KR102083675B1

KR102083675B1 - 단일염기다형성 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법

Info

Publication number: KR102083675B1
Application number: KR1020180161211A
Authority: KR
Inventors: 김승창; 조창연; 노희종
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-03-02

Abstract

본 발명은 칡소 품종 식별용 SNP 마커 및 상기 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법에 관한 것이다.

Description

단일염기다형성 마커를 이용한 칡소 품종 식별 방법 {Method for identification of Chikso breed using single nucleotide polymorphism markers}

본 발명은 칡소 품종 식별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 이를 이용한 칡소 품종 식별 방법에 관한 것이다.

과거 우리나라 한우의 모색은 갈색, 흑색, 백색, 반색, 렴색과 잡색 등의 다양한 모색을 가지고 있어 다양성이 있었으나, 1916년 일본 총독부에 의해서 모색호칭의 통일과 모색단일화 조치로 인하여 다양한 한우의 모색이 갈색으로 통일되어감으로써 유전자원의 다양성을 상실하게 되었다. 최근에 유전자원의 다양성의 중요성이 대두되어 재래종 소 품종 중 칡소의 복원과 증식 연구가 활발하게 진행되고 있고, 칡소는 원종인 한우로부터 분리되어 한국 재래종의 특성을 잘 나타내 주는 계통으로서 연구를 통한 종축으로서의 가치 증진을 위한 기반 연구가 될 것으로 생각된다. 그러나, 칡소에 대해서는 많은 연구가 진행되지 않아 종간 구분 방법이 모색과 체형에만 의존할 수밖에 없는 한계가 있으며, 축산농가에서 도축 시 잡우 또는 이모색으로 분류되는 경우가 많아 축산업계의 큰 손실 또한 야기하고 있는 실정이다.

또한, 세계적으로 가축의 개량이 각국의 기호에 맞게 진행되면서, 품종에 대한 유전적 다양성이 급감하는 추세이며, 국제식량농업기구(Food and Agriculture Organization, FAO)에 등재된 가축품종의 20%에 달하는 품종이 멸종위기에 놓여 있다. 칡소 품종 또한 위험 취약한 품종으로 이러한 자원소실을 대비하여 유전자원 보전 및 관리가 관리기관에서 이루어지고 있으므로 체계적이고 과학적인 혈통정립을 위한 특성에 관한 연구가 필요한 실정이다.

이와 같이, 최근 들어 유전자원에 대한 미래 활용가치의 중요성이 인식되면서 자원의 확보, 보존, 관리와 더불어 특성평가 및 활용 등에 많은 관심과 노력을 기울이고 있다. 특히 DNA 다형에 기초한 여러 유전적 마커를 활용하여 기원, 품종 형성, 유전적 다양성, 타 품종들과의 유연관계 등 보유자원의 유전적 특성 파악을 위한 분자 생물학적 특성평가가 활발히 진행되고 있다(Groeneveld et al., 2010, Anim. Genet. 41:6-31).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 효과적으로 칡소 품종을 식별할 수 있는 SNP 마커를 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 칡소 품종에 특이적인 SNP 마커를 이용할 경우, 칡소 품종을 식별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 21종의 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 증폭 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 칡소 품종 식별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 21종의 단일염기다형성 마커 중에서 선택된 어느 하나 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는, 칡소 품종 식별용 SNP(Single nucleotide polymorphism) 마커; 및 이를 포함하는 칡소 품종 식별용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 칡소 품종 식별용 조성물; 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

본 발명의 하나의 양태는 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 21종의 단일염기다형성(Single nucleotide polymorphism; SNP) 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계; 및 (b) 상기 증폭 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 칡소 품종 식별 방법을 제공한다.

상기 단일염기다형성 마커는 칡소 품종 식별을 위한 것으로, 본 발명의 단일염기다형성 마커는 서열번호 1 내지 21의 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기를 다형성 부위로 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하며, 본 발명의 21종의 단일염기다형성 마커는 상기 서열번호 1 내지 21의 다형성 부위 21종을 의미하는 것으로, 본 발명에서 용어 "마커 세트"는 상기 21종의 단일염기다형성 마커 조합을 의미한다.

