KR101677091B1 - 돼지의 코르티졸 분비수준을 조절하는 ｓｎｐ 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지의 코르티졸 분비수준을 조절하는 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자의 인트론 영역의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 키트, 돼지의 육질형질 수준을 판단하는 방법, 돼지의 육질형질 수준이 증가된 돼지의 제조방법, 돼지의 코르티졸 분비수준을 저하시키는 방법, 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커 및 상기 일배체형 마커를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명의 일배체형 마커는 돼지에서 분비되는 스트레스 호르몬인 코르티졸의 분비량을 통하여 육질형질 수준을 판단하는 특이적 유전자 마커로서, 육안으로 구별되지 않는 돼지의 육질형질 수준을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있을 것이다.

Description

돼지의 코르티졸 분비수준을 조절하는 ＳＮＰ 및 이의 용도{SNP for regulating cortisol secretion level of Pig and use thereof}

본 발명은 돼지의 코르티졸 분비수준을 조절하는 SNP 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 돼지의 코르티졸 분비수준을 조절하는 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자의 인트론 영역의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 키트, 돼지의 육질형질 수준을 판단하는 방법, 돼지의 육질형질 수준이 증가된 돼지의 제조방법, 돼지의 코르티졸 분비수준을 저하시키는 방법, 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커 및 상기 일배체형 마커를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 마이크로어레이에 관한 것이다.

약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다. 일반적으로 유럽품종과 아시아 품종들은 각 대륙의 야생 멧돼지(Susscrofa)에서 유래되었으며, 현재까지 존재하고 있는 품종은 200 여종 이며, 최근 FAO (Finance and Accounts Office)에서 발표한 결과에 따르면 아시아품종이 30%, 유럽품종이 33% 정도임이 보고되었다. 이 품종들 사이에 표현형의 차이는 모색, 크기, 체형 등이 있다.

최근에는, 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵기 때문에, 이러한 점을 악용하여 브랜드화되지 않은 돼지육을 브랜드화된 돼지육으로 속여서 판매하는 방식으로 돼지육의 유통질서를 교란시키는 사건이 빈번하게 발생하고 있다. 실제로, 브랜드화된 돼지와 브랜드화되지 않은 돼지육을 구별하는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로서, 돼지육의 유전자를 분석하여 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 방법이 개발되었는데, 이처럼 유전자를 분석하는 방법은 PCR 기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 등의 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법을 개발 및 발전시키려는 방향으로 활발한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 특허공개 제2004-0039059호에는 돼지의 일당증체량, 등지방두께, 육질형질에 관련된 특이 DNA marker를 이용하여 돼지의 형질이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 유전자 검정방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2007-0113336호에는 돼지의 근세포 분화에 관여하는 것으로 알려진 Myogenin 유전자의 5' 말단의 프로모터 부위의 단일 염기서열 차이에 의한 변이(SNP)를 이용한 돼지 근세포수 증가 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있으며, 특허공개 제2011-0011443호에는 KIT 유전자에 대한 한국재래돼지 특이적인 DNA 마커를 검출하여, 한국재래돼지와 기타 개량종 돼지와의 정확한 품종을 판별하는 기술이 개시되어 있고, 특허공개 제2011-0050261호에는 흑모색 돼지의 KIT 유전자 지역의 SNP로부터 추정된 haplotype을 이용하여 흑모색 돼지의 품종을 식별하는 방법이 개시되어 있으며, 특허공개 제2011-0139011호에는 돼지 근내지방 함량 진단용 단일형질 다형성 바이오마커를 이용하여 육질을 평가하는 방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2012-0046968호에는 돼지의 유전자를 이용하여 전단력이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법이 개시되어 있으며, 특허공개 제2012-0049624호에는 돼지의 유전자를 이용하여 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법이 개시되어 있고, 특허공개 제2012-0052796호에는 돼지의 육질 특성에 관여하는 PPARGC1A 유전자의 새로운 유전적 변이(SNP) 부위를 이용한 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있으며, 특허공개 제2012-0072871호에는 돼지의 불포화 지방산 함량 확인용 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하여 고품질의 돼지육을 확인하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 여전히 돼지의 육질형질 수준을 정확하게 판단하기 위한 방법에 대하여는 개발되지 않고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 돼지의 육질형질을 기준으로 하여 돼지육의 품질을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 돼지의 스트레스 호르몬인 코르티졸(cortisol)의 분비량을 조절하는 유전자를 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 돼지의 육질형질의 수준을 판별하여, 돼지의 품질을 판단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돼지의 육질형질 수준 판단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 육질형질 수준을 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 육질형질 수준이 증가된 돼지의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 코르티졸 분비수준을 저하시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 돼지의 육질형질을 기준으로 하여 돼지육의 품질을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 스트레스 저항 호르몬인 코르티졸(cortisol)에 주목하게 되었다. 통상적으로, 돼지는 땀샘이 없어 스트레스에 약한 동물이며, 과도한 스트레스를 받으면 갑작스런 폐사하는 경우가 많이 발생하며 또한 내분비계통에서 스트레스 저항성 호르몬인 코르티졸의 분비량이 증가하는데, 이러한 코르티졸의 분비량은 돼지의 개체별로 차이가 있으며, 과도한 스트레스로 인하여 코르티졸이 과다하게 분비되면, 고기가 창백하고 육즙 배출이 많이 되는 등 육질과 고기맛에 좋지 않은 영향을 준다고 알려져 있다. 따라서, 상기 코르티졸의 분비량을 조절할 수 있는 유전자를 확인할 수 있다면, 돼지육의 품질을 보다 효과적으로 판단할 수 있을 것으로 예상하였다. 이에, 상기 코르티졸 분비량과 관련된 유전자를 검색한 결과, 7번 염색체의 119Mb 내지 121Mb에 존재하는 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자의 인트론 영역(서열번호 2)에 존재하는 3개의 SNP가 코르티졸의 분비량과 직접적으로 연관됨을 확인하고, 상기 SNP를 코르티졸의 분비량을 예측할 수 있는 유전자 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 457번째 염기가 A 또는 G이고, 470번째 염기가 T 또는 C이며, 501번째 염기가 C 또는 A이고, 상기 457, 470 또는 501번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 조성물을 제공한다.

