpm/min的转速，离心15分钟。
步骤S013：吸取上层水相，向上层水相中加异丙醇0.5ml，充分震荡混匀，室温放置10分钟，然后在4℃的温度下，以12000rpm/min的转速，离心10分钟。该步骤中，吸取的上层水相可转入另一试管中。
步骤S014：弃去上清液后，向RNA沉淀中加入75％乙醇1ml并振摇，充分洗涤沉淀，然后在4℃的温度下，以12000rpm/min的转速，离心5分钟。
步骤S015：弃去上清液后，将RNA沉淀空气干燥10分钟。
步骤S016：将干燥后的RNA沉淀悬于DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中，测定RNA浓度。上述测定RNA浓度的仪器为分光光度计。
步骤S017：测定浓度后的RNA于-80℃保存备用，可以采用冰箱作为保存的仪器。
步骤S02：对RNA进行RT逆转录得到cDNA第一链。
步骤S02包括如下具体过程为：
步骤S021：向总量为2μg的RNA中加入1μL的10mM的dNTP复合物(dNTPmixture)，1μL的OligodT12-18引物，再加入DEPC水至10μL得到第一混合液。
步骤S022：将第一混合液在65℃孵育5分钟，然后在冰中放置5分钟。
步骤S023：向第一混合液中加入2μL的10倍的逆转录缓冲液(10×RTbuffer)，4μL的25mM的MgCl2，2μL的0.1M的二硫苏糖醇DTT，1μL的RNaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂(RNaseoutRecombinantRNaseInhibitor)和1μL的SuperscriptⅡRT得到第二混合液。该第二混合液的体积为20μL。
步骤S024：第二混合液在42℃反应1小时，然后在70℃灭活逆转录酶15分钟，再加入核糖核酸酶H(RNaseH)1分钟，在37℃反应20分钟去除第二混合液中未反应的RNA。
步骤S03：以cDNA第一链作为模板，用PCR反应液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR反应液中MDGA2的上游引物为：5’-TGGGCTGGATATGTTCATGTT-3’F，下游引物为5’-CTGATCTGTGGACGTGGATG-3’-R。
该上游引物和下游引物是以胃癌标记物MDGA2为检测对象特异性设计的。由于在进行引物设计时，需要考虑二级结构、退火温度、扩增长度、GC含量、核苷酸序列等多种因素，还要考虑配对时避免出现二聚体和发卡结构等等，因此该上游引物和下游引物是发明人经过反复多次实验，付出创造性劳动得到的。
其中，PCR反应液具体组成为：11.2μL的重蒸水(ddH2O)、4μL的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL的2.5mM的dNTP、0.5μL的上游引物pF、0.5μL的下游引物pR、0.2μL的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL的模板(template)RNA。
作为内参的肌动蛋白ACTIN的上游引物为：5’-GTCTTCCCCTCCATCGTG-3’F，下游引物为5’-AGGGTGAGGATGCCTCTCTT-3’R。
步骤S03的具体过程依次为：在94℃预变性5min；在94℃变性30s；在56℃复性30s；在72℃延伸30s，循环40次；在72℃延伸10min。
步骤S04：将PCR产物mRNA进行琼脂糖电泳，检测MDGA2的mRNA的表达情况，如果有观察到特异性条带，则表示MDGA2的mRNA有表达；如果没有观察到特异性条带，则表示MDGA2的mRNA没有表达。
步骤S04的具体过程为：取5μL的PCR产物mRNA进行2％的琼脂糖凝胶电泳30min，经溴乙啶染色，紫外灯观察特异性条带情况，其中，MDGA2的PCR产物的片段为248bp，作为内参的ACTIN的PCR产物的片段为113bp。
针对上述胃癌标记物的表达检测方法，本发明实施例还提供了一种用于胃癌标记物的表达检测的试剂盒。该试剂盒用于检测MDGA2的表达情况。该试剂盒包括：PCR反应液。PCR反应液包括MDGA2的上游引物5’-TGGGCTGGATATGTTCATGTT-3’F，下游引物5’-CTGATCTGTGGACGTGGATG-3’-R。该试剂盒还可以用于根据胃癌标记物MDGA2的表达情况诊断胃癌。
PCR反应液具体组成为：11.2μL/管的重蒸水(ddH2O)、4μL/管的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL/管的2.5mM的dNTP、0.5μL/管的上游引物pF、0.5μL/管的下游引物pR、0.2μL/管的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL/管的模板(template)RNA。