구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs110875712를 포함할 수 있고, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs109219403를 포함할 수 있고, 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs136080674를 포함할 수 있고, 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs135929827를 포함할 수 있고, 서열번호 5의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs41897038를 포함할 수 있고, 서열번호 6의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs134353733를 포함할 수 있고, 서열번호 7의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs134697549를 포함할 수 있고, 서열번호 8의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs133504917를 포함할 수 있고, 서열번호 9의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs136515647를 포함할 수 있고, 서열번호 10의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs41646624를 포함할 수 있고, 서열번호 11의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs43638582를 포함할 수 있고, 서열번호 12의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs110016769를 포함할 수 있고, 서열번호 13의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs135468039를 포함할 수 있고, 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs43323258를 포함할 수 있고, 서열번호 15의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs110094408를 포함할 수 있고, 서열번호 16의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs109193617를 포함할 수 있고, 서열번호 17의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs110930723를 포함할 수 있고, 서열번호 18의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs134226650를 포함할 수 있고, 서열번호 19의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs135882339를 포함할 수 있고, 서열번호 20의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs133234554를 포함할 수 있고, 서열번호 21의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 SNP인 rs133900865를 포함할 수 있다. 서열번호 1 내지 21의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 각각의 해당 SNP 부위를 61번째 염기에 포함하면서, 해당 염기를 중심으로 양쪽으로 60개씩의 염기를 포함하는 것이다. 다만, 본 발명의 SNP 부위를 포함하기만 하면, 공지된 서열 정보를 토대로 상기 단일염기다형성 마커에 포함되는 연속적인 염기의 수는 제한 없이 포함될 수 있으며, 구체적으로 5 내지 121개, 보다 구체적으로는 5 내지 61개, 보다 더욱 구체적으로는 5 내지 41개의 염기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 SNP 부위의 서열 정보는 공지의 데이터베이스를 토대로 당업자가 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 1 내지 21중 어느 하나에 상보적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드 서열 역시 본 발명의 단일염기다형성 마커에 포함된다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로 부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 allace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사 폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 CR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecific ybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립 유전자를 확인할 수 있다. 이와 같은 변이 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 DNA 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 염기를 결정하는 단계를 포함한다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다.

상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDITOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP의 유전적 변이를 검출할 수 있다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 칡소 품종과 같은, 개체의 표현형 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "칡소 품종"이란 재래종 소 품종 중 하나로, 칡한우, 호반모, 염우, 리우 또는 얼룩소라고도 하며, 황갈색의 한우모색에 검은색이나 흑갈색의 세로무늬가 전신에 있거나, 그 무늬가 머리 부분에만 있거나, 칡덩굴 같이 짙은 갈색과 검은색 무늬 등의 표현형을 나타낼 수 있다.

상기 칡소 품종을 식별하는 것은, 칡소와 비칡소, 즉 칡소와 칡소가 아닌 소중 칡소를 식별하는 것일 수 있고, 구체적으로는 한우, 백우, 흑우, 제주흑우, 젖소 및 칡소 중 칡소 품종을 식별하는 것일 수 있다.

상기 칡소 품종 식별 방법은, (c) 상기 (b) 단계의 다형성 부위의 염기 결정 결과 마커 번호(Marker number) n의 SNP 위치의 대립형질이 메이저 대립유전자 동형접합체(AA)인 경우 SNP_n= 0, 이형접합체(AB)인 경우 SNP_n= 1, 마이너 대립유전자 동형접합체(BB)인 경우 SNP_n= 2 로 변환하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 변환된 값을 하기 [수학식 1]에 대입하여 추정값(E)이 0.5 이하인 경우 칡소로 판단하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.

