CN114317736B - 用于泛癌种检测的甲基化标志物组合及其应用 - Google Patents

用于泛癌种检测的甲基化标志物组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合和应用，该标志物组合可以用于检测肺癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌等33种癌的标记物。本发明提供的标志物在癌症检测中同时具有很高的敏感性和特异性，适用于肿瘤的无创筛查、辅助诊断以及复发监测等。

Description

用于泛癌种检测的甲基化标志物组合及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及用于泛癌种检测的甲基化标志物及其组合和应用。
背景技术
众所周知，癌症已成为威胁人类健康的头号杀手。据世卫组织国际癌症研究机构，2020年中国新发癌症人数全球最多，约457万人，其中新发病例数前十的是：肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、食管癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌和宫颈癌。世界卫生组织提出，近一半的癌症是可以预防的。三分之一的癌症可以通过癌症筛查及早发现、明确诊断。
DNA甲基化在调节基因表达中起重要作用。DNA甲基化的异常改变与很多疾病的发生和维持有着紧密联系。大量研究表明DNA甲基化在癌症的诱发和维持中起着重要作用，使之成为泛癌种检测的很好的生物标志物。
发明内容
本发明的目的之一是提供泛癌种之一的肺癌的甲基化标志物组合。
一种用于检测肺癌的甲基化标志物组合，该组合包括以下标记物：cg08089301,cg13795264,cg14458834,cg26327071,cg25832771,cg21901718,cg07438617,cg21546671,cg04167903,cg02978421,cg17839237,cg25365565,cg03257575,cg26049726,cg19081437,cg25092681,cg26744375,cg17003293,cg08869573,和cg00466108。
本发明的目的之二是提供泛癌种之一的乳腺癌的甲基化标志物组合。
一种用于检测乳腺癌的甲基化标志物组合，该组合包括以下标记物：cg01016662,cg01313313,cg11267829,cg17652435,cg23855505,cg09695735,cg03562044,cg17093995,cg02435495,cg25832771,cg11856078,cg08382226,cg02474799,cg03257575,cg22260952。
本发明的目的之三是提供泛癌种之一的乳腺癌的甲基化标志物组合。
一种用于检测肝癌的甲基化标志物组合，该组合包括以下标记物：cg18233405,cg14263942,cg14570307,cg11176990,cg03757145,cg03468349,cg20353496,cg21825027,cg14251622,cg04148762。
本发明的目的之四是提供泛癌种之一的乳腺癌的甲基化标志物组合。
一种用于检测前列腺癌的甲基化标志物组合，该组合包括以下标记物：cg23855505,cg17498803,cg16232979,cg26149167,cg17355294,cg22260952,cg05402599,cg14210694,cg15233183,cg23095615。
本发明的目的之五是提供泛癌种之一的乳腺癌的甲基化标志物组合。
一种用于检测膀胱癌的甲基化标志物组合，该组合包括以下标记物：cg26970841,cg21901718,cg25160978,cg03978375,cg08382226,cg25927164,cg25832771,cg14665813,cg15906409,cg01556502。
本发明的目的之六是提供泛癌种之一的乳腺癌的甲基化标志物组合。
一种用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合，包括上述用于肺癌检测的甲基化标志物组合和选自目的2至5中的至少一种所述的甲基化标志物组合。
在其中一些实施例中，用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合包括全部上述的甲基化标志物组合。
在其中一些实施例中，用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合包括本发明的说明书中表1的全部甲基化标志物。
本发明的目的之七是提供上述甲基化标志物组合的应用，包括以下技术方案。
检测上述甲基化标志物组合(cg08089301,cg13795264,cg14458834,cg26327071,cg25832771,cg21901718,cg07438617,cg21546671,cg04167903,cg02978421,cg17839237,cg25365565,cg03257575,cg26049726,cg19081437,cg25092681,cg26744375,cg17003293,cg08869573,和cg00466108)的甲基化水平的试剂在制备肺癌检测试剂盒中的应用。
