CN113308544B

CN113308544B - 用于dna甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒

Info

Publication number: CN113308544B
Application number: CN202110625017.6A
Authority: CN
Inventors: 张良禄; 周俊; 董兰兰; 熊杨辉; 李婷婷
Original assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Current assignee: Wuhan Aimisen Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2041-06-04
Also published as: CN113308544A

Abstract

本申请公开了一种用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒，对SEQ ID NO.37或者其部分区域或者其互补序列DNA甲基化水平的检测，可以用于食管癌患者的诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，包括高级别瘤变、早期食管癌、进展期食管癌，因而本申请的检测试剂盒可用于食管癌的早期筛查，其灵敏度可达70％甚至97％以上，具有良好的灵敏度和特异性，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。

Description

用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒

技术领域

本申请涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒。

背景技术

食管癌是发生在食管黏膜上皮及食管腺上皮的恶性肿瘤，是消化系统最常见的恶性肿瘤之一。食管癌分为鳞状细胞癌和腺癌两种亚型，其中鳞状细胞癌占绝大部分，90％的食管癌病例为鳞状细胞癌。两种亚型的食管癌在地理分布上呈现不同的差异，比如在美国，更多食管癌患者为食管腺癌，在中国，大部分食管癌患者为鳞状细胞癌。

相当多食管癌患者在确诊时已经是中晚期，其预后较差。食管癌的早期诊断能明显提高治疗效果并改善患者的预后，食管癌的癌前病变，包括鳞状细胞癌的癌前病变和腺癌的癌前病变，即鳞状上皮和腺上皮的上皮内瘤变/异型增生。鳞状上皮的上皮内瘤变/异型增生，是指以食管黏膜鳞状上皮内不同层次的异型鳞状细胞为特征的癌前病变，根据病变累及层次，分为低级别上皮内瘤变/异型增生和高级别上皮内瘤变/异型增生。腺上皮的上皮内瘤变/异型增生，是指以食管腺上皮不同程度的细胞异型性和结构异常为特征的癌前病变，主要见于Barrett食管，根据细胞异型性和结构异常的程度，分为低级别上皮内瘤变/异型增生和高级别上皮内瘤变/异型增生。内镜和细胞活检等技术相结合提高了高危人群中食管癌的检出率，但患者接受度低、且操作不够灵活，近年来分子生物学方面的进展为开发简便、有效的早期诊断方法提供了新的方向，食管癌组织中存在多基因、多位点的甲基化，并且在食管癌发生的早期即出现DNA甲基化的改变，因此，甲基化改变有望作为食管癌早期诊断的标志物，从DNA甲基化角度探索食管癌诊断策略已成为一种新的思路。

一般而言，与癌症相关的DNA甲基化改变指的是CpG岛的甲基化改变，值得注意的是，尽管CpG岛内包含多个CpG二核苷酸位点，但并非每个位点都与癌症的发生发展有同等的相关性。现有技术中以某基因的DNA甲基化水平作为疾病诊断依据时，通常以基因整体作为靶序列，但这种情况下靶序列中的CpG岛较长，且与疾病的相关性存在差异，导致检测的特异性及灵敏度降低。因此，在开发癌症检测标记物时，需要找到灵敏性和特异性均较好的CpG位点。

发明内容

本申请提供一种用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒，可以用于食管癌的诊断尤其是食管癌的早期筛查。

本申请提供如下技术方案：

一种用于DNA甲基化检测的试剂，包括能够特异性检测生物样本中以下(a)-(c)中至少任一核苷酸序列的甲基化水平的检测试剂：

(d)SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；

(e)与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；

(f)与(a)或(b)至少80％以上同一性的核苷酸序列。

在本申请的一些实施例中，所述互补序列是与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的每个碱基一一对应互补所形成的核苷酸序列。

在本申请的一些实施例中，所述(a)或(b)中部分区域为SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列或其互补序列中包括CpG二核苷酸位点的区域，所述部分区域的核苷酸序列长度为小于908bps。

在本申请的一些实施例中，所述(a)中的部分区域为SEQ ID NO.37中的第1-304位所示的核苷酸序列。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂包括核酸分子。

在本申请的一些实施例中，所述核酸分子包括可PCR扩增(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的引物对。

