CN113355414A - 食管癌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种食管癌检测试剂盒及其应用，对DIDO1基因CpG岛DNA甲基化水平的检测，可以用于食管癌患者的诊断及辅助诊断。本申请提供了DIDO1作为食管癌的分子标记物，可用于不同分期食管癌患者的检测诊断，具有良好的灵敏度和特异性，对于食管癌非介入性检测、早期筛查及改善患者预后具有重要意义。

Description

食管癌检测试剂盒及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种食管癌检测试剂盒及其应用。

背景技术

食管癌是是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。食管癌分为鳞状细胞癌和腺癌两种亚型，其中在中国鳞状细胞癌的发病率非常高。

相当多食管癌患者在确诊时已经是中晚期，其预后较差。食管癌的早期诊断能明显提高治疗效果并改善患者的预后，食管癌的癌前病变，包括鳞状细胞癌的癌前病变和腺癌的癌前病变，即鳞状上皮和腺上皮的上皮内瘤变/异型增生。鳞状上皮的上皮内瘤变/异型增生，是指以食管黏膜鳞状上皮内不同层次的异型鳞状细胞为特征的癌前病变，根据病变累及层次，分为低级别上皮内瘤变/异型增生和高级别上皮内瘤变/异型增生。腺上皮的上皮内瘤变/异型增生，是指以食管腺上皮不同程度的细胞异型性和结构异常为特征的癌前病变，主要见于Barrett食管，根据细胞异型性和结构异常的程度，分为低级别上皮内瘤变/异型增生和高级别上皮内瘤变/异型增生。内镜和细胞活检等技术相结合提高了高危人群中食管癌的检出率，但患者接受度低、且操作不够灵活，近年来分子生物学方面的进展为开发简便、有效的早期诊断方法提供了新的方向。

人DIDO1基因是引起细胞凋亡的蛋白，细胞凋亡是细胞死亡的主要形式，是消除有害细胞的有效机制，对于后生动物的发育和体内平衡具有至关重要的作用。但尚未见DIDO1基因与食管癌相关的报道。

发明内容

本申请提供一种基于DIDO1基因CpG岛甲基化水平检测的食管癌检测试剂盒及其使用方法，可以用于食管癌的检测诊断尤其是食管癌的早期筛查。

本申请提供如下技术方案：

一种基于DIDO1基因甲基化水平检测的食管癌检测试剂盒，包括能够特异性检测生物样本中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应的检测试剂，其中，所述靶核苷酸序列源自DIDO1基因的CpG岛。

在本申请的一些实施例中，所述靶核苷酸序列是DIDO1基因的核苷酸序列全长或其部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。

在本申请的一些实施例中，所述部分区域为SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.28一一对应且反向互补的核苷酸序列。

在本申请的一些实施例中，所述部分区域为SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.36任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂包括可PCR扩增所述靶核苷酸序列的引物对。

在本申请的一些实施例中，所述引物对选自以下的组中的一组或多组：

(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；

(2)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；

(3)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；

(4)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；

(5)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

(6)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子；

(7)SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核酸分子；

(8)SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核酸分子。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂还包括可标记所述靶核苷酸序列的探针；在一些实施例中，所述探针选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、或SEQ ID NO.24中的至少一种。

在本申请的一些实施例中，所述试剂盒还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。

在本申请的一些实施例中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。

本申请还提供上述食管癌检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒用于制备食管鳞状细胞癌或食管腺癌的诊断或辅助诊断试剂盒。

相应地，本申请还提供上述食管癌检测试剂盒的使用方法，

提供离体生物样本，提取样本DNA；

加入所述检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述样本DNA中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应，其中，所述靶核苷酸序列源自DIDO1基因的CpG岛；以及

分析所述样本中被扩增区域的DNA的甲基化水平；

其中，加入所述检测试剂之前，任选地，还包括加入反应试剂差异化修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的步骤。