상기 "서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드" 는 돼지의 코르티졸 분비수준의 조절에 관여하는 유전자의 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)로서, 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제" 란, 폴리뉴클레오티드내 SNP가 포함된 다형성 부위(polymorphic site)에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 다형성 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

더욱 구체적으로는 서열번호 2로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 3 및 4으로 이루어진 프라이머 쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5’또는 3’ 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.

본 발명의 용어 “프라이머”란, 짧은 자유 3’말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 발명의 용어 "육질형질"이란, 돼지로부터 얻어진 도축물의 상태를 나타내는 다양한 표현형질을 의미하는데, 상기 표현형질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 근내지방함량, 육색, 보수력, 전단력 등이 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 육질형질은 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 포함된 3종 SNP의 유전자형에 의해 영향을 받는데, 상기 SNP의 457번째 염기가 G이고, 470번째 염기가 C이며, 501번째 염기가 A인 경우, 이를 포함하는 돼지가 일반 돼지보다도 낮은 수준의 코르티졸 분비량을 나타내는 것으로 판단할 수 있다. 상기 코르티졸은 스트레스 호르몬으로서 이의 분비량이 증가하면, 돼지고기의 혈색이 감소하여 고기가 창백하고, 고기에 포함된 육즙이 빠르게 방출되어 육질과 고기맛이 저하된다고 알려져 있다. 따라서, 상기 SNP의 457번째 염기가 G이고, 470번째 염기가 C이며, 501번째 염기가 A인 경우, 이를 포함하는 돼지가 일반 돼지보다도 낮은 수준의 코르티졸 분비량을 나타내어 상대적으로 우수한 육질형질을 갖는다고 판단할 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 돼지의 코르티졸 분비수준을 통해 육질형질의 수준을 판단하는 대상이 되는 돼지는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 코르티졸의 분비량과 관련된 돼지의 유전자를 검색한 결과, 7번 염색체의 119Mb 내지 121Mb에 존재하는 SNP가 코르티졸의 분비량과 관련됨을 확인하고(도 1 및 2), 상기 SNP를 대상으로 분석한 결과, ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자의 인트론 영역(서열번호 2)에 존재하는 3개의 SNP(457번(A/G), 470번(T/C) 및 501번(C/A))가 코르티졸의 분비량과 직접적으로 연관됨을 확인하였으며(도 3, 4a, 4b 및 4c), 실제 돼지에서 코르티졸의 분비량과 SNP의 연관성을 분석한 결과, 상기 서열번호 2의 457번(A/G) SNP가 A, 470번(T/C) SNP가 T 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 C인 경우에는 코르티졸의 분비량이 최소화되는 반면, 상기 457번(A/G) SNP가 G, 470번(T/C) SNP가 C 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 A인 경우에는 코르티졸의 분비량이 최대화됨을 알 수 있었다(표 1).