[수학식 1]

E = 1.11486 + SNP₁×0.05985 + SNP₂Х(-0.04662) + SNP₃Х0.10858 + SNP₄Х(-0.1992) + SNP₅Х(-0.07566) + SNP₆Х0.55892 + SNP₇Х(-0.47284) + SNP₈Х(-0.16675) + SNP₉Х(-0.07524) + SNP₁₀Х0.06872 + SNP₁₁Х0.08672 + SNP₁₂Х0.04238 + SNP₁₃Х(-0.04216) + SNP₁₄Х(-0.08041) + SNP₁₅Х(-0.06971)+ SNP₁₆Х(-0.05585) + SNP₁₇Х(-0.07817) + SNP₁₈Х(-0.07988) + SNP₁₉Х(-0.04858)+ SNP₂₀Х(-0.04965) + SNP₂₁Х(-0.08575)

본 발명의 일 구현 예에서, 칡소 96두, 한우 95두 및 젖소 48두의 총 238두의 소를 대상으로 염기서열 분석을 시행한 결과 MAF(minor allele frequency) 차이가 0.3 이상으로 나타난 112개의 SNP를 칡소 식별을 위한 마커로 선발하였으며, 상기 112개의 SNP에 대해 단계적 변수선택법을 수행하여 21종의 마커 세트를 선별하였고 상기 마커 세트를 이용하여 한우, 젖소, 제주흑우 및 백우와 칡소가 확연히 구분되는 것을 확인하였다(도 1). 이는 본 발명의 SNP 마커의 유전자형을 판독하여 변환 후 판별식에 대입하면, 한우와 젖소 뿐만 아니라 우리나라에서 사육하고 있는 희귀종인 제주흑우 및 백우와 칡소를 정확하게 판별할 수 있음을 나타내는 결과로, 21종의 SNP 마커 및 이의 조합과 상기 판별식은 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

본 발명의 용어 "개체"란, 품종을 식별하고자 하는 대상인 소를 의미하며, 상기 소로부터 수득한 시료를 이용하여 SNP 마커 유전자형을 분석함으로써 칡소 품종인지 식별할 수 있다. 구체적으로, 상기 SNP 마커 유전자형을 분석하고 SNP_n 값으로 변환한 후 상기 [수학식 1]의 판별식에 SNP_n값을 대입하여 추정값(E)이 0.5 이하이면 칡소, 0.5 초과이면 비칡소로 판별할 수 있다.

상기 시료는 분석하고자 하는 개체의 모근, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 예로, 상기 시료는 개체의 혈액일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 21종의 마커 중에서 선택된 1종 이상의 단일염기다형성 마커를 포함하는, 칡소 품종 식별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 제공한다. 전술한 바와 같이, 상기 21종의 마커가 칡소 판별에 사용될 수 있음은 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것으로, 상기 SNP 마커의 유전자형을 증폭 및 분석을 수행하고 유전자형을 판독하면 칡소 품종을 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 칡소 품종 식별용 조성물을 제공한다. 상기 칡소 품종 식별은 한우, 백우, 흑우, 제주흑우, 젖소 및 칡소로 구성된 군으로부터 칡소 품종을 식별하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제" 란, 상기 칡소 품종 선별용 SNP 마커에 포함된 SNP에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 SNP를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(probe), 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

본 발명의 용어 "프로브(probe)"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링(labeling) 되어 있어 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 발명에서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식 가능하도록 하기 위해 프로브의 5' 또는 3' 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합체) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 조성물을 포함하는 칡소 품종 식별용 키트를 제공한다.

구체적으로, 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나 RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP의 염기를 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 백우 품종을 식별할 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 SNP에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 칡소 품종 식별용 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 칡소 품종 식별용 SNP 마커를 포함하는 칡소 품종 식별용 마이크로어레이를 제공한다.

구체적으로, 상기 마이크로어레이는 서열번호 1 내지 21의 폴리뉴클레오티드의 61번째 염기를 다형성 부위로 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이와 상보적인 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 백우 품종 식별 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 판단방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및25-30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 칡소 품종 식별과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 공지된 기술을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 폴리뉴클레오티드의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 SNP 마커를 이용하여 칡소를 정확하게 판별함으로써, 칡소에 대한 유전적 연구를 통해 우리나라 고유의 생물자원으로서 인정받을 수 있으며 체계적이고 과학적인 혈통정립을 위한 특성에 관한 연구에 기여하며, 연구를 통한 종축으로서의 가치 증진을 위한 기반을 마련할 수 있다.

