KR101784163B1

KR101784163B1 - 돼지의 등지방두께 저감 판단용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101784163B1
Application number: KR1020150159079A
Authority: KR
Inventors: 조인철; 김지향; 백광수; 김남영; 정영훈
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2017-10-16
Also published as: KR20170055818A

Abstract

본 발명은 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 돼지의 등지방두께 저감을 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 키트, 돼지의 등지방두께 저감을 판단하는 방법, 돼지의 등지방두께가 저감된 돼지의 제조방법, 돼지의 등지방두께를 저감시키는 방법 및 돼지의 등지방두께 저감 판단용 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커는 돼지의 등지방두께 저감을 판단할 수 있는 SNP 마커로서, 육안으로 구별되지 않는 등지방두께의 저감을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있을 것이다.

Description

돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커 및 이의 용도{Novel SNP marker for discriminating reduction of backfat thickness and use thereof}

본 발명은 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 돼지의 등지방두께 저감을 판단할 수 있는 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 키트, 돼지의 등지방두께 저감을 판단하는 방법, 돼지의 등지방두께가 저감된 돼지의 제조방법, 돼지의 등지방두께를 저감시키는 방법 및 돼지의 등지방두께 저감 판단용 마이크로어레이에 관한 것이다.

약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다. 일반적으로 유럽품종과 아시아 품종들은 각 대륙의 야생 멧돼지(Susscrofa)에서 유래되었으며, 현재까지 존재하고 있는 품종은 200 여종 이며, 최근 FAO (Finance and Accounts Office)에서 발표한 결과에 따르면 아시아품종이 30%, 유럽품종이 33% 정도임이 보고되었다. 이 품종들 사이에 표현형의 차이는 모색, 크기, 체형 등이 있다.

최근에는, 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵기 때문에, 이러한 점을 악용하여 브랜드화되지 않은 돼지육을 브랜드화된 돼지육으로 속여서 판매하는 방식으로 돼지육의 유통질서를 교란시키는 사건이 빈번하게 발생하고 있다. 실제로, 브랜드화된 돼지와 브랜드화되지 않은 돼지육을 구별하는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로서, 돼지육의 유전자를 분석하여 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 방법이 개발되었는데, 이처럼 유전자를 분석하는 방법은 PCR 기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 등의 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법을 개발 및 발전시키려는 방향으로 활발한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 특허공개 제2004-0039059호에는 돼지의 일당증체량, 등지방두께, 육질형질에 관련된 특이 DNA marker를 이용하여 돼지의 형질이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 유전자 검정방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2007-0113336호에는 돼지의 근세포 분화에 관여하는 것으로 알려진 Myogenin 유전자의 5' 말단의 프로모터 부위의 단일 염기서열 차이에 의한 변이(SNP)를 이용한 돼지 근세포수 증가 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있으며, 특허공개 제2011-0011443호에는 KIT 유전자에 대한 한국재래돼지 특이적인 DNA 마커를 검출하여, 한국재래돼지와 기타 개량종 돼지와의 정확한 품종을 판별하는 기술이 개시되어 있고, 특허공개 제2011-0050261호에는 흑모색 돼지의 KIT 유전자 지역의 SNP로부터 추정된 haplotype을 이용하여 흑모색 돼지의 품종을 식별하는 방법이 개시되어 있으며, 특허공개 제2011-0139011호에는 돼지 근내지방 함량 진단용 단일형질 다형성 바이오마커를 이용하여 육질을 평가하는 방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2012-0046968호에는 돼지의 유전자를 이용하여 전단력이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법이 개시되어 있으며, 특허공개 제2012-0049624호에는 돼지의 유전자를 이용하여 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2012-0052796호에는 돼지의 육질 특성에 관여하는 PPARGC1A 유전자의 새로운 유전적 변이(SNP) 부위를 이용한 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있으며, 특허공개 제2012-0072871호에는 돼지의 불포화 지방산 함량 확인용 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하여 고품질의 돼지육을 확인하는 방법이 개시되어 있다.