有益效果：

本申请提供的基于DIDO1基因甲基化水平检测的食管癌检测试剂盒及其使用方法，以对DIDO1基因作为目标基因，通过检测DIDO1基因中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化，为食管癌患者的诊断及辅助诊断提供参考。本申请提供了一种基于新的食管癌检测生物标志物，可用于不同分期食管癌患者的检测诊断，具有良好的灵敏度和特异性，对于食管癌非介入性检测、早期筛查及改善患者预后具有重要意义。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请实施例提供一种基于DIDO1基因甲基化水平检测的食管癌检测试剂盒及其使用方法。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。

本申请实施例首先提供一种基于DIDO1基因甲基化水平检测的食管癌检测试剂盒，包括能够特异性检测生物样本中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应的检测试剂，其中，所述靶核苷酸序列源自DIDO1基因的CpG岛。

CpG岛是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。一般的定义为一段至少含有200bp碱基的区域，其中GC所占的比例超过50％，且CpG的观察值/预测值高于0.6。

在本申请的一些实施例中，所述靶核苷酸序列是DIDO1基因的核苷酸序列全长或其部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。

本申请的发明人发现，人食管癌与DIDO1基因的DNA甲基化水平相关，DIDO1基因CpG岛区域在食管癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，通过检测DIDO1基因核苷酸序列的DNA甲基化水平，可以为受试者(对象)是否存在食管癌的风险或者是否存在食管癌早期病变、或者是否已经发生食管癌病变提供参考。

DNA甲基化是在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化水平是指在特定核苷酸序列或其部分区域中，所有CpG二核苷酸位点中发生甲基化的CpG二核苷酸位点所占的比例。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

在本申请的实施例中，DIDO1基因位于人20号染色体，例如以GRCh38/hg38为参考基因组，为该基因组中Chr20:62877738-62937952区域的全长序列(本文中所提到的以基因组为参考的位点或区域的位置均是以GRCh38/hg38为参考)。

其中，DIDO1基因的CpG岛包括Chr20:62877064-62877325区域、Chr20:62880870-62882355区域、Chr20:62911003-62911525域、Chr20:62925676-62926862区域、Chr20:62929082-62929602区域和Chr20:62937327-62938564区域。

在本申请的实施例中，所述SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列为chr20:62929613-62929070区域。所述检测试剂还可针对与SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列全长或部分区域。

在本申请的实施例中，所述DIDO1基因甲基化水平检测可针对SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列或与之反向互补的核苷酸链的全长或部分区域。在一些实施例中，所述部分区域为是来源于SEQ ID NO.28所示核苷酸序列或与之反向互补的核苷酸序列的至少连续10个碱基长度，且至少包含1个CpG二核苷酸位点；例如所述部分区域为至少连续50个碱基长度，或者至少连续83个碱基长度、至少连续91、95、98、108、127、129、136、142、173个碱基长度的核苷酸序列；再例如，所述部分区域至少包含6-53个CpG二核苷酸位点，该部分区域可以含有6-53之间任意数量的CpG二核苷酸位点，例如至少6-50个、至少6-30个或者至少6-12个CpG二核苷酸位点；示例性地，可以是6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、40个、或50个CpG二核苷酸位点。

作为示例性方案，所述部分区域包括SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.36任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。

具体来说，SEQ ID NO.29为Chr20：62929070-62929184区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化水平检测是针对SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列中第13位、24位、34位、41位、51位、99位、108位和第113位一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20：62929070-62929184区域正义链中chr20:62929082、chr20:62929093、chr20:62929103、chr20:62929110、chr20:62929120、chr20:62929168、chr20:62929177和chr20:6292918)。

SEQ ID NO.30为Chr20：62929122-62929270区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化水平检测是针对SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列中第7、21、77、84、91和135位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20：62929122-62929270区域正义链的chr20:62929128、chr20:62929142、chr20:62929198、chr20:62929205、chr20:62929212和chr20:62929256位)。

