CN116200499B - 一种用于肝癌检测的基因组合与相关试剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于肝癌检测的基因组合与相关试剂和应用，涉及生物技术与疾病检测领域，本发明提供了可用于肝癌检测的OSR2、TSPYL5和SDF4基因，通过检测此基因组合的甲基化含量，可判断受检者是否患有肝癌和/或患有肝癌的风险高低，具有检测灵敏度高，特异性好的优势。

Description

一种用于肝癌检测的基因组合与相关试剂和应用
技术领域
本发明涉及生物技术与疾病检测领域，具体而言，涉及一种用于肝癌检测的基因组合与相关试剂和应用。
背景技术
肝癌主要包括肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)与肝内胆管癌(Intrahepatic Cholangiocarcinoma，ICC)，其中70％-90％的肝癌是肝细胞癌。肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其发生率正在逐年增加，预计到2025年，发病率将超过一百万例。
HCC的高危人群包括HBV感染、HCV感染、过度饮酒引起的酒精肝(Alcoholic LiverDisease，ALD)、糖尿病或肥胖相关代谢原因导致的非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic FattyLiver Disease，NAFLD)及其他原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史的人群，尤其是年龄大于40岁的男性。HBV感染是HCC最主要的风险因素，约占肝癌患者人数的85％。由于自2002年起，新生儿HBV疫苗接种的普及与HCV治愈率的提高，HBV、HCV感染导致的HCC比例呈下降趋势。但由于生活水平和饮食结构变化，酒精肝和非酒精性脂肪肝导致的HCC病例呈上升趋势，占到普通人群的15％，成为继HBV感染之后的第二大风险因素。超过90％的HCC患者都有慢性肝病，任何病因导致的肝硬化是HCC的极高危因素。
HCC的预后取决于肿瘤分期。早期HCC的5年生存率超过70％，而中期HCC病人治疗后，只有70％的患者能存活1～1.5年。对肝硬化与HBV慢性感染者等高危人群进行定期筛查能够将死亡率降低37％。目前，早期肝癌患者只占到肝癌人数的10％～20％，大部分HCC病人检测出肝癌时已为中晚期，生存率大大降低。因此，在早期发现肝癌并及时进行手术治疗，能够使患者获得最佳的生存率。
对HBV或HCV感染，或任何原因引起的肝硬化高风险人群进行筛查，能够提高早期肝癌的检出率和肝癌治愈率。每半年一次腹部超声或结合血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是推荐的HCC的筛查手段。超声筛查具有简单、费用低、非侵入性、能实时观察、无放射辐射等优点。但不断增加的数据强调腹部超声依赖于操作者的水平，而且用于肥胖和非酒精性脂肪肝患者筛查的性能不佳。一项meta分析发现腹部超声检测早期HCC的整体灵敏度只有45％，虽然结合AFP检测早期HCC的灵敏度能提高到63％，但特异性降低。且大多数直径＜1cm的小肝癌不容易被腹部超声检测出，非常难以诊断，因此针对直径<1cm的病灶要进行定期随访，如3个月随访一次。
血清AFP是当前诊断肝癌和疗效监测常用且重要的指标。血清AFP≥400ng/ml，在排除妊娠、慢性或活动性肝病、生殖腺胚胎原性肿瘤以及消化道肿瘤后，高度提示肝癌。当AFP阈值在20ng/mL时，AFP检测HCC的灵敏度和特异性分别在41％～65％和80％～90％；然而，将近50％的HCC患者的AFP水平低于20ng/mL，因此AFP不能单独用于HCC筛查。总AFP并不是肝癌特异性的，有10％～42％的AFP水平升高也在除HCC之外的其他肝脏疾病中出现，如病毒性肝炎。
综上，由于AFP和超声筛查的灵敏度和特异性均不高，且腹部超声依赖于操作者的水平，临床上大部分肝癌发现时均处于晚期，大大降低了患者的五年生存率。因此，亟待开发一款灵敏度高、特异性高的针对肝癌高风险人群的早筛、早诊产品。理想的检测产品应当高度可重复，不依赖于操作者的经验(如腹部超声)，高准确度，在不同的临床场景容易实施，而液体活检正好符合这些标准。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于肝癌检测的基因组合与相关试剂和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了试剂或试剂组合在制备用于具有以下任意一种或多种用途的产品中的应用，所述用途包括(1)肝癌的早筛或早诊、(2)肝癌的诊断或辅助诊断、(3)肝癌预后风险的评估或辅助评估和(4)肝癌的动态监测；所述试剂或试剂组合包括：检测OSR2基因的甲基化含量的第一试剂和检测TSPYL5基因的甲基化含量的第二试剂。
第二方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂组合，其包括前述实施例所述的试剂或试剂组合。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括前述任意实施例所述的试剂或试剂组合。
第四方面，本发明实施例提供了一种靶基因甲基化含量的检测方法，其包括：采用前述实施例所述的试剂或试剂组合对样本进行靶基因的甲基化含量的检测；所述靶基因包括OSR2和TSPYL5基因。
第五方面，本发明实施例提供了一种肝癌预测模型的训练方法，其包括：获取前述实施例所述试剂或试剂组合对训练样本中靶基因的甲基化含量进行检测并为其标注结果；其中，所述靶基因为如前述实施例所述的靶基因，所述标注结果包括：代表样本的肝癌患病风险、预后风险和疾病进程中任意一种情况的标签；将待测样本的靶基因的甲基化含量输入预先构建的预测模型中，获得预测结果；所述预测模型为能够根据所述靶基因的甲基化含量判断样本的肝癌患病风险、预后风险和疾病进程中任意一种情况的机器学习模型。
第六方面，本发明实施例提供了一种电子设备，其包括：处理器和存储器；所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现前述实施例所述的肝癌预测模型的训练方法或肝癌的预测方法；所述预测方法包括：获取待测样本中靶基因的甲基化含量；所述靶基因为前述实施例所述的靶基因；将待测样本靶基因的甲基化含量输入前述实施例所述的训练方法训练好的模型中，获得待测样本的预测结果。
本发明具有以下有益效果：
针对目前超声与AFP检测对早期肝癌检测灵敏度、特异性低的问题，本发明提供能用于肝癌检测的基因组合OSR2和TSPYL5基因，通过检测此基因组合的甲基化含量，可判断受检者是否患有肝癌、患有肝癌的风险高低和/或肝癌的疾病进程，具有检测灵敏度高，特异性好的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为MethyLight与HeavyMethyl检测的原理对比；
图2为21个候选基因区分肝癌与肝硬化的ROC曲线；
图3为OSR2与TSPYL5区分肝癌与所有阴性样本的ROC曲线；
图4为OSR2与TSPYL5区分肝癌与肝硬化样本的ROC曲线；
图5为OSR2与TSPYL5区分肝癌与健康人样本的ROC曲线；
图6为OSR2与TSPYL5区分肝癌与肝硬化的ROC曲线；
图7为OSR2、TSPYL5与AFP区分肝癌与肝硬化的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
甲基化(Methylation)是人基因组DNA常见的一种表观遗传修饰，是指在DNA甲基化转移酶的作用下，将甲基(-CH3)转移到DNA胞嘧啶碱基C的第5号碳原子上。DNA甲基化修饰参与细胞分化、基因组稳定性、X染色体失活和基因印记等多种细胞生物学过程。在哺乳动物体内常见的甲基转移酶有DNMT3a、DNMT3b和DNMT1，其中DNMT3a和DNMT3b实现DNA的从头甲基化(De novo Methylation)，而DNMT1负责复制DNA模板序列的甲基化模式。