在本申请的一些实施例中，所述部分区域为SEQ ID NO.38-SEQ ID NO.49任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。

在本申请的一些实施例中，所述引物对选自以下的组中的一组或多组：

(13)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；

(14)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；

(15)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；

(16)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；

(17)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

(18)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子；

(19)SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核酸分子；

(20)SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核酸分子；

(21)SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核酸分子；

(22)SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的核酸分子；

(23)SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核酸分子；

(24)SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的核酸分子；

在本申请的一些实施例中，所述探针选自SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.36中的一种或多种。

在本申请的一些实施例中，所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。

在本申请的一些实施例中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。

相应地，本申请还提供一种用于食管癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其包括如上所述的用于DNA甲基化水平检测的试剂。

在本申请的一些实施例中，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。

在本申请的一些实施例中，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌。

有益效果：

本申请提供的用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒，对特定的核苷酸序列DNA甲基化水平的检测，可以用于食管癌患者的诊断及辅助诊断，尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断，可用于不同分期食管癌患者，包括高级别瘤变、早期食管癌、进展期食管癌，因而本申请的检测试剂盒可用于食管癌的早期筛查，其灵敏度可达70％甚至97％以上，具有良好的灵敏度和特异性，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请实施例提供一种DNA甲基化检测试剂及食管癌检测试剂盒。以下分别进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。

本申请实施例首先提供一种DNA甲基化检测用的试剂，包括能够特异性检测生物样本中以下(a)-(c)中至少任一DNA序列的甲基化水平的检测试剂：

(a)SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的全长或其任意部分区域；

(b)与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列互补序列的全长或其任意部分区域；

(c)与(a)或(b)至少80％以上同一性的核苷酸序列。

本申请的发明人发现，人食管癌与上述核苷酸序列的DNA甲基化水平相关，并且在食管癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，通过检测上述核苷酸序列的DNA甲基化水平，可以为受试者(对象)是否存在食管癌的风险或者是否存在食管癌早期病变、或者是否已经发生食管癌病变提供参考，为食管癌诊断或辅助诊断提供参考。

DNA甲基化是在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化水平是指在特定核苷酸序列或其部分区域中，所有CpG二核苷酸位点中发生甲基化的CpG二核苷酸位点所占的比例。本申请中，DNA甲基化检测是指通过检测确定每一个CpG岛是否发生甲基化，并计算出特定区域的核苷酸序列中其甲基化水平。在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。

在本申请的实施例中，所述SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列是来源于人1号染色体，例如以GRCh38.p13为参考基因组，为该基因组中Chr1:110674274-110675181区域的全长序列(本文中所提到的以基因组为参考的位点或区域的位置均是以GRCh38.p13为参考)。

CpG岛是指DNA上的一个区域，此区域富含大量的用磷酸酯键相连的胞嘧啶和鸟嘌呤。一般的定义为一段至少含有200bp碱基的区域，其中GC所占的比例超过50％，且CpG的观察值/预测值高于0.6。其中，本申请所涉及的CpG岛包括Chr1：110674274-110674356区域、Chr1：110674361-110674450区域、Chr1:110674451-110674577区域、Chr1:110674609-110674700区域、Chr1:110674712-110674849区域、Chr1:110674874-110674962区域、Chr1:110675072-110675181区域、Chr1:110674452-110674559区域、Chr1：110674300-110674428区域、Chr1：110674940-110675112区域、Chr1:110674791-110674932区域和Chr1:110674682-110674776区域。

在本申请的实施例中，所述SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列为chr1:110674274-110675181区域。但是，所述DNA甲基化检测还可针对与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列互补序列的全长或部分区域。

在本申请的实施例中，所述DNA甲基化检测可针对SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列或与之互补的正义链全长或部分区域。其中，所述部分区域是中SEQ ID NO.37所示核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列中包括CpG二核苷酸位点的区域。在一些实施例中，所述部分区域为是来源于SEQ ID NO.37所示核苷酸序列或与之互补的核苷酸序列的至少连续10个碱基长度，且至少包含1个CpG二核苷酸位点；例如所述部分区域为至少连续50个碱基长度，或者至少连续83个碱基长度、至少连续91、95、98、108、127、129、136、142、173个碱基长度的核苷酸序列；再例如，所述部分区域至少包含6-110个CpG二核苷酸位点，该部分区域可以含有6-110之间任意数量的CpG二核苷酸位点，例如6-100个、至少6-50个、或者至少6-12个CpG二核苷酸位点；示例性地，可以是7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、40个、或50个CpG二核苷酸位点。

