KR20200073407A

KR20200073407A - 돼지 정액의 품질 판별용 단일염기다형성(snp) 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200073407A
Application number: KR1020180161514A
Authority: KR
Inventors: 조은석; 조규호; 최태정; 김용민; 김영신; 이미진
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-06-24

Abstract

본 발명은 돼지 정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 돼지 정액의 품질 판별용 조성물과 키트, 및 돼지 정액의 품질 판별 방법에 관한 것이다.

Description

돼지 정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 및 이의 용도{SNP Markers for discriminating quality of pig semen and their uses}

본 발명은 돼지 정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 돼지 정액의 품질 판별용 조성물과 키트, 및 돼지 정액의 품질을 판별하는 방법에 관한 것이다.

양돈 산업에서 돼지의 인공수정에 따른 경제적 수익성은 정액의 양과 품질 특성의 평가에 따라서 달라진다. 이러한 인공수정은 자연교배와 달리 수퇘지 능력을 후대에 손쉽게 전달할 수 있고, 외부 질병으로부터 자연교배보다는 안정적이라는 장점이 있으며, 우수한 수퇘지 확보와 사육 유지비 절감 등과 같은 효율적인 번식관리를 위해 이용되고 있다. 하지만 인공수정 위주의 교배 발달로 수퇘지의 사육 두수가 암퇘지에 비해 현저히 감소되었으며 이로 인하여 암퇘지보다 수퇘지의 관한 연구가 더 미비한 실정이다. 이것은 수퇘지 두수를 충분히 확보하는데 어려움이 있기 때문인 것으로 사료된다.

최근 세계적으로 돼지 정액의 품질을 향상시키려는 연구들이 많이 진행되고 있다. 이전의 돼지 정액에 관한 연구들은 전통적인 방법으로 진행되었으며 전통적인 방법에는 정자의 육안적인 평가 방법과 Hypo-osmotic swelling test (HOST), 첨체 온전성 검사 등이 있다.

최근에는 분자유전학적 기술의 발전에 따라 돼지의 정액을 분석하는 연구뿐만 아니라 품질이 우수한 정액을 가진 개체를 선발하려는 연구들도 진행되고 있다. 동물 육종개량에 있어 세계적인 추세는 가축개량 체계의 문제 및 한계점을 극복하고 개량 성과를 조기에 달성하기 위하여 전통적인 방법과 분자유전학적 기법을 접목하여 동물자원의 육종개량 효율을 극대화하는 것이다. 이러한 추세에 따라 세계적으로 수퇘지의 번식 형질과 연관된 DNA 마커(marker)의 개발에 관한 연구 결과가 몇몇 연구자들에 의해 보고되고 있다.

따라서 본 발명의 주된 목적은 돼지 정액의 품질 판별용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 키트를 제공하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은 돼지 정액의 품질 판별 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위한 것으로, 서열번호 1로 표시되는 ZAR1(Zygote arrest 1) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 조성물이다.

또한, 본 발명의 다른 실시형태는 상기 조성물을 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 키트이다.

나아가, 본 발명의 또 다른 실시형태는 돼지로부터 분리된 시료의 핵산으로부터 서열번호 1로 표시되는 ZAR1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별 방법이다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명은 돼지 정액의 품질 판별용 조성물과 키트, 및 돼지 정액의 품질 판별 방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 본 발명의 SNP 위치의 염기를 확인함으로써, 돼지 정액 내 정자 운동성과 같은 정자 품질을 조기에, 그리고 정확하게 판별(예측)할 수 있어, 성장이 이루어지지 않은 상태에서 좋은 정액을 생산할 수 있는 개체를 판단할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 ZAR1(Zygote arrest 1) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열에서, 2540번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 2540번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커에 관한 것이다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 ZAR1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "ZAR1(Zygote arrest 1) 유전자"는 Maternal effect genes 중 하나로 알려져 있으며 초기 배아 발달에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. ZAR1은 돼지의 8번 염색체 상에 위치하고 있으며, 돼지, 쥐, 소, 닭 등과 같은 척추동물의 배아 발달 단계에서 중요한 영향을 미친다는 연구가 보고된 바 있다.

