CN112725455B - m6A关键基因及风险模型预测肾上腺皮质腺癌预后的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的研究表明，m6A基因可相互形成模块对肾上腺皮质腺癌预后直接产生影响，并可通过调控免疫评分、以及诸多肿瘤免疫浸润细胞（巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等）比例间接影响肿瘤微环境。因此，我们挑选出m6A关键分子，并通过LASSO Cox回归模型确立并构建了基于8基因标签（包括METTL14,ZC3H13,FTO,YTHDF1,YTHDF3,HNRNPA2B1,LRPPRC,ELAVL1）。该模型相比临床分期有更好的临床预测价值，ROC高达0.9，并在多个验证组中具有相同的结果。因此，该模型在肾上腺皮质腺癌的个体化治疗试剂中具有潜在临床价值。

Description

m6A关键基因及风险模型预测肾上腺皮质腺癌预后的应用
技术领域
本发明属于肿瘤诊断标志，具体涉及预测肾上腺皮质腺癌预后的联合诊断标记。
背景技术
肾上腺皮质腺癌（ACC）是一种罕见的内分泌恶性肿瘤，年发病率为每百万0.7-2.0例。尽管非常罕见，但5年生存率不到35％。当前，ACC的唯一治疗方法是手术。即使完全切除，局部复发率也通常在19-34％之间。化疗和放疗可以一定程度减少复发但仅显示出有限的治疗效果。目前TNM分期对于相同分期异质结局和不良生存等现象无法很好预测。因此，揭示ACC的基因组特性迫在眉睫。其对于开发有效的治疗方法和预测个体生存至关重要。
N6-甲基腺苷（m6A）最早发现于1970年代，是许多真核生物中信使RNA（mRNA）和长非编码RNA（lncRNA）中最主要和最丰富的内部修饰形式。人们认为m6A甲基化会影响RNA代谢的各个方面，包括RNA剪接，易位，稳定性和翻译。m6A修饰通过三种类型进行修饰：甲基转移酶（“书写者”），脱甲基酶（“擦除者”）和m6A结合蛋白（“阅读者”）。迄今为止，N6-甲基腺苷是一种潜在的生物标志物，可积极参与各种重要的生理过程，例如干细胞分化，昼夜节律和体内DNA损伤反应。m6A的异常表达和突变导致被证实可导致包括细胞死亡和增殖失调，发育缺陷和自我更新能力受损等在内的异常过程。最近研究表明，异常的m6A甲基化修饰与多种人类疾病密切相关，特别是癌症，包括膀胱癌，头颈鳞状细胞癌，胃癌，乳腺癌，肝细胞癌和结肠直肠癌。例如，在乳腺癌中，高FTO水平与不良的生存率显着相关。此外，有研究在低级神经胶质瘤患者中建立了一个m6A相关的9基因lncRNA预后模型。现越来越多的证据表明，m6A相关的mRNA和lncRNAs可以作为预测多种类型癌症的预后和开发个性化治疗的新型潜在靶标。但是，关于m6A甲基化修饰作用与ACC之间的关系知之甚少。
肿瘤微环境（TME）由肿瘤细胞，基质细胞和远处募集的细胞组成，在肿瘤进展中起着至关重要的作用，并通过封锁免疫检查点（ICB，PD-1 / L1和CTLA-4）的新策略直接影响临床获益。在晚期肾上腺皮质腺癌中，除免疫检查点阻滞外，没有研究方法可提供长期的疾病控制。II期研究表明，pembrolizumab（一种抗PD-1单克隆抗体）可以提供有意义且持久的抗肿瘤活性。现兴起较多研究集中分析特定的m6A调节分子，来增强对TME异质性和复杂性的深入了解，从而改善免疫治疗策略。例如，抑制ALKBH5可以通过介导Mct4 / Slc16a3的水平来增强黑色素瘤患者的抗PD-1治疗的疗效，该水平参与调节TME中抑制性淋巴细胞Treg和髓样来源的抑制性细胞的积累。当前，这些研究都没有扩展到肾上腺皮质腺癌领域。
因此我们TCGA和GEO数据库进行了回顾性分析，以评估m6A相关基因对预后价值的影响。我们通过建立模型，鉴定了多个m6A调节分子作为潜在的生物标记。
发明内容
本发明的目的在于提及一种用于预测肾上腺皮质腺癌不良预后及复发的联合诊断标记，该标志对肾上腺皮质腺癌的不良预后及复发有很好的预测价值。
本发明公开了检测基因标签组表达量试剂在制备肾上腺皮质腺癌预后预测试剂中的应用，所述检测基因标签组由METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1, YTHDF3, HNRNPA2B1,LRPPRC, ELAVL1共8个基因标签组成。