其中，在一些实施例中，所述SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列中第1-304位碱基区域(即GRCh38.p13基因组中chr1:110674274-110674577区域)作为所述DNA甲基化检测的目标区域。或者，在另一些实施例中，所述DNA甲基化检测还可针对SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列中第1-304位碱基区域(即GRCh38.p13基因组中chr1:110674274-110674577区域)的正义链进行。

作为示例性方案，在本申请的一些实施例中，所述部分区域为SEQ ID NO.38-SEQID NO.49任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。

具体来说，SEQ ID NO.38为Chr1：110674274-110674356区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列中第5位、第14、21、34、41、65、68、79位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1：110674274-110674356区域正义链Chr1:110674278、Chr1:110674287、Chr1:110674294、Chr1:110674307、Chr1:110674314、Chr1:110674338、Chr1:110674341和Chr1:110674352位)。

SEQ ID NO.39为Chr1：110674361-110674450区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列中第2、14、19、43、46、56、71位的胞嘧啶是否发生甲基化。(Chr1：110674361-110674450区域正义链Chr1:110674362、Chr1:110674374、Chr1:110674379、Chr1:110674403、Chr1:110674406、Chr1:110674416和Chr1:110674431位)

SEQ ID NO.40为Chr1:110674451-110674577区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列中第9、14、19、53、68、72、74、106、110、116、119、122位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674451-110674577区域正义链Chr1:110674459、Chr1:110674464、Chr1:110674469、Chr1:110674503、Chr1:110674518、Chr1:110674522、Chr1:110674524、Chr1:110674556、Chr1:110674560、Chr1:110674566、Chr1:110674569和Chr1:110674572位)。

SEQ ID NO.41为Chr1:110674609-110674700区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列中第10、30、39、48、79、81、87位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674609-110674700区域正义链Chr1:110674618、Chr1:110674638、110674647、110674656、Chr1:110674687、110674689和110674695位)。

SEQ ID NO.42为Chr1:110674712-110674849区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列中第8、11、18、73、88、92、120、134位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674712-110674849区域正义链Chr1:110674719、Chr1:110674722、Chr1:110674729、Chr1:110674784、Chr1:110674799、Chr1:110674803、Chr1:110674831和Chr1:110674845)。

SEQ ID NO.43为Chr1:110674874-110674962区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列中第2、8、14、19、28、47、49、72、80、88位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674874-110674962区域正义链Chr1:110674875、Chr1:110674881、Chr1:110674887、Chr1:110674892、Chr1:110674901、Chr1:110674920、Chr1:110674922、Chr1:110674945、Chr1:110674953和Chr1:110674961)。

SEQ ID NO.44为Chr1:110675072-110675181区域正义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.44所示的核苷酸序列中第3、9、19、56、65、89、92、97位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110675072-110675181区域正义链Chr1:110675074、Chr1:110675080、Chr1:110675090、Chr1:110675127、Chr1:110675136、Chr1:110675160、Chr1:110675163和Chr1:110675168)。

SEQ ID NO.45为Chr1:110674452-110674559区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.45所示的核苷酸序列中第3、8、13、19、35、37、41、90、95、100位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674452-110674559区域负义链Chr1:110674557、Chr1:110674552、Chr1:110674547、Chr1:110674541、Chr1:110674525、Chr1:110674523、Chr1:110674519、Chr1:110674470、Chr1:110674465和Chr1:110674460)。

SEQ ID NO.46为Chr1：110674300-110674428区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.46所示的核苷酸序列中第2、12、22、66、70、76、87、114、121、127位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1：110674300-110674428区域负义链Chr1:110674427、Chr1:110674417、Chr1:110674407、Chr1:110674363、Chr1:110674359、Chr1:110674353、Chr1:110674342、Chr1:110674315、Chr1:110674308和Chr1:110674302)。