本发明实施例还提供了一种胃癌标记物的甲基化检测方法，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况。该方法包括如下具体的步骤：
步骤S11：从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA。
步骤S12：将抽提的DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA(modifiedDNA)。
其中，DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒购自ZYMOResearch，为EZDNAMethylation-GoldTM试剂盒，货号：D5006，ZRC175078，根据该试剂盒附带的步骤说明将DNA进行亚硫酸氢盐处理。通过步骤S12的对DNA的亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
步骤S13：用mDNA作为模板，用PCR反应液进行甲基化特异性PCR扩增得到扩增后的PCR产物，PCR反应液中甲基化特异性上游引物为：5’-CGGTTTTCGGGTATTTCGG-3’F，下游引物为5’-TCGCGATTCCACTCACCG-3’R；非甲基化特异性上游引物为：5’-AGTGGTTTTTGGGTATTTTGG-3’F,下游引物为5’-CATCACAATTCCACTCACCA-3’R。
上述引物是以胃癌标记物MDGA2为检测对象特异性设计的。由于在进行引物设计时，需要考虑二级结构、退火温度、扩增长度、GC含量、核苷酸序列等多种因素，还要考虑配对时避免出现二聚体和发卡结构等等，因此该上游引物和下游引物是发明人经过反复多次实验，付出创造性劳动得到的。
其中，PCR反应液具体组成为：11.2μL的重蒸水(ddH2O)、4μL的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL的2.5mM的dNTP、0.5μL的上游引物pF、0.5μL的下游引物pR、0.2μL的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL的模板(template)RNA。
步骤S13的具体过程依次为：在94℃预变性5min；在94℃变性30s；在56℃复性30s；在72℃延伸30s，循环40次；在72℃延伸10min。
步骤S14：将扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，判断MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，如果只有甲基化引物有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为完全甲基化状态；如果只有非甲基化引物有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为完全非甲基化状态；如果甲基化引物和非甲基化引物均有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为不完全或半甲基化状态。
步骤S14的具体过程为：取5μLPCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳30min，经溴乙啶染色，紫外灯观察特异性条带情况。其中，甲基化引物和非甲基化引物的PCR产物的条带均为171bp。
针对上述胃癌标记物的甲基化检测方法，本发明实施例还提供了一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒。该试剂盒用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况。该试剂盒包括PCR反应液。该PCR反应液包括：甲基化上游引物5’-CGGTTTTCGGGTATTTCGG-3’F和甲基化下游引物5’-TCGCGATTCCACTCACCG-3’R；非甲基化上游引物5’-AGTGGTTTTTGGGTATTTTGG-3’F和非甲基化下游引物5’-CATCACAATTCCACTCACCA-3’R。该试剂盒还可以用于根据胃癌标记物MDGA2的甲基化情况诊断胃癌。