본 발명에서 상기 ZAR1 유전자 내 단일염기다형성 부위는 ZAR1 유전자의 2540번째 위치에 존재하는 염기(T 또는 C)에 해당하며, 상기 단일염기다형성 부위를 포함하고 있는 ZAR1 유전자의 일부 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다. 또한, 상기 단일염기다형성 부위는 ZAR1 유전자의 엑손 3 부위에 위치한다. 본 명세서에서는 상기 다형성 부위를 "ZAR1 g.2540T>C"로 표시할 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"이란 다형성(polymorphism; 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우) 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 의미한다. SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 10개 이상일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 100개, 10 내지 80개, 10개 내지 60개 또는 10개 내지 40개의 연속 염기로 구성될 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 서열번호 1로 표시되는 ZAR1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치의 SNP를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화 하는 프로브일 수 있다.

본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific)이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "대립형질 특이적(allele-specific)"이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화 하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화 하는 것을 의미한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1 M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 15 내지 30개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 돼지 정액의 품질을 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 같은 종의 두 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 한 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 돼지 정액의 품질을 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 조성물은 돼지 정액의 품질을 판별하기 위한 것으로, 특히는 정액 내 정자의 운동성의 정도를 판별할 수 있다.

본 명세서에서 상기 "정자의 운동성"은 정자의 곡선속도, 직선속도, 평균 이동속도 및 ALH(Amplitude of Lateral Head displacement)로 구성된 군으로부터 선택되는 운동학적 특징을 분석하여 판단할 수 있다.

본 발명의 조성물은 두록 품종(Duroc pig)의 정액의 품질 판별에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 키트이다.

본 발명의 키트는 돼지 정액의 품질 판별용 마커인, ZAR1 유전자의 g.2540 T>C 단일염기다형성 부위를 확인함으로써 돼지 정액의 품질을 예측하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 키트는 PCR 키트, DNA 분석용(예컨대, DNA 칩) 키트 또는 마이크로어레이 키트로 구현될 수 있다.

본 발명의 키트에는 ZAR1 g.2540 T>C SNP를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는 상기 SNP 에 특이적인 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있고, 여기서 상기 DNA 칩 키트는 상기 SNP에 특이적인 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 SNP에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고, 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 돼지로부터 분리된 시료로부터 서열번호 1로 표시되는 ZAR1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치에 존재하는 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 시료로는 털, 뇨, 혈액, 정액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명에서 상기 시료로부터 상기 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용할 수 있지만, 예를 들어, 본 발명의 SNP의 유전자형 확인은 시퀀싱 분석, 자동 염기서열 분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 단일염기다형성 부위의 염기 결정 시 본 발명의 돼지 정액의 품질 판별용 조성물을 사용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 본 발명에서 제공하는 프라이머로 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 상기 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 단계 이후에, 결정된 염기 정보에 근거하여 검체 대상인 돼지의 정액의 품질을 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 단일염기다형성 부위의 유전자형이 CC인 경우 TT인 경우보다 검체 대상인 돼지의 정액의 품질이 우수한 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 돼지 정액의 품질을 판별하기 위한 것으로, 특히는 정액 내 정자의 운동성의 정도를 판별할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 돼지 중에서도 특히 두록 품종(Duroc pig)의 정액의 품질을 판별할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

1. 공시동물

한국 농촌진흥청 국립축산과학원에서 균등한 먹이 및 취급 조건들에서 사육된 두록(Duroc, n=105)의 정액을 수압법을 이용하여 채취하였다. 채취된 정액은 여과지를 이용하여 불순물을 제거한 후 38℃ Beltsville thawing solution (BTS)와 1:1 비율로 희석을 실시하였다.