本发明还公开了检测基因标签组表达量试剂在制备肾上腺皮质腺癌疗效预测试剂中的应用，所述基因标签由METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1, YTHDF3, HNRNPA2B1,LRPPRC, ELAVL11共8个基因标签组成。
优选的，风险评分 = METTL14× (-0.1750) + ZC3H13× (-0.0212) + FTO× (-0.0984) + YTHDF1×0.0159 + YTHDF3× (-0.0073) + HNRNPA2B1×0.0405 + LRPPRC×0.0437 + ELAVL1×0.0376, 在这个公式，风险评分越高，预示预后可能越差，需要采取更积极的治疗方式及复查。
优选的，检测基因标签组表达量试剂为抗人METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1,YTHDF3, HNRNPA2B1, LRPPRC, ELAVL1八个抗体。
本发明的技术方案，进一步的：
1） 我们首先分析了所有重要m6A调节分子，并发现m6A分子与ACC存在一定相关性。通过ConsensusClusterPlus R分析，基于m6A调节分子的表达，取共识矩阵k值为3，将ACC病例分为三类，并发现各组不同m6A基因表达明显差异，同时不同群集之间也存在总生存时间明显差异。
2） 为了探索三种不同m6A修饰模式之间的潜在生物学差异，我们通过KEGG、GO及GSEA分析发现通路富集于IL-17信号传导途径，TNF和NF-κB信号传导途径。这些信号通路大多数与免疫检查点表达的调节有关。我们通过ESTIMATE算法m6A基因表达与肿瘤纯度表现出相似趋势，而与基质，免疫和ESTIMATE评分方面则表现出相反的趋势，表明m6A途径在肿瘤免疫微环境中起着重要作用，并决定了肿瘤的进展和转移。此外，我们还使用CIBERSORT算法分析了22种不同免疫细胞类型比例。结果表明，M0，MI，M2巨噬细胞，树突状细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，自然杀伤细胞的激活或异质可直接产生临床效益影响并潜在地影响对免疫疗法的反应。
3）为了建立ACC预后预测模型，我们基于TCGA数据库对21个m6A相关基因进行了Lasso Cox回归分析并构建了由八个基因（METTL14，ZC3H13，FTO，YTHDF1，YTHDF3，HNRNPA2B1，LRPPRC和ELAVL1）组成的风险模型，并将这些基因的系数用于计算风险评分。风险评分= METTL14×（-0.1750）+ ZC3H13×（-0.0212）+ FTO×（-0.0984）+ YTHDF1×0.0159+ YTHDF3×（-0.0073）+ HNRNPA2B1×0.0405 + LRPPRC×0.0437 + ELAVL1×0.0376。患者依照分数中位数被分为低风险组或高风险组，我们发现随着风险评分的增加，高风险患者的OS显着低于低风险患者（P = 1.617e-08）。ROC曲线显示该风险评分具有很强的预测能力，与其他因素相比，在1年，3年和5年中AUC分别为0.844、0.945和0.893。这些结果表明，该风险模型可以作为评估ACC预后的重要指标。
4）为了验证和识别m6A模式的关键基因，我们在GEO数据集中评估了这8个基因的预后价值和风险模型。选择了三个包含OS统计信息的数据集（GSE10927，GSE19750和GSE33371）和两个包含无事件生存（EFS）统计信息的数据集（GSE76019和GSE76021）结果表明该风险模型在所有GEO数据集中都具有潜在的预测价值。尤其HNRNPA2B1，LRPPRC，和ELAVL1，与正常组织相比，这三种m6A调节分子的表达在癌组织中明显上调。
本发明的研究表明，m6A基因可相互形成模块对肾上腺皮质腺癌预后直接产生影响，并可通过调控免疫评分、以及诸多肿瘤免疫浸润细胞（巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等）比例间接影响肿瘤微环境。因此，我们挑选出m6A关键分子，并通过LASSO Cox回归模型确立并构建了基于8基因标签（包括METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1, YTHDF3,HNRNPA2B1, LRPPRC, ELAVL1）。该模型相比临床分期有更好的临床预测价值，ROC高达0.9，并在多个验证组中具有相同的结果。因此，该模型在肾上腺皮质腺癌的个体化治疗试剂中具有潜在临床价值。此外，核心基因HNRNPA2B1, LRPPRC, 及ELAVL1ABUC具有更强的临床终点预测能力，并发现在癌组织中明显上调，因此，均可作为靶位点应用于肾上腺皮质腺癌治疗试剂中。
