CN111788317B - 用于表征癌症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于表征癌症和确定治疗行动过程的组合物、系统和方法。具体地，本公开内容涉及利用基因表达和甲基化特性来分级和治疗肾上腺皮质癌的组合物、系统和方法。

Description

用于表征癌症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月29日提交的美国临时申请号62/592,009和2018年5月22日提交的美国临时申请号62/674,883的优先权和权益，其内容特此通过引用整体并入。
技术领域
本公开内容涉及用于表征癌症和确定治疗行动过程的组合物、系统和方法。具体地，本公开内容涉及利用基因表达和甲基化特性来分级和治疗肾上腺皮质癌的组合物、系统和方法。
背景技术
肾上腺皮质癌(ACC)是一种总体预后不良的罕见恶性肿瘤。ACC的治疗选择是有限的，并且外科手术是可以提供长期缓解和治愈的唯一疗法。尽管进行了外科手术，三分之一的具有早期疾病的患者在术后仍发生转移，因此需要全身治疗。由于该原因，在无切缘手术切除之后，使用抗肾上腺素化合物米托坦的辅助疗法现在成为大多数ACC患者的标准护理的一部分。米托坦的治疗性血清水平通常需要数月的药物施用才能达到，许多患者不可避免地在该窗口期间复发。辅助细胞毒性化学疗法对这些高危患者是非常有益的。多达三分之一的患者不会在外科手术后复发，因此不需要辅助护理。但是，ACC中的风险分级具有挑战性。
基于细胞增殖的组织学评估（通过KI67指数或有丝分裂计数）对具有早期疾病的患者的复发风险进行分级的当前方案具有一些限制，并且不会可靠地鉴别出具有高危ACC的患者。
需要用于鉴别和治疗高危患者的改进方法。
发明内容
本公开内容涉及用于表征癌症和确定治疗行动过程的组合物、系统和方法。具体地，本公开内容涉及利用基因表达和甲基化特性来分级和治疗肾上腺皮质癌的组合物、系统和方法。
在某些实施方案中，本文提供了一种用于表征肾上腺皮质癌(ACC)的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：a)使来自被诊断出患有ACC的受试者的样品与用于确定BUB1有丝分裂检验点丝氨酸/苏氨酸激酶B (BUB1B)、PTEN诱导的假定激酶1 (PINK1)和G0/G1开关2 (G0S2)中的至少一种的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂接触；和b)基于BUB1B、PINK1和G0S2中的至少一种的表达水平以及G0S2的甲基化状态，将所述ACC表征为分子亚组COC1、COC2或COC3。在某些实施方案中，所述表征包括确定BUB1B-PINK1表达评分。在某些实施方案中，高于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分指示COC1。在某些实施方案中，低于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分和小于阈值水平(例如，5%)的G0S2甲基化指示COC2。在某些实施方案中，低于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分和大于阈值水平(例如，5%)的G0S2甲基化指示COC3。在某些实施方案中，所述表征进一步包括确定预后(例如，转移的可能性)。在某些实施方案中，COC3分类指示ACC的转移和侵袭性癌症。在某些实施方案中，所述方法进一步包括基于分子亚组确定治疗行动过程。例如，在某些实施方案中，所述治疗行动过程包括在具有COC3肿瘤的受试者中的辅助细胞毒性化学疗法(例如，米托坦)。在某些实施方案中，所述方法进一步包括施用所述治疗。
另外的实施方案提供了一种治疗ACC的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：a)使来自被诊断出患有ACC的受试者的样品与用于确定BUB1B、PINK1和G0S2中的至少一种的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂接触；b)基于BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态，将所述ACC表征为分子亚组COC1、COC2或COC3；和c)在具有COC3肿瘤的受试者中施用辅助细胞毒性化学疗法。
再其它的实施方案提供了一种测定基因表达和甲基化的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：a)使来自被诊断出患有ACC的受试者的样品与用于确定BUB1B、PINK1和G0S2中的至少一种的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂接触；和b)鉴别BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态。
在某些实施方案中，所述生物样品是，例如，组织样品、活组织检查样品、血液样品或尿样品。在某些实施方案中，所述试剂是，例如，与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，或特异性地结合甲基化的G0S2核酸或经修饰的(例如，亚硫酸氢盐处理过的) G0S2核酸的一种或多种核酸引物。
再其它实施方案提供了试剂盒或系统，其包含以下或由以下组成：用于确定BUB1B、PINK1和G0S2中的至少一种的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂，其中所述试剂是，例如，与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，或特异性地结合甲基化的G0S2核酸或经修饰的(例如，亚硫酸氢盐处理过的) G0S2核酸的一种或多种核酸引物。在某些实施方案中，所述试剂盒或系统进一步包含用于检测甲基化的DNA的试剂(例如，亚硫酸氢盐)、缓冲液、对照等。
另外的实施方案将是相关领域的技术人员基于本文所含的教导显而易见的。
附图说明
图1. ACC的分子分类。
图2A-D. 患者组群的特征。
图3. COC分配程序框图。
图4A-G. BUB1B和PINK1的表达以及G0S2的甲基化概括了来自ACC-TCGA的COC1-3。
定义
为了促进本公开内容的理解，下面定义了许多术语和短语：