SEQ ID NO.31为Chr20:62929392-62929542区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化水平检测是针对SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列中第5、10、76、78、132、136和143位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20:62929392-62929542区域正义链chr20:62929396、chr20:62929401、chr20:62929467、chr20:62929469、chr20:62929523、chr20:62929527和chr20:62929534位)。

SEQ ID NO.32为Chr20:62929425-62929610区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化水平检测是针对SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列中第12、43、45、51、165和177位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20:62929425-62929610区域正义链chr20:62929436、chr20:62929467、chr20:62929469、chr20:62929475、chr20:62929589和chr20:62929601)。

SEQ ID NO.33为Chr20:62929613-62929519区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化水平检测是针对SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列中第95、90、86、79、57、24和12位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20:62929613-62929519区域负义链chr20:62929519、chr20:62929524、chr20:62929528、chr20:62929535、chr20:62929557、chr20:62929590和chr20:62929602)。

SEQ ID NO.34为Chr20:62929503-62929365区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化检测是针对SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列中第130、127、36、34、28、26、21、17和13位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20:62929503-62929365区域负义链chr20:62929374、chr20:62929377、chr20:62929468、chr20:62929470、chr20:62929476、chr20:62929478、chr20:62929483、chr20:62929487和chr20:62929491)。

SEQ ID NO.35为Chr20：62929314-62929202区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化检测是针对SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列中第109、102、94、58、39、20、9位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20：62929314-62929202区域负义链中chr20:62929206、chr20:62929213、chr20:62929221、chr20:62929257、chr20:62929276、chr20:62929295和chr20:62929306)。

SEQ ID NO.36为Chr20：62929201-62929101区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的甲基化水平检测是针对SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列中第98、91、46、33、19位和第3位的一处或多处胞嘧啶是否发生甲基化(Chr20：62929201-62929101区域负义链chr20:62929104、chr20:62929111、chr20:62929156、chr20:62929169、chr20:62929183和chr20:62929199)。

本领域技术人员可以理解，由于个体差异的不同，在同一染色体的相同区域，基因的碱基序列可能存在细微差别。因此，与SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列、或其反向互补序列、或前述两者的部分区域存在不同位点，但具有较高同一性的序列仍可作为本申请中的靶核苷酸序列。只要该目标序列生物学上是对应于GRCh38/hg38基因组的相应区域。因而，可作为甲基化水平检测目标序列的靶核苷酸序列还包括与GRCh38/hg38基因组人DIDO1基因核苷酸序列存在80％以上同一性的核苷酸序列，例如至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列；优选地，所述具有同一性的序列仍保持SEQID NO.37所示的核苷酸序列、或其互补序列中的CpG二核苷酸位点不发生变化。

两个核酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。同一性百分比或一致性百分比意指在最佳比对(bestalignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的百分比，该百分比是纯粹统计学的，且两个序列之间的差异随机地分布并分布在其整个长度上。通常，这种序列的比较可以手动进行，也可以利用序列比对工具(例如Blast或其他在线序列比对软件)进行。在本申请的一些实施例中，所述DNA甲基化水平检测所针对的是与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分连续区域有至少80％的同一性。

在本申请的一些实施例中，核苷酸序列“互补”是指一一对应的碱基互补。例如人基因组中DNA序列包括正义链和与之对应互补的反义链，正义链和反义链具有本领域已知的含义，一般来说，反义链(负链，nonsense strand)为mRNA转录时结合的模板链，而非模板链存储mRNA的编码信息，为正义链(正链，sense strand)。可以理解的是，在DNA双链中，只是在某一部分区域某一条链是正义链，部分是反义链，在另一个区域可能是完全相反的。

可采用本领域已知的方法检测上述核苷酸序列的DNA甲基化水平，包括但部限于甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法等。本领域技术人员可根据已知方法所需的试剂和工具确定并制备所述检测试剂。