SEQ ID NO.47为Chr1：110674940-110675112区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.47所示的核苷酸序列中第19、22、62、159、167、169位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1：110674940-110675112区域负义链Chr1:110675094、Chr1:110675091、Chr1:110675051、Chr1:110674954、Chr1:110674946和Chr1:110674944)。

SEQ ID NO.48为Chr1:110674791-110674932区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.48所示的核苷酸序列中第10、12、87、121、129、133位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674791-110674932区域负义链Chr1:110674923、Chr1:110674921、Chr1:110674846、Chr1:110674812、Chr1:110674804和Chr1:110674800)。

SEQ ID NO.49为Chr1:110674682-110674776区域负义链。在一些实施例中，本申请所述的DNA甲基化检测是针对SEQ ID NO.49所示的核苷酸序列中第2、5、16、22、24、47、54、57、81、87、89位的胞嘧啶是否发生甲基化(Chr1:110674682-110674776区域负义链Chr1:110674775、Chr1:110674772、Chr1:110674761、Chr1:110674755、Chr1:110674753、Chr1:110674730、Chr1:110674723、Chr1:110674720、Chr1:110674696、Chr1:110674690和Chr1:110674688)。

本领域技术人员可以理解，由于个体差异的不同，在同一染色体的相同区域，基因的碱基序列可能存在细微差别。因此，与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分区域存在不同位点，但具有较高同一性的序列仍可作为本申请中DNA甲基化检测的目标序列。只要该目标序列生物学上是对应于GRCh38.p13基因组的相应区域，例如是属于KCNA3基因序列。两个核酸序列之间的“同一性”，其百分比表示在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的统计学意义的百分比，两个序列之间的差异随机地分布在其整个长度上。同一性百分比或一致性百分比意指在最佳比对(best alignment)后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸的百分比，该百分比是纯粹统计学的，且两个序列之间的差异随机地分布并分布在其整个长度上。通常，最佳比对(best alignment)是待比较的两个序列之间的同一性百分比最高的比对，例如两个核酸序列之间的序列比较通过在最优比对后比较这些序列来进行，所述比较通过区段或比较窗口进行以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域；这种序列的比较可以手动进行，也可以利用序列比对工具(例如Blast或其他在线序列比对软件)进行。在本申请的一些实施例中，所述DNA甲基化检测所针对的是与SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列、或其互补序列、或前述两者的部分连续区域有至少80％、至少85％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％同一性的序列；优选地，所述具有同一性的序列仍保持SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列、或其互补序列中的CpG二核苷酸位点不发生变化。

在本申请的一些实施例中，核苷酸序列“互补”是指一一对应的碱基互补。例如人基因组中DNA序列包括正义链和与之对应互补的反义链，正义链和反义链具有本领域已知的含义，一般来说，反义链(负链，nonsense strand)为mRNA转录时结合的模板链，而非模板链存储mRNA的编码信息，为正义链(正链，sense strand)。可以理解的是，在DNA双链中，只是在某一部分区域某一条链是正义链，部分是反义链，在另一个区域可能是完全相反的。

可采用本领域已知的方法检测上述核苷酸序列的DNA甲基化水平，包括但不限于甲基化特异性PCR、定量甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字PCR法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法等。本领域技术人员可根据已知方法所需的试剂和工具确定并制备所述检测试剂。

在本申请的实施例中，所述检测试剂包括核酸分子。所述核酸分子包括可PCR扩增上述核苷酸序列或其互补序列的全长或其任意部分区域的引物对及探针。本申请中，检测试剂所包括的引物对及探针没有特别的限定，本领域技术人员在确定上述核苷酸序列作为目标序列之后，可根据本领域已知的方法和工具设计特异性引物对及探针，只要可以实现检测特定CpG位点是否发生甲基化的目的即可。