附图说明
图1 m6A基因的聚类分析。（A）使用Pearson相关分析来探索m6A基因之间的关系（B）k = 3的共识聚类矩阵。（C）k = 2到5的共识聚类累积分布函数（CDF）和CDF曲线下面积的相对变化。（D）三个聚类的总生存期的Kaplan-Meier曲线（E）21个m6A调节因子在不同聚类中的表达（*** P <0.001； ** P <0.01； * P <0.05）。
图2 聚类之间的相互作用和相关性。（A）对cluster1和cluster2之间的差异基因进行GO和KEGG分析。（B）对cluster1和cluster3之间的差异基因进行GO和KEGG分析。（C）对cluster2和cluster3之间的差异基因进行GO和KEGG分析。（D）cluster1和cluster2之间的差异基因的GSEA分析。
图3 三种m6A模式之间的免疫特性。（A）来自3个聚类的m6A分子的热图。（B）在三种m6A模式中ESTIMATE，免疫，基质和肿瘤纯度评分。（C）三种m6A模式中22种免疫细胞的浸润水平差异（*** P <0.001; ** P <0.01; * P <0.05）。
图4 m6A关键基因风险模型。（A）21个m6A相关基因的Cox回归分析。（B）高/低风险患者的总体生存分析。（C）风险评分，生存状态和m6A核心基因的表达分布。（D）风险评分和临床特征的ROC曲线。
图5风险模型的预后价值
图6鉴定m6A模型的核心基因。（A）HNRNPA2B1表达相关的OS，EFS的Kaplan-Meier曲线。（B）LRPPRC表达相关的OS，EFS的Kaplan-Meier曲线。（C）ELAVL1表达相关的OS，EFS的Kaplan-Meier曲线。
图7验证免疫组织化学中核心m6A调节分子的表达。（A）HNRNPA2B1在肿瘤和正常组织中的表达。 （B）LRPPRC在肿瘤和正常组织中的表达。（C）ELAVL1在肿瘤和正常组织中的表达。（*** P <0.001； ** P <0.01）。
具体实施方式
下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明
1、ACC数据集的数据处理
可从TCGA和GEO下载ACC的公共RNA测序，突变和完整的临床信息。没有生存信息的患者被排除在进一步评估之外。 TCGA-ACC（癌症基因组图谱-肾上腺皮质腺癌）的RNA测序数据（FPKM值）和体细胞突变数据可从Genomic Data Commons（GDC； https：//portal.gdc.cancer.gov/）下载并收集作为进一步分析的训练集。总共下载了六个来自GEO的合格数据（GSE10927，GSE19750，GSE33371，GSE76019，GSE76021和GSE49280），并使用affy和simpleaffy软件包的平均方法执行背景调整和分位数归一化。
、m6A基因聚类为临床结果不同的三个模块
我们首先从既往研究中选择了21个m6A RNA甲基化调节子。这21个m6A包括8个写入器（METTL3，METTL14，RBM15，RBM15B，WTAP，KIAA1429，CBLL1和ZC3H13），2个橡皮擦（ALKBH5，FTO）和11个读取器（YTHDC1，YTHDC2，YTHDF1，YTHDF2，YTHDF3，IGF2 HNRNPA2B1，HNRNPC，FMR1，LRPPRC和ELAVL1）。我们首先绘制了m6A模式与ACC之间的相关性。进行了Pearson相关分析，确定m6A调节子之间的关系（图1A）。并同时确定了一些高度相关（|相关系数|≥0.5，P <0.05）的m6A调节子，例如YTHDF1，YTHDF2，HNRNPC，KIAA1429，ELAVL1，HNRNPA2B1，CBLL1和YTHDF3。根据21种m6A调节子的表达，使用最佳k均值聚类（R中的“kmeans”函数）将患者分组。使用ConsensusClusterPlus R软件包进行聚类分析，并进行1000次循环计算以确保稳定性和可靠性。当共识矩阵k值等于3时，ACC样本之间的交叉最少（图1B-C）。使用Kaplan-Meier方法计算了不同群集之间的总生存期（OS）。与其他聚类相比，在聚类1（Cluster1）中的患者总生存时间明显更好（图1D）。此外，我们绘制了箱形图（图1E）和热图（图3A）以可视化不同聚类间21个m6A调节因子的表达，发现聚类3中的CBLL1，ELAVL1，HNRNPA2B1，HNRNPC，KIAA1429，LRPPRC，RBM15，RBM15B， WTAP，YTHDF2和YTHDF3高于其他聚类（P <0.01），而聚类2中的ALKBH5，IGF2BP1，METTL3和YTHDF1的表达高于其他聚类。