DNA的甲基化主要发生CpG二核苷酸的碱基C上。约70％的人类基因上游的启动子区上有多个密集的CpG二核苷酸，形成CpG岛(CpG Island)。CpG岛的甲基化导致基因表达沉默。除了基因启动子区CpG岛的甲基化，基因的第一号外显子与启动子区类似，也存在甲基化，而导致基因表达的沉默。基因的DNA甲基化在肿瘤发生发展中亦发挥重要作用。抑癌基因启动子区的高甲基化抑制基因的表达，使抑癌基因功能丧失，导致肿瘤细胞的增殖失控和侵袭转移，最终导致癌症的发生发展。
有研究表明，甲基化修饰发生于肿瘤早期，早于基因突变的发生。CpG二核苷酸的甲基化常常成簇出现，即呈连锁状态，适合肿瘤的早筛、早诊。另外，由于CpG岛与控制基因的表达相关，CpG岛的甲基化可呈现出组织特异性模式，因此，可以用DNA甲基化进行癌症的组织溯源。
目前，DNA甲基化的检测方法可分为化学转化法、酶转化法、酶切法和甲基化DNA免疫沉淀法。化学转化法即通过重亚硫酸氢盐将甲基化胞嘧啶(5-mC)转化成尿嘧啶U，然后进行PCR检测或测序，此类方法有WGBS(Whole-Genome Bisulfite Sequencing)、BSAS(Bisulfite Amplicon Sequencing)、MSP(Methylation Specific PCR)、BSP(BisulfiteSequencing PCR)、QMSP(Quantitative Methylation Specific PCR)。酶转化法即通过TET酶将5-mC转化为5-caC，再用APOBEC酶将5-caC转化为尿嘧啶U或者通过吡啶硼烷将5-caC转化为DHU，如NEB公司的NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit和Base Genomics公司的TAPS方法。酶切法即通过甲基化敏感或不敏感的内切酶切割甲基化或非甲基化位点，通过PCR或测序进行DNA模板的选择性分析，如简化基因组重亚硫酸盐测序RRBS。甲基化DNA免疫沉淀法(Methylated DNA Immunoprecipitation，MeDIP)，通过抗5-mC的抗体分离出甲基化的DNA片段，然后进行相关检测分析。酶转化法对DNA的损伤小，转化后的DNA回收率高，片段较为完整，但转化效率不稳定。酶切法对DNA的损伤小，酶切效率高，但需要对一种或一类DNA序列寻找特异性的内切酶，不具有普适性。甲基化DNA免疫沉淀法的捕获效率受体系影响较大。重亚硫酸氢盐转化虽然对DNA的损伤大，转化后的DNA呈片段化，转化回收率低，但转化效率高，转化率稳定，可以识别单碱基甲基化，是DNA甲基化检测的金标准，在科研与临床上广泛应用。
基于重亚硫酸氢盐转化的荧光定量PCR按照检测甲基化的原理可分为MethyLight和HeavyMethyl两种(见附图1)。HeavyMethyl的引物设计不区分甲基化与非甲基化序列，而是通过设计一条或两条甲基化特异性的寡核苷酸Blocker，阻断引物延伸非甲基化模板，从而选择性扩增甲基化模板，同时设计一条甲基化特异性的探针，通过寡核苷酸Blocker和甲基化特异性探针，实现甲基化模板的选择性扩增与检测。经过对Blocker、探针的精心设计、检测体系的优化，HeavyMethyl能够检测到低至30～60pg的甲基化DNA，而非甲基化DNA不被扩增。
MethyLight针对重亚硫酸氢盐转化后的DNA序列，设计甲基化特异性的引物与探针，使得只有甲基化的模板进行扩增与检测，而非甲基化的模板不会被进行扩增与检测。MethyLight被认为灵敏度高，广泛用于DNA的甲基化检测。对于大部分基因的甲基化序列，能够设计出灵敏度和特异性均高的引物和探针，然而对于个别基因的甲基化序列，由于CpG二核苷酸不够密集或者甲基化的C与非甲基化C分布不均匀等原因，难以设计出合适的引物探针，从而导致MethyLight检测体系的灵敏度或特异性不足，出现假阳性或假阴性结果。因此，在用MethyLight方法检测基因甲基化含量时，需要对基因序列进行充分分析，选择适合设计引物探针的序列，根据适合设计引物探针的序列特性，结合MethyLight引物探针设计要素，精心设计、筛选与充分验证可行的引物探针组合。
尽管基于重亚硫酸氢盐转化的荧光定量PCR有上述优势，但目前荧光定量PCR最多只有5个荧光通道，因此限制了基因甲基化靶点的检测个数。因此，针对特定癌种的检测，首选要进行甲基化Marker(靶基因)的筛选，筛选出灵敏度与特异性高的甲基化Marker，然后再进行荧光定量PCR检测。由此可见，筛选出性能好的甲基化Marker尤为关键。
本发明提供一种用于肝癌检测的基因组合，以及基于此基因组合的一组用于肝癌检测的试剂组合及试剂盒，通过检测靶基因组合的甲基化含量，可判断受检者是否患有肝癌或患有肝癌的风险高低。
具体的技术方案
一方面，本发明提供了试剂或试剂组合在制备用于具有以下任意一种或多种用途的产品中的应用，所述用途包括(1)肝癌的早筛或早诊、(2)肝癌的诊断或辅助诊断、(3)肝癌预后风险的评估或辅助评估和(4)肝癌的动态监测；所述试剂或试剂组合包括：检测OSR2基因的甲基化含量的第一试剂和检测TSPYL5基因的甲基化含量的第二试剂。
OSR2是一种蛋白质编码基因，编码奇数跳跃(odd-skipped)相关转录因子2。
在一些实施例中，所述OSR2基因的Gene ID：116039。
在一些实施例中，所述OSR2基因的检测区域选自：OSR2基因(外显子区和内含子区)与5`启动子区的全长或部分序列。
在一些实施例中，所述OSR2基因的检测区域包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的区域1。区域1为优选的检测区域，其序列中CpG二核苷酸中的C在肝癌中呈高度甲基化连锁状态，而在肝硬化、肝脏良性病变与健康人中甲基化水平低，二者有显著差异。染色体坐标为chr8:99,955,670-99,961,095(基因组版本号hg19)，DNA序列如下(备注：加粗CG或所有CG中的C为甲基化的C)：
5`-GTGTATCATTCCCTTCCTGTCACTCGGTCACCCCTATTCCAGAGAGGTTGAAGTGCTTTTTGCAGTTACACTCACACAAGACCA AACCTTTAGAAGGACCTGAAAAATGTATCACTGCACTTTGAATTCTATTAACTTTCCTGGAGACTGAACATTGAACTCAATTTTTGCTGGGAATGAAGATGTAAATGTTTTGAAAAACTAGAATCGCATTTTCCTAAATTTTAAAAATGATTGTTCTTCACCAATTCCAGATGGATTCTTTATTCTTTGCCAATGGGTTGCAGATGCCCACTGTTTTAACCAAGTTGGTTTACTGCGTATGAAATGAACATTTGCCGATTAAAGCTTAAATATTGGAAGAAATTTCTCCTGGGGCATTCCACGCGTCTTTGCAATAATTACTAAATTAGTCAATTGCCACCTCTGTAAACAAACTTCGTTTAGAAAACAGCAGGCGAAAGCAGACTACACATGTAGTCATAATTGACCAAAAGTATGTACAAAACTGTTTAAAATTGGGGAAAGAGTGATTTATGCTGGAGAATGCAGTCTAGACCTGAATTATTTTACTTTACGGTGAAGGTAGTTGTATTGAATGTGTTAAGATGTGCAAATTAAGCCGGCGAGCGAACCAAATAAAAATACTAAATGCCCTTTGGGATTCTCTGTGGAGTCTTTGAGAGGCAGAGAAGCAGTTGTTGAGTTTCTAATGGTATAAGGAAAAGTGGCAACGAGAAGAAAGGGGGTGGGTATTGTGTTTGTGTGTGAGTTTTGAACTGAGTCACCTACGGCTGCGTCTCTATAACAGGGAAACCTCGAGCAAACCTGTGCCTTTAAGACTCAGTTGCTATCCAAACAGAAGTAAACAGAGTGGACCATTAGCAGACGCCGGGCGCGGAGGCGGAGCCAGGGCGCTGAGGGCCCCGCGCGGCGGCGGGACGCCCGCCCGAAGGGGAGGCGGGGCCGCTACTAAAGCCCAAGACTCCCGGCCTGGGGCAGCCTGGGGAGGGACGCGGGCGGGGACGGAGCTCGGCGTGCTTGCTGCTGGAGGGTGATGGCCCTGCAAGGCTGTGGGCTCCGACCTCACCGGGAGTCGACAGCGAGAGGTTCGCCGAAGAGCGAGGTTCTGGGCGAGCGCTGAACGCCGGCCCCAAGCACCCCGGGTCTTTACACAGTCCGCGTCCACAGACTCTGACGAAGACGTGGATCTGCTCTCGCTTTAGCTGCTCGCGGTCCTCCAGATCATGTCCGCGACTCCTGCGACTCCGCGCGGAAAAAAAAGTTTGCCAGGCGTGGACTCAATGACCTTTCCAAGCTGTGCGCCTCGCTGCCTGGACCGGGTCTGAGCGCGGCTGCCCAGGTTGACCTTTCTGCGGGAGGTGAGTGTTCGCTCTGGGAAGGGGCTGTAGCTGCCCTTTGGAAGGAAGGGTTTGGGGGTGTAAGAGGCGTTCAGATTCTCGGTCTGGTGTGCCCCAAATTCAGATGTGAAAATAGATCATGGGGATGCAATCCCAGGGCACTGTATTTCTCACTTCCTTGGGTCCCTGGCACGCGACTCCCAGCTAACACCCAACCACACACATTTCTACATACTGTTTCTTAATTTTGTTTTGGGATATTTAATCTAAGCGGTCAGCAAGACTTCTTATAAAAGCTGGTCTACGTACACTGAGATCAAACCCCACAATCCCATGGTGTTTCTGCTCCTGCCCTAGCAAGCCTGGGTCGACTTGTCCCGGGGCAGCCGCGGCAGCGCAGCGTGGACGGGCCCGGACACCCGGTGCCTGCCCAGCCAGCGACGCTGAAGGCACATTTCAAGAGGGAAATAGTTCAGTCCTCGGTAATTTGTCAACCTCGTGCTGGCTTTAAAATTCTCCTCCCACCTTCTAGTCCTGACTGAGGGGGCCCAAAAGCAAACTCCCCGGGGGCTTAAACGCTCGGATTCCTGAGAAACGGCAAGTGAGAAAGGAGTTGCAGTTGTACGAAGAAGGAGCGAGGAAAAGGTGTTTGTGGAGGGAGCCCCGGATCTGTCTTCCTACCTGTTAGCCGAGAACAAAAGGGGGCTGGCGTTTCCCGAAGCGAAAGGGCGCAGACAGCCACTTTCTCTGCTAAACAAACTGCAGTCCTGGGCAGAACAAGAAAATTACTCACGCAGGGGGAGCAAGGGGAGCACAGAGAAACAGAACCTAGATTATGCGGAAGGCATCTTAATTTAATTAACTCCTTGGGAAGGCAGAGGCGCTCTGAAGGGGCAGGAACTTCGCAGCCGTTTCTCTATTCACCTGATACAGTCTGGCCCTAACAATCTGTCCTTTAACAATTTTTTTTCTTTTTAATGATCTTCTTTGATCTACTTAGTCTATAGCTCTCTAATTTATATAAAATTCTGCTGTGGTTTGGGCTGAAATTCAGTGAGCCTACCTATCCGACCATCAGTCATTTATCTCATATACCAGTGCACAGGTTTTAGCAGATGAACCCTGACTGTATATTATTTTTAGATAATTCAGTGTAATATTACCATTACCAAAGAGCGAAACTCCTTATCAAGTTACTTCTTAATTTTTTTCTCCAATGTTTTGAAAGCTTCACTGAACTGAAATAAGTGTGTACACATCTTCCTTGGTGACAGCCAGTCAAGTAAATTTTACAAAATTTCTCCACATGCCTGGAAATTCCTGTGAAGAAGACTGATGAAAGAAAAGTAGCCTCAGCTCCACCAACATATTTATGACTTTTCATTGGTTTAAGTTTCTTTCCTTGCAAGATTAAAAGTAACCAGTGGTCTGAAACGGGACGGTGGAGAAATGACAGCAGATGATGATCGCTGTTATTTCCTGAAAGGGAGTGTGGGAACTACAAGGCTCAGCTCTAGACAAAACGAAAGTACTTTAGGATCTCTGCATTCACTTAAAATACTTCTTTTGACATACATTTCCAGCAACTCAATGGGAGTGTGGAAATTTAACCTTCCTAATTATTTGTGGCAAGAGCCATTGGTGGATATTTAAGGTTGTTCTGTTTGTAAAAGGGTTTCAAAAGGACCAATGGTTTGCTCTTCCTCTATGAAGAAACTATCTGCCCTACAAATTAAAACAAACAGGTACTATGAAATAGCACTTTTTTTTTTTACTAACATGAACCTGAATTATATTAGTCGTTAATTTCTGTATTATAAACCATTCAGAGAAAAGGGAAAGAAGATGGCACTCAACTTTGTGGCAGTGTAACCTTTATGGCAGAGTTCGCTGTGCCTTTGGTATAGAAATCACAGGTCACAACAGTACTTTAGCCAACACCACTCCCCCACATGCCCGCTCCCCCCTCCCCAACGCATACACCCTGTGGTGGGAGTTGTGCTTTGCCTCCTGTATTTATTTCTAAGAAATCTAGTCTGGGAATACACCCAAATAATAATTTCGGTTTCCTCTCTATGGGAAAGAGGTTGCTTTTCAACACGAAGGGAAAAATAATATTTTGAATCTCTGGAAAATCCTCATTACGCAAAGAGAAGGAAATAAAGGTATAAATTATTATTTTTAATTGAAAGGGAAATAATCAGGTAGATTACCAGGAATGTTAGTAGAATCCTTTTCCCCTGCCTCCCTAAGAGACTTGCCACCGAGCAAAAATGAATCGTGATTTGTGGTGGGAAAGTTGATTACTAATGGGGGTTTGCAGTTGCGGTTGAATGGTCTGACTGAGACCCTCTGACTGTTACCCACCTCTCATTAACTCTTAGCCTGAACTCCCAGACCGCATACCACCAAGCAGAAGCGATTCGTTAATAAATCTCTGTCCCGAGCCCTTCCAGAGGAAGGTGTGGGCCCCGCAGAGGCAGCCAGATCCTGCCTTGCCAGAGCGCTCTGTCATTAGCGTAGCCCCCTAAGTCTGCTCACAGATGGAACCATAGGCAATACTTCATAACGCGCTGGAGAGGACAAGTCAGACGCAGGAAGGGGTTGGGTGGGAAGGGAAGGCTGGAGTCTCTCCTGCCTTCCTGCTGGGTTCAAATGCCAGGCTTGGCGGTTGGTGGCACAGACTGGGAAACGTGACTCCTACACCTGGGGGTCTGCCCTCAGAGGGAAGGCCCTGGTCCCCCGAACTGGCAGAACTCCTTTCTAAAAAGGGGCTGGTAGTGGGAGAAGGTGGGCCCGCTGTGAATGTAGGTGAGGTGATCCCGGGAACCTGGGTCTGAAATCAGACCTGTGTTGCCATTGGGAGCACGGAGAGAGGGGAAGCGCCCTGCTTAGGCCCAGGCCGGGCGTCCTGGTGGTGGGACCGCAGCCGCACTCACCTCCAGGCCAACGGACAAGGTTCCTGCAAGCCAGCAGGGCCACTCTGTGCTTGGCCTACTGCAGCTCCCCTGCAGCTCCTTTCCTCTCCCTCCCCGGAGCGCTCTCCTCTCTCCTCTCCCCTCTCTTCTCTCTCCTCTCTCGTCTCCTGGGGCATCCCGGGTGGAGGGATGTAGGGGTCGCTCCTCGGTGCCAGGCCGGGAAGCAGCTCAGGCCTCCCAAGAGCTTGGCGCTCAGTCTGGGAAAAGGGGTTCCTCTGGCCTCAGGGACGTTCTCCGCCCCCACCCCACCCCCTGGGAGCCTGAACCATCTGGAAGGGATCTTAGTCGGGGGTTGGGAGGAGAGCCCGTGGATAGGAGGAGGGGGCGATTCTAGGCCGAATCCAGCCCCTGAGGTGTCACTTTTCTTTCCTGCGGCCCGTCACCGCTGATAGATGGGGCTGAGGGCAGAGGAAGGAAAAAGAAAACCTCCGAGGTCAGTGCGGGGCGAGGTGAGCCCCTCCCAGGGCCCTCTGGCCCAGGAGGATGAAGCGCGCCGGCTTCGCTCTTGCACGCCGGCTTGCCATCCGGGTAAGCGCGGGAAAGGCGGCCACAGGGCGCGGCGGCAGCGCAGCGCGTGGGATCTCACGACCCATCCGTTAACCCACCGTTCCCAGGAGCTCCGAGGCGCAGCGGCGACAGAGGTTCGCCCCGGCCTGCTAGCATTGGCATTGCGGTTGACTGAGCTTCGCCTAACAGGCTTGGGGAGGGTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGGCTGGGTGCTGCCCGGCTGTCCGCCTTTCGTTTTCCTGGGACCGAGGAGTCTTCCGCTCCGTATCTGCCTAGAGTCTGAATCCGACTTTCTTTCCTTTGGGCACGCGCTCGCCAGTGGAGCACTTCTTGTTCTGGCCCCGGGCTGATCTGCACGCGGACTTGAGCAGGTGCCAAGGTGCCACGCAGTCCCCTCACGGCTTTCGGGGGGTCTTGGAGTCGGGTGGGGAGGGAGACTTAGGTGTGGTAACCTGCGCAGGTGCCAAAGGGCAGAAGGAGCAGCCTTGGATTATAGTCACGGTCTCTCCCTCTCTTCCCTGCCATTTTTAGGGCTTTCTCTACGTGCTGTTGTCTCACTG-3`。
在一些实施例中，所述第一试剂包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述第一试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.4～5所示的引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针。
在一些实施例中，TSPYL5是一种蛋白编码基因，预测能激活染色质结合活性和组蛋白结合活性，涉及多个生理过程，包括细胞对伽马辐射的反应，蛋白激酶B信号的正调控和蛋白质泛素化的正调控。
在一些实施例中，所述TSPYL5基因的Gene ID：85453。
在一些实施例中，所述TSPYL5基因的检测区域选自：TSPYL5基因(外显子区和内含子区)与5`启动子区的全长或部分序列。
在一些实施例中，所述TSPYL5基因的检测区域包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的区域2。区域2为优选的检测区域，其序列中CpG二核苷酸中的C在肝癌中呈高度甲基化连锁状态，而在肝硬化、肝脏良性病变与健康人中甲基化水平低，二者有显著差异。染色体坐标为chr8:98,289,281-98,290,380(基因组版本号hg19)，DNA序列如下(备注：加粗CG或所有CG中的C为甲基化的C)：
5`-GGATGCTAGCTGGGGATGGTTCTGAAATGCTTGCCCCCAGAAGCCCGGGATATTTTGGATGAGGTGGTTCCTGCGCTCCAAGT GCTGCAGTCGCAACTGCCCAAACTTCCTGGAGAGCCGAAGGTAGGCCCTGTCCGCCTGGGCGTTCATGTTCTCCAGCTTCAGCTGCACGTTCTCCAGCGTATCCATGCTGCCTTCCGTCGCTGGGGGCCCCGACCCTGCATCCCTCTCTTCCTTCTTTTCCTCCCCAGCTGACACCGAGGTATTCTCCCCTGCCGCCCCTTTCTTCTGCCTCCCACCAGCTATGACCTGAGGCCCCCTCCCCGCGGTGCTACAGGTTTCTGGGGCCTTCTTCCCGGCAGGGCCACGCCGGTTTCCAACGCGGGGGGCATTTTTCGGCCTTCCCACGGTTCCCGCTGTTCCCACGAAGACAGTGTCTGCGGCCAGGCGCTCCGAGAGAGATGCGGCCTTCCCCGGGCCGGGCCTGGCCGCGGCCTGCCCGTGGTCCCCCGCAGCTCGGGCCCGCAGCGCGAGGCCACAGTCCAGGGGGAGCCGGCAGGCGGCCTCCTCCCCGAGCCGGAGGAGCTGCGCGGACGCAGCGGCTTCCAGGCCACCCCACCCCGCGCCAGCCTGCACCTGTGCCGCCTGGGTGTCTTCCCCGAGACTCTGGTACTGTGAAGGGTCCGGGTCGCGCGGGGCGTCGTCCGGAGCAGGGCGGACTCGGGCTTTGGCGCGGCCTTTGCCCCGGTTTTTGGCGCGGGAGGACTTTCGACCCCGACTTCGGCCGCTCATGGTGGCGGCGGAGGCAGCTTCAAAGACACGCTGTGACCCTGCGGCTCCTGACGCCAGCTCTCGGTCGGGACCGAGCGGGTCTCTCCACGGCAACCGCCGACGTCACGAACGTACAACTGTACCGTCGCGAGAGGACGTGATGCGCCCGGTGATTGGCGCCGCCGCTGCGGCTGCGCAGGAGACGACCCCCGCGGGCGCTCCCACCCCCATCTCGCGCGGACTCGCTTTAGGTCTCGGCGAGTTTCTCTGATATGCGCTCGCGGGGGTGCTGCCATTTCATCTCTTCCGCGCGGGCTCATCGTGCTCTC-3`。
在一些实施例中，所述第二试剂包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述第二试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.16～17所示的引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针。
在一些实施例中，所述试剂或试剂组合还包括：用于检测C1QL4基因、CR1L基因、CYP26C1基因、FOXG1基因、GHSR基因、HIST1H1D基因、IRX5基因、KCNG3基因、LHX2基因、MEX3A基因、NEFM基因、OTX1基因、OXTR基因、PCDHGB6基因、PCDHGB7基因、PITX1基因、PRLHR基因、PRRX1基因、ZIC4基因中的任意一种或多种基因的甲基化含量的试剂或试剂组合。该19个基因的甲基化含量的检测区域选自对应基因与其启动子区域的全长或部分区域，在限定了检测基因的情况下，本领域技术人员可结合常规技术手段获得对应的检测试剂。将19个基因与OSR2基因、TSPYL5基因作为基因组合，用于肝癌检测，具有很好的检测灵敏度和特异性，AUC可达到0.92。
在一些实施例中，所述试剂或试剂组合还包括：检测内参基因的含量的第三试剂。
在一些实施例中，所述内参基因包括SDF4基因。SDF4是一种蛋白质编码基因，编码一种基质细胞衍生因子，其为CREC(网腔钙结合蛋白)蛋白家族的成员之一，该编码蛋白质包含六个EF-hand基序和钙结合基序。这种蛋白质定位在高尔基体腔，可能参与调节钙依赖的细胞活动。
在一些实施例中，所述SDF4基因的Gene ID：51150。
在一些实施例中，所述SDF4基因的检测区域包括：SDF4基因的全长或部分序列。