在本申请的实施例中，所述检测试剂包括可PCR扩增上述靶核苷酸序列的引物对及探针。本申请中，检测试剂所包括的引物对及探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对及探针，只要可以实现检测特定CpG位点是否发生甲基化的目的即可。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂包括可PCR扩增所述靶核苷酸序列的引物对及探针。

作为示例性方案，可采用下述一组或多组引物对及探针分别检测SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.36任一序列或多个序列：

(1)引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3；

(2)引物对为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，探针为SEQ ID NO.6；

(3)引物对为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，探针为SEQ ID NO.9；

(4)引物对为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，探针为SEQ ID NO.12；

(5)引物对为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，探针为SEQ ID NO.15；

(6)引物对为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，探针为SEQ ID NO.18；

(7)引物对为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，探针为SEQ ID NO.21；

(8)引物对为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23，探针为SEQ ID NO.24。

本申请中，所述探针标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，在一些实施方式中，所述探针5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光猝灭基团为MGB。

在本申请的实施例中，所述试剂还包括能特异性修饰甲基化DNA的反应试剂。在用所述反应试剂处理来自生物样本的DNA样本之后，所述检测试剂能确定上述核苷酸序列中的每一个CpG是甲基化的还是非甲基化的。

在一些实施例中，所述反应试剂是选自以下方法的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、焦磷酸测序法、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、数字PCR法等所需的试剂等。在本申请的示例性方案中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

在本申请的一些实施例中，所述试剂盒还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。

在本申请的一些实施例中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。所述内参基因可以为β-act in，对照物为β-act in基因和目标序列的人工合成质粒。所述缓冲液可以为本领域已知的适于本申请PCR反应的缓冲液体系。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂盒用于检测食管鳞状细胞癌或食管腺癌。

在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于对象的离体生物样本。本申请中，“对象”或“患者”或“受试者”包括人类患者和其它哺乳类动物，还包括患有或患有过食管癌的任何个体，或者希望使用本发明方法进行分析或治疗的任何个体。落入本发明范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如绵羊、牛、马、猴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如猫、狗)和圈养野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。优选地，患者为人类患者。

本申请还提供核酸分子的组合，所述核酸分子选自以下的组中的一组或多组：

(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；

(2)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；

(3)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；

(4)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；

(5)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

(6)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子；

(7)SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核酸分子；

(8)SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核酸分子；

进一步地，所述核酸分子的组合还对应地包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24中的一种或多种。

相应地，本申请还提供上述检测试剂盒的使用方法，包括：

提供离体生物样本，提取其中的样本DNA；

加入所述检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述DNA样本中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应，其中，所述靶核苷酸序列源自DIDO1基因的CpG岛；以及

分析所述样本中被扩增区域的DNA的甲基化水平；

其中，加入所述检测试剂之前，任选地，还包括加入反应试剂差异化修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的步骤。

在一个实施例中，所述使用方法包括：

S1.提供离体生物样本，提取其中的样本DNA；

S2.用所述反应试剂与所述DNA样本反应，差异化修饰所述DNA样本中的甲基化DNA和非甲基化DNA；

S3.加入所述检测试剂，进行PCR扩增反应；以及

S4.分析所述样本中被扩增区域的DNA的甲基化水平。

其中，在S1中，所述生物样本为离体样本，本领域技术人员可以采用本领域已知的方法或工具提取样本中的DNA样本，例如采用商业化的血液DNA提取试剂盒或组织样本DNA提取试剂盒。