도 1은 칡소, 한우, 젖소, 제주흑우, 백우에 대해 본 발명의 21개의 마커 조합의 다형성 부위의 염기 결정 결과를 변환하여 본 발명의 추정공식에 대입하여판별한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 칡소 식별 마커 선별

칡소 품종 선별을 위한 단일염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism) 마커를 선별하기 위해, BovineHD칩을 이용한 지노타이핑 (genotyping)을 실시하였다.

실시예 1-1: DNA 분리

칡소 96두, 한우 95두, 젖소 48두의 혈액으로부터 게놈 DNA 추출키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다.

각각의 품종으로부터 채취한 혈액 300ul와 Cell lysis solution 900ul를 넣고 섞어준 후, 상온에서 10분 경과시킨 뒤 15000g에서 20분간 원심분리 후 상층액을 버리고 바닥에 부착된 것을 섞어주었다. 다음으로 Nuclei lysis solution을 300ul를 넣고 섞어준 후, Protein precipitation solution 100ul를 넣고 20초 동안 섞어 준 후 15000g에서 3분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 이소프로판올 300ul를 넣고 섞었다. 15000g로 1분동안 원심 분리한 후 상층액을 버리고 70% 에탄올을 300ul를 넣고 15000g로 1분 동안 원심분리 하였다. 상층액을 피펫으로 제거한 후 바닥에 가라앉은 것을 자연건조 시켰다. RNA 분해효소 40ng/ul가 포함된 30ul의 3차 증류수를 넣고 튜브 끝을 손가락으로 가볍게 치면서 DNA 응축물을 녹였다.

실시예 1-2: SNP 지노타이핑

다음으로 SNP 지노타이핑을 위해, 실시예 1-1에서 수득한 DNA 시료를 Picogreen 시약으로 정량하여 Whole genome amplification을 통해 증폭하였다. 증폭된 시료를 무작위로 조각내어 2-프로판올 침전법으로 정제하였다. DNA 시료를 넣기 전에 칩을 완충용액으로 전처리한 후 DNA 시료를 첨가하였다. 약 16시간 동안 인큐베이션 한 후 염색, 알릴특이적 프라이머 신장(allele specific primer extension), 혼성화(hybridization), 타겟 제거 후 세척하여 iScan 장비로 형광값을 스캐닝하였다. 스캐닝 완료 후 비드스튜디오 소프트웨어를 이용하여 지노타입을 결정하였다.

지노타이핑 수행으로 수득한 700K의 SNP 중에서, 칡소와 한우 또는 칡소와 젖소 간에 MAF(minor allele frequency) 차이가 0.3 이상으로 나타난 112개의 SNP를 칡소 식별을 위한 마커로 선발하였다.

실시예 2: 선별된 SNP 마커를 이용한 칡소 식별

실시예 1에서 선발한 112개의 마커에 대하여 단계적 변수선택법을 시행한 결과, 칡소를 선별할 수 있는 21개 유전자 세트 (set)를 최종 SNP 마커 세트로 선발하였다. 단계적 변수선택법에 의한 추정식 구성 방법은 다음과 같다.

E= β₀+ SNP₁×β₁ + SNP₂×β₂ + SNP₃×β₃ ……SNP_n×β_n

E: 우종 추정값

SNP_n: n 번째 SNP의 마이너 대립유전자 추가값 (AA=0, AB=1, BB=2)

β₀: 절편(intercept)

β_n: n 번째 SNP의 계수

상기 SNP 마커 세트로 선발한 21개의 SNP 유전자의 지노타입을 하기 수학식 1의 추정공식에 넣어 칡소를 식별하였다. 단계적 변수선택법을 이용한 식별에 앞서 본 발명의 추정공식은 칡소와 비칡소(한우, 젖소 등 칡소가 아닌 소)가 각각 0과 1의 고유값을 갖는다는 전제 하에 개발되었기 때문에 추정값(E)이 0.5 이하이면 칡소, 0.5 초과이면 비칡소로 판별하였다.