在一些实施例中，所述SDF4基因的检测区域包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的区域3。区域3为优选的检测区域，该区段序列的GC含量＝64.7％，CpG二核苷酸密度＝5.88％，重亚硫酸氢盐转化后的GC含量＝32.5％。染色体坐标为chr1:1,159,192-1,159,483(基因组版本号hg19)，DNA序列如下(备注：加粗CG或所有CG中的C为甲基化的C)：
5`-CCCCGGCCCAGCCACAGTACCGTCCCCGTCAGGGTCCACGGCGCGGAAGTGTGTCTTGCTCTCCTCCATGGCCTCCTGGAAGT GCTCGGCCGTCTTCTCCATGATCCAGCGCTGCATCTCCTTGGCACTGATCTTCCGGTCAGTGTTCACATCCACCCTGCAAGACAGCAA ATGGGCAGGTGGCCGTCAGACTGGGCCCCCAGGACCCCGAACAGCCAGACGGATGCCGCCGGCCCAGGACTCCATGGCTGCGTGAA CCTGCCACCAACAGCGACAGGCTCCACCAGGCAAC-3`。
在一些实施例中，所述第三试剂包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述第三试剂包括：核苷酸序列如SEQ ID NO.28～29所示的引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的探针。
在本发明实施例中，OSR2与TSPYL5为肝癌高度相关的肿瘤标志物，检测靶点为其甲基化的DNA序列，SDF4为内参基因，用于质控DNA样本合格并作为靶基因甲基化含量的参照。具体为：通过检测样本中靶基因OSR2、TSPYL5的甲基化含量，分别以OSR2、TSPYL5扩增的Ct值减去内参基因SDF4扩增的Ct值的差值(△Ct)作为靶基因甲基化相对含量的高低，以△Ct值进行建模后，判断受检者是否患有肝癌或患有肝癌的风险高低。
在一些实施例中，所述产品包括：试剂和试剂盒中的任意一种或多种。
另一方面，本发明实施例提供了一种试剂或试剂组合，其包含前述任意实施例所述的试剂或试剂组合。
另一方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括前述任意实施例所述的试剂或试剂组合。
所述试剂或试剂组合以及所述试剂盒具有以下任意一种或多种用途：(1)肝癌的早筛或早诊；(2)肝癌的诊断或辅助诊断、(3)肝癌预后风险的预评估或辅助评估和(4)肝癌的动态监测。
另一方面，本发明实施例提供了一种靶基因甲基化含量的检测方法，其包括：采用前述任意实施例所述的试剂或试剂组合对样本进行靶基因的甲基化含量的检测；所述靶基因包括OSR2基因和TSPYL5基因。
在一些实施例中，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
不以疾病的诊断或治疗为直接目的的情况有很多，比如待测样本为含生物样本的环境样本或人工制作的标准品时，检测的直接目的并非是以疾病的诊断或治疗为直接目的。
在一些实施例中，所述方法还包括对内参基因进行检测。
在一些实施例中，所述靶基因还包括：用于检测C1QL4基因、CR1L基因、CYP26C1基因、FOXG1基因、GHSR基因、HIST1H1D基因、IRX5基因、KCNG3基因、LHX2基因、MEX3A基因、NEFM基因、OTX1基因、OXTR基因、PCDHGB6基因、PCDHGB7基因、PITX1基因、PRLHR基因、PRRX1基因、ZIC4基因中的任意一种或多种。
在一些实施例中，所述内参基因包括：SDF4基因。
在一些实施例中，所述检测方法的样本包括：DNA样本或含DNA的环境样本。DNA样本的类型可以为血浆cfDNA、血清cfDNA、组织DNA、细胞DNA和外泌体DNA中的任意一种。
在一些实施例中，所述靶基因的甲基化含量的检测包括：采用所述试剂或试剂组合对经重亚硫酸氢盐转化后的样本进行qPCR扩增；
在一些实施例中，当所述试剂或试剂组合包含第一试剂～第三试剂时，所述qPCR的反应体系包括：MgCl2的终浓度为4～8mM，dNTP Mix的终浓度为200～800μM，Taq酶的终浓度为1.0～10U/反应，用于OSR2基因检测的引物对的终浓度为0.05～1.0μM、探针终浓度为50～500nM；用于TSPYL5基因检测的引物对的终浓度为0.1～1.0μM、探针的终浓度为50～500nM；用于SDF4基因检测的引物对的终浓度为0.1～1.0μM、探针的终浓度为50～500nM。
在一些实施例中，所述qPCR的反应体系包括：MgCl2的终浓度为6mM，dNTP Mix的终浓度为500μM，Taq酶的终浓度为3U/反应，用于OSR2基因检测的引物对的终浓度为0.1μM、探针的终浓度为200nM，用于TSPYL5基因检测的引物对终浓度为0.2μM、探针的终浓度为200nM，用于SDF4基因检测的引物对的终浓度为0.2μM、探针的终浓度为100nM，反应总体积25μL。
在一些实施例中，所述qPCR的反应程序包括如下：
95～98℃预变性0.5～5分钟；95～98℃变性5～15秒，55～65℃退火与延伸30～60秒，15个循环，不收集荧光；95～98℃变性5～15秒，55～65℃退火与延伸30～60秒，30个循环，收集荧光。
在一些实施例中，所述qPCR的反应程序包括如下：95℃预变性5分钟；95℃变性15秒，62℃退火与延伸30秒，15个循环，不收集荧光；95℃变性15秒，62℃退火与延伸32秒，30个循环，收集荧光。
另一方面，本发明实施例还提供了一种肝癌预测模型的训练方法，其包括：
获取前述任意实施例所述试剂或试剂组合对训练样本中靶基因的甲基化含量进行检测并为其标注结果；其中，所述靶基因为如前述任意实施例所述的靶基因，所述标注结果包括：代表样本的肝癌患病风险、预后风险和疾病进程中任意一种情况的标签；
将待测样本的靶基因的甲基化含量输入预先构建的预测模型中，获得预测结果；所述预测模型为能够根据所述靶基因的甲基化含量判断样本的肝癌患病风险、预后风险和疾病进程中任意一种情况的机器学习模型。
在一些实施例中，训练样本的样本量为大于等于10。该样本量具体可以为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000中的任意一种或任意两种之间的范围。
在一些实施例中，所述标签可以为字符，字符指类字形单位或符号，包括字母、数字、运算符号、标点符号和其他符号，以及一些功能性符号。
在一些实施例中，所述机器学习模型可以选自：支持向量机、决策树、随机森林、逻辑回归、贝叶斯、K近邻、K均值、马尔可夫和回归岭算法中的任意一种或几种的组合。
此外，本发明实施例还提供了一种电子设备，其包括：处理器和存储器；所述存储器用于存储程序，当所述程序被所述处理器执行时，使得所述处理器实现前述任意实施例所述的肝癌预测模型的训练方法或肝癌的预测方法；
所述预测方法包括：获取待测样本中靶基因的甲基化含量；所述靶基因为前述任意实施例所述的靶基因；将待测样本靶基因的甲基化含量输入前述任意实施例所述的训练方法训练好的模型中，获得待测样本的预测结果。
所述电子设备可以包括存储器、处理器、总线和通信接口，该存储器、处理器和通信接口相互之间直接或间接地电性连接，以实现数据的传输或交互。例如，这些元件相互之间可通过一条或多条总线或信号线实现电性连接。处理器可以处理与目标识别有关的信息和/或数据，以执行本申请中描述的一个或多个功能。
存储器可以是但不限于，随机存取存储器(Random Access Memory，RAM)，只读存储器(Read Only Memory，ROM)，可编程只读存储器(Programmable Read-Only Memory，PROM)，可擦除只读存储器(Erasable Programmable Read-Only Memory，EPROM)，电可擦除只读存储器(Electric Erasable Programmable Read-Only Memory，EEPROM)等。