따라서, 상기 서열번호 2의 SNP를 포함하는 SNP는 코르티졸의 분비량을 예측할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 코르티졸의 분비량에 의하여 직접적으로 영향을 받는 돼지의 육질형질을 평가할 수 있는 유전자 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었으며, 상기 유전자 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나 PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기 조성물을 이용하여 본 발명에서 제공하는 3종 SNP 마커의 유전자형을 증폭을 통해 확인하거나, 또는 mRNA의 발현 수준을 확인함으로써 돼지의 육질형질 수준을 판단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 제공하는 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 일배체형의 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또 다른 예로서, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지 육질형질 수준 판단용 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 용어 "DNA 칩"이란, 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

상기 DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구이다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단 방법을 제공한다. 이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 육질형질 수준을 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP의 다형성 부위의 유전자형을 분석함으로써 상기 돼지의 육질형질 수준을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 일배체형 마커에 포함된 SNP의 다형성 부위를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 변이 부위를 포함하는 일배체형에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다. 이와 같은 변이 부위의 염기를 결정하는 것은 바람직하게는 DNA 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP의 유전적 변이를 검출할 수 있다.

바람직하게, 상기 (b) 단계에서 결정된 염기서열 중, 상기 일배체형 마커에 포함된 서열번호 2의 457번째 염기가 A이고, 470번째 염기가 T이며, 501번째 염기가 C인 경우, 이를 포함하는 돼지가 일반 돼지보다도 낮은 수준의 코르티졸 분비량을 나타내어 우수한 육질형질을 갖는다고 판단할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 돼지의 코르티졸 분비수준에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 457번째 염기의 대립유전자를 A로 고정하거나, 470번째 염기의 대립유전자를 T로 고정하거나 또는 501번째 염기의 대립유전자를 C로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준이 감소되어, 육질형질이 우수한 돼지의 제조방법을 제공한다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 돼지의 코르티졸 분비수준에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 457번째 염기의 대립유전자를 A로 고정하거나, 470번째 염기의 대립유전자를 T로 고정하거나 또는 501번째 염기의 대립유전자를 C로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행될 수 있다. 더욱 구체적으로, 돼지의 코르티졸 분비수준에 관여하는 유전자인 457, 470 및 501번째 염기가 각각 A/A, T/T 및 C/C인 개체를 교배시키고, 이로부터 수득한 자손 중에서 서열번호 2로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 457, 470 및 501번째 염기가 각각 A/A, T/T 및 C/C로 고정된 돼지를 선발함으로써 돼지의 코르티졸 분비수준이 감소된 돼지를 얻을 수 있다. 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자의 인트론 영역의 단일염기다형성인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커를 제공한다.

구체적으로, 상기 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커는 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자의 인트론 영역(서열번호 2)의 457번째 염기가 A 또는 G이고, 470번째 염기가 T 또는 C이며, 501번째 염기가 C 또는 A인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 용어 "ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자"란, 칼슘에 의해 활성화되는 염소채널을 조절하는 이노시톨 신호전달경로에 관여하는 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 ITPK1 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession No. NM_001142593, NM_172584 등으로 표시되는 유전자가 될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "일배체형(haplotype) 마커"란, 1개의 염색체 상에 다형의 유전자자리가 조밀하게 연쇄하여 존재하는 경우, 동일 염색체 상에 연쇄하는 각 유전자자리의 대립유전자 조합을 포함하는 마커를 의미한다. 상기 일배체형을 이용하면 유전자 영역을 식별할 수 있고, 상기 일배체형을 형성하는 대립유전자는 연쇄불평형 관계가 형성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 일배체형은 특별히 이에 제한되지 않으나, ITPK1 유전자의 인트론 영역의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드(ITPK1 유전자의 인트론 영역)의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 2로 구성된 폴리뉴클레오티드에 있어서, SNP 위치인 457번째 염기가 A 또는 G이고, 470번째 염기가 T 또는 C이며, 501번째 염기가 C 또는 A인 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준을 판단할 수 있는 일배체형 마커가 될 수 있다.