检测上述甲基化标志物组合(cg01016662,cg01313313,cg11267829,cg17652435,cg23855505,cg09695735,cg03562044,cg17093995,cg02435495,cg25832771,cg11856078,cg08382226,cg02474799,cg03257575,cg22260952)的甲基化水平的试剂在制备乳腺癌检测试剂盒中的应用。
检测上述甲基化标志物组合(cg18233405,cg14263942,cg14570307,cg11176990,cg03757145,cg03468349,cg20353496,cg21825027,cg14251622,cg04148762)的甲基化水平的试剂在制备肝癌癌检测试剂盒中的应用。
检测上所述甲基化标志物组合(cg23855505,cg17498803,cg16232979,cg26149167,cg17355294,cg22260952,cg05402599,cg14210694,cg15233183,cg23095615)的甲基化水平的试剂在制备前列腺癌检测试剂盒中的应用。
检测上述甲基化标志物组合(cg26970841,cg21901718,cg25160978,cg03978375,cg08382226,cg25927164,cg25832771,cg14665813,cg15906409,cg01556502)的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌检测试剂盒中的应用。
检测上述甲基化标志物组合的甲基化水平的试剂在制备泛癌检测试剂盒中的应用。
本发明的目的之八是提供检测泛癌种的试剂盒，包括以下技术方案。
一种检测肺癌的试剂盒，包括检测上述肺癌所述甲基化标志物组合(cg08089301,cg13795264,cg14458834,cg26327071,cg25832771,cg21901718,cg07438617,cg21546671,cg04167903,cg02978421,cg17839237,cg25365565,cg03257575,cg26049726,cg19081437,cg25092681,cg26744375,cg17003293,cg08869573,和cg00466108)的甲基化水平的试剂。
一种检测乳腺癌的试剂盒，包括检测上述甲基化标志物组合(cg01016662,cg01313313,cg11267829,cg17652435,cg23855505,cg09695735,cg03562044,cg17093995,cg02435495,cg25832771,cg11856078,cg08382226,cg02474799,cg03257575,cg22260952)的甲基化水平的试剂。
一种检测肝癌的试剂盒，包括有检测所述甲基化标志物组合(cg18233405,cg14263942,cg14570307,cg11176990,cg03757145,cg03468349,cg20353496,cg21825027,cg14251622,cg04148762)的甲基化水平的试剂。
一种检测前列腺癌的试剂盒，包括有检测所述甲基化标志物组合(cg23855505,cg17498803,cg16232979,cg26149167,cg17355294,cg22260952,cg05402599,cg14210694,cg15233183,cg23095615)的甲基化水平的试剂。
一种检测膀胱癌的试剂盒，包括有所述甲基化标志物组合(cg26970841,cg21901718,cg25160978,cg03978375,cg08382226,cg25927164,cg25832771,cg14665813,cg15906409,cg01556502)的甲基化水平的试剂。
一种检测泛癌种的试剂盒，包括有上述任一所述甲基化标志物组合的甲基化水平的试剂。
在其中一些实施例中，所述泛癌种包括肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、急性粒细胞白血病、肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、子宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、间皮瘤、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、子宫内膜癌、葡萄膜黑色素瘤。
本发明的目的之八是提供一种泛癌种的检测方法。
一种泛癌种的检测方法，包括以下步骤：
提取将待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行如上述所述DNA甲基化标记物组合的共甲基化检测。
在其中一些实施例中，所述生物样品为血液、粪便、组织、尿液或其它可提取DNA的生物样本，例如肿瘤组织、痰液、脑脊液。
本发明提供的上万个甲基化标志物及其组合能够检测33种癌症：急性粒细胞白血病、肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、子宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肝癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、间皮瘤、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、子宫内膜癌、葡萄膜黑色素瘤。本发明提供的标志物在癌症检测中同时具有很高的敏感性和特异性，适用于肿瘤的无创筛查、辅助诊断以及复发监测等。
附图说明