PCR反应液具体组成为：11.2μL/管的重蒸水(ddH2O)、4μL/管的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL/管的2.5mM的dNTP、0.5μL/管的上游引物pF、0.5μL/管的下游引物pR、0.2μL/管的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL/管的模板(template)RNA。
本发明实施例还提供了另一种胃癌标记物的甲基化检测方法，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况。该方法的具体过程包括：
步骤S21：从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA。
步骤S22：将抽提的DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA。
其中，DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒购自ZYMOResearch，为EZDNAMethylation-GoldTM试剂盒，货号：D5006，ZRC175078，根据该试剂盒附带的步骤说明将DNA进行亚硫酸氢盐处理。通过步骤S12的对DNA的亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
步骤S23：用mDNA作为模板，用PCR反应液进行亚硫酸氢盐测序(bisulfitegenomicsequencing，BGS)PCR扩增得到扩增后的PCR产物，PCR反应液中亚硫酸氢盐测序上游引物为5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物为5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R。
上述引物是以胃癌标记物MDGA2为检测对象特异性设计的。由于在进行引物设计时，需要考虑二级结构、退火温度、扩增长度、GC含量、核苷酸序列等多种因素，还要考虑配对时避免出现二聚体和发卡结构等等，因此该上游引物和下游引物是发明人经过反复多次实验，付出创造性劳动得到的。
其中，PCR反应液具体组成为：11.2μL的重蒸水(ddH2O)、4μL的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL的2.5mM的dNTP、0.5μL的上游引物pF、0.5μL的下游引物pR、0.2μL的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL的模板(template)RNA。
步骤S24：将扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，如果观察到有特异性条带，则通过亚硫酸氢盐测序测定MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化水平。其中PCR产物的条带为221bp。
通过亚硫酸氢盐测序测定MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化水平具体可以通过用SeqScape软件(AppliedBiosystems)和Bioedit(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)分析测序结果，定量得到甲基化的CpG位点的数量或CpG位点的甲基化状态。
针对上述胃癌标记物的甲基化检测方法，本发明实施例还提供了一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒。该试剂盒用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况。该试剂盒包括PCR反应液。该PCR反应液包括：亚硫酸氢盐测序上游引物5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R。该试剂盒还可以用于根据胃癌标记物MDGA2的甲基化情况诊断胃癌。
PCR反应液具体组成为：11.2μL/管的重蒸水(ddH2O)、4μL/管的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL/管的2.5mM的dNTP、0.5μL/管的上游引物pF、0.5μL/管的下游引物pR、0.2μL/管的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL/管的模板(template)RNA。