또한, 본 발명의 일배체형 마커는 457번째 염기의 대립유전자가 A, 470번째 염기의 대립유전자가 T 또는 501번째 염기의 대립유전자가 C인 경우, 457번째 염기의 대립유전자가 G, 470번째 염기의 대립유전자가 C 또는 501번째 염기의 대립유전자가 A인 경우보다도, 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준이 저하되어, 돼지의 육질형질이 우수하고 판단할 수 있다.

상술한 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 돼지의 육질형질 수준 판단용 일배체형 마커를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 판단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 돼지의 육질형질 수준 판단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 판단방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25-30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 돼지의 육질형질 수준 판단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 일배체형 마커는 돼지에서 분비되는 스트레스 호르몬인 코르티졸의 분비량을 통하여 육질형질 수준을 판단하는 특이적 유전자 마커로서, 육안으로 구별되지 않는 돼지의 육질형질 수준을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있을 것이다.

도 1은 돼지의 코르티졸 분비와 관련된 유전자가 포함된 염색체를 GWAS (genome wide association study) 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 돼지의 코르티졸 분비와 관련된 유전자를 검색한 결과를 나타내는 도표이다.
도 3은 다수의 돼지로부터 증폭된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내는 전기영동사진이다.
도 4a는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 포함된 457번(A/G) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 포함된 470번(T/C) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 포함된 501번(C/A) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 코르티졸의 분비량 관련 유전자 검색

제주재래돼지와 듀록 교배 참조집단에 대한 2세대 자손돼지의 혈청내 코르티졸(cortisol) 함량을 측정하고, GWAS (genome wide association study) 분석을 통해 코르티졸 분비량을 결정하는 유전자 좌위를 검색하였다(도 1).

도 1은 돼지의 코르티졸 분비와 관련된 유전자가 포함된 염색체를 GWAS (genome wide association study) 분석을 통해 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 돼지의 코르티졸 분비와 관련된 유전자는 7번 염색체의 말단에 존재함을 확인하였다.

상기 결정된 7번 염색체의 말단에 위치한 유전자 중에서 코르티졸의 분비량과 관련된 유전자를 규명하기 위하여, 대용량 DNA chip을 이용해서 상기 수득한 2세대 자손돼지의 혈청내 코르티졸 함량을 측정하고, 유전자형과 표현형과의 연관성 분석을 수행하였다(도 2).

도 2는 돼지의 코르티졸 분비와 관련된 유전자를 검색한 결과를 나타내는 도표이다. 도 2에서 보듯이, 7번 염색체 내에서 약 65개의 SNP가 돼지의 코르티졸 분비와 관련되었음을 확인하였고, 특히, 고도의 유의성을 나타내는 10개의 유전자가 7번 염색체의 119Mb 내지 121Mb에 존재함을 확인하였다.

실시예 2: 코르티졸의 분비량 관련 후보 유전자의 검증

실시예 2-1: 후보 유전자 확보

상기 실시예 1-1에서 결정된 7번 염색체의 119Mb 내지 121Mb에 존재하는 유전자 중에서 코르티졸의 분비와 관련된 유전자를 탐색한 결과, 인간의 경우 신경관계 질환과 관련된 것으로 알려진 ITPK1(inositol-tetrakisphosphate 1-kinase) 유전자(서열번호 1)가 스트레스와 직접적으로 연관될 것으로 예상하고, 이를 후보 유전자로 선정하였다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열과 이로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 분석한 결과, 141번 및 209번에 변이서열이 존재하지만, 이는 아미노산 서열에 영향을 주지 않음을 확인하였다.

상기 선정된 유전자를 대상으로 8개체의 유전자 분석자료에 기초하여, 코르티졸 분비형질과 연관성을 나타내는 염기서열상의 변이를 분석한 결과, 7번 염색체의 121,017,897b에 위치한 SNP가 코르티졸 분비형질과 가장 높은 연관성을 나타내었고, 상기 SNP를 중심으로 포함하는 1001개의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)을 확보하였다. 상기 확보된 뉴클레오티드 서열을 확인한 결과, ITPK1 유전자의 인트론 영역의 서열임을 확인하였고, 상기 확보된 뉴클레오티드 서열의 457번(A/G), 470번(T/C) 및 501번(C/A) 염기에 존재하는 SNP가 코르티졸 분비형질과 연관됨을 확인하였다.

실시예 2-2: PCR 분석

상기 서열번호 2를 증폭하고, 이에 포함된 SNP 서열을 분석하고자 하였다.