作为示例性方案，可采用下述一组或多组引物对及探针分别检测SEQ ID NO.38-SEQ ID NO.49任一序列或多个序列：

(1)引物对为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3；

(2)引物对为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，探针为SEQ ID NO.6；

(3)引物对为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8，探针为SEQ ID NO.9；

(4)引物对为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，探针为SEQ ID NO.12；

(5)引物对为SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14，探针为SEQ ID NO.15；

(6)引物对为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，探针为SEQ ID NO.18；

(7)引物对为SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20，探针为SEQ ID NO.21；

(8)引物对为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23，探针为SEQ ID NO.24；

(9)引物对为SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26，探针为SEQ ID NO.27；

(10)引物对为SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29，探针为SEQ ID NO.30；

(11)引物对为SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32，探针为SEQ ID NO.33；

(12)引物对为SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35，探针为SEQ ID NO.36。

在本申请的实施例中，所述探针含有荧光基团。

在本申请的实施例中，所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。在用所述反应试剂处理来自生物样本的样本DNA之后，所述检测试剂能确定上述核苷酸序列中的每一个CpG是甲基化的还是非甲基化的，进而可分析所述样本DNA的甲基化水平。

在一些实施例中，所述反应试剂是选自以下方法的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、焦磷酸测序法、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、数字PCR法等所需的试剂等。在本申请的示例性方案中，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

在本申请的一些实施例中，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于对象的离体生物样本。本申请中，“对象”或“患者”或“受试者”包括人类患者和其它哺乳类动物，还包括患有或患有过食管癌的任何个体，或者希望使用本发明方法进行分析或治疗的任何个体。落入本发明范围内的合适的哺乳类动物包括但不限于：灵长类、家畜(例如绵羊、牛、马、猴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如猫、狗)和圈养野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。优选地，患者为人类患者。

在本申请的实施例中，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。所述内参基因可以为β-actin，对照物为β-actin基因和目标序列的人工合成质粒。所述缓冲液可以为本领域已知的适于本申请PCR反应的缓冲液体系。

本申请还提供核酸分子的组合，其可用于检测SEQ ID NO.37或其互补序列的全长或部分区域的DNA甲基化水平，所述核酸分子选自以下的组中的一组或多组：

(25)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核酸分子；

(26)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核酸分子；

(27)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核酸分子；

(28)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核酸分子；

(29)SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的核酸分子；

(30)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示的核酸分子；

(31)SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的核酸分子；

(32)SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示的核酸分子；

(33)SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的核酸分子；

(34)SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.29所示的核酸分子；

(35)SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的核酸分子；

(36)SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.35所示的核酸分子。

进一步地，所述核酸分子的组合还对应地包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.9、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.36中的一种或多种。

本申请进一步提供上述检测试剂盒的使用方法，包括：将来源于生物样本的DNA序列用所述反应试剂处理，随后加入所述检测试剂，进行PCR反应，测得所述DNA序列中DNA甲基化的水平。

本申请提供了可作为食管癌检测诊断标志物的核苷酸序列，其可在食管癌检测诊断/辅助诊断中作为目标序列，并进一步提供了检测上述核苷酸序列的试剂及方法。本申请所提供的试剂、检测试剂盒以及核酸分子的组合均可用于各种亚型的食管癌患者的诊断及辅助诊断。在本申请的一些实施例中，所述食管癌包括食管鳞状细胞癌和食管腺癌，本申请的检测试剂盒尤其适用于食管鳞状细胞癌的检测诊断/辅助诊断。本申请的检测试剂盒可用于不同分期食管癌的诊断及辅助诊断，例如高级别瘤变、早期食管癌、进展期食管癌，因而，本申请的检测试剂盒可用于食管癌的早期筛查，其灵敏度可达70％甚至97％以上。本申请所称的不同分期的食管癌可以是参考美国癌症协会(American Joint Committee onCancer,AJCC)所定义的分期系统，例如食管鳞癌，0期食管鳞癌为TisN0M0，表现为食管的重度异型增生或高级别瘤变。也就是说，即使患者处于0期食管鳞癌或者更早期的病变，本申请的检测试剂盒仍可保持较高的灵敏度，可应用于食管癌的早期筛查，对于早日治疗介入及改善患者预后具有重要意义。需要说明的是，基于人类疾病诊断的复杂性，本申请所述的食管癌检测试剂盒所获得的结果仅做为食管癌诊断的中间结果或提示患者患有食管癌的可能性或风险，还需结合个体的临床表现及其他生理指标最终得出是否罹患食管癌的结论。