图1以本发明实施例1中所述的上万个甲基化标志物构建的诊断模型在区分肠癌组织样本和正常癌旁组织样本中的ROC曲线。
图2以本发明实施例2中所述的20个肺癌特异的甲基化标志物构建的诊断模型在区分肺癌组织样本和良性肺结节样本中的ROC曲线。
图3以本发明实施例3中所述的15个乳腺癌特异的甲基化标志物构建的诊断模型在区分乳腺癌组织样本和良性乳腺结节样本中的ROC曲线。
图4以本发明实施例4中所述的10个肝癌特异的甲基化标志物构建的诊断模型在区分肝癌组织样本和癌旁正常组织样本中的ROC曲线。
图5以本发明实施例5中所述的10个前列腺癌特异的甲基化标志物构建的诊断模型在区分前列腺癌组织样本和癌旁正常组织样本中的ROC曲线
图6以本发明实施例6中所述的10个膀胱癌特异的甲基化标志物构建的诊断模型在区分膀胱癌组织样本和癌旁正常组织样本中的ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列，该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。
如本发明所用，术语“核酸检测”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法。
术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。
术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”(下文定义)的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
如本文所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
术语“甲基化测定”或“甲基化水平检测”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
泛癌(pan-cancer)就是多种癌症的简称。在本发明中具体指在不同肿瘤类型中发现的甲基化标志物的相似性和差异性。
本发明所涉及到的生物标志物，具体见表1。
表1：本发明所述泛癌检测的甲基化生物标志物
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本发明一些实施例中，还涉及了一种用于泛癌种检测的甲基化标志物及其组合，通过提取生物样本(包括但不限于肿瘤组织、血清、血浆、尿液、痰液、粪便、脑脊液)中的DNA，然后进行文库制备，接着对测序文库利用Illumina的Hiseq X ten进行高通量测序从而一次检测上万个甲基化标志物，并通过机器学习算法构建分类模型，实现癌症患者和非癌症个体(良性疾病患者或者健康对照)的准确分类。
本发明的实施例中，检测标志物甲基化水平的方法包括如下步骤：
步骤1DNA的亚硫酸盐转化
1.取10ng DNA至200μL low bind PCR管中，DNA体积不足20μL则加EB补足；
2.加入130μL Lightning Conversion Reagent(闪电转换试剂)，涡流充分混匀，离心10秒；
3.将移液器调至75μL，混匀液体10次，转移75μL混合液至新的200μL lowbind PCR管中，将两个PCR管一起进行PCR反应；
4.PCR程序：98℃8min→54℃60min→4℃ Hold(Hold<20h)，热盖105℃，体积75μL；
5.将Zymo-SpinTMIC Column(柱)放入收集管中，再加入600μL的M-BindingBuffer到Zymo-SpinTMIC Column中；
6.从PCR仪中取出反应后的PCR管并简单离心30s，加入150μL反应后的样品到Zymo-SpinTMIC Column中；
7.压紧收集管和Column并上下颠倒混匀至少12次，于12000g离心30s；
8.用1mL移液枪将下面收集管中的液体重新加入Zymo-SpinTMIC Column中
9. 12000g离心30s，弃下清，并于擦镜纸上拍干收集管；
10.加入100μL M-Wash Buffer到Zymo-SpinTMIC Column中，于12000g离心30s；
11.重复步骤10一次；
12.加入200μL L-Desulphonation Buffer(缓冲液)到Zymo-SpinTMIC Column中，室温静置孵育17min；
13.准备相应数量1.5ml离心管(非low bind)及并剪去管盖，1.5ml low bind离心管写好编号；
14.孵育结束后，于12000g离心30s；
15.加入200μLM-Wash Buffer到Zymo-SpinTMIC Column中，于12000g离心30s；
16.加入150μL M-Wash Buffer到Zymo-SpinTMIC Column中，于12000g离心30s，弃收集管；
17.将Zymo-SpinTMIC Column放入已剪盖的新的1.5ml离心管中，于12000g空甩离心1min；
18.观察柱子内是否还有残留的M-wash Buffer，若有液滴残留则用2.5μL细长枪头将液滴摊开，并开盖晾干至Column无残留液滴；
19.Zymo-SpinTMIC Column放入已做好标记的新1.5ml low bind(LoBind)离心管；
20.小心向Column中间白色柱体滤膜上加入10μL已经加热到47℃的M-ElutionBuffer，放于47℃孵育5min，于12000g离心1min；
21.重复步骤20一次，2次离心得到的洗脱液即为转化后的DNA；
22.量取17ul洗脱液进行后续实验。