处理器可以是一种集成电路芯片，具有信号处理能力。该处理器可以是通用处理器，包括中央处理器(Central Processing Unit，CPU)、网络处理器(Network Processor，NP)等；还可以是数字信号处理器(Digital Signal Processing，DSP)、专用集成电路(Application Specific Integrated Circuit，ASIC)、现场可编程门阵列(Field－Programmable Gate Array，FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件。
在实际应用中，该电子设备可以是服务器、云平台、手机、平板电脑、笔记本电脑、超级移动个人计算机(Ultra-mobile Personal Computer，UMPC)、手持计算机、上网本、个人数字助理(Personal Digital Assistant，PDA)、可穿戴电子设备、虚拟现实设备等设备，因此本申请实施例对电子设备的种类不做限制。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1靶基因的筛选
1、甲基化捕获测序
(1)样本
收集43例肝癌组织与配对的32例癌旁组织DNA，55例肝癌、55例肝硬化、50例健康人血浆，每例血浆2mL。
(2)血浆cfDNA提取
a、将血浆于室温或37℃解冻后，于16,000g、4℃离心10分钟；
b、向15mL离心管中加入80μL的Proteinase K(Apostle MiniMax游离DNA分离试剂盒，货号A17622CN-384)，随后加入离心后的血浆，转移血浆时不要吸到离心沉淀或者絮状物，然后旋涡混匀；
c、向上述15mL离心管中加入200μL的Sample Lysis Buffer，旋涡混匀，然后60℃水浴20分钟，每隔5分钟颠倒混匀数次；
d、水浴结束后，将15mL离心管取出，室温静止10分钟，然后短暂离心，使得管壁上的血浆裂解液收集到管底；
e、取6个深孔板，准备核酸的自动化提取。板1：加入2.5mL的cfDNA Lysis/BindingSolution、30μL的Magnetic Nanoparticles和上述全部的血浆裂解液，板2：加入1mL的cfDNA Wash Solution，板3：加入1mL的cfDNA Wash Sloution，板4：加入2mL稀释的2ndWash Solution，板5：加入500μL稀释的2nd Wash Solution，板6：加入50μL的cfDNAElution Solution；
f、在第7号板位，放置新的Deep-Well Tip Comb板，开始仪器自检，自检合格后，选择核酸自动化提取程序，开始cfDNA的自动化提取，按照顺序依次放入板1-板6；
g、仪器提取完成后，取下板6吸取cfDNA。
(3)甲基化捕获文库制备与上机测序
用Qubit dsDNA HS Assay Kit(Thermofisher Scientific，货号Q32854)测定cfDNA浓度。
取40μL的组织DNA或cfDNA加入到160μL的重亚硫酸氢盐转化试剂(ZymoResearch，EZ DNA Methylation Lightning Kits)中进行转化，98℃变性8分钟，54℃转化1小时，4℃保持。将转化后的产物进行纯化。纯化DNA用Qubit ssDNA Assay Kit(ThermoFisher，货号：Q10212)进行定量。
转化后的DNA采用Hieff NGS Methyl-seq DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒(YEASEN，货号：12211ES24)进行建库，操作步骤见试剂盒说明书。
文库用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行浓度测定并用4200生物分析仪进行文库片段质检(Agilent DNA 1000Kit，货号：5067-1504)。质检合格后的文库进行液相杂交捕获。捕获后的文库用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行浓度测定并用4200生物分析仪进行文库片段质检。捕获文库质检合格后在Illumina测序仪NovaSeq上进行测序，读长PE150。
2、靶基因的筛选
对下机后的捕获数据进行分析，按照如下条件进行靶基因的筛选：
(1)使用fastp软件对下机数据进行数据过滤，包括过滤测序接头序列，去除测序读长小于50bp的DNA片段，去除平均测序质量较低的DNA片段；
(2)使用Bismark将过滤后的数据与hg19参考基因组(携带decoy诱饵序列)进行比对，得到每个DNA片段对应的具体基因组位置信息，并且得到每个CpG位点的甲基化状态信息；
(3)使用picard软件对top链和bottom链分别去除PCR扩增过程中引入的冗余数据，然后合并数据；
(4)使用bamUtil软件对较短的插入片段重叠区域进行soft-clipped标记，防止甲基化水平检测时发生重复统计；
(5)使用bamtools软件去除比对质量较低、未比对上、双端reads未能完全配对的DNA片段；
(6)筛选在肝癌组织DNA与血浆cfDNA中高甲基化且连锁，而在癌旁组织DNA与肝硬化、健康人血浆cfDNA中低甲基化的基因及染色体区段。
3、筛选结果
对组织DNA与血浆cfDNA的测序数据进行分析，最终筛选出21个候选基因。21个候选基因在肝癌与肝硬化、肝癌与肝硬化及健康人中的中位甲基化百分比的差异水平见表1。21个候选基因区分肝癌与肝硬化性能见图2。从图2可见，整合21个基因后，区分肝癌与肝硬化的AUC达到0.92，其中HIST1H1D、IRX5、NEFM、OSR2、OTX1、PITX1、TSPYL5区分肝癌与肝硬化的AUC能达到0.71以上。
表1候选基因在肝癌、肝硬化与健康人中的中位甲基化百分比的差异
实施例2OSR2、TSPYL5与SDF4扩增引物探针的筛选
根据候选基因在肝癌、肝硬化、健康人中的甲基化百分比的差异水平与ROC曲线的AUC面积，并结合基因序列的特征，筛选出OSR2与TSPYL5两个靶基因，设计qPCR引物探针。根据OSR2与TSPYL5基因的优选序列，遍历整个优选序列，筛选适合引物探针设计的序列片段，结合MethyLight引物探针设计要素，精心设计了几套引物探针组合。
(1)引物探针设计
在OSR2与TSPYL5优选的DNA区段各设计几套引物探针组合，进行引物探针组合的筛选。
OSR2扩增的引物探针组合有：
引物探针组合1：
SEQ ID NO.4：5`-GCGTCGGTTTCGTTTTTGTACGTC-3`；
SEQ ID NO.5：5`-CCACGCGCTACGCTACCG-3`；
SEQ ID NO.6：
5`6-FAM-ACCGCCTTTCCCGCGCTTACCCGA-3`BHQ1；
引物探针组合2：
SEQ ID NO.7：5`-GTTTTTCGGAGGTAAGATTATTTGCG-3`；
SEQ ID NO.8：5`-ACTCGATATATCCAAAACAAATTCGC-3`；
SEQ ID NO.9：
5`6-FAM-CAACCATCCTCCTTACCCGCCTCACCTATAATC-3`BHQ1；
引物探针组合3：
SEQ ID NO.10：5`-TTTTGCGTCGTCGTTATTTTCG-3`；
SEQ ID NO.11：5`-AAAACCTATACGATCTCAACGCG-3`；
SEQ ID NO.12：5`6-FAM-ATGGTGGAGCGGGTGATTTCGTGTAT-3`BHQ1；
引物探针组合4：
SEQ ID NO.13：5`-GGTTTTGCGTCGTCGTTATTTTC-3`；
SEQ ID NO.14：5`-AAAACCTATACGATCTCAACGCGA-3`；
SEQ ID NO.15:5`6-FAM-ATGGTGGAGCGGGTGATTTCGTGTAT-3`BHQ1；
TSPYL5扩增的引物探针组合有：
引物探针组合5：
SEQ ID NO.16：5`-CGCTCATAATAACGACGAAAACAACT-3`；
SEQ ID NO.17：5`-GGAGAGATTCGTTCGGTTTCGATC-3`；
SEQ ID NO.18：
5`Cy5-CACGCTATAACCCTACGACTCCTAACGCCA-3`BHQ-3；
引物探针组合6：
