CN108342483B - 一组用于非超突变型结直肠癌分子分型的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组用于非超突变型结直肠癌分子分型的基因，包含COL6A3基因、FLG基因、LRP1B基因、MUC16基因、SMAD4基因；根据该基因突变特征组合可对结直肠癌进行分子分型，筛选在术后发生复发和转移可能性较高的患者，对此类患者临床医生可加强监控和治疗；而另一组术后复发和转移可能性较低的患者，可加强观察，避免过度治疗。本发明还公开了用于捕获上述基因的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一组用于非超突变型结直肠癌分子分型的基因，及该组基因在预判结直肠癌术后复发转移上的应用。
背景技术
恶性肿瘤目前已成为一个全球性公共健康问题。近三十年以来，癌症发病数以年均3％‐5％的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。结直肠癌是我国常见癌症之一。近几十年来，结直肠癌发病率年均上升3％～4％，但地区差异较大，如上海2012年发病率达56/10万。世界卫生组织国家癌症研究代表处(Internatinal Agency for Research onCancer,IARC)发表的Globocan 2012估算中国大陆结直肠癌标化发病率为14.2/10万，居世界第75位，标化病死率7.4/10万，据世界第78位。我国结直肠癌发病率和死亡例数分别占全世界发病和死亡总例数的18.6％和20.1％，均居第1位。根据国家癌症中心全国肿瘤登记数据报告，我国城市和农村地区结直肠癌发病率分别列所有恶性肿瘤的第3位及第5位，病死率分别居第4位和第5位。
手术、化疗和放疗是传统的癌症治疗手段，目前多数早期患者通过综合治疗后可以获得较好的预后，但这些治疗无法降低所有肿瘤患者的死亡率。主要原因是手术治疗后发生的肿瘤复发或转移，最终导致患者死亡。二期和三期的结直肠癌的术后复发转移的影响因素包括术前分期、手术和病理诊断等。尽管有诊疗指南作为依据，但术后化疗方案的选择依然是摆在临床医生面前的难题。大约30‐50％的二三期结直肠癌患者在术后可能复发或转移，最终导致死亡。而现有的TNM分期不足以判断复发转移风险，也无法为术后治疗方案的选择提供更多依据。
因此我们对结直肠癌的基因组突变谱进行了深入分析，筛选得到了一组结直肠癌基因突变特征和组合，并在独立的结直肠癌队列上做了验证，根据该基因突变特征组合可对结直肠癌进行分子分型，从而筛选在术后发生复发和转移可能性较高的患者，对此类患者临床医生可加强监控和治疗，而另一组术后复发和转移可能性较低的患者，可加强观察，避免过度治疗。
发明内容
本发明针对结直肠癌患者在术后可发生肿瘤复发或转移，最终导致患者死亡的问题，提供了一组用于预判非超突变型结直肠癌术后复发转移的基因及其检测试剂盒。
本发明提供一组用于非超突变型结直肠癌分子分型的基因，包括如下基因：COL6A3基因、FLG基因、LRP1B基因、MUC16基因、SMAD4基因。
本发明提供一种用于非超突变型结直肠癌分子分型的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括捕获本发明所述用于结直肠癌分子分型的基因的探针。
其中，所述的检测试剂盒较佳地还包括：基因组DNA提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂，选自末端修复酶、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、质控品、核酸纯化磁珠和链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。
其中，所述基因组DNA提取试剂为本领域常规的基因组DNA提取试剂。
其中，所述文库构建试剂和二代测序试剂为本领域常规使用的试剂，只要能否满足对所得序列构建文库并进行二代测序的要求即可。所述的二代测序为本领域常规的二代测序。
本发明所述的检测试剂盒较佳地还包括从检测对象提取检测样本的器械；更佳地，还包括从检测对象或肿瘤患者体内提取组织或血液的器械，所述器械较佳地为任何能用于取血的釆血针、注射器等。
本发明所述的检测样本较佳地为来自检测对象的组织，只要能从检测样本中抽提检测对象的基因组DNA即可。所述检测样本较佳地为组织样本、血液、血浆和体液中的一种或几种，更佳地为组织样本，更佳地为石蜡组织样本，优选地为肿瘤细胞含量高的组织。
本发明所述检测试剂盒适用于对确定为非超突变型的结直肠癌进行进一步检测，使用方法包括以下步骤：