本发明实施例还提供了又一种胃癌标记物的甲基化检测方法，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况。该方法的具体过程包括：
步骤S31：从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA。
步骤S32：将抽提的DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA。
其中，DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒购自ZYMOResearch，为EZDNAMethylation-GoldTM试剂盒，货号：D5006，ZRC175078，根据该试剂盒附带的步骤说明将DNA进行亚硫酸氢盐处理。通过步骤S12的对DNA的亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。
步骤S33：用该mDNA作为模板，用PCR反应液进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增得到扩增后的PCR产物，PCR反应液中亚硫酸氢盐测序上游引物为5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物为5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R。
其中，PCR反应液具体组成为：11.2μL的重蒸水(ddH2O)、4μL的10倍的缓冲液(10×buffer)、1.6μL的2.5mM的dNTP、0.5μL的上游引物pF、0.5μL的下游引物pR、0.2μL的TaqHS聚合酶(TaqHSPolymerase)和2μL的模板(template)RNA。
步骤S34：用联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法COBRA酶切该扩增后的PCR产物得到COBRA酶切后的产物。
步骤S35：将COBRA酶切后的产物进行凝胶电泳，如果只观察到一条条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点没有甲基化；如果观察到两条或三条条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点有甲基化。
上述胃癌标记物的甲基化检测方法可以采用用于BGS法的试剂盒。
本发明实施例还提供了一种胃癌标记物在制备用于胃癌标记物的表达检测、胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒中的应用。该胃癌标记物MDGA2的核苷酸序列如SEQNO：1所示。
下面以具体实施例对本发明的方法做进一步说明。
实施例1胃癌标记物的表达检测
该实施例采用本发明的胃癌标记物的表达检测方法，即步骤S01～S04。
其中，步骤S01中采用的胃癌细胞株包括11种胃癌细胞株，具体为：AGS、BGC823、MGC803、MKN1、MKN28、MKN45、NCI-N87、SNU1、SNU16、SNU638和SNU719，每一种细胞株用约106个细胞构成的细胞团提RNA。步骤S01采用的胃癌组织及其相应的癌旁正常组织为9对胰腺组织。步骤S02中的RNA浓度A260/280的比值位于1.8～2.0之间。
如图1所示，为本发明实施例的胃癌细胞株的PCR产物电泳测试结果。其中MDGA2指示的泳道(lane)是MDGA2基因的表达，β-actin指示的泳道是作为内参的肌动蛋白ACTIN基因的表达。MDGA2指示的泳道的结果显示：逆转录PCR检测到胃癌细胞株中MDGA2基因表达沉默或下调。如图2所示，为本发明实施例的9对胃癌组织及其癌旁正常组织的PCR产物电泳测试结果。其中MDGA2指示的泳道是MDGA2基因的表达，β-actin指示的泳道是作为内参的肌动蛋白ACTIN基因的表达。MDGA2指示的泳道的结果显示：在9对胃癌组织及其相应的癌旁正常组织中，胃癌组织中MDGA2信使RNA表达下调或沉默。
对比例1
对20对胃癌组织及其癌旁正常组织采用免疫组化处理，具体过程如下：