本文中使用的术语“灵敏度”定义为测定（例如，方法、试验）的性能的统计量度，其通过将真阳性的数目除以真阳性和假阴性的总和来计算。
本文中使用的术语“特异性”定义为测定（例如，方法、试验）的性能的统计量度，其通过将真阴性的数目除以真阴性和假阳性的总和来计算。
本文中使用的术语“信息性的”或“信息性”是指标志物或标志物组的质量，并且具体地是指在阳性样品中发现标志物（或标志物组）的可能性。
本文中使用的术语“转移”是指其中起源于身体的一个器官或部分的癌细胞重新定位到身体的另一个部分并继续复制的过程。转移的细胞随后形成可能进一步转移的肿瘤。因此，转移是指癌症从它最初发生的身体部位向身体的其它部位的扩散。本文中使用的术语“转移的ACC癌细胞”是指已经转移的ACC癌细胞。
本文中使用的术语“肿瘤”是指组织的任何新的和异常的生长。因此，肿瘤可以是恶化前的肿瘤或恶性的肿瘤。术语“肿瘤特异性的标志物”是指可用于指示肿瘤存在的任何生物材料。生物材料的例子包括但不限于核酸、多肽、碳水化合物、脂肪酸、细胞组分（例如，细胞膜和线粒体）和全细胞。
本文中使用的术语“扩增子”是指使用引物对产生的核酸。扩增子通常是单链DNA（例如，不对称扩增的结果），但是，它可以是RNA或dsDNA。
术语“扩增(amplifying或amplification)”在核酸的上下文中是指多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生，通常从少量的多核苷酸（例如，单个多核苷酸分子）开始，其中扩增产物或扩增子通常是可检到的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促过程。在聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR；参见，例如，美国专利号5,494,810；通过引用整体并入本文)期间从靶标或模板DNA分子的一个或几个拷贝产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增的其它类型包括但不限于：等位基因特异性PCR (参见，例如，美国专利号5,639,611；通过引用整体并入本文)、组装PCR (参见，例如，美国专利号5,965,408；通过引用整体并入本文)、解螺旋酶依赖性的扩增(参见，例如，美国专利号7,662,594；通过引用整体并入本文)、热启动PCR (参见，例如，美国专利号5,773,258和5,338,671；每篇通过引用整体并入本文)、序列间特异性PCR、反转PCR (参见，例如，Triglia等人(1988) Nucleic AcidsRes., 16:8186；通过引用整体并入本文)、连接介导的PCR (参见，例如，Guilfoyle, R.等人, Nucleic Acids Research, 25:1854-1858 (1997)；美国专利号5,508,169；它们中的每篇通过引用整体并入本文)、甲基化特异性PCR (参见，例如，Herman等人, (1996) PNAS93(13) 9821-9826；通过引用整体并入本文)、微型引物PCR、多路连接依赖性探针扩增(参见，例如，Schouten等人, (2002) Nucleic Acids Research 30(12): e57；通过引用整体并入本文)、多路PCR (参见，例如，Chamberlain等人, (1988) Nucleic Acids Research16(23) 11141-11156; Ballabio等人, (1990) Human Genetics 84(6) 571-573; Hayden等人, (2008) BMC Genetics 9:80；它们中的每篇通过引用整体并入本文)、巢式PCR、重叠延伸PCR (参见，例如，Higuchi等人, (1988) Nucleic Acids Research 16(15) 7351-7367；通过引用整体并入本文)、实时PCR (参见，例如，Higuchi等人, (1992)Biotechnology 10:413-417; Higuchi等人, (1993) Biotechnology 11:1026-1030；它们中的每篇通过引用整体并入本文)、反转录PCR (参见，例如，Bustin, S.A. (2000) J.Molecular Endocrinology 25:169-193；通过引用整体并入本文)、固相PCR、热不对称交错PCR和降落PCR (参见，例如，Don等人, Nucleic Acids Research (1991) 19(14) 4008;Roux, K. (1994) Biotechniques 16(5) 812-814; Hecker等人, (1996) Biotechniques20(3) 478-485；它们中的每篇通过引用整体并入本文)。多核苷酸扩增也可以使用数字PCR来完成(参见，例如，Kalinina等人, Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997)；Vogelstein和Kinzler, Proc Natl Acad Sci USA. 96; 9236-41, (1999)；国际专利公开号WO05023091A2；美国专利申请公开号20070202525；它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。
本文中使用的术语“互补的”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关的多核苷酸（即核苷酸序列）。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅某些核酸碱基根据碱基配对规则是匹配的。或者，在核酸之间可能存在“完全的”或“全部的”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中是特别重要的。