2. 액상 정액 제조 및 운동학적 특성 분석

희석된 정액은 BTS를 이용하여 정자 농도가 30×10⁶cells/ml 되도록 희석을 통해 액상 정액을 제조하였다. 제조된 액상 정액은 38℃ Water bath를 이용하여 20분 동안 가온하였다. 가온 된 정액에서 5㎕ 표본을 makler chamber (Sefi-Medical Instruments, Israel)와 자동 정자 분석 프로그램(Computer aided sperm analysis, CASA)을 사용하여 샘플 당 최소 100마리의 정자를 평가하기 위하여 38℃에서 약 5번 이상 분석하였다. 각각의 정자는 운동학적 특성인 정자의 운동성(Motility, MOT), 직선운동 속도(Straight-line Velocity, VSL), 곡선운동 속도(Curvilinear Velocity, VCL), 평균운동 속도(Average Path Velocity, VAP), 직진성(Linearity, LIN), 선형성(Straightness, STR), 측두 이동거리(Amplitude of lateral head displacement, ALH), 머리 진동수(Beat cross Frequency, BCF)를 측정하였다.

3. Genomic DNA 분리

Genomic DNA는 두록 105두의 혈액에서 Wizard Genomic DNA 정제 키트(DNA Purification Kit) (Promega, Madison, WI, USA)의 세포 용혈 용액(cell lysis solution), 뉴클레오티드 용혈 용액(nucleotide lysis solution), 단백질 침전 용액(protein precipitation solution), 이소프로파놀(isopropanol), DNA 재수화 용액(DNA rehydration solution)을 사용하여 제조사의 제조 방법으로 분리하였다.

4. PCR 및 유전자형 분석

중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR) 혼합액은 증류수(distilled water 13.3㎕), 10X 버퍼(buffer) 2㎕, 5pmol 프라이머(primer) 2㎕, 2.5mmol dNTP 1.5㎕, 1.25 U DNA 중합효소(DNA polymerase) (Genet Bio, Chungnam, Korea) 0.2㎕, 100μg DNA를 사용하여 총 20㎕로 제조하였다. PCR 조건은 95℃ 5분 이후 95℃ 30초, 제작된 표 1의 프라이머의 각각의 온도 30초, 72℃에서 30초를 반복하여 총 40번 실시하였고 이후 72℃ 5분, 마지막으로 4℃에 보관하였다. 염기서열 분석을 위하여 Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit V3.0 (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA, USA)와 ABI PRISM^® 3730 Genetic Analyzer (Life Technologies Corp.)를 이용하여 염기서열 분석을 하였고, SeqMan program (DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)을 비교하고 유전자형을 결정하였다.

ZAR1 유전자 시퀀싱을 위한 프라이머

영역	프라이머		Tm(℃)	사이즈(bp)
5’UTR	F	5'-AACAGCCAACGTTTTTCTGG-3'	58.1	545
	R	3'-AGCAGGATTCCAGCAAGAGA-5'
엑손1(Exon1)	F	5'-GCCGACTACCTCCACAGCTA-3'	54	370
	R	3'-CTTCCTGGAGGGTGTCGAG-5'
엑손2(Exon2) 엑손3(Exon3)	F	5'-CCAAGCTTCTGAGGTGAAGG-3'	60.3	383
	R	3'-TGGTCAGAAGGTTTGGGGTA-5'
엑손4(Exon4) 3’UTR	F	5'-TGGTCAGAAGGTTTGGGGTA-3'	59	635
	R	3'-AGAAGAGAGTCTGGAGGGGC-5'
축약: Tm; 온도, F: 정방향, R: 역방향

5. 통계분석

본 연구에서의 통계분석은 SAS 9.4 Package/PC를 이용하여 수행하였다. GLM 분석 결과 제공되는 TYPE Ⅲ 제곱합을 이용하여 분산 분석을 하였다. 유의수준은 5%로 검정을 하였다.