本申请提供了作为食管癌检测诊断的生物标记物，提出DIDO1基因甲基化水平与食管癌检测有重要关联，该基因及其部分区域的CpG位点是否发生甲基化可以特异性地指示受试者是否患有食管癌，为食管癌的诊断/辅助诊断提供了一种有效的分子生物学标记物。本申请进一步提供了检测DIDO1基因或其部分区域甲基化水平的试剂及方法，可用于各种亚型的食管癌患者的诊断及辅助诊断。在本申请的一些实施例中，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌，本申请的检测试剂盒尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断。本申请的检测试剂盒可用于不同分期食管癌的诊断及辅助诊断，例如高级别瘤变、早期食管癌、进展期食管癌，因而，本申请的检测试剂盒可用于食管癌的早期筛查，其灵敏度可达70％甚至97％以上。本申请所称的不同分期的食管癌可以是参考美国癌症协会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)所定义的分期系统，例如食管鳞癌，0期食管鳞癌为TisN0M0，表现为食管的重度异型增生或高级别瘤变。也就是说，即使患者处于0期食管鳞癌或者更早期的病变，本申请的检测试剂盒仍可保持较高的灵敏度，可应用于食管癌的早期筛查，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。需要说明的是，基于人类疾病诊断的复杂性，本申请所述的食管癌检测试剂盒所获得的结果仅作为食管癌诊断的中间结果或提示患者患有食管癌的可能性或风险，还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患食管癌的结论。

下面结合具体实施例说明本申请的技术方案。

本实施例中，所用试剂如无特殊说明，均为市售产品。

实施例

本实施例提供用于食管癌的检测试剂盒，共8组，其包括扩增目标序列的引入对和探针。具体序列如表1所示。

表1 实施例1-8的试剂盒涉及的目标序列、引入对及探针

上述实施例1-8所提供的食管癌检测试剂盒可通过如下步骤进行食管癌患者生物样本的检测诊断及辅助诊断：

1、DNA模板的提取：

当所用样本是食管组织样本时，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

当所用样本是血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。

2、亚硫酸盐的转化

所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。

3、PCR反应

β-actin作为内参基因，

其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.25)；

β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.26)；

β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.27)。

PCR反应体系如表2所示。

检测目标序列的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。

表2 PCR扩增反应体系

组分	规格	体积(μL)
			缓冲液	5×	5
dNTPs	各2.5mM	2
			目标序列上游引物	10μM	1
目标序列下游引物	10μM	1
			目标序列探针	10μM	1
β-actin上游引物	10μM	1
			β-actin下游引物	10μM	1
β-actin探针	10μM	1
			DNA酶	5U/μL	0.5
待测样本DNA	/	5
			纯化水	/	补至25

如表3所示，在检测SEQ ID NO.29-36任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将表1某一区域对应的引物探针、β-actin引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表2中的体积加入到反应体系中。PCR反应条件如下表3所示。

表3 PCR反应条件

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin基因和目标序列的人工合成质粒，浓度为10³拷贝/微升，阴性对照应无扩增，阳性对照应有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果分析和判读方法：在相同的实验条件下，对不同的样本检测同一基因的甲基化时，Ct值越小，表明该基因在该样本中的甲基化水平越高。若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。敏感性为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。

实验例1

收集武汉某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管癌鳞组织48例、早期食管鳞癌组织48例、进展期食管鳞癌组织64例及癌旁组织56例，所有样本为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理，食管癌患者均为食管鳞癌。按照实施例提供的方法进行DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-8中的基于8个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表4所示。

表4 实施例1-8的检测试剂盒在组织样本中的检测灵敏度和特异性

实验例2

收集郑州某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌血液样本89例、早期食管鳞癌血液样本75例、进展期食管鳞癌血液样本130例及正常人血液样本52例，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。按照实施例提供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-8中的针对人基因组中基于8个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表5所示。