步骤2DNA测序文库构建
在完成了DNA样本的亚硫酸氢盐转化处理后，我们利用AnchorDx EpiVisioTMMethylation Library Prep Kit、AnchorDx EpiVisioTM Indexing PCR Kit、AgencourtAMPure XP Magnetic Beads，经过3’端适配体连接反向互补(adaptor ligation ofreverse DNA)和indexing PCR两步反应进行了靶向DNA甲基化测序文库构建。该过程又可以分为如下几个子步骤：
1.末端修复
1.1.将转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
Figure BDA0003220709890001731
1.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
温度 时间
37℃ 30min
95℃ 5min
热盖 105℃
1.3当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
2.连接I
2.1配制如下反应液
Figure BDA0003220709890001732
2.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
温度 时间
37℃ 30min
95℃ 5min
10℃ hold
热盖 105℃
3.扩增I
3.1配制如下反应液
Figure BDA0003220709890001741
3.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
Figure BDA0003220709890001742
3.3纯化I：加入166ul 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)的对Amplification I反应后的产物进行纯化，用21ul EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
a.取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166ul(1:6倍稀释AgencourtAMPure Beads，用移液器吹打混匀。
b.室温孵育5min。
c.瞬离，置于磁力架上静置5min,待液体澄清后，吸弃上清
d.加入200ul 80％无水乙醇，静置30s，吸走乙醇。
e.重复步骤d)一次。
f.瞬离，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。
g.开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。
h.加入21ul EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。
I.瞬离，将PCR管置于磁力架上，静置3min。
J.吸取20ul上清于新的200ul PCR管中。
4.连接II
4.1配制如下反应液：
组分 体积(ul)
上一步反应体积 20
H<sub>2</sub>O 4
MSB1 Buffer 8
MSR1 Reagent 2
MSR5 Reagent 2
MSE1 Enzyme 2
MSE5 Enzyme 2
总体积 40
4.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应
温度 时间 循环数
37℃ 30min 1
95℃ 5min 1
10℃ Hold 1
5.Indexing PCR:
5.1配制如下反应液：
Figure BDA0003220709890001751
5.2置于PCR仪中按照以下程序进行反应
Figure BDA0003220709890001752
Figure BDA0003220709890001761
5.3纯化II
加入Agencourt AMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR反应后的产物进行纯化，用41ul EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
a.取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71ul Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。
b.室温孵育5min。
c.瞬离，置于磁力架上静置5min,待液体澄清后，吸弃上清
d.加入200ul 80％无水乙醇，静置30s，吸走乙醇。
e.重复步骤d)一次。
f.瞬离，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。
g.开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。
h.加入55ul EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。
I.瞬离，将PCR管置于磁力架上，静置3min。
J.吸取54ul上清于新的1.5mL离心管中。
L.Qubit定量：
取2ul用Qubit dsDNA BR Assay Kit对文库进行定量。
步骤3 DNA测序文库的高通量测序
我们通过Illumina HiSeq X Ten Sequencing System，采用150bp双端测序，上机数据量为60M，对杂交捕获的DNA测序文库进行高通量测序。