下面结合具体实施例说明本申请的技术方案。

本实施例中，所用试剂如无特殊说明，均为市售产品。

实施例

本实施例提供用于食管癌的诊断或辅助诊断的试剂及检测试剂盒，共12组，其包括扩增目标序列的引入对和探针。具体序列如表1所示。

表1 实施例1-12的试剂盒涉及的目标序列、引入对及探针

上述实施例1-12所提供的食管癌检测试剂盒可通过如下步骤进行食管癌患者生物样本的检测诊断及辅助诊断：

1、DNA模板的提取：

当所用样本是食管组织样本时，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取组织DNA，具体操作参见试剂盒说明书。

当所用样本是血液样本时，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。

2、亚硫酸盐的转化

所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见试剂盒说明书。

3、PCR反应

β-actin(ACTB)作为内参基因，

其中β-actin上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG(SEQ ID NO.50)；

β-actin下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC(SEQ ID NO.51)；

β-actin探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG(SEQ ID NO.52)。

PCR反应体系如表2所示。

检测目标序列的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，β-actin探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。

表2 PCR扩增反应体系

如表3所示，在检测SEQ ID NO.38-49任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将表1某一区域对应的引物探针、β-actin引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表2中的体积加入到反应体系中。PCR反应条件如下表3所示。

表3 PCR反应条件

Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。

质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，阴性对照为纯化水，阳性对照为含有β-actin基因和目标序列的人工合成的混合质粒，浓度为10³拷贝/微升，阴性对照应无扩增，阳性对照应有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。

结果分析和判读方法：在相同的实验条件下，对不同的样本检测同一基因的甲基化时，Ct值越小，表明该基因在该样本中的甲基化水平越高。若某一检测区域在样本上的Ct值≤38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阳性，若某一检测区域在样本上的Ct值>38，则认为该样本在这一检测区域为甲基化阴性。将样本的甲基化检测结果同病理结果进行对比，计算甲基化检测的敏感性和特异性。敏感性为病理结果为阳性的样本中甲基化阳性的比例，特异性为病理结果为阴性的样本中甲基化阴性的比例。

实验例1

收集武汉某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌组织48例、早期食管鳞癌组织48例、进展期食管鳞癌组织64例及癌旁组织56例，所有样本为福尔马林浸泡、石蜡包埋的组织，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。按照实施例提供的方法进行DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-12中的基于12个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表4所示。

表4 实施例1-12的检测试剂盒在组织样本中的检测灵敏度和特异性

实验例2

收集郑州某医院临床病理确诊为高级别瘤变的食管鳞癌血液样本89例、早期食管鳞癌血液样本75例、进展期食管鳞癌血液样本130例及正常人血液样本52例，样本的收集过程经过伦理委员会的审批，所有患者均签署了知情同意书，所有样本均采用匿名化处理。按照实施例提供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1-12中的针对人基因组中基于12个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，PCR检测结果如表4所示。

表5 实施例1-12的试剂盒在血浆样本中的检测灵敏度和特异性

由表4和表5可以看出，实施例1-实施例12的试剂盒作为食管癌患者检测诊断时，均有良好的灵敏度和特异性，其中对于高级别瘤变、早期食管癌的灵敏度可达70％以上，对于进展期食管癌的检测灵敏度达80％以上，对癌旁组织区分的特异性均在96％以上，说明SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列或其部分区域或者相应区域内其对应的正链作为DNA甲基化检测目标序列在食管癌检测诊断中具有良好的灵敏度和特异性。并且，实施例1、实施例2、实施例3和实施例8、实施例9可以看出SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQID NO.45和SEQ ID NO.46对于食管癌高级别瘤变、早期食管癌的灵敏度均在85％以上，进展期食管癌的检测灵敏度达96％以上。可见，本申请实施例提供的检测试剂及试剂盒用于食管癌的诊断/辅助诊断具有良好的灵敏度和特异性，且可用于食管癌的早期筛查，具有良好的临床应用前景。

