CN115772564A - 用于辅助检测肺癌体细胞atm基因融合突变的甲基化生物标记物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的甲基化位点及其应用，包括chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241中的任意至少一种DNA甲基化位点，通过针对这些位点及其不同组合检测，采用随机森林和逻辑回归等方式建立辅助检测模型，发现其能辅助检测肺癌体细胞样本中ATM基因融合突变情况，同时还能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。从而为肺癌患者的临床靶向用药治疗等方面提供更为有效地辅助检测服务。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及用于辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的甲基化位点及其应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。目前肺癌特别是非小细胞肺癌已证实与多种基因突变、融合和基因扩增有关。
ATM基因编码的蛋白属于PI3/PI4激酶家族，这种蛋白是一种重要的细胞周期检查点激酶，通过磷酸化调控下游一系列重要蛋白，包括抑癌蛋白p53和BRCA1、检查点激酶CHK2、检查点蛋白RAD17和RAD9以及DNA修复蛋白NBS1，主要参与DNA损伤修复过程，基因组稳定性的维持等。
ATM基因的突变与肺癌发生密切相关。研究表明，ATM基因与肿瘤的放疗治疗的敏感性有较强的关联度，同时，ATM激酶在肺癌细胞中的突变状态可作为衡量患者对MEK抑制剂类药物敏感性的新型肿瘤标志物，可极大提高对该类亚型患者的诊断及后续治疗效，并有望拓展该类药物在RAS及BRAF等突变之外类型肿瘤患者中的应用[Ji X,et al.Protein-altering germline mutations implicate novel genes related to lung cancerdevelopment.2020；11(1):1-14.]。
目前常规检测ATM Gene Fusion(基因融合)突变的手段主要是qRT-PCR、Fish、WGS、WES、gene panel、RNA-seq等，通过寻找甲基化生物标记物来辅助检测基因突变，并且通过多个DNA甲基化的甲基化状态可以克服单个DNA甲基化信号低的问题，可以提高检测的灵敏度和特异性。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的甲基化位点或其组合。
具体技术方案如下：
用于辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的甲基化位点或其组合，其包括chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241中的任意至少一种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:114414408和选自chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241中的任意1种。
在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:114414408和chr1:247802703；或，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和chr10:131529436；或，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和chr8:1892241。
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在其中一些实施例中，上述甲基化位点组合包括chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436和chr8:1892241。
本发明的目的之一还在于提供上述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞ATM基因融合突变的试剂盒中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种肺癌体细胞ATM基因融合突变辅助检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下：
一种肺癌体细胞ATM基因融合突变辅助检测试剂盒，其包括检测上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的试剂。
在其中一些实施例中，上述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
在其中一些实施例中，上述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
本发明的目的之一还在于上述试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞ATM基因融合突变中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的方法，其包括以下步骤：
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对上述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度进行检测。
在其中一些实施例中，上述方法包括但不限于以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
在其中一些实施例中，上述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人发现甲基化位点chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436和chr8:1892241可用于辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变，通过针对这些位点的不同组合检测，采用随机森林和逻辑回归等方式建立预测模型，发现其均能有效地辅助检测肺癌体细胞样本中ATM基因融合突变的情况，通过甲基化辅助检测ATM基因是否存在融合突变的方法是一种新的尚未报道过的方法，多甲基化联合检测能克服单个DNA甲基化信号低的问题，并提高检测的灵敏度和特异性。基于对样本体细胞中这些DNA甲基化标记物的甲基化状态进行检测，还可以更全面分析肺癌发生、发展中的甲基化变化，应用于肺癌早期筛查、辅助诊断、疗效评估和复发监测等阶段，为临床提供更准确灵敏的检测服务。
附图说明
图1为实施例3中4个marker在20个Gene_Fusion_wt和6个Gene_Fusion_mut样本中的heatmap图。
图2为实施例3中4个marker在20个Gene_Fusion_wt和6个Gene_Fusion_mut样本中的ROC图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明涉及的甲基化位点chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436和chr8:1892241的具体信息如下表所示：
表1
| 编号 | 染色体 | 位置 | 类型 | 基因 |