(1)提取血液和组织样本中的基因组DNA双链核酸；
(2)将步骤(1)的所述DNA双链核酸变性处理得到DNA单链，使用捕获探针捕获COL6A3基因、FLG基因、LRP1B基因、MUC16基因和SMAD4基因；捕获区域分别如下：
针对捕获对象设计探针为本领域的常用技术手段，探针的序列包括但不限于如上表所示区域。
(3)将步骤(2)所捕获的DNA单链进行测序，得到血液和组织样本中的核酸序列；
(4)将步骤(3)所得到的核酸序列进行自动化处理，计算组织样本中的5个基因的变异位点数量。若合计变异位点数量为0，则为5基因野生型；若合计变异位点数量大于0，则为5基因突变型。
其中步骤(1‐4)所述的提取方法、文库构建、测序方法和基因变异位点计算方法均为本领域常规方法。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明所取得的有益效果是：本发明首次提出了非超突变型结直肠癌的复发转移标志物，该组标志物可用于区分预后较差和预后较好的患者，提示患者在术后发生复发转移的可能性，对术后复发转移可能性高的患者可加强监控，及时治疗，对术后复发转移可能性小的患者可避免过度治疗，有较好的临床指导意义。
附图说明
图1显示了对ZJU数据集中的非超突变型结直肠癌患者使用5基因模型预测死亡风险的结果。与5基因野生型组的患者相比，5基因突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。
图2显示了对TCGA数据集中的非超突变型结直肠癌患者，使用5基因模型预测死亡风险的结果。与5基因野生型组的患者相比，5基因突变型组的患者预后更差，死亡风险更高。
图3显示了对TCGA数据集中的非超突变型结直肠癌患者，随机选取5个基因，进行了10000次多重置换检验的结果，并与本发明的5基因模型的Log10(P值)比较。结果说明本发明的5基因预后预测模型显著优于随机选择的同样数量基因的预后预测模型。
图4显示了对ZJU数据集中的非超突变型结直肠癌患者，使用5基因模型预测复发风险的结果。与5基因野生型组的患者相比，5基因突变型组的患者预后更差，复发风险更高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列是实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书。
实施例1基因组DNA样品的制备和肿瘤体细胞突变位点的测定
为检测结直肠癌的体细胞突变，本发明分两个阶段完成了338例结直肠癌组织标本的高通量测序，第一阶段完成了80例结直肠癌的高通量测序，其中10例为全基因组测序，70例为全外显子测序。通过第一阶段的高频基因分析，进一步结合TCGA数据库和COSMIC数据库中的高频基因，以及NCCN遗传性结直肠癌诊疗指南，本发明设计了一个包括524个基因的基因群(表1)，定制了针对这个基因群的捕获探针，用于第二阶段的测序。第二阶段使用该捕获探针完成了258例结直肠癌组织标本的靶向测序工作。所有标本来自患者手术切除的组织标本，经病理诊断后多余的部分用于测序研究。此工作经浙江大学医学院附属第二医院人体研究伦理委员会批准进行。此部分338例肿瘤患者为ZJU数据集。
表1：524基因列表
实施例2非超突变型结直肠癌的基因突变预后预测模型的建立
由于超突变型和非超突变型结直肠癌的发生机制、预后和疗效等均存在较大区别，因此本发明首先将结直肠癌患者区分为超突变型和非超突变型两组。突变负荷率小于等于10Mut/Mb的肿瘤定义为非超突变型肿瘤。实施例1中的338例结直肠癌(ZJU数据集)中，293例被确定为非超突变型。另外为了验证模型的稳定性和普适性，本发明下载了来自TGCA的结直肠癌数据共计382例作为独立验证的数据(TCGA数据集)，根据同样的标准其中319例被定为非超突变型结直肠癌。进一步，本发明要求大于24个月随访时间的患者数据用于预后模型的建立，因此来自ZJU数据集的285例为训练集，来自TCGA数据集的156例为测试集，用于后续分析。