[수학식 1]

E = 1.11486 + rs110875712×0.05985 + rs109219403×(-0.04662) + rs136080674×0.10858 + rs135929827×(-0.1992) + rs41897038×(-0.07566) + rs134353733×0.55892 + rs134697549×(-0.47284) + rs133504917×(-0.16675) + rs136515647×(-0.07524) + rs41646624×0.06872 + rs43638582×0.08672 + rs110016769×0.04238 + rs135468039×(-0.04216) + rs43323258×(-0.08041) + rs110094408×(-0.06971) + rs109193617×(-0.05585) + rs110930723×(-0.07817) + rs134226650×(-0.07988) + rs135882339×(-0.04858) + rs133234554×(-0.04965) + rs133900865×(-0.08575)

표 1과 같이 메이저 대립유전자 동형접합체(major allele homozygote), 이형접합체(heterozygote), 마이너 대립유전자 동형접합체(minor allele homozygote)를 각각 AA, AB, BB로 가정하고, AA=0, AB=1, BB=2로 변환하여 추정공식에 대입하였다.

Marker Number	SNPID	메이저대립유전자 동형접합체(AA)	이형접합체(AB)	마이너대립유전자 동형접합체(BB)
1	rs110875712	TT	GT	GG
2	rs109219403	TT	CT	CC
3	rs136080674	GG	GT	TT
4	rs135929827	CC	CT	TT
5	rs41897038	CC	CT	TT
6	rs134353733	TT	CT	CC
7	rs134697549	AA	AG	GG
8	rs133504917	TT	GT	GG
9	rs136515647	CC	CT	TT
10	rs41646624	AA	AC	CC
11	rs43638582	AA	AC	CC
12	rs110016769	GG	AG	AA
13	rs135468039	TT	GT	GG
14	rs43323258	AA	AG	GG
15	rs110094408	CC	CT	TT
16	rs109193617	TT	CT	CC
17	rs110930723	TT	CT	CC
18	rs134226650	AA	AG	GG
19	rs135882339	GG	AG	AA
20	rs133234554	TT	CT	CC
21	rs133900865	CC	CT	TT

상기 표 1의 칡소 판별용 SNP 유전자 21개의 플랭킹 서열(flanking sequence) 정보를 표 2에 정리하였다. 표 2에서 [A/B]는 염기 A가 B로 점돌연변이된 SNP를 가진다는 것을 의미하며, 상기 A, B는 염기 A(아데닌), T(티민), G(구아닌), C(시토신) 중 하나이다.