步骤4高通量测序数据的生物信息学分析
测序数据的生物信息学分析主要包含如下几个步骤：
1.测序数据的预处理
原始的测序数据首先用fastp软件去除低质量碱基以及测序接头序列以得到可以用于比对的高质量测序数据。
2.将经过预处理的测序数据比对至人类基因组参考序列
经过预处理的测序数据利用Bismark软件比对至人类基因组参考序列(UCSC hg19版本)。
3.上万个甲基化标志物的甲基化水平测定
利用Bismark软件计算甲基化标志物面板(methylation marker panel)的上万个甲基化标志物的甲基化水平。
4.基于上万个甲基化标志物及其各种组合的甲基化水平构建可以区分癌症样本和非癌症样本的分类模型用一组癌症样本和一组非癌症样本(比如良性病变样本或者正常对照样本)基于上万个甲基化标志物或其各种组合构建可以准确诊断各类癌症的分类模型。
5.分类模型的性能评估
用另外一组完全独立的癌症样本和非癌症样本对分类模型进行诊断性能评估。我们拟计算受试者操作特征曲线下面积，并利用youden指数作为阈值，计算敏感性和特异性。
本发明涉及的用于泛癌种检测的上万个甲基化标志物及其基因组位置(参考UCSChg19基因组坐标)信息见表1。
以下通过具体实施例对本申请做进一步的阐述，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以70例结肠癌组织和91例癌旁组织为检测对象(剔除了肿瘤纯度小于10％的癌组织样本)，采用Qiagen的DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)提取-80摄氏度冰箱中保存的新鲜冰冻结直肠癌病人肿瘤组织和癌旁正常组织的DNA，具体步骤参考产品说明书。然后参考发明内容中所描述的实验步骤及生物信息分析方法对待测样本进行本发明所述表1中的所有甲基化标志物的甲基化水平测定。之后，随机选取60％的样本作为训练集，用支持向量机构建分类模型，并在剩余40％的样本中进行预测，评估分类模型性能。ROC曲线如图1所示，AUC为0.997，以youden index作为阈值，得到模型的敏感性为96.4％，特异性为100％，准确性为98.5％。表明本发明的甲基化标志物能够准确区分肠癌样本和正常癌旁样本。
实施例2
我们选取了123例肺癌组织样本和294例良性肺结节组织样本，采用Qiagen的DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)提取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本的DNA，具体步骤参考产品说明书。然后用亚硫酸盐进行转化，通过两步连接反应构建测序文库，之后参考本发明所描述的实验步骤及生物信息分析方法对待测样本进行本发明表1中的所有甲基化标志物的甲基化水平测定。测序数据经过生物信息学分析之后，我们提取了肺癌特异的20个甲基化标志物组合(cg08089301,cg13795264,cg14458834,cg26327071,cg25832771,cg21901718,cg07438617,cg21546671,cg04167903,cg02978421,cg17839237,cg25365565,cg03257575,cg26049726,cg19081437,cg25092681,cg26744375,cg17003293,cg08869573,cg00466108)的甲基化水平测定值。之后，我们随机选取60％的样本作为训练集，用支持向量机构建分类模型，然后在剩余40％的样本中进行模型评估。ROC曲线如图2所示，AUC为0.93，以youden index作为阈值，得到模型的敏感性为84％，特异性为96％，准确性为92％。表明本发明的甲基化标志物能够准确区分肺癌组织样本和良性肺结节组织样本。
实施例3
本实施例选取了224例经手术切除组织病理确认为乳腺癌的组织样本和33例病理确认为良性的组织样本，采用Qiagen的DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&TissueKit)提取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本的DNA，具体步骤参考产品说明书。然后用亚硫酸盐进行转化，通过两步连接反应构建测序文库，之后参考本发明所描述的实验步骤及生物信息分析方法对待测样本进行本发明表1中的所有甲基化标志物的甲基化水平测定测序数据经过生物信息学分析之后，我们提取了乳腺癌特异的15个甲基化标志物(cg01016662,cg01313313,cg11267829,cg17652435,cg23855505,cg09695735,cg03562044,cg17093995,cg02435495,cg25832771,cg11856078,cg08382226,cg02474799,cg03257575,cg22260952)的甲基化水平测定值。之后，我们随机选取50％的样本作为训练集，用随机森林算法构建分类模型，然后在剩余50％的样本中进行模型性能评估。ROC曲线如图3所示，AUC为0.95，以youden index作为阈值，得到模型的敏感性为79.5％，特异性为100％，准确性为82％。表明本发明的甲基化标志物能够准确区分乳腺癌组织样本和良性乳腺疾病组织样本。
实施例4