| 1 | chr1 | 114414408 | ncRNA_intronic | AP4B1-AS1 |
| 2 | chr1 | 247802703 | intergenic | - |
| 3 | chr10 | 131529436 | intronic | MGMT |
| 4 | chr8 | 1892241 | intronic | ARHGEF10 |
其中intronic为内含子、intergenic为基因间序列，ncRNA为非编码RNA。
实施例1
本实施例公开了甲基化位点chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436和chr8:1892241用于辅助检测肺癌体细胞EGFR突变的检测方法，具体包括如下步骤：
一、样本信息
1、肺癌患者组织FFPE取自广州广州医科大学附属第一医院。该项目获得了广州医科大学附属第一医院大学医学伦理学委员会的批准。在每一个病例中都征求患者知情同意。术后从每位患者采集2-5个FFPE载玻片样本，相关病人个人病理信息来自医院的官方病理报告。
2、78例肺癌样本包含35例女性，43例男性；年龄介于33-81之间，平均年龄53.3；57例IA(浸润性腺癌)，2例LC(大细胞癌)，19例MIA(微浸润性腺癌)；按照病理分期分别为60例Ia，15例Ib，1例IIa，2例IIIa(其中Ia、Ib指癌症I期：局域性癌症，癌组织局限于最初形成的地方，没有任何扩散现象；IIa期指癌症II期：区域性癌症：癌细胞已扩散到附近的淋巴结、组织或器官；IIIa期指癌症III期：远位癌症：癌症已经扩散到身体的各个部分。)；78例FFPE组织样品由均进行了全外显子和RNA-seq测序，并进行了变异分析，得到了SNVs，Indels等信息，按照ATM基因融合突变型样本与ATM野生型样本分组，分别为6个ATM Gene_Fusion_mut和72个ATM Gene_Fusion_wt样本。
二、建库流程和方法
1、组织DNA提取及甲基化建库
1.1、组织DNA的提取。
上述肺癌组织样本DNA的提取步骤按照QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit操作说明进行；
1.2、转化
将提取的组织DNA(50ng)进行亚硫酸氢盐转化，使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，得到亚硫酸氢盐转化后的DNA，转化具体操作按照Zymo Research的EZ DNAMethylation-Lightning Kit说明书进行。
1.3、末端修复
将上述转化后的17ul样本加入以下试剂进行反应：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 热盖 | 105℃ |
当PCR反应第二步(95℃)达到5min时，立即将样本从PCR仪中取出，直接插入冰中，放置2min以上再进行下一步操作。
1.4连接I
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
| 37℃ | 30min |
| 95℃ | 5min |
| 10℃ | hold |
| 热盖 | 105℃ |
1.5扩增I
配制如下反应液
| 组分 | 单个用量(μl) |
| 上一步反应产物 | 40 |
| H2O | 35 |
| MAB2缓冲液 | 20 |
| MAR1试剂 | 2 |
| MAR2试剂 | 2 |
| MAE3酶 | 1 |
| 反应混合体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应：
1.6纯化I：
加入166ul 1:6倍稀释的AgencourtAMPure Beads(需提前于室温平衡半小时)的对扩增I反应后的产物进行纯化，用21μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入166μl 1:6倍稀释的Agencourt AMPure Beads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl 80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇，开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入21μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。
1.7连接II
配制如下反应液：
| 组分 | 体积(μl) |
| 上一步反应体积 | 20 |
| H2O | 4 |
| MSB1缓冲液 | 8 |
| MSR1试剂 | 2 |
| MSR5试剂 | 2 |
| MSE1酶 | 2 |
| MSE5酶 | 2 |
| 总体积 | 40 |
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 30min | 1 |
| 95℃ | 5min | 1 |
| 10℃ | Hold | 1 |
1.8Indexing PCR(扩增产物文库构建):
配制如下反应液：
置于PCR仪中按照以下程序进行反应
1.9纯化II
加入AgencourtAM Pure Beads(需提前于室温平衡半小时)对Indexing PCR反应后的产物进行纯化，用41μl EB进行洗脱，纯化具体步骤如下：
取上一步反应产物并进行离心，每个样本加入71μl未稀释的AgencourtAM PureBeads，用移液器吹打混匀。室温孵育5min。离心，置于磁力架上静置5min。吸去上清。加入200μl80％EtOH，静置30s，吸走乙醇，重复步骤一次后，离心，将PCR管置于磁力架上，吸走剩余乙醇。开盖干燥磁珠2-3min，注意不要过干。加入41μl EB进行洗脱，用移液器充分吹打混匀，室温静置3min。离心，将PCR管置于磁力架上，静置3min。吸取20μl上清于新的PCR管中。Qubit定量：取1μl用Qubit dsDNAHS Assay Kit对文库进行定量。
2、通过对已建库后的样本进行寡核苷酸探针捕获富集，得到特定区域的上机终文库。杂交捕获试剂盒为IDT公司的xGen Lockdown Reagents，具体按照说明书进行操作。
3、采用Illumina公司的测序仪对杂交捕获后的样本进行测序，得到测序结果。
4、下机数据的分析：
对测序仪的下机原始数据，进行常规的生物信息学分析处理，先通过fastp过滤低质量(QC低，长度短、太多N等)的读长(reads)，然后去除reads双端的adapter、共有序列、PolyA/T，得到理想的插入片段序列(target区间)，使用bismark将这些reads比对hg19对应的位置后，根据UMI对reads进行去重，得到每份样本被探针捕获得到的真实reads数据(bamfile)，对bam文件进行统计和分析，得到甲基化数据，用于后续的数据再分析。
5、对原始测序数据进行了相关清理及处理分析[Liang,W.,et al.,Non-invasivediagnosis of early-stage lung cancer using high-throughput targeted DNAmethylation sequencing of circulating tumor DNA(ctDNA).2019.9(7):p.2056.]，并基于对reads读数来确定每一个位点甲基化胞嘧啶的百分比(β值)。