Marker Number	SNPID	left flanking sequence [A/B] right flanking sequence
1	rs110875712	TCAATTATACATTTTAAAGCTGGGGGAAAAATGAGCAGGAGTCAGCACATGAAGGCCATT[T/G]TATACCATATTAATGAGTTTGGATTTCATCCTATAAGTAAATGGAATGAAATAAAGGGTT
2	rs109219403	GAGTTCAGGCACTAAAGGATATTTCACAGTGGCTCCCACTCTCTGTGTGAGTTTCCAGAG[T/C]CCTTGTAGATCACAGCTAACTTCCTGCAAACCCGCCTTTCCTTCTCCTTTCCGGTTCCTT
3	rs136080674	ATCTCTCAGGGCCTCAGCTTCCTCTTCGTTAAAACAGAACTAAGGATTAAGCATAGGAGT[T/G]CCTTGCCCCCCCCGCCTGACGGACTGTAATGGGGGTTAATATGCACTTGGTCTTAGTGTC
4	rs135929827	TCCGGCCTTTCTCGACCATTCATGGAGACTTCCTGCACAGTGCTCAGACCCTGGTAACCA[T/C]CTGTGTCCTGCACCAAGCGTCCCCAGCTCCTGGCTGAGCCCACAGTTCTGTCAGGGTTTG
5	rs41897038	CGAGGCCAGCGTCTTCTGAAGTGGTTTGCACACACGGACTCACTGGAAAGTGATGTTCGG[T/C]GTGCTGGGCTCGCCTGTCACCTGCGGGCCTTCACTCTGGAGGGCCATGGCGTCCCTCGGA
6	rs134353733	TGAAGCAGAGCAGTGACTGATCACACAGGTAGACACAGGGGCAAGGGTGCTTGCCTGTGG[T/C]CCAGAAGTAACCCCAGGGTTGCCCAGGCCAGGGCAAAGGTGAGGGGTGTTTCTAGTTCCC
7	rs134697549	TGGGTAGGAAGAGCCGGGTTTCACTTACATGGCTTGGCCTTGATCCCCTTGGGTATCCCA[A/G]TGGGCATGGCTGGTAGGCCCCTGGACTTCTGAGTCTGAAATTGGGGGAAAGGTGTGCACG
8	rs133504917	AGTGTGGACCAGCTAGGCCGTGCCACTCATAGGAAGTCAGGGCTCAGGTCAAGATCGTCT[T/G]TGGGCTACCAGTGATCTAATGTGTCGTGAGTGATCTGTGCTGTGATCCTGGGTGTGAGAG
9	rs136515647	GATCTTCCCAACCCAGGGATTGAACCCGAGTCTCCTGCATTGCTGGTGGATTTTTACCAC[T/C]GAACCACTGGAGAAGCCAACCTCTATCCTCACCTTTAAAATGAATGACAGCTGCTTGAAT
10	rs41646624	ACCCAGATGGAATTATTCTTCCCTAAGTCTTTCTGCAGTATTGGCTAAACTACCATCATA[A/C]AGTATTACTTCGACCATAACAAGCCTCCCCAGAAAAGGCCTATTTGTTACAGTAAAAATG
11	rs43638582	ACACACACACATGTCTTGAGCTGAGCCACTTGAGAATTAGTTGCAGAGTCACTTCCTCCC[A/C]AAATACAGCACCACAAATCCCCTAAGAAGATGGGAAATTTTCTGTATAATCACAATACAA
12	rs110016769	AAAGTGTTAGAAATACTCATGGGACATGGTGAAGATGGTATCTGTCTAAGGCAATAGTTC[A/G]GCACCCTGGTTGCACATTAGAATCACCTGGAAAGTTTTAAAACATTGATTCCTGGAATCT
13	rs135468039	TACTCCTTATGCCAGTAGCCTAAGCCTGAATTGTGAACTTTGCACAGAAATTTTAGAAGG[T/G]AGCAGGGGCAGAAAAATGCAGAAGCAATTAGCTATATTGCCAAGTGGTAAGTAATAAACA
14	rs43323258	ATTGGTGGCCCTGCTTAAGCTTGAAAGGGGGAGATCAGGTAAAAGAAAAATACCTGACYT[A/G]AAGCAAAGGGTCTCAAATGTTCCAATAGCCATCAGATAATCTCCAAAATATACAAACAGC
15	rs110094408	CTGCTTCCATGGAGCAGTGTTTTCGTGGAAATCAGTATCCTCATTTTATGGATTTGGAAA[T/C]TGAGGAATAGAGAGATTGAGTGACTTGCCCATATTGTCACGTATTTAGGGTGGAAACGAA
16	rs109193617	CGAACCCGTGTCTCCTGCATTGACAGATGGATTCTTTACCACGGAACGACCAGGGAAGCC[T/C]GTTTTGACCATTTTGGGGGTGAGGAAATGGAGAGTCAGAGAAGGAAAGGAACTTGCTAAA
17	rs110930723	ATGTTATTTTGGTTATATAATATTCTGGGCAGCCCTGAGATGCAGAAATGTTAAGGAAAA[T/C]AAGAATGCTTCTTCATAAATGAGGAGGAATGAATAAATCACACTTTCATTTTCAGAGTTT
18	rs134226650	GTATTAGCTCCCTAAACTTGGCTCTGTCCCCCAGTAGGACACCTAAAATTGAAGGTGTTC[A/G]GACAGCTGAGAGCCCACAGGATCTGGATTCTTCTTTCTAAAAATGGTACAAGGTACCAAT
19	rs135882339	TAAGGAAATAATTGACAAGTTTATGTTTAAAACTAATCAACATAGACATTTGCTAAAATC[A/G]TACTGAACAAATACACATACAGTCACATACACAAAACCAGAAATAAAAGGTAAAACCTGG
20	rs133234554	ACAAACAATGAACATACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACAACCCAAAATCCATAGCACT[T/C]AAAGTGATGAATTAAGAAGATAATTACAACAGGAAAGAAGGTAGGGAGTGTTAGAGGCAG
21	rs133900865	GAGAGAAGGATGTATGTGTGGAAGGAGAATGGGGCTAGAACCCAGGTGTCGCCCGTTTGG[T/C]ACCAAATCACAATCCTTGGAAGGGGATTCTCCCTGTTTGAGTGAGGATGTAGTGTAAAGG

표 1의 21개의 마커로 구성된 마커 조합 및 추정공식을 이용한 결과, 한우 (95두), 젖소(48두)뿐만 아니라 우리나라에서 사육하고 있는 희귀종인 제주흑우 (24두), 백우(23두)와 칡소(96두)가 100% 구분됨을 확인하였다(도 1).