、三聚类中m6A调节子之间的相互作用和相关性
为了确定TCGA-ACC队列中三个聚类之间的差异基因，在标准比较模式下采用limma R软件包的经验贝叶斯方法。确定差异基因的显着性标准设置为| logFC | > 1，P值<0.05。为了研究在不同亚组中富集的途径，我们通过应用阈值P值<0.05，最小计数5和富集因子>进行了KEGG途径分析和GO分析。基因组富集分析（GSEA）用于评估所有基因的log2倍变化，并运用clusterProfiler R软件包评估与鉴定相关的功能。通过比较聚类1和聚类2，有371个上调基因和292个下调基因。GO分析中对于生物学过程的分析表明，差异基因富集于细胞外结构组织，基质组织和体液免疫反应。细胞成分分析表明，差异基因在细胞外基质和含胶原的细胞外基质中丰富。分子功能分析表明差异基因主要位于受体调节子和配体活性中。此外，KEGG分析显示差异基因主要参与酪氨酸代谢，病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用以及IL-17信号通路（图2A-C）。此外，运用GSEA进一步信号传导途径富集分析，在对cluster1和cluster2进行比较时发现，相对于cluster2，IL-17信号传导途径，TNF和NF-κB信号传导途径明显富集（图2D）。这些信号通路与核心生物致癌过程有关，其中大多数与免疫检查点表达的调节有关，并且有可能进一步影响m6A修饰对免疫治疗的作用。
、m6A可影响肾上腺皮质腺癌肿瘤免疫微环境
为了探索三个亚组之间的免疫细胞浸润程度，我们应用了ESTIMATE算法来计算估计分数，免疫分数和基质评分，以进一步预测肿瘤的纯度。m6A相关基因表达的热图以及基质，免疫和估计评分以及肿瘤纯度均在图3A中显示。从聚类中，我们发现此类m6A基因表达与肿瘤纯度表现出相似的表达趋势，而在基质，免疫和ESTIMATE评分方面则表现出相反的趋势，表明m6A途径在肿瘤免疫微环境中起着重要作用，并决定了肿瘤的进展和转移。此外，m6A聚类之间的免疫评分存在显着差异，而聚类1显示出最高的免疫评分。与此同时，我们还计算了ESTIMATE和基质得分，聚类1的表达高于聚类2的表达。相反，肿瘤纯度的分布不同于基质，免疫和ESTIMATE评分，聚类1的肿瘤纯度评分低于其他（图3B）。
为了探索多个聚类之间免疫细胞亚型的差异，我们使用了CIBERSORT软件包，基于TCGA-ACC病例评估了22种免疫细胞亚型的比例。 CIBERSORT分析中P <0.05的结果用于进一步分析。使用Mann-Whitney U检验比较三个亚组之间的差异。结果表明，巨噬细胞M0，MI，M2，树突状细胞，树突状细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，自然杀伤细胞占免疫细胞浸润过程中很大比例。此外，与其他较差预后的聚类相比，具有更好生存率的聚类1显示出拥有更多比例的M1，M2巨噬细胞和NK细胞（图3C）。我们还发现聚类1中的树突状细胞，巨噬细胞M0和NK细胞的水平明显低于聚类2和聚类3中的水平。结果表明，m6A相关模式可能显着抑制或增强特定免疫细胞类型的表达，从而潜在地影响对免疫疗法的反应。
5、m6A相关风险模型建立与评价
为了建立ACC预后预测的特征，我们基于TCGA数据库对21个m6A相关基因进行了Lasso Cox回归分析。使用R的“ glmnet”软件包，筛选了8个与m6A相关的基因，以构建最佳的预后模型。八个基因分别为METTL14，ZC3H13，FTO，YTHDF1，YTHDF3，HNRNPA2B1，LRPPRC和ELAVL1，我们将这些基因的系数用于计算风险评分（图4A）。风险评分= METTL14×（-0.1750）+ ZC3H13×（-0.0212）+ FTO×（-0.0984）+ YTHDF1×0.0159 + YTHDF3×（-0.0073）+ HNRNPA2B1×0.0405 + LRPPRC×0.0437 + ELAVL1×0.0376。 ACC患者被分为低风险组或高风险组，如图4B和4C所示，我们发现随着风险评分的增加，高风险患者的总生存时间显著低于低风险患者（P = 1.617e-08）。单因素和多因素分析用于评估年龄，性别，M，N，T和临床阶段的预后价值；然而，只有T期与OS相关。ROC曲线显示该风险评分具有很强的预测能力，与其他因素相比，在1年，3年和5年中AUC分别为0.844、0.945和0.893（图4D）。这些结果表明，该风险模型可以作为评估ACC预后的重要指标。