6、针对6个ATM Gene_Fusion_mut(6个样本均为ATM相关基因融合)和20(由于突变型和野生型样本数目存在较大差异，所以在野生型里面随机挑选了20个样本)个ATM Gene_Fusion_wt样本，用表1中的marker，用逻辑回归建模，模型可以得出每个样本的风险得分，将风险得分和样本诊断结果对比，计算每个marker的auc、敏感性、特异性等，结果如下表2所示。表2结果表明，在20个Gene_Fusion_wt和6个ATM Gene_Fusion_mut样本中，标记物chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241的表达情况存在明显差异，这些甲基化位点每一个均可以作为辅助检测体细胞是否存在ATM融合突变的标记物。
表2
| 序号 | Marker | auc | specificity | sensitivity | acc | ppv | npv |
| 1 | chr1:114414408 | 0.88 | 0.8 | 1 | 0.85 | 0.6 | 1 |
| 2 | chr1:247802703 | 0.90 | 0.83 | 0.9 | 0.88 | 0.95 | 0.71 |
| 3 | chr10:131529436 | 0.82 | 1 | 0.7 | 0.77 | 1 | 0.5 |
| 4 | chr8:1892241 | 0.93 | 0.80 | 1 | 0.85 | 0.6 | 1 |
其中auc为ROC曲线下面积、se为敏感性、sp为特异性、acc为准确率、ppv为阳性辅助检测值、npv为阴性辅助检测值，下同。
实施例2
从实施例1中的样本选择20个ATM Gene_Fusion_wt和6个ATM Gene_Fusion_mut(6个样本均为ATM基因融合)样本，用表1中的4个marker进行分析，heatmap图如图1，将这26个样本利用逻辑回归建模(建模方法参考实施例1)，AUC图如图2所示，平均auc为0.933，90％特异度下的灵敏度为1。说明采用4个marker的模式组合对于肺癌体细胞ATM基因融合突变样本诊断的整体灵敏度很高，ROC曲线稳定性优异。在20个Gene_Fusion_wt和6个ATM Gene_Fusion_mut样本中，ATM Gene_Fusion_mut和Gene_Fusion_wt存在明显差异，这些甲基化位点组合可以作为辅助检测体细胞是否存在ATM融合突变的标记物。
实施例3
利用实施例2相同的样本和切分，分别用不同的marker组合，用逻辑回归建模(建模方法参考实施例1)，不同组合建模的auc、敏感性、特异性等如下表3所示。在20个Gene_Fusion_wt和6个ATM Gene_Fusion_mut样本中，标记物chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241的表达情况存在明显差异，说明这些甲基化位点不同组合可以作为辅助检测体细胞是否存在ATM融合突变的标记物.
表3
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (14)
1.用于辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的甲基化位点或其组合，其特征在于，所述甲基化位点或其组合包括chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241中的任意至少一种。
2.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和选自chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241中的任意1种。
3.根据权利要求2所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和chr1:247802703；或，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和chr10:131529436；或，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和chr8:1892241。
4.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408和选自chr1:247802703、chr10:131529436、chr8:1892241中的任意2种。
5.根据权利要求4所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408、chr1:247802703和chr10:131529436；或，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408、chr10:131529436和chr8:1892241；或，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408、chr1:247802703和chr8:1892241。
6.根据权利要求1所述甲基化位点组合，其特征在于，所述甲基化位点组合包括chr1:114414408、chr1:247802703、chr10:131529436和chr8:1892241。
7.检测权利要求1-6任一项所述甲基化位点或其组合的试剂在制备预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞ATM基因融合突变的试剂盒中的应用。
8.一种肺癌体细胞ATM基因融合突变辅助检测试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1-6任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度的试剂。
9.根据权利要求8所述肺癌体细胞ATM基因融合突变辅助检测试剂盒，其特征是在于，所述试剂盒是采用聚合酶链式反应技术、原位杂交技术、酶学突变检测技术、化学剪切错配技术、质谱分析技术、基因芯片技术或基因测序技术或它们的组合制备而成。
10.根据权利要求9所述肺癌体细胞ATM基因融合突变辅助检测试剂盒，其特征是在于，所述试剂盒采用的检测方法包括但不限于荧光定量PCR、甲基化特异性PCR、数字PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、全基因组甲基化测序、DNA甲基化质谱中的至少一种。
11.权利要求8-10任一项所述试剂盒在预测、检测、分类、治疗监测、预后或其它评价肺癌体细胞ATM基因融合突变中的应用。
12.一种辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测的生物样品基因组DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对权利要求1-6任一项所述甲基化位点或其组合的甲基化差异程度进行检测。
13.根据权利要求12所述辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的方法，其特征在于，所述方法包括但不限于以下技术：甲基化特异性PCR，亚硫酸盐PCR测序，实时定量甲基化特异性PCR等；高通量检测技术包括简化基因组甲基化测序，全基因组甲基化测序，DNA富集测序，焦磷酸盐测序，亚硫酸盐转化测序等；基于质谱等检测平台的检测技术；基于芯片检测平台，如450K和850K甲基化检测技术。
14.根据权利要求12-13任一项所述辅助检测肺癌体细胞ATM基因融合突变的方法，其特征在于，所述生物样品为组织切片、血液、唾液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的动物细胞，优选为组织切片。
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