20对胃癌组织及其癌旁正常组织迅速用中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋制备厚5μm连续切片，采用常规SP法进行免疫组化染色：(1)胃癌组织及其癌旁正常组织石蜡切片常规烤片、脱蜡至水：石蜡切片置于60℃烤箱中1小时；室温下二甲苯浸片15分钟，两次；室温下100％、95％、70％乙醇依次浸片，各15分钟各一次；室温下蒸馏水浸片15分钟，两次。(2)3％过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶室温20分钟；PBS洗3次各5分钟。(3)微波加热5分钟修复抗原。PBS冲洗5分钟，共3次。(4)室温下滴加2％山羊血清封闭液，孵育1小时。(5)甩去多余液体，滴加1：100稀释的兔抗人MDGA2一抗50μl，4℃过夜，PBS代替一抗作阴性对照。4℃过夜后在37℃复温45分钟；PBS冲洗5分钟，共3次。(6)滴加即用型羊抗兔二抗50μl，室温下作用1小时；PBS洗3次各5分钟。(7)DAB显色10分钟，在显微镜下掌握染色程度；水洗10分钟；苏木精复染2分钟，水洗。(8)室温下常规脱水、透明：70％、95％、100％乙醇依次浸片，各5分钟；二甲苯浸片5分钟，两次；干燥。(9)中性树胶封片后光镜下观察并摄片。结果判定：MDGA2的表达以组织中出现棕黄色颗粒者为MDGA2蛋白阳性表达。每张切片随机观察5个高倍视野，分别计算阳性细胞数和总细胞数，阳性率＝阳性细胞数/总细胞数×100％。免疫组化结果提示，癌旁正常组织比胃癌组织MDGA2表达水平高(参见图3和图4，图3和图4均为免疫组化结果，图3为免疫组化代表图，图4是将20对胃癌组织及其癌旁正常组织进行免疫组化染色，将胃癌标记物MDGA2阳性染色结果用百分比量化后的图)。图3中N表示正常组织，T表示患癌部分。
免疫组化提示在20对胃癌组织及其相应的癌旁正常组织中，胃癌组织中MDGA2蛋白表达下调或沉默。由此，可以验证实施例1的方法的结果准确。
实施例2胃癌标记物的甲基化检测
该实施例采用本发明的胃癌标记物的甲基化检测方法，即步骤S11～步骤S14。
步骤S11中抽提的DNA分别来自11种胃癌细胞株，具体为：AGS、BGC823、MGC803、MKN1、MKN28、MKN45、NCI-N87、SNU1、SNU16、SNU638和SNU719。如图1所示，为本发明实施例的胃癌细胞株的PCR产物电泳测试结果。其中，U用于指示未被甲基化的MSP产物的泳道；M用于指示被甲基化的MSP产物的泳道。泳道U中的可见PCR产物说明了存在未被甲基化的等位基因，而泳道M中的PCR产物说明了存在被甲基化的等位基因。通过MSP处理后发现，11株胃癌细胞株中有10株(90.9％)启动子区CpG位点为完全甲基化状态，包括AGS、BGC823、MGC803、MKN28、MKN45、NCI-N87、SNU1、SNU16、SNU638和SNU719的MDGA2，而只有MKN1细胞株和正常胃组织对照为完全非甲基化状态。如图5所示，为本发明实施例的胃癌细胞株去甲基化后的PCR产物电泳测试结果。其中MDGA2指示的泳道是MDGA2基因的表达，β-actin指示的泳道是作为内参的肌动蛋白ACTIN基因的表达。用脱甲基试剂5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷(缩写：5Aza)去甲基化处理后，MDGA2信使RNA表达恢复。
步骤S11中抽提的DNA还可以来自10对胃癌患者组织。如图6所示，为本发明实施例的10对胃癌组织及其癌旁正常组织MSP扩增后的PCR产物电泳测试结果。其中，U用于指示未被甲基化的MSP产物的泳道，M用于指示被甲基化的MSP产物的泳道。对10对胃癌组织及其癌旁非肿瘤组织进行MSP分析：泳道U中的可见PCR产物说明了存在未被甲基化的等位基因，而泳道M中的PCR产物说明了存在被甲基化的等位基因。
实施例3胃癌标记物的甲基化检测
该实施例采用本发明的胃癌标记物的甲基化检测方法，即步骤S21～步骤S24。
步骤S21中抽提的DNA来自11种胃癌细胞株，具体为：AGS、BGC823、MGC803、MKN1、MKN28、MKN45、NCI-N87、SNU1、SNU16、SNU638和SNU719。如图7所示，为本发明实施例的胃癌细胞株的亚硫酸氢盐测序PCR产物分析结果。通过BGS分析发现，11株胃癌细胞株中有10株(90.9％)的启动子区CpG位点甲基化比率大于80％，而MKN1细胞株和正常胃组织对照的启动子区CpG位点甲基化百分比为17.8％，0％。
步骤S21中抽提的DNA还可以来自10对胃癌患者组织。如图8所示，为本发明实施例的10对胃癌组织及其癌旁正常组织的亚硫酸氢盐测序PCR产物分析结果。对这10对胃癌组织及其癌旁正常(非肿瘤组织)进行BGS分析进一步确认了胃癌组织MDGA2的甲基化水平明显比其癌旁非肿瘤组织高。胃癌组织中的MDGA2的启动子区CpG位点为甲基化状态，而对应的癌旁正常组织的MDGA2的启动子区CpG位点为非甲基化状态。胃癌组织中的MDGA2的启动子区CpG位点甲基化百分比也远远大于其对应的癌旁正常组织MDGA2的启动子区CpG位点甲基化百分比。如图9所示，为本发明实施例的10对胃癌组织及其癌旁正常组织的甲基化百分比。