그러나 재래돼지는 성장이 더디고 산자수가 적은 등 경제성이 낮은 특성 외에도 도체상태에서 등지방이 과도하게 두꺼워 산업화 하는데 제약이 많다. 등지방두께에 있어 비육돈에서 일반돼지는 20mm 내외이나 재래돼지는 최소 40mm 이상으로 일부 개체들은 80mm까지도 확인된다. 지금까지 재래돼지는 품종보존의 성격이 강하고 지금까지 선발보다는 종 유지 차원에서 보존이 되었으나, 재래종의 유전자원으로서 가치 상승과 더불어 산업화하는데 중요 자원으로 대두가 되고 있어 가장 문제시되는 등지방두께를 저감시키는 목적으로 유전자 수준에서 조절 방법 개발이 필요하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 돼지의 등지방두께를 저감할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 5번 염색체에 존재하는 SNP를 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 돼지의 등지방두께의 저감을 판별하여, 돼지의 품질을 판단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 등지방두께 저감을 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 등지방두께가 저감된 돼지의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 등지방두께를 저감시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 등지방두께 저감 판단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 돼지의 등지방두께를 저감할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 이에 돼지의 등지방두께와 관련된 유전자좌위(quantitative trait loci, QTL)를 검색하였고, 그 결과, 5번 염색체의 30 MB 내지 35 MB에 존재하는 SNP(ALGA0031489)이 등지방두께의 저감과 연관됨을 확인하고, 상기 SNP를 등지방두께 저감을 판단할수 있는 유전자 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 501번째 염기가 A 또는 G이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커를 제공한다.

본 발명의 용어 "서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드"는 돼지의 등지방두께의 저감에 관여하는 유전자의 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)로서, 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 구체적인 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "등지방두께"란, 등쪽의 지방두께를 말하는 것으로, 돼지는 일반적으로 피하지방이 많지만 특히 견부와 요부에 두텁게 부착되어 등의 중심부의 지방은 엷고 일정하게 부착되어 등급 규격에서는 제11 내지 제12늑골 부위와 마지막 늑골과 첫 번째 요추 사이에서 등지방의 두께를 측정하여 평균치를 내어 평가한다.

본 발명에 있어서, 상기 등지방두께는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 포함된 SNP의 유전자형에 의해 영향을 받는데, 상기 SNP의 501번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 경우, 이를 포함하는 돼지가 일반 돼지보다 저감된 등지방두께를 나타낸 것으로 판단할 수 있다.

또한, 구체적으로 상기 돼지의 등지방두께의 저감을 판단하는 대상이 되는 돼지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로, 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 제주 재래돼지의 도체를 사용하여, 등지방두께의 표현형을 분석한 결과, 90 kg 도달시 등지방 두께는 40 mm 이상이며, 많게는 80 mm까지 편차가 심하였다(도 1). 또한, 등심과 삼각근 사이에 근간 지방 함량이 높아 가식부위가 거의 없는 편이었다.

본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 등지방두께의 저감과 관련된 돼지의 유전자좌위를 검색한 결과, 5번 염색체의 30 Mb 내지 35 Mb에 존재하는 SNP가 등지방두께의 저감과 관련됨을 확인하고(도 2, 도 3 및 표 1), 상기 SNP를 분석한 결과, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 존재하는 SNP(501번(A/G))가 등지방 두께 저감과 연관됨을 확인하였으며(도 5), 실제 돼지에서 등지방두께의 저감과 SNP의 연관성을 분석한 결과, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드의 501번(A/G) SNP가 모두 A인 경우, 등지방두께가 저감되는 것을 알 수 있었다(표 2).

따라서, 상기 서열번호 1의 SNP를 이용하여 등지방두께의 저감을 판단할 수 있을 뿐만 아니라 등지방두께를 판단할 수 있는 유전자 마커로 사용될 수 있음을 알수 있었으며, 상기 SNP 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 폴리뉴클레오티드 내 SNP가 포함된 다형성 부위(polymorphic site)에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 다형성 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

보다 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 프라이머 쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식 가능하도록 하기 위해 프로브의 5’또는 3’ 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지인자 등을 추가로 부착할 수 있다.

본 발명의 용어 “프라이머”란, 짧은 자유 3’말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 키트를 제공한다. 구체적으로 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나, PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 돼지의 등지방두께 저감을 판단할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 일배체형의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감을 판단하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"란, 등지방두께 저감을 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP의 다형성 부위의 유전자형을 분석함으로써 상기 돼지의 육질형질 수준을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 마커에 포함된 SNP의 다형성 부위를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 변이 부위를 포함하는 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다. 이와 같은 변이 부위의 염기를 결정하는 것은 구체적으로 DNA 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDITOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP의 유전적 변이를 검출할 수 있다.