本文中使用的术语“引物”是指寡核苷酸，无论其天然存在（如在经纯化的限制性消化物中）还是合成产生，其当置于一定条件下时能够充当合成的起始点，在所述条件下诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成(例如，在核苷酸和诱导剂诸如生物催化剂(例如，DNA聚合酶等)的存在下以及在合适的温度和pH下)。为了在扩增中的最大效率，引物通常是单链的，但可替换地可以是双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物之前，通常首先对引物进行处理以分开其链。在某些实施方案中，所述引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物是足够长的以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的用途。在某些实施方案中，所述引物是捕获引物。
本文中使用的术语“核酸分子”是指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。该术语涵盖包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，包括但不限于4乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮杂环丙基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。
本文中使用的术语“核碱基”与在本领域中使用的其它术语同义，包括“核苷酸”、“脱氧核苷酸”、“核苷酸残基”、“脱氧核苷酸残基”、“核苷酸三磷酸(NTP)”或脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。
“寡核苷酸”是指包括至少两个核酸单体单元（例如核苷酸）、通常超过三个单体单元、和更通常大于十个单体单元的核酸。寡核苷酸的确切大小通常取决于各种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。为了进一步举例说明，寡核苷酸通常具有小于200个残基（例如15-100个残基）的长度，但是，本文中使用的该术语还旨在涵盖更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常通过其长度来表示。例如24个残基的寡核苷酸被称为“24-聚体”。通常，核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等，包括缔合的抗衡离子，例如，H+、NH4 +、Na+等（如果此类抗衡离子存在的话）。此外，寡核苷酸通常是单链的。任选地通过任意合适的方法制备寡核苷酸，所述方法包括但不限于，现有或天然序列的分离、DNA复制或扩增、反转录、适当序列的克隆和限制性消化、或通过以下方法的直接化学合成：诸如Narang等人(1979) Meth Enzymol. 68: 90-99的磷酸三酯方法；Brown等人(1979) Meth Enzymol. 68: 109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981)Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；Matteucci等人(1981) J AmChem Soc. 103:3185-3191的三酯方法；自动化的合成方法；或标题为“PROCESS FORPREPARING POLYNUCLEOTIDES”的美国专利号4,458,066的固体支持物方法（1984年7月3日授权给Caruthers等人），或本领域技术人员已知的其它方法。所有这些参考文献通过引用并入。
生物聚合物的“序列”是指在生物聚合物中的单体单元（例如，核苷酸等）的顺序和身份。通常在5'至3'方向上读出核酸的序列（例如，碱基序列）。
本文中使用的“甲基化”是指在胞嘧啶的C5或N4位的胞嘧啶甲基化、腺嘌呤的N6位或其它类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA是未甲基化的，因为体外DNA扩增方法不保留扩增模板的甲基化模式。但是，“未甲基化的DNA”或“甲基化的DNA”也可以是指扩增的DNA，其原始模板分别是未甲基化的或甲基化的。
“甲基化状态”是指在DNA的一部分内的一个或多个特定核苷酸处甲基化的存在、不存在和/或数量。特定DNA序列（例如，如本文中所述的基因标志物或DNA区域）的甲基化状态可以指示序列中每个碱基的甲基化状态，或者可以指示序列内的碱基对的子集（例如一个或多个胞嘧啶）的甲基化状态，或者可以指示关于序列内区域甲基化密度的信息，而无需提供甲基化发生在序列中何处的精确信息。甲基化状态可以任选地由“甲基化值”表示或指示。甲基化值可以如下产生：例如，通过量化在用甲基化依赖性限制性酶进行限制性消化后存在的完整DNA的量，或通过对比亚硫酸氢盐反应后的扩增特征，或通过对比亚硫酸氢盐处理过的和未处理的DNA的序列。因此，值（例如甲基化值）代表甲基化状态，且因此可以用作在基因座的多个拷贝上的甲基化状态的定量指标。当需要将样品中序列的甲基化状态与阈值或参考值进行对比时，这是特别有用的。
本文中使用的术语”受试者”是指任何动物（例如，哺乳动物），包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等，其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在涉及人受试者时在本文中可互换地使用。
本文中使用的术语“非人动物”是指所有的非人动物，包括但不限于脊椎动物诸如啮齿类动物、非人灵长类动物、绵羊、牛、反刍动物、兔类动物、猪、山羊、马、犬、猫、鸟类等。
术语“基因”是指核酸(例如，DNA)序列，其包含产生多肽、RNA (例如，包括但不限于，mRNA、tRNA和rRNA)或前体所必需的编码序列。多肽、RNA或前体可以由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要保留全长或片段的期望活性或功能特性（例如，酶活性、配体结合、信号转导等）即可。该术语还涵盖结构基因的编码区，并且包括在5'和3'两端上与编码区相邻在任一端上约1 kb的距离的序列，使得该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'且存在于mRNA上的序列被称作5'非翻译序列。位于编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称作3'非翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组两种形式。基因的基因组形式或克隆含有被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录成核RNA（hnRNA）的基因区段；内含子可含有调节元件诸如增强子。内含子从核或初级转录物中除去或“剪接掉”；因此，在信使RNA（mRNA）处理过的转录物中不存在内含子。mRNA在翻译过程中起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。