步骤S21中抽提的DNA还可以来自非配对胃癌组织及正常胃组织。对非配对的胃癌组织及正常胃组织中MDGA2的启动子区CpG位点甲基化水平进行BGS检测，也提示胃癌患者组织中MDGA2的启动子区CpG位点甲基化百分比远远大于正常胃组织中MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化百分比。如图10所示，为本发明实施例的非配对胃癌组织及正常胃组织的亚硫酸氢盐测序PCR产物分析结果。BGS分析进一步确定了胃癌组织中MDGA2的启动子区CpG位点甲基化水平明显高于正常胃组织。
实施例4胃癌标记物的甲基化检测
该实施例采用本发明的胃癌标记物的甲基化检测方法，即步骤S31～步骤S34。
步骤S31抽提的DNA来自11种胃癌细胞株，具体为：AGS、BGC823、MGC803、MKN1、MKN28、MKN45、NCI-N87、SNU1、SNU16、SNU638和SNU719。COBRA和BGS的区域如图7所示。图7中一个典型的CpG岛横跨MDGA2的启动子区。每一个竖杠代表一个CpG位点。转录起始点由一个弯曲的箭头表示。BGS分析进一步确定了胃癌细胞株中MDGA2的甲基化水平。
步骤S31抽提的DNA还可以为218例胃癌患者组织及17例正常胃组织的DNA。
如图11所示，为本发明实施例的胃癌组织及正常胃组织用亚硫酸氢盐测序引物扩增后的PCR产物进行联合亚硫酸氢钠限制性内切酶酶切后的产物进行凝胶电泳的测试结果。通过该结果可以判断该胃癌患者MDGA2基因启动子区CpG位点的甲基化状态。用COBRA分析了胃癌组织和正常胃组织中MDGA2启动子区CpG位点甲基化水平，未被消化的片段(U指示的泳道)代表未甲基化的DNA；消化的片段(M指示的泳道)代表甲基化的DNA。
对218例胃癌患者进行COBRA分析，结果提示MDGA2启动子区CpG位点甲基化在胃癌患者中频繁发生(62.39％，136/218)，而在正常胃组织中基本没有MDGA2启动子区CpG位点甲基化(9.17％，2/17)。该结果提示MDGA2启动子区CpG位点甲基化是肿瘤特异性的。
对这些患者进行Kaplan-Meier曲线和log-ranktest生存分析；并将这些患者按照TNM分期，然后对早期(TNMI/II)和晚期(TNMIII及TNMIII)胃癌患者分别进行Kaplan-Meier曲线和log-ranktest生存分析。为了避免和胃癌不相关的死亡可能性，对胃癌患者的生存分析限定在5年，P值小于0.05被认为有统计学意义。如表1和图12所示，为本发明实施例的218例胃癌患者的Kaplan-Meier曲线生存分析结果。其中，M代表甲基化，U代表非甲基化；N代表正常组织，T代表肿瘤组织。对218位胃癌患者进行的Kaplan-Meier曲线生存分析提示有MDGA2启动子区CpG位点甲基化(M)的患者生存时间明显短于非甲基化(U)患者(p＝0.001)。对胃癌患者进行肿瘤分期后再进行Kaplan-Meier曲线生存分析，提示在TNM肿瘤分期I/II期的患者中，有MDGA2启动子区CpG位点甲基化(M指示的曲线表示)的患者生存时间明显短于非甲基化(U指示的曲线表示)的患者(p＝0.024)。然而在TNM肿瘤分期III期或IV期的患者中，有MDGA2启动子区CpG位点甲基化(M指示的曲线表示)的患者生存时间与非甲基化(U指示的曲线表示)的患者没有明显差异。上述结果表明，有MDGA2启动子区CpG位点甲基化的患者总体生存时间明显短于无MDGA2启动子区CpG位点甲基化的患者，特别是在胃癌早期，这种差异非常显著，而在胃癌晚期无差异。因素回归分析提示MDGA2启动子区CpG位点甲基化是胃癌患者生存的一个独立风险因素。对这些信息进行多因素cox回归分析，从图12中还可以看出，MDGA2启动子区CpG位点甲基化是胃癌患者预后的独立风险因素(p<0.05)。
表1本发明实施例的218例胃癌患者的Kaplan-Meier曲线生存分析结果
| 变量 | RP(95％CI) | P值 |
| 年龄 | 1.001(0.987～1.014) | 0.935 |
| 性别 | ||
| 男性 | 1.145(0.785～1.670) | 0.481 |
| 女性 | 1 | |
| TNM期 | ||
| Ⅰ | 0.105(0.045～0.248) | ＜0.001 |
| Ⅱ | 0.215(0.117～0.394) | ＜0.001 |
| Ⅲ | 0.241(0.157～0.369) | ＜0.001 |
| Ⅳ | 1 | |
| 癌组织中MDGA2甲基化 | ||
| 有 | 1.851(1.208～2.836) | 0.005 |
| 无 | 1 |
上述结果表明可以根据MDGA2基因启动子区CpG位点的甲基化状态预测胃癌患者的5年生存率，特别对于早期预测胃癌患者的5年生存率有意义。