表5 实施例1-8的试剂盒在血浆样本中的检测灵敏度和特异性

由表4和表5可以看出，实施例1-实施例8的试剂盒作为食管癌患者检测诊断时，均有良好的灵敏度和特异性。具体来说，对于食管组织样本，实施例1-8的试剂盒对于高级别瘤变可以达到70％以上的灵敏度，对于早期食管癌可以达到80％以上灵敏度，对于进展期食管癌可到90％以上灵敏度，特异性达95％以上，可见本申请实施例提供的试剂盒可通过食管组织样本的DNA甲基化检测有效检测出食管癌病变，对于高危癌前病变也有良好的预警作用；对于血液样本，实施例1-8的试剂盒对于高级别瘤变可以达到70％及以上的灵敏度，对于早期食管癌可以达到75％以上灵敏度，对于进展期食管癌可到80％以上灵敏度，特异性达94％以上，可见本申请实施例提供的试剂盒也可用于血液样本，尤其是可有效检测进展期食管癌，采用血液样本可简化取样环节，减小取样创伤，可大大提高食管癌检测诊断试剂的可及性。尤其是SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34四个序列作为靶序列时，无论是采用组织样本还是血液样本，均有优异的灵敏度和特异性，例如灵敏度均在85％以上，进展期食管癌的检测灵敏度达96％以上，可用于早期高危病变的筛查和辅助诊断，对食管癌的早筛早干预有重大意义。

以上对本申请实施例所提供的食管癌检测试剂盒及其应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 食管癌检测试剂盒及其应用

<130> WHP210731CN

<160> 36

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 1

ttaggaggta gtcggtttta tttcg 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 2

aacgaaccgt ctctaccgaa a 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 3

aagtcggatt tcgtttagtt tcgtg 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 4

tgaaagcgaa ggagtattag cg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

aaccctatcc ttaaccgcta cc 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 6

ttaagaatcg gaagtcggat agcgt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 7

tgttcgtttc gggggatatt tatag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

acaaacacga ctcacgaccg aa 22

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 9

atggaggttt gtagggatgt atcgc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

tagatttttg tcgaggtagg atgga 25

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

ataactaacg atacaacccc cga 23

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 12

tttgtaggga tgtatcgcgg gttc 24

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<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 13

taagtggttg gcgatatagt tttcg 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

gacccgatcg taaatcgtat ctata 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 15

attgaggttt tggagtatag cgtgg 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 16

agaattatgt ttcggtcgtt cg 22

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 17

ctaaacctcg acgctaaact cct 23

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<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 18

tcgcgggttc gcggtgtatt t 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 19

ttaaaggtcg agatttggac gt 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 20

aaccgaacaa cgtcaaaacg t 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 21

cgggggtttt gtttttggtc gtt 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 22

ttcggttttt ggagaggacg 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 23

accgaatttc gcttaatccc 20

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 24

ttgtcgagag aattgtgcgg aat 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 25