本文中使用的术语“基因座”是指在染色体上或在连锁图上的核酸序列，并且包括编码序列以及参与基因调节的5'和3'序列。
公开内容的详细描述
本公开内容涉及用于表征癌症和确定治疗行动过程的组合物、系统和方法。具体地，本公开内容涉及利用基因表达和甲基化特性来分级和治疗肾上腺皮质癌的组合物、系统和方法。
近年来，揭示了ACC由三种分子亚型“COC1”、“COC2”和“COC3”组成。虽然COC1和COC2肿瘤分别表现出更有利的和中间的预后，但COC3肿瘤呈现始终不佳的结果（中位无事件生存期为8个月）。COC3肿瘤还以许多可靶向的分子改变为特征。这些肿瘤经常在细胞周期调节剂、几个染色体断点和广泛的CpG岛超甲基化（“CIMP-高”）中具有遗传改变。因此，基于TCGA分子类别对ACC分级是一种具有临床价值的可靠风险评估方法。具体而言，可靠地将COC3肿瘤与其它ACC亚型区分开有助于新辅助策略的开发和实施，所述策略使这些高风险患者受益并阻止化学疗法在较低风险患者中的应用。重要的是，使用很少生物标志物来概括TCGA的发现并允许在与临床决策相适应的时间范围内对患者分级的方法是有用的。
因此，本文提供了一种对ACC进行分类的方法，其包括评价少数关键基因的表达和单个基因座的DNA甲基化以根据ACC-TCGA定义的分子类别对ACC样品进行分级。
I. ACC分类的鉴别
如本文中所述的，在某些实施方案中，一种或多种ACC标志物(例如，BUB1B、PINK1或G0S2)的表达或水平以及G0S2的甲基化状态。在某些实施方案中，使用表达和/或甲基化评分来表征ACC。例如，在某些实施方案中，高于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分指示COC1。在某些实施方案中，低于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分和小于阈值水平(例如，5%)的G0S2甲基化指示COC2。在某些实施方案中，低于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分和大于阈值水平(例如，5%)的G0S2甲基化指示COC3 (参见例如，下面的实施例1和2)。
下面描述了示例性的检测和评分方法。
A. DNA和RNA检测
在某些实施方案中，通过RNA印迹分析来检测RNA。RNA印迹分析涉及RNA的分离和互补标记探针的杂交。在某些实施方案中，通过与寡核苷酸探针的杂交来检测RNA（或相应的cDNA）。使用多种用于杂交和检测的技术的多种杂交测定是可用的。例如，在某些实施方案中，利用TaqMan测定(PE Biosystems, Foster City, CA；参见例如，美国专利号5,962,233和5,538,848, 它们中的每一篇通过引用并入本文)。该测定在PCR反应期间进行。TaqMan测定利用AMPLITAQ GOLD DNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性。在PCR反应中包括由具有5′-报告染料（例如，荧光染料）和3′-猝灭剂染料的寡核苷酸组成的探针。在PCR期间，如果探针与其靶标结合，则AMPLITAQ GOLD聚合酶的5'-3'核酸水解活性在报告染料和猝灭剂染料之间切割探针。报告染料与猝灭剂染料的分离导致荧光的增加。信号随着PCR的每个循环而积累，并可以用荧光计监测。
在某些实施方案中，利用微阵列测量癌症标志物mRNA水平，所述微阵列包括但不限于：DNA微阵列（例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列）；蛋白微阵列；组织微阵列；转染或细胞微阵列；化学化合物微阵列；和抗体微阵列。DNA微阵列（通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片）是附着至固体表面（例如，玻璃、塑料或硅片）的微小DNA斑点的集合，其形成阵列，用于表达谱分析或同时监测数千个基因的表达水平的目的。固定的DNA区段被称为探针，数千个探针可以在单个DNA微阵列中使用。通过对比在疾病和正常细胞中的基因表达，微阵列可以用于鉴定疾病基因。可以使用多种技术来制造微阵列，所述技术包括但不限于：用细尖针印刷到载玻片上；使用预制掩模的光刻技术；使用动态微镜装置的光刻技术；喷墨印刷；或在微电极阵列上的电化学。
在其它实施方案中，使用逆转录酶PCR (RT-PCR)检测RNA的表达。在RT-PCR中，使用逆转录酶将RNA酶促地转化为互补DNA或“cDNA”。然后将cDNA用作PCR反应的模板。可以通过任何合适的方法来检测PCR产物，所述方法包括但不限于凝胶电泳和用DNA特异性染料染色或与标记探针杂交。在某些实施方案中，利用在美国专利5,639,606、5,643,765和5,876,978 (它们中的每一篇通过引用并入本文)中描述的具有竞争模板的标准化混合物的定量逆转录酶PCR方法。在某些实施方案中，通过与可检测地标记的探针杂交并测量所得的杂交体来检测癌症标志物。下面描述了检测方法的示例性非限制性例子。
一种示例性的检测方法杂交保护测定（Hybridization Protection Assay，HPA）涉及将化学发光的寡核苷酸探针(例如，吖啶酯-标记的(AE)探针)与靶序列杂交，选择性地水解在未杂交探针上存在的化学发光标记，并在光度计中测量从剩余探针产生的化学发光。参见，例如，美国专利号5,283,174; Nelson等人, Nonisotopic Probing, Blotting,and Sequencing, 第17章(Larry J. Kricka编, 第2版. 1995，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。
还可以检测两个分子之间的相互作用，例如，使用荧光能量转移（FRET）(参见，例如，Lakowicz等人, 美国专利号5,631,169; Stavrianopoulos等人, 美国专利号4,968,103；它们中的每一篇通过引用并入本文)。选择荧光团标记，使得第一供体分子发出的荧光能量将被在第二个“受体”分子上的荧光标记吸收，后者又能够由于吸收的能量而发出荧光。