综上所述，本发明明确证实了胃组织特异性表达基因MDGA2是胃癌特异性甲基化异化基因，因此提示胃组织特异性表达基因MDGA2可用于胃癌的早期诊断，可作为胃癌早期诊断预后标志。通过分别采用MSP、BGS和COBRA方法，均可以检测与人胃癌预后及生存率相关的MDGA2基因甲基化程度，为胃癌的临床诊断和胃癌患者的预后提供科学依据。
发明人发现与正常胃组织及成对的癌旁正常组织比较，胃组织特异性表达基因MDGA2在胃癌细胞及胃癌组织中表达下调或缺失。针对MDGA2启动子区-1467至-1247的CpG岛(包括19个CpG位点)，设计并合成MSP引物及BGS引物，扩增MDGA2启动子活性区域，并对胃癌细胞、胃癌组织和正常胃组织及成对的癌旁正常组织进行经亚硫酸氢盐处理后的基因组测序(BGS)发现，表观遗传学中的甲基化可能参与了MDGA2基因的表达调控。
通过对胃癌细胞及胃癌组织进行MSP及BGS检测发现，MDGA2基因启动子CpG岛中CpG位点在正常胃组织及成对的癌旁正常组织中处于非甲基化状态，而在MDGA2表达缺失的胃癌细胞及胃癌组织中却存在高度的甲基化。用甲基化酶抑制剂5-氮-2脱氧胞苷处理MDGA2基因表达缺失的胃癌细胞，可恢复MDGA2的表达。上述这些发现提示MDGA2表达缺失和该基因的甲基化密切相关，胃组织特异性表达基因MDGA2是胃癌特异性甲基化异化基因。
发明人还发现通过测定胃癌患者MDGA2基因启动子区CpG位点的甲基化状态预测胃癌患者的5年生存率，特别对于早期预测胃癌患者的5年生存率有意义。
用本发明的胃组织特异性表达基因MDGA2启动子区甲基化检测方法，从胃癌患者组织、大便或血浆中提取DNA，再经过亚硫酸氢盐处理，即可进行MDGA2启动子区CpG位点特异性甲基化检测，可以定量检测各人群组织、大便或血浆中MDGA2启动子区CpG位点甲基化状态，从而预测胃癌的患病风险，筛查易感者，并对胃癌患者做出早期、快速的无创性诊断。
利用本发明的检测系统(例如PCR仪器)检测组织、大便或血浆中的MDGA2启动子区CpG位点甲基化状态的灵敏度高，只需经亚硫酸盐修饰后50ngmDNA即可定量检测出MDGA2的甲基化状态。本发明的检测系统操作简便、稳定性好，不仅可以用于胃癌的早期诊断，而且适合用于胃癌的早期大规模人群筛查与患病风险预测，为胃癌的早期诊断与防治提供了强有力的技术支持，具有深远的临床意义和推广性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胃癌标记物，其特征在于：所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。
2.一种胃癌标记物在制备诊断胃癌的试剂盒中的应用，其特征在于：所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。
3.一种胃癌标记物的表达检测方法，其特征在于，用于检测MDGA2的表达情况，包括：
提取RNA，包括提取胃癌细胞株的RNA，和从胃癌患者获得的胃癌组织及其癌旁正常组织中抽提RNA；
对所述RNA进行RT逆转录得到cDNA第一链；
以所述cDNA第一链作为模板，用PCR反应液进行PCR扩增得到PCR产物，所述PCR反应液中MDGA2的上游引物为：5’-TGGGCTGGATATGTTCATGTT-3’F，MDGA2的下游引物为5’-CTGATCTGTGGACGTGGATG-3’-R；
将所述PCR产物mRNA进行琼脂糖电泳，检测MDGA2的mRNA的表达情况，如果有观察到特异性条带，则表示MDGA2mRNA有表达；如果没有观察到特异性条带，则表示MDGA2的mRNA没有表达。
4.一种用于胃癌标记物的表达检测的试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述试剂盒用于检测MDGA2的表达情况，所述PCR反应液包括MDGA2的上游引物5’-TGGGCTGGATATGTTCATGTT-3’F和MDGA2的下游引物5’-CTGATCTGTGGACGTGGATG-3’-R。
5.一种胃癌标记物的甲基化检测方法，其特征在于，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，包括：
从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA；
将抽提的所述DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA；
用所述mDNA作为模板，用PCR反应液进行甲基化特异性PCR扩增得到扩增后的PCR产物，所述PCR反应液中甲基化上游引物为：5’-CGGTTTTCGGGTATTTCGG-3’F，甲基化下游引物为5’-TCGCGATTCCACTCACCG-3’R；非甲基化上游引物为：5’-AGTGGTTTTTGGGTATTTTGG-3’F,非甲基化下游引物为5’-CATCACAATTCCACTCACCA-3’R；