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 26

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 27

ggagtggttt ttgggtttg 19

<210> 28

<211> 544

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28

ccaggaggca gccggcttta cttcgtttaa agccggattt cgcttagtcc cgtgaaagcg 60

aaggagcacc agcgcttcct gattccgcac agttctctcg gcagagacgg cccgtcctct 120

ccaagaaccg gaagccggac agcgtcagga cgttttattc ttctcacctg ggattcagag 180

aggcagcggc caaggacagg gcccccgccg aggccaccgg gcagcgtcca ggtctcggcc 240

tttgggaggg gagcagcggg ggaggggcac ggggaggggc gagggcgggg cgcgcctggg 300

cctcggcgct gggctcctcc tctgcccgct ccgggggaca cccacaggat tcttgcagac 360

ctctgccgag gcaggatgga ggcctgcagg gatgcaccgc gggcccgcga cccgggcggc 420

cggaacatag ttctttctgg ccggagatcg gcccggtcgt gagtcgtgtc tgtgccaggc 480

cccccacgct gtgctccagg gcctcagtgc ccggcgcgcc gggggctgta tcgccagcca 540

cttg 544

<210> 29

<211> 115

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

ccaggaggca gccggcttta cttcgtttaa agccggattt cgcttagtcc cgtgaaagcg 60

aaggagcacc agcgcttcct gattccgcac agttctctcg gcagagacgg cccgt 115

<210> 30

<211> 149

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 30

tgaaagcgaa ggagcaccag cgcttcctga ttccgcacag ttctctcggc agagacggcc 60

cgtcctctcc aagaaccgga agccggacag cgtcaggacg ttttattctt ctcacctggg 120

attcagagag gcagcggcca aggacaggg 149

<210> 31

<211> 151

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31

tgcccgctcc gggggacacc cacaggattc ttgcagacct ctgccgaggc aggatggagg 60

cctgcaggga tgcaccgcgg gcccgcgacc cgggcggccg gaacatagtt ctttctggcc 120

ggagatcggc ccggtcgtga gtcgtgtctg t 151

<210> 32

<211> 186

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32

cagacctctg ccgaggcagg atggaggcct gcagggatgc accgcgggcc cgcgacccgg 60

gcggccggaa catagttctt tctggccgga gatcggcccg gtcgtgagtc gtgtctgtgc 120

caggcccccc acgctgtgct ccagggcctc agtgcccggc gcgccggggg ctgtatcgcc 180

agccac 186

<210> 33

<211> 95

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

caagtggctg gcgatacagc ccccggcgcg ccgggcactg aggccctgga gcacagcgtg 60

gggggcctgg cacagacacg actcacgacc gggcc 95

<210> 34

<211> 139

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

agaactatgt tccggccgcc cgggtcgcgg gcccgcggtg catccctgca ggcctccatc 60

ctgcctcggc agaggtctgc aagaatcctg tgggtgtccc ccggagcggg cagaggagga 120

gcccagcgcc gaggcccag 139

<210> 35

<211> 113

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

ccaaaggccg agacctggac gctgcccggt ggcctcggcg ggggccctgt ccttggccgc 60

tgcctctctg aatcccaggt gagaagaata aaacgtcctg acgctgtccg gct 113

<210> 36

<211> 101

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

tccggttctt ggagaggacg ggccgtctct gccgagagaa ctgtgcggaa tcaggaagcg 60

ctggtgctcc ttcgctttca cgggactaag cgaaatccgg c 101

Claims (13)

1.一种食管癌检测试剂盒，其特征在于，包括能够特异性检测生物样本中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂，其中，所述靶核苷酸序列源自DIDO1基因的CpG岛。

2.根据权利要求1所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述靶核苷酸序列是DIDO1基因的核苷酸序列全长或其部分区域，其中所述部分区域至少包括一个CpG二核苷酸位点。

3.根据权利要求2所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述部分区域为SEQ IDNO.28所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.28一一对应反向互补的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述部分区域为SEQ IDNO.29-SEQ ID NO.36任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。

5.根据权利要求1-4任一项所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括可PCR扩增所述靶核苷酸序列的引物对。

6.根据权利要求5所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述引物对选自以下的组中的一组或多组：

(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；

(2)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；

(3)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；

(4)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；

(5)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

(6)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子；

(7)SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核酸分子；

(8)SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核酸分子。

7.根据权利要求5或6所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂还包括可特异性标记所述靶核苷酸序列的探针。

8.根据权利要求7所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、或SEQ ID NO.24中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括能差异化修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。

10.根据权利要求9所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

11.根据权利要求1所述的食管癌检测试剂盒，其特征在于，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。

12.如权利要求1所述的食管癌检测试剂盒的应用，其特征在于，所述检测试剂盒用于制备食管鳞状细胞癌或食管腺癌的诊断或辅助诊断试剂盒。

13.如权利要求12所述的食管癌检测试剂盒的应用，其特征在于，

提供离体生物样本，提取样本DNA；

加入所述检测试剂，进行PCR扩增反应，检测所述样本DNA中靶核苷酸序列中CpG二核苷酸位点是否发生甲基化反应，其中，所述靶核苷酸序列源自DIDO1基因的CpG岛；以及

分析所述样本中被扩增区域的DNA的甲基化水平；

其中，加入所述检测试剂之前，任选地，还包括加入反应试剂差异化修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的步骤。