SEQ ID NO.19：5`-GCGGGAGGATTTTCGATTTCGA-3`；
SEQ ID NO.20：5`-AAAACCGCAAAATCACAACGTATCTT-3`；
SEQ ID NO.21：
5`Cy5-AAACTACCTCCGCCGCCACCATAAACGAC-3`BHQ-3；
引物探针组合7：
SEQ ID NO.22：5`-CCGCGATACTACAAATTTCTAAAACCTT-3`；
SEQ ID NO.23：5`-GTAGATATTGTTTTCGTGGGAATAGCG-3`；
SEQ ID NO.24：
5`Cy5-CCCGACAAAACCACGCCGATTTCCAACGC-3`BHQ-3；
引物探针组合8：
SEQ ID NO.25：5`-AATACTACAATCGCAACTACCCAAA-3`；
SEQ ID NO.26：5`-GGAAGGTAGTATGGATACGTTGGA-3`；
SEQ ID NO.27：
5`Cy5-AAAACCGAAAATAAACCCTATCCGCCTAAACG-3`BHQ-3；
SDF4扩增的引物探针组合有：
引物探针组合9：
SEQ ID NO.28：5`-GTAGGTGGTCGTTAGATTGGG-3`；
SEQ ID NO.29：5`-TCGCTATTAATAACAAATTCACGCA-3`；
SEQ ID NO.30：5`ROX-ACCGACGACATCCGTCTAACTATTCGA-3`BHQ2；
引物探针组合10：
SEQ ID NO.31：5`-TGTCGTTGTTGGTGGTAGGTTTA-3`；
SEQ ID NO.32：5`-CCCCAAAACCCCGAACAAC-3`；
SEQ ID NO.33：5`ROX-AACGAATACCGCCGACCCAAAACTCCA-3`BHQ2；
引物探针组合11：
SEQ ID NO.34：5`-GGTCGGATTAACGGGATGAAGTTTA-3`；
SEQ ID NO.35：5`-CCCACACACGATTCGTACCTC-3`；
SEQ ID NO.36：5`ROX-CCCGATCCCGCGTTCCCTACTATCCT-3`BHQ2。
需要说明的是，探针5`端的荧光基团修饰可以是TaqMan探针、MGB探针、分子信标、BQ探针等各种类型探针使用的荧光基团，如FAM、TET、JOE、VIC、HEX、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Cy5、AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、Oregon Green 488、R6G、Yakima Yellow、Quasar 570、AquaPhluor 593、Texas Red、Atto 590、Quasar 670、Cy5.5、Cy7和IR Dye 750等；探针3`端的荧淬灭基团修饰可以是TaqMan探针、MGB探针、分子信标、BQ探针等各种类型探针使用的淬灭基团，如BHQ1、BHQ2、BHQ3、BBQ650、MGB、Dabcyl和DBQ1等。
(2)样本
甲基化含量为95％～100％的阳性质控品DNA与甲基化含量为0％的阴性质控品DNA(自制)。
(3)重亚硫酸氢盐转化
试剂与操作步骤见实施例1。
(4)甲基化特异性qPCR验证
取转化后的30ng阴性质控品进行引物探针的特异性验证，设置3个技术重复；将转化后的阳性质控品DNA用无核酸酶水进行梯度稀释，分别取100copies、10copies进行灵敏度验证，分别设置1个与3个技术重复。
按照表2-1配制qPCR反应体系。
表2-1 qPCR反应体系
试剂组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
4×Enhancer 1×
MgCl2(250mM) 6mM
dNTP Mix(25mM each) 350μM
Taq酶(5U/μL) 3U
引物对 0.2μM
探针 250nM
DNA模板
无核酸酶水 补水到25μL
总体积 25μL
按照表2-2程序进行qPCR扩增。
表2-2 qPCR反应程序
(5)4200质检
将起始量为100copies的阳性质控品的qPCR扩增产物用4200生物分析仪进行质检，质检试剂(Agilent DNA 1000Kit，货号：5067-1504)。
(6)qPCR验证结果
OSR2、TSPYL5与SDF4的引物探针组合的验证结果如表2-3。选择灵敏度高、特异性高、尽量没有引物二聚体与非特异性扩增的引物探针组合，并结合荧光扩增曲线，确定最优的引物探针组合。由表2-3可见，OSR2基因扩增的最优引物探针组合是组合1，TSPYL5基因扩增的最优引物探针组合是组合5，SDF4基因扩增的最优引物探针组合是组合9。
表2-3靶基因与内参基因的引物探针筛选结果
/>
备注：检测结果为Undetermined时，设值为30。Ct值为检测的数值+15。
实施例3基因组合的血浆样本验证
(1)样本
肝细胞癌(HCC)53例，其中31例为2018年采集的血浆，22例为2020年采集的血浆；肝硬化(Liver Cirrhosis)52例，其中4例为2019年采集的血浆，42例为2020年采集的血浆，6例为2021年采集的血浆；健康人(Health)50例，均为2021年采集的血浆；肝脏良性病变：6例局灶性结节性增生(Focal Nodular Hyperplasia)，2例肝腺瘤(Hepatic Adenoma)，12例肝血管瘤(Hemangioma)。每例样本2mL血浆。
(2)血浆cfDNA提取
试剂与操作步骤见实施例1。
(3)重亚硫酸氢盐转化
试剂与操作步骤见实施例1。
(4)qPCR
用于OSR2扩增的引物探针组合1；
用于TSPYL5扩增的引物探针组合5；
用于SDF4扩增的引物探针组合9。
按照表3-1配制qPCR反应体系。
表3-1qPCR反应体系
按照如下程序进行qPCR反应
表3-2qPCR反应程序
(5)qPCR结果
表3-3qPCR结果
/>
/>
/>
/>
由图3可见，将肝硬化、肝局灶性结节增生、肝腺瘤、肝血管瘤作为阴性人群，OSR2与TSPYL5区分肝癌与阴性人群的性能相当，ROC曲线的AUC面积均为0.927，将OSR2与TSPYL5整合后，区分肝癌与阴性人群的AUC能达到0.955。
当将肝硬化作为阴性人群，TSPYL5区分肝癌与肝硬化的性能比OSR2更优，AUC分别是0.933与0.906。将TSPYL5与OSR2整合后，区分肝癌与肝硬化的AUC能达到0.95。(图4)。
当将健康人作为阴性人群时，OSR2区分肝癌与健康人的性能比TSPYL5更优，AUC分别为0.935与0.923。将OSR2与TSPYL5整合后，区分肝癌与健康人的AUC能达到0.961(图5)。
由此可见，OSR2与TSPYL5检测肝癌的性能均佳，且二者有较好的互补性。
实施例4试剂盒在肝癌检测中的应用
为了进一步验证OSR2与TSPYL5基因组合检测肝癌的性能，将血浆体积降至1mL，进行第二批血浆样本验证，其中部分样本同时进行AFP的检测。
(1)样本
肝癌54例，肝硬化61例，每例血浆体积1mL。
(2)血浆cfDNA提取
血浆cfDNA提取试剂与方法见实施例1。
(3)重亚硫酸氢盐转化
重亚硫酸氢盐转化试剂与方法见实施例1。
(4)qPCR扩增
OSR2扩增的引物探针为组合1；
TSPYL5扩增的引物探针为组合5；
SDF4扩增的引物探针为组合9；
对qPCR反应体系的各组分浓度进行了优化，最优的反应体系如表4-1。
按照表4-1配制qPCR反应体系。
表4-1 qPCR反应体系
试剂组分 终浓度
10×PCR Buffer 1×
4×Enhancer 1×
MgCl2(250mM) 6mM
dNTP Mix(25mM each) 500μM
Taq酶(5U/μL) 3U
OSR2引物对(5μM)OSR2 0.1μM
OSR2探针(10μM) 200nM
TSPYL5引物对(5μM) 0.2μM
TSPYL5探针(10μM) 200nM
SDF4引物对 0.2μM
SDF4探针对 100nM
DNA模板
无核酸酶水 补水到25μL
总体积 25μL
对qPCR反应的温度、时间进行了优化，最优的反应程序如表4-2。