6. SNP 탐색 및 유전자형 분석

두록의 전혈에서 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 시퀀싱 분석을 수행한 결과, ZAR1 유전자의 5'UTR, 엑손 1(Exon 1), 엑손 2(Exon 2), 엑손 3(Exon 3), 엑손 4(Exon 4), 3'UTR 내 SNP을 탐색하였다. 그 결과 엑손 3번 영역에서 g.2540T>C SNP을 1개 검출하였다. 이 SNP은 두록 돼지에서 발굴된 SNP로서 코딩(coding) 영역에 포함되어 이었다. 두록 수퇘지 105두 대상으로 ZAR1 유전자의 유전자형 분석 결과, 유전자형 빈도와 대립유전자 빈도는 하기 표 2에 나타내었다. ZAR1의 유전자형의 g.2540T>C SNP에 대한 유전자형 빈도는 TT형 14%(15두), TC형 32%(34두) 및 CC형 54%(56두)로 CC형이 가장 높게 나타났고, TT형이 가장 낮게 나타났다. 대립유전자의 빈도는 T 대립유전자가 3%, C 유전자가 7%로 C 대립유전자가 T 대립유전자보다 높게 나타났다.

Duroc에서 다형성의 유전자형 및 대립 유전자 빈도

SNP 마커	빈도
	SNP 유전자형(n, %)			SNP 대립 유전자(%)
g.2540	TT (15, 14)	TC (34, 32)	CC (56, 54)	T(30)	C(70)

7. SNP 탐색 및 유전자형 분석

두록 수퇘지 105 두를 대상으로 수행한 ZAR1 유전자의 SNP들에 대한 유전자형 확인 결과와 두록의 정액 운동학적 특성 측정치와의 연관성 통계 분석을 통해 유전자형이 정액의 운동학적 특성에 미치는 효과를 추정하였다. 액상 정액의 운동학적 특성과 ZAR1 유전자의 SNP을 분석한 결과 하기 표 3에 나타내었다. 그 결과 g.2540 T>C SNP은 MOT (p<0.01) 및 VSL (p<0.05)에서 유의적 연관성이 확인되었다. 즉 CC 유전자형을 가진 개체들이 TT 유전자형을 가진 개체들에 비해 정액의 MOT가 약 10.41% 정도 유의적으로 높고, VSL이 약 4.69 정도 유의적으로 높게 나타났다.

돼지에서 ZAR1의 SNP과 운동학적 특성을 분석한 연구는 전혀 보고되지 않았기 때문에 본 논문의 유전자형 빈도와 비교할 수는 없었지만 CC 유전자형을 가진 개체들이 TT 유전자형을 가진 개체들 보다 정액의 운동학적 특성 관련 유전 능력이 우수한 것으로 분석되었다.

따라서 본 연구를 통해 발굴된 ZAR1 유전자의 g.2540T>C SNP은 두록 돼지의 정액 운동학적 특성이 우수한 돼지 개체 조기 선발을 위한 새로운 분자 지표로 활용될 가능성이 있음을 확인하였다.

돼지의 g.2540 T>C ZAR1 유전자와 액상의 정액 속성 사이 상관 관계

속성	TT (n=56)	TC (n=34)	CC (n=15)	p-value
MOT (%)	76.85 ±8.99	78.86 ±7.56	87.26 ±3.85	0.0001**
VCL (um/s)	58.85 ±16.48	59.99 ±17.42	69.79 ±16.24	0.0816
VSL (um/s)	24.74 ±4.71	27.03 ±7.44	29.43 ±6.14	0.0172*
VAP (um/s)	40.79 ±10.03	43.11 ±11.62	48.22 ±11.79	0.0637
LIN (VSL/VCL)	47.81 ±8.75	50.14 ±10.75	46.76 ±8.70	0.4109
STR (VSL/VAP)	62.22 ±8.83	63.51 ±8.96	62.10 ±8.31	0.775
BCF (Hz)	5.23 ±1.54	5.06 ±1.50	5.89 ±1.43	0.2154
ALH (um)	2.44 ±0.82	2.44 ±0.87	2.92 ±0.77	0.1246
축약: MOT; 운동성, VCL; 곡선형 속도, VSL; 직선형 속도, VAP, 평균 길 속도, LIN; 직선성, STR; 직진도, BCF; 진동수(Beat cross frequency), ALH; 진폭(Amplitude of lateral head displacement) *p<0.01, p<0.05