以上对本申请实施例所提供的用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉艾米森生命科技有限公司

<120> 用于DNA甲基化检测的试剂及食管癌检测试剂盒

<130> WHP210472CN

<160> 52

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 1

atgtcgatgg gtacgttgat cg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 2

aaccgaccca acttcgacgc catcc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 3

atgcggtttt cggattgata gtagt 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 4

tcgaagaagt attcgttgcg ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

aaacccttta ccaattcccc ga 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 6

attttatgcg tcgtttgggg tcgtt 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 7

tttagttgcg tttcgaagcg t 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 8

ataacgacga cgactacgac cgcta 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 9

ttcgtagtag ttttgttcgt tcgcg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 10

ggttattttc ggttttagta ggtgg 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 11

taataaacca cgactacgcg aaac 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 12

tttcgggtat tacggttatg tcggg 25

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 13

tgggtatcgt cgttgttcgt t 21

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 14

acgacctaac ctcaccgcta 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 15

agcgtagaag gttgaggcgt tcgtt 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 16

tcgttttcgt tttcgagtcg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 17

tacgaaaacc cgactaaccg 20

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 18

tcgtttgttg tagttaaagt cgcga 25

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 19

ttcgttttcg ggggtagtcg t 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 20

cgaaacgccg aaatacaaca ta 22

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 21

aggtttttcg gtgttagcga aagag 25

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 22

atcgttacga gtcgttgtcg 20

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 23

tcaactacgt ctcgaaacgc aac 23

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 24

tcgcgggcga gtaggattgt t 21

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 25

acgttgttgg gcgattttaa gc 22

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 26

acgaatacga cccccgaact a 21

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 27

ttcgatcgta atcggtttag tttcg 25

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 28

ttgtaagaaa tgtaggttcg gcg 23

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<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 29