이는 본 발명의 추정식 및 마커를 국내에서 사육하고 있는 모든 소품종에 적용할 수 있으며, 외형이나 개체 이력이 아닌 유전자 검사로서 간편하게 칡소를 식별할 수 있음을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for identification of Chikso breed using single nucleotide polymorphism markers <130> KPA180879-KR <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 1 tcaattatac attttaaagc tgggggaaaa atgagcagga gtcagcacat gaaggccatt 60 ktataccata ttaatgagtt tggatttcat cctataagta aatggaatga aataaagggt 120 t 121 <210> 2 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 2 gagttcaggc actaaaggat atttcacagt ggctcccact ctctgtgtga gtttccagag 60 yccttgtaga tcacagctaa cttcctgcaa acccgccttt ccttctcctt tccggttcct 120 t 121 <210> 3 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 3 atctctcagg gcctcagctt cctcttcgtt aaaacagaac taaggattaa gcataggagt 60 kccttgcccc ccccgcctga cggactgtaa tgggggttaa tatgcacttg gtcttagtgt 120 c 121 <210> 4 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 4 tccggccttt ctcgaccatt catggagact tcctgcacag tgctcagacc ctggtaacca 60 yctgtgtcct gcaccaagcg tccccagctc ctggctgagc ccacagttct gtcagggttt 120 g 121 <210> 5 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 5 cgaggccagc gtcttctgaa gtggtttgca cacacggact cactggaaag tgatgttcgg 60 ygtgctgggc tcgcctgtca cctgcgggcc ttcactctgg agggccatgg cgtccctcgg 120 a 121 <210> 6 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 6 tgaagcagag cagtgactga tcacacaggt agacacaggg gcaagggtgc ttgcctgtgg 60 yccagaagta accccagggt tgcccaggcc agggcaaagg tgaggggtgt ttctagttcc 120 c 121 <210> 7 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 7 tgggtaggaa gagccgggtt tcacttacat ggcttggcct tgatcccctt gggtatccca 60 rtgggcatgg ctggtaggcc cctggacttc tgagtctgaa attgggggaa aggtgtgcac 120 g 121 <210> 8 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 8 agtgtggacc agctaggccg tgccactcat aggaagtcag ggctcaggtc aagatcgtct 60 ktgggctacc agtgatctaa tgtgtcgtga gtgatctgtg ctgtgatcct gggtgtgaga 120 g 121 <210> 9 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 9 gatcttccca acccagggat tgaacccgag tctcctgcat tgctggtgga tttttaccac 60 ygaaccactg gagaagccaa cctctatcct cacctttaaa atgaatgaca gctgcttgaa 120 t 121 <210> 10 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 10 acccagatgg aattattctt ccctaagtct ttctgcagta ttggctaaac taccatcata 60 magtattact tcgaccataa caagcctccc cagaaaaggc ctatttgtta cagtaaaaat 120 g 121 <210> 11 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 11 acacacacac atgtcttgag ctgagccact tgagaattag ttgcagagtc acttcctccc 60 maaatacagc accacaaatc ccctaagaag atgggaaatt ttctgtataa tcacaataca 120 a 121 <210> 12 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 12 aaagtgttag aaatactcat gggacatggt gaagatggta tctgtctaag gcaatagttc 60 rgcaccctgg ttgcacatta gaatcacctg gaaagtttta aaacattgat tcctggaatc 120 t 121 <210> 13 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 13 tactccttat gccagtagcc taagcctgaa ttgtgaactt tgcacagaaa ttttagaagg 60 kagcaggggc agaaaaatgc agaagcaatt agctatattg ccaagtggta agtaataaac 120 a 121 <210> 14 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 14 attggtggcc ctgcttaagc ttgaaagggg gagatcaggt aaaagaaaaa tacctgacyt 60 raagcaaagg gtctcaaatg ttccaatagc catcagataa tctccaaaat atacaaacag 120 c 121 <210> 15 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 15 ctgcttccat ggagcagtgt tttcgtggaa atcagtatcc tcattttatg gatttggaaa 60 ytgaggaata gagagattga gtgacttgcc catattgtca cgtatttagg gtggaaacga 120 a 121 <210> 16 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 16 cgaacccgtg tctcctgcat tgacagatgg attctttacc acggaacgac cagggaagcc 60 ygttttgacc attttggggg tgaggaaatg gagagtcaga gaaggaaagg aacttgctaa 120 a 121 <210> 17 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 17 atgttatttt ggttatataa tattctgggc agccctgaga tgcagaaatg ttaaggaaaa 60 yaagaatgct tcttcataaa tgaggaggaa tgaataaatc acactttcat tttcagagtt 120 t 121 <210> 18 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 18 gtattagctc cctaaacttg gctctgtccc ccagtaggac acctaaaatt gaaggtgttc 60 rgacagctga gagcccacag gatctggatt cttctttcta aaaatggtac aaggtaccaa 120 t 121 <210> 19 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 19 taaggaaata attgacaagt ttatgtttaa aactaatcaa catagacatt tgctaaaatc 60 rtactgaaca aatacacata cagtcacata cacaaaacca gaaataaaag gtaaaacctg 120 g 121 <210> 20 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 20 acaaacaatg aacatacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac aacccaaaat ccatagcact 60 yaaagtgatg aattaagaag ataattacaa caggaaagaa ggtagggagt gttagaggca 120 g 121 <210> 21 <211> 121 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 21 gagagaagga tgtatgtgtg gaaggagaat ggggctagaa cccaggtgtc gcccgtttgg 60 yaccaaatca caatccttgg aaggggattc tccctgtttg agtgaggatg tagtgtaaag 120 g 121