可替代地，“供体”蛋白分子可以简单地利用色氨酸残基的天然荧光能量。选择发射不同波长的光的标记，使得“受体”分子标记可以与“供体”的标记区分开。由于标记之间的能量转移效率与分离所述分子的距离有关，因此可以评估分子之间的空间关系。在分子之间发生结合的情况下，“受体”分子标记的荧光发射应是最大的。通过荧光测量检测手段可以方便地测量FRET结合事件。
具有自身互补性的检测探针的另一个例子是“分子信标”。分子信标包括具有以下的核酸分子：靶互补序列，在扩增反应中存在的靶序列不存在的情况下将探针保持在闭合构象的亲和对（或核酸臂），和当探针处于闭合构象时相互作用的标记对。靶序列和靶互补序列的杂交将亲和对的成员分开，从而将探针转变为开放构象。由于标记对（其可能是例如荧光团和猝灭剂(例如，DABCYL和EDANS)）的相互作用降低，因此向开放构象的转变是可检测的。分子信标公开在例如美国专利号5,925,517和6,150,097中，其通过引用整体并入本文。作为非限制性例子，具有相互作用标记的探针结合对，例如在美国专利号5,928,862(通过引用整体并入本文)中公开的那些，可能适用于本公开内容的实施方案的方法中。用于检测单核苷酸多态性(SNP)的探针系统也可用于本发明中。另外的检测系统包括“分子开关”，如在美国公开号20050042638（通过引用整体并入本文）中公开的。其它探针，例如包含嵌入染料和/或荧光染料的探针，也可用于本公开内容的实施方案的扩增产物检测方法。参见，例如，美国专利号5,814,447 (通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，将核酸测序方法用于检测。在某些实施方案中，所述测序是第二代(又名下一代或Next-Gen)、第三代(又名Next-Next-Gen)或第四代(又名N3-Gen)测序技术，包括但不限于焦磷酸测序、连接测序、单分子测序、合成测序(SBS)、半导体测序、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时、大规模平行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics, 92: 255 (2008)中提供了一些这样的技术的综述，其通过引用整体并入本文。本领域普通技术人员会认识到，由于RNA在细胞中的稳定性较差并且更容易受到核酸酶攻击，因此在实验上在测序之前通常将RNA逆转录为DNA。
DNA测序技术包括基于荧光的测序方法(参见，例如，Birren等人, GenomeAnalysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, N.Y.；通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，所述测序是自动化的测序。在某些实施方案中，所述测序是经隔开的扩增子的平行测序(PCT公开号: WO2006084132，Kevin McKernan等人, 通过引用整体并入本文)。在某些实施方案中，所述测序是通过平行寡核苷酸延伸进行的DNA测序(参见，例如，授予Macevicz等人的美国专利号5,750,341和授予Macevicz等人的美国专利号6,306,597，二者通过引用整体并入本文)。测序技术的其它例子包括Church polony技术(Mitra等人,2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65; Shendure等人, 2005 Science 309,1728-1732；美国专利号6,432,360, 美国专利号6,485,944, 美国专利号6,511,803；通过引用整体并入本文)、454皮滴度焦磷酸测序技术(Margulies等人, 2005 Nature 437,376-380; US 20050130173；通过引用整体并入本文)、Solexa单碱基添加技术(Bennett等人, 2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382；美国专利号6,787,308；美国专利号6,833,246；通过引用整体并入本文)、Lynx大规模平行签名测序技术(Brenner等人(2000). Nat.Biotechnol. 18:630-634；美国专利号5,695,934；美国专利号5,714,330；通过引用整体并入本文)和Adessi PCR菌落技术(Adessi等人(2000). Nucleic Acid Res. 28, E87; WO00018957；通过引用整体并入本文)。
下一代测序（NGS）方法具有大规模平行高通量策略的共同特征，与旧测序方法相比，其目标是成本更低(参见，例如，Voelkerding等人, Clinical Chem., 55: 641-658,2009; MacLean等人, Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；每篇通过引用整体并入本文)。NGS方法大致可分为通常使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。需要扩增的方法包括由Roche商业化为454技术平台(例如，GS 20和GS FLX)的焦磷酸测序、LifeTechnologies/Ion Torrent、由Illumina商业化的Solexa平台、GnuBio和由AppliedBiosystems商业化的Supported Oligonucleotide Ligation and Detection（SOLiD）平台。非扩增方案（也被称作单分子测序）的例子为由Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台，以及分别由VisiGen、Oxford Nanopore Technologies Ltd.和PacificBiosciences商业化的新出现平台。
B. 甲基化
在哺乳动物中，甲基化仅发生在胞嘧啶残基处，更具体地，仅发生在与鸟嘌呤残基相邻的胞嘧啶残基上（即，在序列CG处，通常表示为“CpG”）。检测和描绘DNA甲基化位点是理解表观遗传基因调控并提供诊断工具以鉴定与基因调控错误相关的癌症和其它疾病状态的重要步骤。