、m6A相关风险模型验证及核心基因筛选
为了验证和识别m6A模型有效性及核心基因，我们在GEO数据集中评估了这8个基因的预后价值和风险模型。选择了三个包含总生存时间（OS）统计信息的数据集（GSE10927，GSE19750和GSE33371）和两个包含无事件生存（EFS）统计信息的数据集（GSE76019和GSE76021）进行进一步验证。幸运的是，结果表明该风险模型在所有GEO数据集中都具有潜在的预测价值（图5）。考虑到TCGA和GEO数据中已鉴定基因的相似性，我们着重挑选均能被验证的m6A调控子进入下一步研究，包括HNRNPA2B1，LRPPRC和ELAVL1。根据所有GEO数据集，HNRNPA2B1被确认为OS和EFS较差的重要预测指标指标（图6A）。 LRPPRC可能被认为是OS降低的重要生物标志物，并已在四个GEO数据集（GSE10927，GSE33371，GSE76019和GSE76021）上成功进行了验证（图6B）。此外，基于两个包含EFS数据的GEO数据库，ELAVL1被重新验证为潜在的复发预测的生物标志物（图6C）。
、标本获取及核心基因验证
肾上腺皮质腺癌组织和正常肾上腺组织取自2016年1月至2020年12月在湘雅三医院（中国湖南长沙）的5例手术患者。这些患者经病理分析确诊，未接受化疗或放疗。湖南省湘雅三医院伦理委员会机构审查委员会批准了研究程序，本研究中所有患者均提供了书面知情同意书。
获取的病例组织通过石蜡包埋，将石蜡包埋的ACC组织和正常组织切成薄片，进行脱蜡，水合和抗原修复，然后封闭内源性过氧化物酶。抗HNRNPA2B1（1：100，14813-1-AP，武汉武汉，武汉），抗LRPPRC（1：100，21175-1-AP，武汉武汉，武汉），和抗ELAVL1（1：100，11910）加入-1-AP，Proteintech Group），并将它们分别在4℃下孵育过夜。将聚合物增强剂在室温下孵育30分钟，然后添加生物素标记的二抗，并在室温下孵育30分钟。接下来，使用二氨基联苯胺染色液对切片进行染色，然后用苏木精复染，然后将切片固定在甘油-乙烯醇中。两名独立的专业病理学家对患者的数据和组织病理学特征进行分析，并根据评分标准对IHC评分进行了评估。结果显示，HNRNPA2B1，LRPPRC，和ELAVL1，与正常组织相比，这三种m6A调节分子的表达在癌组织中明显上调（图7）。

Claims (4)

1.检测基因标签组表达量试剂在制备肾上腺皮质腺癌预后预测试剂中的应用，其特征在于，所述检测基因标签组由METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1, YTHDF3, HNRNPA2B1,LRPPRC, ELAVL1共8个基因标签组成。
2.检测基因标签组表达量试剂在制备肾上腺皮质腺癌疗效预测试剂中的应用，其特征在于：所述基因标签由METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1, YTHDF3, HNRNPA2B1, LRPPRC,ELAVL11共8个基因标签组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：风险评分 = METTL14× (-0.1750) +ZC3H13× (-0.0212) + FTO× (-0.0984) + YTHDF1×0.0159 + YTHDF3× (-0.0073) +HNRNPA2B1×0.0405 + LRPPRC×0.0437 + ELAVL1×0.0376, 在这个公式，风险评分越高，预示预后可能越差，需要采取更积极的治疗方式及复查。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：检测基因标签组表达量试剂为抗人METTL14, ZC3H13, FTO, YTHDF1, YTHDF3, HNRNPA2B1, LRPPRC, ELAVL1八个抗体。
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