taacgcgatc aaccgaact 19

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 30

tgggcgggaa ttttaagggg a 21

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 31

atagagtatc gcggttttgg ttg 23

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 32

aactaaaacg ctcgtccata cg 22

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 33

aggaggagcg atttggttt 19

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 34

tcgtcgtttt tagttcgtta tcgc 24

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 35

aactccgcgt aaccgtaatt c 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 36

tttagcgagt agcggcggtg t 21

<210> 37

<211> 908

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 37

tgggcattcc cgcggggcgc cgaggtacaa catgagggct ctttcgctga caccgagggg 60

ccttgagggc tgcaagaaat gcaggcccgg cggctgcccc cgagagcggg acgcgcgccc 120

gcgcggtggg cgggaatcct aaggggacgc ggaggcgggc gcgcgccccg caggggaggg 180

ggcggagagc gcgagaagga gggaggaggc gtccccgtgc gggagcccgg ctgaccgcgc 240

cagacccaga cagagcatcg cggctttggc tgcaacaggc ggtgggctcg gctcgggggc 300

ggaggcggcg aaagggcggg gagcgcgagg aggagcgacc tggcctcacc gctgccgcct 360

cttccccgcc gcatggacga gcgcctcagc cttctgcgct cgccgccgcc gccctcagcc 420

cgccaccgcg cccaccctcc tcagcgccca gcgagcagcg gcggtgccca cacgctggtg 480

aaccacggct acgcggagcc cgccgcaggc cgcgagctgc cgcccgacat gaccgtggtg 540

cccggggacc acctgctgga gccggaggtg gccgatggtg gaggggcccc gcctcaaggc 600

ggctgtggcg gcggcggctg cgaccgctac gagccgctgc cgccctcact gccggccgcg 660

ggcgagcagg actgctgcgg ggagcgcgtg gtcatcaaca tctccgggct gcgcttcgag 720

acgcagctga agaccctttg ccagttcccc gagacgctgc tgggcgaccc caagcggcgc 780

atgaggtact tcgacccgct ccgcaacgag tacttcttcg accgcaaccg gcccagcttc 840

gacgccatcc tctactacta tcagtccggg ggccgcatcc gccggccggt caacgtgccc 900

atcgacat 908

<210> 38

<211> 83

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 38

atgtcgatgg gcacgttgac cggccggcgg atgcggcccc cggactgata gtagtagagg 60

atggcgtcga agctgggccg gtt 83

<210> 39

<211> 91

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39

tcgaagaagt actcgttgcg gagcgggtcg aagtacctca tgcgccgctt ggggtcgccc 60

agcagcgtct cggggaactg gcaaagggtc t 91

<210> 40

<211> 127

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

ttcagctgcg tctcgaagcg cagcccggag atgttgatga ccacgcgctc cccgcagcag 60

tcctgctcgc ccgcggccgg cagtgagggc ggcagcggct cgtagcggtc gcagccgccg 120

ccgccac 127

<210> 41

<211> 98

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

ggccacctcc ggctccagca ggtggtcccc gggcaccacg gtcatgtcgg gcggcagctc 60

gcggcctgcg gcgggctccg cgtagccgtg gttcacca 98

<210> 42

<211> 136

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 42

tgggcaccgc cgctgctcgc tgggcgctga ggagggtggg cgcggtggcg ggctgagggc 60

ggcggcggcg agcgcagaag gctgaggcgc tcgtccatgc ggcggggaag aggcggcagc 120

ggtgaggcca ggtcgc 136

<210> 43

<211> 91

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 43

ccgcctccgc ccccgagccg agcccaccgc ctgttgcagc caaagccgcg atgctctgtc 60

tgggtctggc gcggtcagcc gggctcccgc a 91

<210> 44

<211> 98

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 44

cccgctctcg ggggcagccg ccgggcctgc atttcttgca gccctcaagg cccctcggtg 60

tcagcgaaag agccctcatg ttgtacctcg gcgccccg 98

<210> 45

<211> 108

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 45

accgctacga gccgctgccg ccctcactgc cggccgcggg cgagcaggac tgctgcgggg 60

agcgcgtggt catcaacatc tccgggctgc gcttcgagac gcagctga 108

<210> 46

<211> 129

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 46

acgctgctgg gcgaccccaa gcggcgcatg aggtacttcg acccgctccg caacgagtac 60

ttcttcgacc gcaaccggcc cagcttcgac gccatcctct actactatca gtccgggggc 120

cgcatccgc 129

<210> 47

<211> 173

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 47

ctgcaagaaa tgcaggcccg gcggctgccc ccgagagcgg gacgcgcgcc cgcgcggtgg 60

gcgggaatcc taaggggacg cggaggcggg cgcgcgcccc gcaggggagg gggcggagag 120

cgcgagaagg agggaggagg cgtccccgtg cgggagcccg gctgaccgcg cca 173

<210> 48

<211> 142

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 48

acagagcatc gcggctttgg ctgcaacagg cggtgggctc ggctcggggg cggaggcggc 60

gaaagggcgg ggagcgcgag gaggagcgac ctggcctcac cgctgccgcc tcttccccgc 120

cgcatggacg agcgcctcag cc 142

<210> 49

<211> 95

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 49

ccgccgccct cagcccgcca ccgcgcccac cctcctcagc gcccagcgag cagcggcggt 60

gcccacacgc tggtgaacca cggctacgcg gagcc 95

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 50

aaggtggttg ggtggttgtt ttg 23

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 51

aataacaccc ccaccctgc 19

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> probe

<400> 52

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Claims

1.一种用于食管鳞状细胞癌诊断或辅助诊断的DNA甲基化水平检测的试剂，其特征在于，包括能够特异性检测生物样本中目标区域的核苷酸序列中CpG二核苷酸位点甲基化水平的检测试剂；其中，所述目标区域的核苷酸序列为SEQ ID NO.38- SEQ ID NO. 47任一所示的核苷酸序列或其中至少两者所示的核苷酸序列的组合。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述检测试剂包括核酸分子。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述核酸分子包括可PCR扩增所述目标区域核苷酸序列的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述核酸分子还包括可标记所述目标区域所示核苷酸序列的探针。

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述目标区域的核苷酸序列，以及所述目标区域对应的引物对和探针的核苷酸序列如下表所示：

。

6.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括能差异修饰甲基化DNA和非甲基化DNA的反应试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂，其特征在于，所述反应试剂为重亚硫酸盐。

8.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述生物样本为血液样本、唾液样本、组织样本或食管来源的细胞样本；所述生物样本为来源于哺乳动物的离体生物样本。

9.一种用于食管鳞状细胞癌诊断或辅助诊断的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-8任一项所述的用于DNA甲基化检测的试剂。

10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括内参基因、对照物和缓冲液。