首先，本发明筛选了ZJU数据集中的结直肠癌高频基因。在结肠癌亚组中突变频率≥5％的基因和在直肠癌亚组中突变频率≥5％的基因，合计43个基因用于后续分析。这些基因的组合形成一个包括n个基因的突变特征，用于构建预后预测模型。在n个基因中携带有1个以上突变位点的患者为突变型，在n个基因中均无突变位点存在的为野生型。其次，本发明使用单因素比例风险回归模型评价了每个突变组合特征和总体生存时间之间的关系，使用ZJU数据集作为训练集，使用TCGA数据集作为测试集。为评价模型预测的生存时间和实际的生存时间之间的符合情况，本发明对测试集计算了C‐index指数。为了寻找最小的能区分患者预后的基因组合特征，本发明从一个基因开始逐个增加基因数量，直到C‐index值不再增加时，本发明得到了最小且最佳的基因突变组合特征。使用上述策略，本发明建立了一个包括5个基因的突变特征组合，包括如下基因：COL6A3、FLG、LRP1B、MUC16和SMAD4基因。该模型将结直肠癌患者区分为5基因突变型和5基因野生型两类，在ZJU数据集中风险比为1.91(95％置信区间＝1.31‐2.78,P<0.001)，在TCGA数据集中风险比为2.19(95％置信区间＝1.28‐3.74，P＝0.003)，见图1和图2。最后，为进一步验证该模型是否为过拟合模型，本发明还进行了多重置换检验的测试，随机选择同样数量的基因，按照同样的模型训练和验证流程重复进行10000次，逐一记录模型在验证集中的P值，将P值的分布情况列出后与5基因模型比较，见图3。
实施例3应用5基因预后预测模型分析结非超突变型直肠癌的术后复发转移情况
由于肿瘤患者死亡的主要原因是复发和转移，影响预后的主因也是复发和转移，因此本发明对5基因突变状态和复发转移的相关性进行了分析。为排除肿瘤残留因素对患者预后的影响，本发明选择了完全切除肿瘤的结直肠癌患者。按5基因突变特征将患者区分为突变型和野生型，对无病生存时间进行生存分析和比较，可以证明突变型患者的复发风险显著高于野生型患者，风险比为2.01(95％置信区间＝1.33‐3.04,P<0.001)，见图4。因此5基因突变特征可以较好的预测结直肠癌患者术后的无病生存时间，判断术后的复发转移情况。
实施例4结合肿瘤超突变特征和5基因预后预测模型分析非超突变型结直肠癌的术后生存和复发转移
应用本发明预测结直肠癌患者术后生存和复发转移情况的流程如下，首先取得该患者手术切除的肿瘤组织块，提取基因组DNA，确定该肿瘤是否为非超突变型的结直肠癌；然后，如确定为非超突变型的结直肠癌，则进一步测定COL6A3、FLG、LRP1B、MUC16和SMAD4这5个基因的全外显子突变情况，统计非同义突变位点数量，如数量大于等于1则为突变型，预后较差，术后发生复发转移的可能性高，否则为野生型，预后较好，术后发生复发转移的可能性较低。需要注意的是，在临床实践中患者的预后和复发转移情况取决于多种因素，不能完全由本发明的方法判断。
Claims (6)
1.一组用于非超突变型结直肠癌分子分型的基因，其特征在于，由COL6A3基因、FLG基因、LRP1B基因、MUC16基因、SMAD4基因构成。
2.如权利要求1所述的一组基因捕获探针在制备用于非超突变型结直肠癌分子分型的试剂盒中的应用。
3.一种用于非超突变型结直肠癌分子分型的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：捕获权利要求1中所述基因的探针。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的捕获区域如下所示：
(1)染色体编号chr2、区域起始位置238233407、区域终止位置238305470、外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获COL6A3基因；
(2)染色体编号chr1、区域起始位置152275166、区域终止位置152287942、外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获FLG基因；
(3)染色体编号chr2、区域起始位置140990745、区域终止位置142888308、外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获LRP1B基因；
(4)染色体编号chr19、区域起始位置8959598、区域终止位置9091824、外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获MUC16基因；
(5)染色体编号chr18、区域起始位置48573407、区域终止位置48604847、外显子区域及外显子内含子交接区域，用于捕获SMAD4基因。
5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：基因组DNA提取试剂、文库构建试剂、二代测序试剂。
6.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括从检测对象提取检测样本的器械。
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