구체적으로, 상기 (b)단계에서 결정된 염기서열 중 상기 마커에 포함된 서열번호 1의 501번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 경우, 이를 포함하는 돼지가 상기 대립유전자가 G인 돼지보다 등지방두께가 저감된 것으로 판단할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 돼지의 등지방두께 저감에 관여하는 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기의 대립유전자를 모두 A로 고정하는 단계를 포함하는 돼지의 등지방두께가 저감된 우수한 돼지의 제조방법을 제공한다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 돼지의 등지방두께 저감에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기의 대립유전자를 모두 A로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지의 등지방두께를 저감시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 돼지의 등지방두께 저감에 관여하는 501번째 염기가 A/A인 개체를 교배시키고, 이로부터 수득한 자손 중에서 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기가 A/A로 고정된 돼지를 선발함으로써 돼지의 등지방두께가 저감된 돼지를 얻을 수 있다. 상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 일 실시양태로서, 본 발명은 상기 돼지의 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 돼지의 등지방두께 저감 판단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 판단방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25-30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 돼지의 등지방두께 저감 판단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 돼지의 등지방두께 저감을 판단할 수 있는 SNP 마커는 육안으로 구별되지 않는 등지방두께의 저감을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있을 것이다.

도 1은 제주 재래돼지의 도체의 등지방두께의 표현형을 나타내는 사진이다.
도 2는 돼지의 등지방두께와 관련된 유전자가 포함된 염색체를 DNA 칩으로 GWAS(genome wide association study)를 분석하여 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 상기 5번 염색체의 등지방두께 연관 유전자좌위 내 다양한 유전자 군을 나타내는 개략도이다.
도 4는 5번 염색체의 SNP를 중심으로 1001개의 뉴클레오티의 염기서열이다.
도 5는 파이로-시퀀싱을 이용하여 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 포함된 501번(A/G) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 제주재래돼지의 등지방두께 표현형 분석

제주 재래돼지의 도체를 사용하여, 등지방두께의 표현형을 분석하였다(도 1). 도 1은 제주 재래돼지의 도체의 등지방두께의 표현형을 나타내는 도이다. 도1에서 보듯이, 90 kg 도달시 등지방 두께는 40 mm 이상이며, 많게는 80 mm까지 편차가 심하였다. 또한, 등심과 삼각근 사이에 근간 지방 함량이 높아 가식부위가 거의 없는 편이었다.

따라서, 재래돼지를 활용하기 위해서는 반드시 등지방 저감이 필요함을 알 수 있었다.

실시예 2. 등지방두께 관련 유전자좌위 검색

제주 재래돼지와 랜드레이스 교배 참조집단에 대한 2세대 자손에서 약 1000 두 이상 도축되는 모든 개체를 대상으로 3개 부위 즉, 4-5번 갈비뼈 영역, 11번-12번 갈비뼈 영역, 마지막 흉추와 요추사이에서 등지방 두께를 측정하고 대용량 DNA 칩으로 GWAS를 분석하여 등지방두께 연관 유전자좌위(Quantative Trait Loci, QTL)를 검색하였다(도 2).

그 결과, 마지막 늑골과 요추사이에 가장 높은 QTL을 확인하였고 도 2에서 보듯이, 상기 QTL은 5번 염색체에 존재하는 것을 확인하였다.

하기의 표1은 상기 5번 염색체에서 돼지 등지방두께에 대한 표현형 연관 유의성이 높은 상위 10개의 SNP 리스트를 추출한 것이다. 이 중, 31,444,249 BP에 위치한 SNP가 등지방두께와 가장 높은 유의성을 나타내었고, 상기 SNP를 중심으로 1001개의 뉴클레오티드(서열번호 1)를 확보하였다(도 4). 상기 확보된 뉴클레오티드 서열을 확인한 결과, 상기 확보된 뉴클레오티드 서열의 501번 염기에 존재하는 SNP가 등지방두께와 연관됨을 확인하였다.