Claims

삭제
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 하기 표 1에 표시된 21종의 단일염기다형성 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계:

;
(b) 상기 증폭 또는 혼성화된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 다형성 부위의 염기 결정 결과 마커 번호(Marker number) n의 SNP 위치의 대립형질이 메이저 대립유전자 동형접합체(AA)인 경우 SNP_n= 0, 이형접합체(AB)인 경우 SNP_n= 1, 마이너 대립유전자 동형접합체(BB)인 경우 SNP_n= 2 로 변환하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 변환된 값을 하기 수학식 1에 대입하여 E 값이 0.5 이하인 경우 칡소로 판단하는 단계를 포함하는, 칡소 품종 식별 방법:
[수학식 1]
E = 1.11486 + SNP₁×0.05985 + SNP₂×(-0.04662) + SNP₃×0.10858 + SNP₄×(-0.1992) + SNP₅×(-0.07566) + SNP₆×0.55892 + SNP₇×(-0.47284) + SNP₈×(-0.16675) + SNP₉×(-0.07524) + SNP₁₀×0.06872 + SNP₁₁×0.08672 + SNP₁₂×0.04238 + SNP₁₃×(-0.04216) + SNP₁₄×(-0.08041) + SNP₁₅×(-0.06971)+ SNP₁₆×(-0.05585) + SNP₁₇×(-0.07817) + SNP₁₈×(-0.07988) + SNP₁₉×(-0.04858)+ SNP₂₀×(-0.04965) + SNP₂₁×(-0.08575).
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 염기 결정은 서열 분석, 마이크로어레이에 의한 혼성화, 대립 유전자 특이적인 PCR (allele specific PCR), 다이나믹 대립 유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP (PCR-single strand conformation polymorphism), PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 및 TaqMan 기법으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법에 의해 수행되는 것인, 칡소 품종 식별 방법.
제2항에 있어서, 상기 칡소 품종 식별은 칡소, 한우, 젖소, 제주흑우 및 백우로 구성된 군으로부터 칡소를 식별하는 것인, 칡소 품종 식별 방법.
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