目前通过Frommer等人描述的用于检测DNA中的5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1827-31 (1992)，明确地通过引用整体并入本文用于所有目的)或其变体完成了对特定部位处的DNA甲基化状态的绘图。描绘5-甲基胞嘧啶的亚硫酸氢盐方法是基于以下观察：胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶与亚硫酸氢根离子（也称为亚硫酸氢盐）反应。该反应通常根据以下步骤进行：首先，胞嘧啶与亚硫酸氢盐反应以形成磺化的胞嘧啶。接着，磺化反应中间体的自发脱氨基产生磺化尿嘧啶。最后，在碱性条件下将磺化的尿嘧啶去磺化以形成尿嘧啶。检测是可能的，因为尿嘧啶与腺嘌呤形成碱基对（因此表现像胸腺嘧啶），而5-甲基胞嘧啶与鸟嘌呤形成碱基对（因此表现像胞嘧啶）。这使得区分甲基化胞嘧啶和非甲基化胞嘧啶成为可能，例如通过亚硫酸氢盐基因组测序(Grigg G和Clark S, Bioessays (1994) 16: 431-36; Grigg G, DNA Seq. (1996) 6: 189-98)或甲基化特异性的PCR (MSP)，如例如在美国专利号5,786,146中公开的。
基因的甲基化状态经常表示为在特定位点处（例如，在单个核苷酸处或在更长目标序列（例如，多达约100-bp DNA子序列）处）被甲基化的DNA的各个链相对于包含该特定位点的样品中的DNA总群的分数或百分比。传统上，使用校准物通过PCR来确定未甲基化的（例如天然的）基因的量。然后，用亚硫酸氢盐处理已知量的DNA，并使用实时PCR或等效指数扩增确定所得的甲基化特异性序列。
例如，常规方法通常包括通过使用外部标准品生成未甲基化靶标的标准曲线。标准曲线由至少两个点构成，并将未甲基化的DNA的实时Ct值与已知的定量标准品相关联。然后，从至少两个点和外部标准品构建甲基化靶标的第二标准曲线。该第二标准曲线将甲基化的DNA的Ct与已知的定量标准品相关联。接下来，确定甲基化和未甲基化的群体的试验样品Ct值，并从由前两个步骤生成的标准曲线计算DNA的基因组当量。相对于群体中DNA的总量，从甲基化DNA的量计算在目标位点处的甲基化百分比，例如，（甲基化DNA的数目）/（甲基化DNA的数目+未甲基化DNA的数目）x 100。
本公开内容不限于测量基因的甲基化状态的方法。例如，在某些实施方案中，通过基因组扫描方法测量甲基化状态。例如，一种方法涉及限制性界标基因组扫描(Kawai等人,Mol. Cell. Biol. 14:7421-7427, 1994)，且另一个实例涉及甲基化敏感的任意引发PCR(Gonzalgo等人, Cancer Res. 57:594-599, 1997)。在某些实施方案中，如下监测在特定CpG位点处的甲基化模式的变化：用甲基化敏感的限制性酶消化基因组DNA，然后对目标区域进行DNA印迹分析(消化-DNA印迹方法)。在某些实施方案中，分析甲基化模式的变化涉及基于PCR的过程，该过程包括在PCR扩增之前用甲基化敏感的限制性酶消化基因组DNA(Singer-Sam等人, Nucl. Acids Res. 18:687, 1990)。另外，已经报道了利用DNA的亚硫酸氢盐处理作为甲基化分析起点的其它技术。这些包括甲基化特异性的PCR (MSP)(Herman等人. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1992)和从亚硫酸氢盐转化的DNA扩增的PCR产物的限制性酶消化(Sadri和Hornsby, Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996；和Xiong和Laird, Nucl. Acids Res. 25:2532-2534, 1997)。已经开发了用于检测基因突变(Kuppuswamy等人, Proc. Natl. Acad. Sci. 55 USA 88:1143-1147,1991)和定量等位基因特异性表达(Szabo和Mann, Genes Dev. 9:3097-3108, 1995；和Singer-Sam等人, PCR Methods Appl. 1:160-163, 1992)的PCR技术。这样的技术使用内部引物，其与PCR产生的模板退火并在要测定的单个核苷酸的5'立即终止。在某些实施方案中使用如美国专利号7,037,650所述的使用“定量Ms-SNuPE测定”的方法。
II. ACC的预后和治疗
另外的实施方案提供了表征ACC（例如，以提供预后诸如肿瘤侵袭性或转移可能性，或确定治疗行动过程）的方法。例如，在某些实施方案中，COC3分类指示ACC的转移和侵袭性癌症。在某些实施方案中，给具有COC3肿瘤的受试者施用辅助细胞毒性化学疗法(例如，米托坦)，并且用单独外科手术治疗具有COC1或COC2肿瘤的受试者。在某些实施方案中，重复COC分类确定(例如，在治疗期间或在外科手术以后)。
在某些实施方案中，使用基于计算机的分析程序将由检测测定产生的原始数据（例如，给定的一种或多种标志物的表达水平）翻译成对临床医师具有预测价值的数据。临床医师可以使用任意合适的方式访问预测数据。因而，在某些优选的实施方案中，本公开内容提供了进一步的益处，即不太可能经过遗传学或分子生物学培训的临床医师不需要理解原始数据。数据以其最有用的形式直接呈现给临床医师。然后，临床医师能够立即利用该信息以优化受试者的护理。
本公开内容涵盖了能够向/从执行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者接收、处理和传输信息的任何方法。例如，在本公开内容的某些实施方案中，从受试者获得样品（例如，活组织检查或血液或尿样品），并提交给位于世界的任何地方（例如，在与受试者居住的国家或最终使用信息的国家不同的国家）的分析服务（例如，医疗机构的临床实验室、基因组分析企业等）以生成原始数据。在样品包含组织或其它生物样品的情况下，受试者可以前往医疗中心以获取样品并将其发送到分析中心，或者受试者可以自己收集样品（例如，尿样品）并将其直接发送到分析中心。在样品包含先前确定的生物学信息的情况下，所述信息可以由受试者直接发送给分析服务（例如，含有该信息的信息卡可以由计算机扫描并且使用电子通信系统将数据传送至分析中心的计算机）。一旦被分析服务接收，就处理样品并产生针对受试者所需的诊断或预后信息特定的概况（即，表达数据）。