염색체	SNP	BP	P-VALUE	LOG
5	ALGA0031489	31,444,249	5.39E-15	14.26849182
5	MARC0065416	31,339,549	5.63E-15	14.24926025
5	ASGA0025386	36,568,996	5.85E-15	14.2327699
5	ASGA0025185	29,697,723	2.46E-14	13.6099485
5	ASGA0025253	33,437,040	3.68E-14	13.43438828
5	ASGA0025355	34,915,630	3.87E-14	13.41217683
5	DRGA0005608	32,804,318	8.29E-14	13.08170749
5	ALGA0031991	58,351,846	1.04E-13	12.98505965
5	ASGA0025277	34,074,022	1.07E-13	12.97183558
5	ASGA0025237	32,661,210	1.12E-13	12.94923369

도 3은 5번 염색체의 등지방두께 연관 유전자좌위 내 다양한 유전자군을 나타낸 도이다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이 상기 5번 염색체의 등지방두께 연관 유전자좌위 내 다양한 유전자 군(MON2, ssc-let-7i, ENSSSCG00000021558, ENSSSCG00000029004, ENSSSCG00000025211, ENSSSCG00000021070, ENSSSCG00000024879, HSBP1, POLR2L, U6, TMEM5, SRGAP1, C12orf56, c12orf66, XPOT, ENSSSCG00000023715, TBC1D30, ENSSSCG00000030998, ENSSSCG00000000468, LEMD3, MSRB3, ENSSSCG00000024846, HMGA2, ENSSSCG00000018696, ENSSSCG00000000474, 5S_rRNA, LLPH, ENSSSCG00000000473, IRAK3, ENSSSCG00000000476, HELB, GRIP1, U1, ENSSSCG00000023676, ENSSSCG00000028869)이 30 Mb 내지 35 Mb에 존재함을 확인하였다.

실시예 3. 파이로-시퀀싱( Phyro -sequencing)을 이용한 등지방두께 연관 SNP를 포함하는 염기서열 추출 및 분석.

제주재래돼지와 랜드레이스 교배 참조축군에서 등지방두께와 관련하여 유의성이 가장 높은 SNP는 ALGA0031489로 확인됨에 따라서, 상기 SNP를 중심으로 확보한 1001개의 뉴클레오티드(서열번호 1)를 증폭하고 이에 포함된 SNP 서열을 분석하고자 하였다.

먼저, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위하여, 다수의 돼지로부터 얻어진 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 단편(서열번호 2, 299 bp)을 수득하였다.

BF_F: 5'-GGC-ATT-CAT-GAG-TTC-AGT-ACA-CC-3'(서열번호 3)

BF_R: 5'-biotin-AAG-CTG-AAT-GGA-AAC-AAA-ACA-3'(서열번호 4)

상기 프라이머를 이용하여 수득한 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 단편의 염기서열을 결정하고 이에 포함된 SNP의 유전자형을 확인하였다.

501번(A/G) SNP를 확인하기 위하여, 하기의 프라이머(Mini-seq)를 사용하여 폴리뉴클레오티드 단편의 염기서열을 결정하고, 입력의 프라이머를 사용하여, 상기의 염기서열 중에서 501번(A/G) SNP의 유전자형을 확인하였다(도 5).

mini-seq: 5'-GCT-CTT-AGC-TGG-CAA-ATT-CT-3'(서열번호 5)

입력: 5'-[A/G]AACTCTTAT-3'(서열번호 6)

도 5는 파이로-시퀀싱을 이용하여 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에 포함된 501번(A/G) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 증폭된 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에는 각각 AA, AG, GG의 유전자형이 포함되어 있음을 확인하였다.

실시예 4. 5번 염색체 SNP의 유전자형과 등지방두께의 연관성 분석

상기 실시예 3에서 확인 SNP의 유전형에 따른 등지방두께의 변화를 비교하였다(표 2).

SNP(ALGA0031489)의 유전자형과 등지방두께의 연관성 분석

유전자형	분석두수	등지방두께(mm)
AA	326	24.8282 ± 7.1571
AG	525	26.7524 ± 7.3770
GG	194	26.7474 ± 7.4760

상기 표 2에서 보듯이, 상기 SNP(ALGA0031489)의 유전자형이 AA인 경우, 등지방두께가 약 24.8282 mm로, AG 또는 GG인 경우, 각각 약 26.7524, 26.7474 mm인 등지방두께와 비교하여, 3가지 유전자형 중 가장 낮은 등지방두께임을 확인하였다.

또한, 상기 AG 또는 GG의 유전자형에 따른 등지방두께의 차이가 없기 때문에, 유전양상이 상가적 효과보다는 우성효과임을 추측할 수 있었다.

따라서, 상기 유전자형을 고려하여 교배를 할 경우, 등지방두께가 저감된 돼지를 선별 및 육성할 수 있을 것으로 사료된다.