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP Markers for discriminating quality of pig semen and their uses <130> 7 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4306 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 agcgggggtg gggcgggcgc ccggctgccc cggggaggcc gcctatttag tgcgcggcag 60 cggcgggagc ggcagaggtg cgttgatggc tgccctgggg gacgaggtgc tggacggtta 120 catgtaccca gcttgcaccc tgtactcata cccgtacccc tacccggccg ccgccaagga 180 caagcgcgcg gcgggcgggg gcggctggcg acacccggac gggggctacc ctcctgtttc 240 ctcctctgac ggcgcggccc cgtcgtcttt cccgggctac gggcagctgg cggccgccga 300 ctacctccac agctaccagc gcgcgcagct catggccctc ctgtcgcaga tgggccccgg 360 cctcgccccg cgacctggcc gagtcagcat tcgagacgtg gcggtgcagg tgaacccgcg 420 ccgcgatgtc tcggtgcagt gctcgttggg gcggcgcacg ctgctgcgca gggcccgcga 480 gcctggatcc tgctccgaag gggcggcggg cgcgggcggc agcggcctgg tctccccgca 540 gcagccccgc cggggcccgg agcagggtag ccccccgaac ggcgcctcgc ggcccatacg 600 cttcccgcgc acagtcgccg tgtactcgcc catggccacc cgccgcctcg acaccctcca 660 ggaaggatcc gaggccgtgg caggcgagca gaggccgggg gagccggggg gagagcgagg 720 gccaccacct gccagacccc gaggccccga ggcaggagag gagtcggcga ggaagacgcc 780 ccaaccgccg cagtccgcgg aggaggagga cgaggcccag gctgcagtgc ggacgagccc 840 ggagcagccc tctcccgtgg ccagggcccc cgacgccgtg ggcgaggggt tgtcgccgcg 900 gagcccccag cccggcaagg agcgcctgcg cttccaggtg agtcccggct ggggtaccgg 960 ccaggggagc cctggggctg cgcgccctct tggctcgcat ccccgcccca cggctgctcg 1020 cgacgcgtgg aggcgcgcgc tcctttaaac gcagaccggt ctgtgcgcct cggtatcgtc 1080 cttttccgac agaagtaaat cgaatgtggt ttgattgttg ctgcgatcgt aaaacgtcgg 1140 ctccacaggg gtggccaagg aaacgaataa gaataacatt catattccga gtgtattttg 1200 ctgtctaaag ccctctccgc gggcgtgtag tgctgtgtca gtccctcctc attggatgat 1260 ctaggaggag tctcacaacg gcagaaggtg aatttcctgg caaggagagt taatcctggg 1320 gatcccgctc acattttcga attcactgtg atagaagccg taacaatcga ctcctggggt 1380 cctggtcagg ttctttcctc gctgttaaga agagcctcta atagaaaacc tagtaggacg 1440 gctggagcat ttgggctgtc atgcattgct gtctgagagc agctggcttg gagggcccct 1500 tggtacttgc ctgaacccta aagggccgga acacattgag cgagttgtgg aaaggcagaa 1560 aggtagtaag acacctcgag gagcgctttg gggggggggg gtctctcttc ccggctcccc 1620 aggggtgttg agcgtgggtg gggcaagcga aagaagagcc catccagaag tttatacaca 1680 agccggagtt gctccaaacc atgtatgatc ttcagtcttg accttcctgg acttcagttt 1740 gctcccctgt gaatttgctc tgtgatgccc ccagttgctt ccaattctaa aggcctacct 1800 ctggaaactt atttatagct ggtttcttac tggagggagg aaaaacttaa ggtaataact 1860 acttttgttc gcatgaagta tgaattacag cttatccata cttttgattc cctcttagca 1920 ctgtttggtg gaaacttaat ttgcatagag aatttatttc aaggtgttca tgctagatca 1980 ttctacgatg cagcgtctta ttccttttca tgagtttaac cactttgttg gtttttgtct 2040 taagatcaga cctatttcat agagaaatcc tcctaaaaca aacccaggtt caggaaccct 2100 ggatgtttgg ctttcccctt gcctgtatga ggaaaaacac