按照表4-2设置qPCR反应程序。
表4-2qPCR反应程序
(5)AFP检测
为了与AFP的性能进行比较，部分血浆样本同时进行AFP检测。AFP为自研试剂，取100μL血浆进行AFP检测。
(6)检测结果
表4-3qPCR结果
/>
/>
备注：NA表示没有检测AFP。
由图6可见，对于1mL血浆，OSR2区分肝癌与肝硬化的AUC达到0.914，TSPYL5区分肝癌与肝硬化的AUC能达到0.915，两个基因整合后，区分肝癌与肝硬化的AUC能达到0.951。对比2mL血浆，OSR2、TSPYL5区分肝癌与肝硬化的AUC分别是0.906与0.933，将OSR2与TSPYL5整合，区分肝癌与肝硬化的AUC能达到0.95。由此可见，虽然1mL血浆起始量下，OSR2的AUC比2mL血浆起始量高，而TSPYL5的AUC比2mL血浆起始量低，但两个基因整合后，1mL血浆起始量与2mL血浆起始量的AUC相当。
为了比较基因甲基化与AFP的性能，选取有AFP数据的肝癌与肝硬化样本，进行ROC曲线分析。由图7可见，AFP区分肝癌与肝硬化的AUC为0.741，OSR2与TSPYL5区分肝癌与肝硬化的AUC均在0.9以上，明显比高于AFP，将OSR2与TSPYL5整合区分肝癌与肝硬化的AUC为0.96，可见，此靶基因组合检测肝癌的性能明显优于AFP。
综上，本发明提供一种用于肝癌检测的肿瘤标志物—OSR2与TSPYL5基因，其DNA序列的甲基化含量可以用于区分肝癌与肝硬化，肝癌与健康人、肝癌与肝脏良性病变，AUC均在0.9以上；本发明还提供一种用于肝癌检测的基因组合及试剂盒，即OSR2、TSPYL5与SDF4基因组合，其中OSR2、TSPYL5为检测肝癌的靶基因，SDF4为用于甲基化相对含量确定的内参基因，检测OSR2、TSPYL5二者的甲基化含量，区分肝癌与肝硬化、肝癌与健康人、肝癌与肝脏良性病变的AUC均能达到0.95以上，明显优于现有用于肝癌筛查的肿瘤标志蛋白AFP的性能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (24)

1.试剂或试剂组合在制备用于具有以下任意一种或多种用途的产品中的应用，所述用途包括（1）肝癌的早筛或早诊和（2）肝癌的诊断或辅助诊断；所述试剂或试剂组合包括：检测OSR2基因的甲基化含量的第一试剂和检测TSPYL5基因的甲基化含量的第二试剂，所述OSR2基因的检测区域为：核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的区域1，所述TSPYL5基因的检测区域为：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的区域2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OSR2基因的Gene ID：116039。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一试剂包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一试剂包括：核苷酸序列如SEQ IDNO.4~5所示的引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的探针。
5.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述TSPYL5基因的Gene ID：85453。
6.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述第二试剂包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第二试剂包括：核苷酸序列如SEQ IDNO.16~17所示的引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的探针。
8.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂组合还包括：检测内参基因的含量的第三试剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述内参基因包括SDF4基因。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SDF4基因的Gene ID：51150。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SDF4基因的检测区域包括：SDF4基因的全长或部分序列。
12. 根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述SDF4基因的检测区域包括：核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示的区域3。
13.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述第三试剂包括：引物对、探针和芯片中的任意一种或多种。
14. 根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述第三试剂包括：核苷酸序列如SEQID NO.28~29所示的引物对和/或核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的探针。
15.根据权利要求1~4任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂组合还包括：MgCl2、dNTP、Taq酶、缓冲液Buffer中的至少一种。
16.一种试剂或试剂组合，其特征在于，其包括权利要求1~15任一项中所述的试剂或试剂组合。
17.一种试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1~15任一项中所述的试剂或试剂组合。
18.一种靶基因甲基化含量的检测方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1~15任一项中所述的试剂或试剂组合对样本进行靶基因的甲基化含量的检测；所述靶基因包括OSR2基因和TSPYL5基因；
所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
19.根据权利要求18所述的检测方法，其特征在于，所述方法还包括对内参基因进行检测。
20.根据权利要求19所述的检测方法，其特征在于，所述内参基因包括：SDF4基因。
21.根据权利要求18所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的样本包括：DNA样本或含DNA的环境样本。
22.根据权利要求18所述的检测方法，其特征在于，所述靶基因的甲基化含量的检测包括：采用所述试剂或试剂组合对经重亚硫酸氢盐转化处理后的样本进行qPCR扩增。
23. 根据权利要求22所述的检测方法，其特征在于，当所述试剂或试剂组合包含第一试剂~第三试剂时，所述qPCR的反应体系包括：MgCl2的终浓度为4~8mM，dNTP Mix的终浓度为200~800μM，Taq酶的终浓度为1.0~10 U/反应，用于OSR2基因检测的引物对的终浓度为0.05~1.0μM、探针终浓度为50~500nM；用于TSPYL5基因检测的引物对的终浓度为0.1~1.0μM、探针的终浓度为50~500nM；用于SDF4基因检测的引物对的终浓度为0.1~1.0μM、探针的终浓度为50~500nM。
24.根据权利要求22所述的检测方法，其特征在于，所述qPCR的反应程序包括：95~98℃预变性0.5~5分钟；95~98℃变性5~15秒，55~65℃退火与延伸30~60秒，15个循环，不收集荧光；95~98℃变性5~15秒，55~65℃退火与延伸30~60秒，30个循环，收集荧光。
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