本实施例选取了50例病理确诊为肝癌的组织样本和50例癌旁的正常组织样本，采用Qiagen的DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)提取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本的DNA，具体步骤参考产品说明书。然后用亚硫酸盐进行转化，通过两步连接反应构建测序文库，之后参考本发明所描述的实验步骤及生物信息分析方法对待测样本进行本发明表1中的所有甲基化标志物的甲基化水平测定测序数据经过生物信息学分析之后，我们提取了肝癌特异的10个甲基化标志物(cg18233405,cg14263942,cg14570307,cg11176990,cg03757145,cg03468349,cg20353496,cg21825027,cg14251622,cg04148762)的甲基化水平测定值。之后，我们采用逻辑回归算法，通过5折交叉验证进行模型的性能评估。ROC曲线如图4所示，AUC为0.998，以youden index作为阈值，得到模型的敏感性为98％，特异性为100％，准确性为99％。表明本发明的甲基化标志物能够准确区分肝癌样本和癌旁正常肝组织样本。
实施例5
本实施例选取了50例前列腺癌的组织样本和50例配对的癌旁正常组织样本，采用Qiagen的DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)提取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本的DNA，具体步骤参考产品说明书。然后用亚硫酸盐进行转化，通过两步连接反应构建测序文库，之后参考发明内容中所描述的实验步骤及生物信息分析方法对待测样本进行表1中的所有甲基化标志物的甲基化水平测定测序数据经过生物信息学分析之后，我们提取了前列腺癌特异的10个甲基化标志物(cg23855505,cg17498803,cg16232979,cg26149167,cg17355294,cg22260952,cg05402599,cg14210694,cg15233183,cg23095615)的甲基化水平测定值。之后，我们采用逻辑回归算法，通过5折交叉验证进行模型的性能评估。ROC曲线如图5所示，AUC为0.94，以youden index作为阈值，得到模型的敏感性为92％，特异性为96％，准确性为94％。表明本发明的甲基化标志物能够准确区分前列腺癌样本和癌旁正常前列腺组织样本。
实施例6
本实施例选取了21例病理确诊为膀胱癌的组织样本和21例癌旁的正常组织样本，采用Qiagen的DNA提取试剂盒(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit)提取福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本的DNA，具体步骤参考产品说明书。然后用亚硫酸盐进行转化，通过两步连接反应构建测序文库，之后参考本发明所描述的实验步骤及生物信息分析方法对待测样本进行本发明表1中的所有甲基化标志物的甲基化水平测定测序数据经过生物信息学分析之后，我们提取了膀胱癌特异的10个甲基化标志物(cg26970841,cg21901718,cg25160978,cg03978375,cg08382226,cg25927164,cg25832771,cg14665813,cg15906409,cg01556502)的甲基化水平测定值。之后，我们采用逻辑回归算法，通过5折交叉验证进行模型的性能评估。ROC曲线如图6所示，AUC为0.995，以youden index作为阈值，得到模型的敏感性为95.2％，特异性为100％，准确性为97.6％。表明本发明的甲基化标志物能够准确区分膀胱癌样本和癌旁正常组织样本。
尽管本发明的实施方案仅列举了本发明的甲基化标志物可以准确诊断常见的一些癌症，包括肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、前列癌、膀胱癌。正如在发明内容中所述，本发明的甲基化标志物及其组合可以诊断发明内容所述的33种癌症。进一步地，本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种用于检测肺癌的甲基化标志物组合，其特征在于，该组合包括以下标记物：cg08089301, cg13795264, cg14458834, cg26327071, cg25832771, cg21901718,cg07438617, cg21546671, cg04167903, cg02978421, cg17839237, cg25365565,cg03257575, cg26049726, cg19081437, cg25092681, cg26744375, cg17003293,cg08869573,和 cg00466108。
2.一种用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合，其特征在于，包括权利要求1所述的甲基化标志物组合和选自以下4组甲基化标志物组合中的至少一组：
cg01016662, cg01313313, cg11267829, cg17652435, cg23855505, cg09695735,cg03562044, cg17093995, cg02435495, cg25832771, cg11856078, cg08382226,cg02474799, cg03257575, 和cg22260952；