将所述扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，判断MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，如果只有甲基化引物有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为完全甲基化状态；如果只有非甲基化引物有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为完全非甲基化状态；如果甲基化引物和非甲基化引物均有特异性条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点为不完全或半甲基化状态。
6.一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于：所述试剂盒用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，所述PCR反应液包括甲基化上游引物5’-CGGTTTTCGGGTATTTCGG-3’F和甲基化下游引物5’-TCGCGATTCCACTCACCG-3’R；非甲基化上游引物5’-AGTGGTTTTTGGGTATTTTGG-3’F和非甲基化下游引物5’-CATCACAATTCCACTCACCA-3’R。
7.一种胃癌标记物的甲基化检测方法，其特征在于，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，包括：
从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA；
将抽提的所述DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA；
用所述mDNA作为模板，用PCR反应液进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增得到扩增后的PCR产物，所述PCR反应液中亚硫酸氢盐测序上游引物为5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物为5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R；
将所述扩增后的PCR产物进行琼脂糖电泳鉴定，如果观察到有特异性条带，则通过亚硫酸氢盐测序测定MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化水平。
8.一种用于胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述试剂盒用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，所述PCR反应液包括：亚硫酸氢盐测序上游引物5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R。
9.一种胃癌标记物的甲基化检测方法，其特征在于，用于检测MDGA2的启动子区CpG位点的甲基化情况，包括：
从胃癌患者获得的组织、大便或血液样品中抽提DNA；
将抽提的所述DNA用亚硫酸氢盐处理得到mDNA；
用所述mDNA作为模板，用PCR反应液进行亚硫酸氢盐测序PCR扩增得到扩增后的PCR产物，所述PCR反应液中亚硫酸氢盐测序上游引物为5’-TTATTTTGGGTTTAAGGTGGTAGTT-3’F，亚硫酸氢盐测序下游引物为5’-CCCTCCTTTACTCTACCTTCCTATATC-3’R；
用联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法COBRA酶切所述扩增后的PCR产物得到COBRA酶切后的产物；
将所述COBRA酶切后的产物进行凝胶电泳，如果只观察到一条条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点没有甲基化；如果观察到两条或三条条带，则表示MDGA2的启动子区CpG位点有甲基化。
10.一种胃癌标记物在制备用于胃癌标记物的表达检测、胃癌标记物的甲基化检测的试剂盒中的应用，其特征在于：所述胃癌标记物为MDGA2，其核苷酸序列如SEQNO：1所示。
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