然后以适合于主治临床医师解释的格式来准备概况数据。例如，不是提供原始表达数据，准备的形式可能代表受试者的诊断或风险评估，以及关于具体治疗选择的推荐。所述数据可以通过任意合适的方法显示给临床医师。例如，在某些实施方案中，所述分析服务产生可以为临床医师打印(例如，在护理地点)或在计算机监视器上显示给临床医师的报告。
在某些实施方案中，首先在护理地点或在当地设施分析信息。然后将原始数据发送至中心处理设施用于进一步分析和/或将原始数据转换为对临床医师或患者有用的信息。中心处理设施提供了数据分析的隐私（所有数据都用统一的安全协议存储在中心设施中）、速度和一致性方面的优点。所述中心处理设施然后可以在受试者的治疗以后控制数据的命运。例如，使用电子通信系统，中心设施可以将数据提供给临床医师、受试者或研究人员。
在某些实施方案中，所述受试者能够使用电子通信系统直接访问数据。所述受试者可以基于结果选择进一步干预或咨询。在某些实施方案中，将数据用于研究用途。例如，数据可以用于进一步优化标志物的包含或消除，以作为疾病的特定状况或阶段的有用指标或作为伴随诊断来确定治疗行动过程。
III. 组合物和试剂盒
用于本文所述方法的组合物包括但不限于试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种用于如上所述确定BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂。在某些实施方案中，所述试剂是例如与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，或特异性地结合甲基化的G0S2核酸的一种或多种核酸引物。
所述探针也可以以阵列的形式提供。在优选的实施方案中，所述试剂盒含有进行检测测定所必需的所有组分，包括所有对照、进行测定的指导以及用于分析和呈示结果的任何必要的软件。
实验部分
提供以下实施例以证实和进一步说明本公开内容的某些优选实施方案和方面，并且不应解释为限制其范围。
实施例1
使用逻辑回归模型，确定了由于G0S2在COC3中处于沉默状态，因此G0S2的表达水平可以可靠地区分COC3和COC2。G0S2的启动子区域具有一个大的CpG岛，该岛仅在高CIMP的肿瘤中完全甲基化，而启动子甲基化与G0S2沉默强烈相关。为了扩展此观察结果，在一组包括正常组织(肺、肾、肝、卵巢、肾上腺皮质)、肾上腺皮质腺瘤、ACC和人ACC-衍生的NCI-H295R细胞系的样品中进行了G0S2启动子的靶向亚硫酸氢盐测序。在该组中包括NCIH295R，这是因为该细胞系具有与COC3的TCGA分类一致的几个分子畸变。在ACC的子集和NCI-H295R细胞系中观察到G0S2甲基化。样品表现出G0S2甲基化的“全有或全无”模式；整个基因座是完全甲基化的或未甲基化的，也与TCGA一致。另外，通过RNA-Seq和Illumina 850k EPIC阵列表征了NCI-H295R的转录组和甲基化组，并且确定该细胞系没有可检测的G0S2表达，并且具有所有跨G0S2 CpG岛的探针的甲基化。最后，使用EpiTect Methyl II PCR Assay(Qiagen)作为快速的台式测定来评估NCI-H295R细胞系中的G0S2甲基化状态，并确认了该基因座是>99%甲基化的。
对约100个ACC新鲜冷冻样品进行了研究，并进行了充分注释的临床随访。通过TaqMan®测定测量了BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平，并通过EpiTect Methyl II PCRAssay (Qiagen)测量了G0S2启动子区域的甲基化状态。作为另一项验证，在样品子集中通过亚硫酸氢盐测序证实了G0S2的甲基化状态。使用这些生物标志物根据表1中的方案对患者进行分级。使用时序检验对比这些不同亚组的存活时间。最后，使用Cox比例危害模型来计算危害比并执行多变量分析。
表1. TCGA分子分类
实施例2
本实施例描述了评价BUB1B和PINK1的表达以及G0S2的甲基化以根据ACC-TCGA的COC分配将ACC样品分级(图1)。ACC-TCGA的多平台分析证实，ACC由3种分子亚型组成，具有不同的无疾病生存率。图2显示了在研究中使用的患者组群。该组群包括来自46位成年ACC患者的原发肿瘤。总生存率和无疾病生存率分别显示在A和B中。根据ENSAT标准在诊断时进行临床分期，如小图C所示。在诊断时根据ENSAT阶段的总生存率显示在D中。
图3显示了COC类别的分配。从46个冷冻原发肿瘤样品中的27个中收获了总mRNA和gDNA。通过TaqMan测定评价了BUB1B、PINK1、G0S2和管家基因GUSB的表达。通过甲基化敏感的qPCR评价了G0S2的甲基化。根据临床结果，使用ROC曲线方法确定ΔCT(BUB1B-PINK1)的截止值。将“COC1”BUB1B-PINK1评分分配给在R0切除术后> 2年的临床观察中无疾病且在任何时间点均无转移证据的患者。
图4表明，在独立的组群中，BUB1B和PINK1的表达以及GOS2的甲基化概括了来自ACC-TCGA的COC1-3。BUB1B-PINK1和G0S2甲基化将FMUSP组群分级为3个不同的临床亚组（B）。COC3指定的肿瘤也与侵袭性的临床和组织学标志物有关（C，E）。最后，在该组群中，COC3分配和G0S2甲基化始终预示转移（F，G）。
在某些实施方案中，使用∆CT G0S2和G0S2 CpG岛的甲基化状态将患者分配给COC3 (> 5%的G0S2甲基化±∆CT G0S2 > 5)。在某些实施方案中，在样品表现出与高G0S2 CpG岛甲基化同时发生G0S2表达的情况下，优先考虑G0S2甲基化以将样品分配给COC3。为了确定∆CT BUB1B - ∆CT PINK1的截止值以定义COC1，将临床结果数据用于建立指示COC评分的阈值。具有良好结果的非-COC3患者被鉴别为在完全R0切除后至少两年的临床观察中没有复发或疾病相关事件的证据，并且在任何时间点都没有转移的证据的那些患者。具有差结果的非COC3患者被鉴别为在任何时间点（包括诊断）有转移性疾病的那些患者，或在完全R0切除的两年内具有复发或疾病相关事件的那些患者。使用针对每个非-COC3患者样品的计算出的∆CT BUB1B - ∆CT PINK1值，并结合对“良好”或“差”结果的二元分配，进行ROC曲线分析以确定上述定义COC1的适当阈值或∆CT BUB1B - ∆CT PINK1。具有高于阈值的评分的非-COC3患者被分配到COC1。所有具有低于阈值的∆CT BUB1B - ∆CT PINK1的非-COC3样品被分配到COC2。