ctgcttggta atctgttaat 2160 tagcttcatg aaccaagcca atctggcacc tgaacttttg tgggcccatg cttttctgct 2220 tgattaaacc attagcatcc ctaattacta cattgtagcg actaacttga acctgattct 2280 actttcctcc atgatttgaa gtggccttgc cagttttaag ggtcccctag gtcctttcca 2340 agcttctgag gtgaaggatg attcaggggt cctgttggtt aaactctgct atcctttgct 2400 cagttcttag agcagaaata cggctactat cactgcaagg actgcaacag ccgatgggaa 2460 agtgcctacg tgtggtgtgt ccagggcact aacaaggtaa gaaacaccct ttaactggca 2520 tcattcggac aaaaggctct gagggttttg ctttttaagt tttctctccc gtcacaggtt 2580 tactacaagc agttttgcag aacctgtcag aagtcttata acccttatcg cgtggaggat 2640 atcacctgtc aggtaaatgg aatgtttgca ttttttgtgt cttgtgtctt cactgagtag 2700 tggtcagaag gtttgggagt acttttctac ctgtaaaaat ttaatgtcta tgtctggcat 2760 aaattcctac ttgacatttc aacaaaggtg tgatgccaga ggatgtagcc ttattttttt 2820 aatatcgagg tacagttgac ttacaatggg ccaatttctg ctgtacagca aagtgattca 2880 cttatacata tatatacttt ttcatatttt gcttctatta tggcatttct caggataact 2940 gatgataagt ctctgtgctt tacagtaagg gcttgtttac ccgttctatg tatgatactc 3000 tgcaatctgc gaacccaaac agccagacca ttcctcttcc ccactttcca ccaaccccct 3060 gcccccgggg gtagtttctt gaatgtattt tctaaaaagc ctaggttccc agtgatctga 3120 ggttttgatt gctttctggg acgagttggt tggaaacagg ggctttgtgc ttagtttcct 3180 ctgcccttgc aaaccttgac aacctcttgt tagcatcttt tagagactat gacctcactt 3240 gcaatatgga aggaagtttg ctctatgtgt gactcagcct aatgtaggag aaagcagact 3300 ggagctgggg aggaaagaat acatttctac taacatgagg tggtaaaggt tgatgatttt 3360 aacatgaaaa tgcattttat gaagcacata cccaagttaa agtacttgga gcatattttt 3420 tatttattta tttttttagg gctgcactcc actggcatat ggaggttccc aggctagggg 3480 tccaattgga gccagtagcc gccagcatat gtccagagcc acagcaatgc aggatgtgag 3540 ccacatctgt gacctacccc acagctcacg ggaatgctgg atccttaacc cactgatcga 3600 gggcagggat cggacccgca acgtcatggt tcctagttgg atgcgttacc cgttgagcca 3660 tgacaggagc tccctatttc ctctttaaat tgtttcaagc tttctcactt cagaactgaa 3720 ttccatgcag cctgggacca ggggtgcgtg aggaaatgcc ctattcgtcc tgtccctgtc 3780 gttgccagga aaggatgcag ccagaccaag atgagcacag ggcctgagtt agcatgcagt 3840 cagttagtat ttgaatgaac tagaaaaccc acttcaagtt ccaggacctc caccaagggt 3900 ttattttctg tgtgtacctg tcgctgtgac tttttttttc ttttcagaat tgtaaactga 3960 ctagatgctc ctgcccagta aaacttcgcc acgtggaccc caaaaggccc caccgtcaag 4020 atttgtgtgg gagatgcaaa ggcaaacgcc tctcctgtga cagcactttc agtttcaaat 4080 atattattta agcgaaaagc aacaaaccat aaaccctggt cctactgatc aggtgctaag 4140 ggagcagaca agtgagcctt tttccatgct cttctccttt ctccctctcc ctcctctaaa 4200 tacttcacga aaggctgtat ttgacaaagc tgtcaaataa aagcattgca aaacaatcac 4260 acatgttgtg tatgatcctt aaacttcgag cttgtgttga cagtct 4306 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence_Primer <400> 2 ccaagcttct gaggtgaagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence_Primer <400> 3 atggggtttg gaagactggt 20