cg18233405, cg14263942, cg14570307, cg11176990, cg03757145, cg03468349,cg20353496, cg21825027, cg14251622, 和cg04148762；
cg23855505, cg17498803, cg16232979, cg26149167, cg17355294, cg22260952,cg05402599, cg14210694，cg15233183， 和cg23095615；
cg26970841, cg21901718, cg25160978, cg03978375, cg08382226, cg25927164,cg25832771, cg14665813, cg15906409, 合cg01556502。
3.根据权利要求2所述的用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合，其特征在于，包括4组甲基化标志物组合中全部所述的甲基化标志物组合。
4.根据权利要求3所述的用于泛癌种诊断、检测或筛查的甲基化标志物组合，其特征在于，包括说明书中表1的全部甲基化标志物。
5.检测权利要求1所述甲基化标志物组合的甲基化水平的试剂在制备肺癌检测试剂盒中的应用。
6.检测权利要求2-4任一项所述甲基化标志物组合的甲基化水平的试剂在制备泛癌检测试剂盒中的应用。
7.一种检测肺癌的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1所述甲基化标志物组合的甲基化水平的试剂。
8.一种检测泛癌种的试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求2-4任一项所述甲基化标志物组合的甲基化水平的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述泛癌种包括肺癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌、急性粒细胞白血病、肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺导管癌、乳腺小叶癌、子宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、低级别胶质瘤、间皮瘤、肺腺癌、肺鳞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、子宫内膜癌、葡萄膜黑色素瘤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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TW202403054A (zh) * 2022-07-04 2024-01-16 大陸商江蘇鵾遠生物科技股份有限公司 癌症特異性甲基化標誌物及其應用
CN116287266A (zh) * 2023-03-07 2023-06-23 江苏先声医学诊断有限公司 Dna复制晚期区域在泛癌种诊断中的应用
CN117165689A (zh) * 2023-10-26 2023-12-05 深圳市睿法生物科技有限公司 一种用于泛实体瘤早期筛查的甲基化标志物及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018009709A1 (en) * 2016-07-06 2018-01-11 Youhealth Biotech, Limited Lung cancer methylation markers and uses thereof
WO2019068082A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona DNA METHYLATION BIOMARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF CANCER
CN112538529B (zh) * 2019-11-14 2021-11-30 广州市基准医疗有限责任公司 血液中结直肠癌的分子标记物及其检测试剂盒和方法
CN110724743B (zh) * 2019-11-15 2021-02-26 广州市基准医疗有限责任公司 人血液中结直肠癌诊断相关的甲基化生物标记物及其应用
CN110872631B (zh) * 2019-12-26 2021-08-10 广州市基准医疗有限责任公司 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
CN110923322B (zh) * 2019-12-26 2020-12-01 广州市基准医疗有限责任公司 膀胱癌相关的dna甲基化生物标志物组合和检测试剂盒
CN112391466A (zh) * 2020-05-19 2021-02-23 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物或其组合和应用
CN112375822B (zh) * 2020-06-01 2021-11-02 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测乳腺癌的甲基化生物标记物及其应用
CN112899359B (zh) * 2021-01-27 2023-06-23 广州市基准医疗有限责任公司 用于肺结节良恶性检测的甲基化标记物或其组合及应用

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