在上面的说明书中提及的所有出版物和专利都通过引用并入本文。在不脱离本公开内容的范围和精神的情况下，本公开内容所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管已经结合具体优选实施方案描述了本公开内容，但是应当理解，要求保护的公开内容不应不适当地限制于这样的具体实施方案。实际上，医学领域的技术人员显而易见的、用于实施本公开内容的所述模式的各种修改意图落入所附权利要求的范围内。

Claims (14)

1.用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂在制备用于根据BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平和G0S2的甲基化状态将肾上腺皮质癌(ACC)表征为分子亚组COC1、COC2或COC3的试剂盒或系统的用途，所述表征包括：
a)使来自被诊断出患有ACC的受试者的样品与用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂接触；和
b)基于所述BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态，将所述ACC表征为分子亚组COC1、COC2或COC3，
其中所述试剂选自：与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，和特异性地结合甲基化的G0S2核酸的一种或多种核酸引物，
其中所述表征包括确定BUB1B-PINK1表达评分，和其中
i)高于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分指示COC1，
ii)低于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分和小于5％的G0S2甲基化指示COC2，和iii)低于阈值水平的BUB1B-PINK1表达评分和大于5％的G0S2甲基化指示COC3。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述表征进一步包括确定预后。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述预后是转移的可能性。
4.根据权利要求3所述的用途，其中COC3分类指示所述ACC的转移和侵袭性癌症。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的用途，其中所述表征进一步包括基于所述分子亚组确定治疗行动过程。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述治疗行动过程包括在具有COC3肿瘤的受试者中的辅助细胞毒性化学疗法。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述化学疗法是米托坦。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其进一步包括施用所述治疗。
9.用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂在制备用于提供辅助细胞毒性化学疗法以治疗根据BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平和G0S2的甲基化状态被鉴定为分子亚组COC1、COC2或COC3的ACC的试剂盒或系统的用途，其包括：
a)使来自被诊断出患有ACC的受试者的样品与用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂接触；
b)基于所述BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态，将所述ACC表征为分子亚组COC1、COC2或COC3；和
c)在具有COC3肿瘤的受试者中施用辅助细胞毒性化学疗法，
其中所述试剂选自：与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，和特异性地结合甲基化的G0S2核酸的一种或多种核酸引物。
10.用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂在制备用于测定来自被诊断出患有ACC的受试者的样品中基因表达和甲基化的试剂盒或系统的用途，所述ACC根据BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平和G0S2的甲基化状态被鉴定为分子亚组COC1、COC2或COC3，所述测定包括：
a)使所述样品与用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂接触；和
b)鉴别所述BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态，
其中所述试剂选自：与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，和特异性地结合甲基化的G0S2核酸的一种或多种核酸引物。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的用途，其中所述生物样品选自组织样品、活组织检查样品、血液样品和尿样品。
12.一种用于根据BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平和G0S2的甲基化状态将肾上腺皮质癌(ACC)表征为分子亚组COC1、COC2或COC3的试剂盒或系统，其包含：
用于确定至少BUB1B、PINK1和G0S2的表达水平以及G0S2的甲基化状态的试剂作为用于表征肾上腺皮质癌(ACC)的唯一试剂，其中所述试剂选自：与BUB1B、PINK1和G0S2杂交的一种或多种核酸探针，用于扩增或延伸BUB1B、PINK1和G0S2的一种或多种核酸引物，和特异性地结合甲基化的G0S2核酸的一种或多种核酸引物。
13.根据权利要求12所述的试剂盒或系统，其中所述试剂盒或系统进一步包含用于检测甲基化的DNA的试剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒或系统，其中所述试剂包含亚硫酸氢盐。
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