Claims

서열번호 1로 표시되는 ZAR1(Zygote arrest 1) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열에서, 2540번째 염기가 T 또는 C이고, 상기 2540번째 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커.
서열번호 1로 표시되는 ZAR1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 단일염기다형성을 검출할 수 있는 제제는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화 하는 프로브인, 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific)인, 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 프라이머는 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 포함하는, 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 돼지 정액의 품질 판별용 조성물은 돼지 정액 내 정자의 운동성의 정도를 판별하기 위한 것인, 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 정자의 운동성은 정자의 곡선속도, 직선속도, 평균 이동속도 및 ALH(Amplitude of Lateral Head displacement)로 구성된 군으로부터 선택되는 운동학적 특징인, 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 돼지 정액의 품질 판별용 조성물은 두록 품종(Duroc pig)의 정액의 품질 판별에 사용되는 것인, 돼지 정액의 품질 판별용 조성물.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 돼지 정액의 품질 판별용 키트.
제9항에 있어서,
상기 키트는 PCR 키트, DNA 분석용 키트 또는 마이크로어레이 키트인, 돼지 정액의 품질 판별용 키트.
돼지로부터 분리된 시료로부터 서열번호 1로 표시되는 ZAR1 유전자 유래 폴리뉴클레오티드 서열의 2540번째 위치에 존재하는 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제11항에 있어서,
상기 시료는 털, 뇨, 혈액, 정액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액을 포함하는, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제11항에 있어서,
상기 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 자동 염기서열 분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 또는 도트 하이브리드화법에 의하는, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제11항에 있어서,
상기 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 단계는 서열번호 2의 정방향 프라이머 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 이용하여 수행되는, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제11항에 있어서,
상기 단일염기다형성 부위의 염기를 결정하는 단계 이후에, 결정된 염기 정보에 근거하여 검체 대상인 돼지의 정액의 품질을 판별하는 단계를 포함하는, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제15항에 있어서,
상기 단일염기다형성 부위의 유전자형이 CC인 경우 TT인 경우보다 검체 대상인 돼지의 정액의 품질이 우수한 것으로 판단하는, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제11항에 있어서,
상기 돼지 정액의 품질은 돼지 정액 내 정자의 운동성의 정도인, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제17항에 있어서,
상기 정자의 운동성은 정자의 곡선속도, 직선속도, 평균 이동속도 및 ALH(Amplitude of Lateral Head displacement)로 구성된 군으로부터 선택되는 운동학적 특징인, 돼지 정액의 품질 판별 방법.
제11항에 있어서,
상기 돼지 정액의 품질 판별 방법은 두록 품종(Duroc pig)의 정액의 품질 판별에 사용되는 것인, 돼지 정액의 품질 판별 방법.