상기 결과를 종합하면, 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 중에서 501번 SNP는 돼지의 등지방두께 저감과 직접적으로 연관되므로, 상기 SNP의 전체 또는 일부를 검출할 경우, 등지방두께가 저감된 돼지를 구별할 수 있다.

기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel SNP marker for discriminating reduction of backfat thickness and use thereof <130> KPA151110-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP nucleotide <400> 1 gatcctattt ttagaatttc cagatattag tgttataaga agttagtaag cttgctactc 60 attacagtga gtgaaagctt ttatagataa tattaatggt tacgctatat ttaagtcata 120 tactggacca tggatcaata cagatctcaa atttttcgtt ggtaaacaaa gacaattcag 180 ttactttttc ataatgccct ttctcccact ccagccaagc tagtatgagg gtgggaacat 240 tccatcataa acactgaact gggaagatgt agagtcatgg cagttatgct ggccacagaa 300 atggatggat cgcagcagct gtttaaaagt aagaggcatt catgagttca gtacacctat 360 tttataaaac tgattttttc taaaactatt tattaaccaa aaatgatata gaattcagta 420 actgggagcc atgtggactg ttcagctttt gcgcttactc tttatcaagg cattggccag 480 gctcttagct ggcaaattct raactcttat aactcaatat aacaatagtg tgtctgtaca 540 tagcatttat tcagtagcat gtgttgaata tattaaaaaa taaacaataa ttatattgga 600 ttctaaaaaa tatgttttgt ttccattcag cttagaactc aatatttgaa ttatttctct 660 gggaatcatt ttttaagtat tgaaagtact tcatgggcag gaagttttta actgagccaa 720 gcagaaaaag aataaatact aaaaattaga aactctagtg tatgctaaga aatcttgaag 780 agcaagtcac tgttttaaaa ttctatatat gagctcctta aatatgttca ttcttcaatt 840 aatggatatt tgtgattaat gattgaataa taactttagg atcctaaaac acatctttca 900 tcatgcatga atatactata atatctcata taagccctac tttatataat gtgtagctag 960 aaagttacaa ttaaattgaa tttttgtaac ttgattcata t 1001 <210> 2 <211> 299 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP nucleotide fragment by PCR <400> 2 ggcattcatg agttcagtac acctatttta taaaactgat tttttctaaa actatttatt 60 aaccaaaaat gatatagaat tcagtaactg ggagccatgt ggactgttca gcttttgcgc 120 ttactcttta tcaaggcatt ggccaggctc ttagctggca aattctraac tcttataact 180 caatataaca atagtgtgtc tgtacatagc atttattcag tagcatgtgt tgaatatatt 240 aaaaaataaa caataattat attggattct aaaaaatatg ttttgtttcc attcagctt 299 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BF_F primer <400> 3 ggcattcatg agttcagtac acc 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BF_R primer <400> 4 aagctgaatg gaaacaaaac a 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mini-seq primer <400> 5 gctcttagct ggcaaattct 20 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 raactcttat 10

Claims

서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 501번 염기가 A 또는 G이고, 상기 501번 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스 교잡종인, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커 조성물.
돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물로서,
상기 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 501번 염기가 A 또는 G이고, 상기 501번 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬수 있는, 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 것인, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 조성물.
제3항의 조성물을 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 키트.
제5항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 돼지의 등지방두께 저감 판단용 키트.
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭시키는 단계로서,
상기 돼지의 등지방두께 저감 판단용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 501번 염기가 A 또는 G이고, 상기 501번 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 등지방두께 저감을 판단하는 방법.
제7항에 있어서,
서열번호 1의 폴리뉴클레오티드에서, SNP 위치인 501번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 경우, 대립유전자가 G인 경우에 비하여, 돼지의 등지방두께가 저감된 것으로 판단하는 것인, 돼지의 등지방두께 저감을 판단하는 방법.
돼지의 등지방두께 저감에 관여하는 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기의 대립유전자를 모두 A로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지의 등지방두께가 저감된 우수한 돼지의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 SNP 형질을 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인, 돼지의 등지방두께가 저감된 우수한 돼지의 제조방법.
돼지의 등지방두께 저감에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기의 대립유전자를 모두 A로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지의 등지방두께를 저감시키는 방법.
제11항에 있어서,
상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 501번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 SNP 형질을 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인, 돼지의 등지방두께를 저감시키는 방법.
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 501번 염기가 A 또는 G이고, 상기 501번 염기를 포함하는 5 내지 1000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 등지방두께 저감 판단용 마이크로어레이.