먼저, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위하여, 다수의 돼지로부터 얻어진 염색체 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 단편을 수득하였다(도 3).

Cortisol_F: 5'-AAA-CTG-ATC-AAG-CTG-CTC-ACA-A-3'(서열번호 3)

Cortisol_R: 5'-biotin-ACC-AGA-TCT-GAG-CTG-TGT-TTG-C-3'(서열번호 4)

도 3은 다수의 돼지로부터 증폭된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 단편을 나타내는 전기영동사진이다.

상기 수득한 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 단편의 염기서열을 결정하고 이에 포함된 SNP의 유전자형을 확인하였다.

먼저, 457번(A/G) SNP를 확인하기 위하여, 하기 프라이머(mini_seq1)를 사용하여 폴리뉴클레오티드 단편의 염기서열을 결정하고, 입력1의 프라이머를 사용하여 상기 염기서열 중에서, 457번(A/G) SNP의 유전자형을 확인하였다(도 4a).

mini_seq1: 5'-TCT-GCA-GTG-TGG-CCT-GTC-TT-3'(서열번호 5)

입력1: 5'-[A/G]CGTTTACC-3'(서열번호 6)

도 4a는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 포함된 457번(A/G) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4a에서 보듯이, 증폭된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에는 각각 AA, AG 및 GG의 유전자형이 포함되어 있음을 확인하였다.

다음으로, 470번(T/C) SNP를 확인하기 위하여, 하기 프라이머(mini_seq2)를 사용하여 폴리뉴클레오티드 단편의 염기서열을 결정하고, 입력2의 프라이머를 사용하여 상기 염기서열 중에서, 470번(T/C) SNP의 유전자형을 확인하였다(도 4b).

mini_seq2: 5'-CTG-TCT-TAC-GTT-TAC-CCT-GC-3'(서열번호 7)

입력2: 5'-[C/T]TGGGACTC-3'(서열번호 8)

도 4b는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 포함된 470번(T/C) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, 증폭된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에는 각각 CC, CT 및 TT의 유전자형이 포함되어 있음을 확인하였다.

끝으로, 501번(C/A) SNP를 확인하기 위하여, 하기 프라이머(mini_seq3)를 사용하여 폴리뉴클레오티드 단편의 염기서열을 결정하고, 입력3의 프라이머를 사용하여 상기 염기서열 중에서, 501번(C/A) SNP의 유전자형을 확인하였다(도 4c).

mini_seq3: 5'-GCT-TTC-CAC-ATG-CGG-TGG-AT-3'(서열번호 9)

입력3: 5'-[A/C]AGAAACAG-3'(서열번호 10)

도 4c는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에 포함된 501번(C/A) SNP의 유전자형을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4c에서 보듯이, 증폭된 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드에는 각각 AA, AC 및 CC의 유전자형이 포함되어 있음을 확인하였다.

아울러, 상기 각 SNP의 유전형을 분석한 결과, 상기 3개 SNP의 유전형은 완전연관되어 있음을 확인하였다. 즉, 3개 SNP의 조합에 의하여 형성될 수 있는 유전형은 이론적으로는 8개 유전형(457-470-501 기준: ATC, ATA, ACC, ACA, GTC, GTA, GCC 및 GCA)을 나타낼 수 있으나, 실제로 검출된 유전형은 2개 유전형(457-470-501 기준: ATC 및 GCA)에 불과함을 확인하여, 상기 3개 SNP의 유전형은 서로 완전연관되어 독립적으로 변이되지 않음을 알 수 있었다.

실시예 2-3: 코르티졸 분비량 분석

상기 실시예 2-2에서 확인된 3개 SNP의 유전형은 완전연관되어 있다는 결과에 따라, 상기 3개 SNP의 유전형에 따른 코르티졸 분비량의 변화를 비교하였다(표 1).

SNP의 유전자형과 코르티졸 분비량의 연관성 분석

SNP 위치	유전자형	분석두수	코르티졸 분비량(unit)
457	AA	73	16.01±10.79
	AG	162	23.80±12.81
	GG	69	28.75±18.74
470	TT	72	16.00±10.76
	TC	161	23.83±12.82
	CC	67	28.64±18.71
501	CC	73	16.01±10.79
	CA	164	23.84±12.84
	AA	69	28.75±18.74

상기 표 1에서 보듯이, 상기 457번(A/G) SNP의 유전형질이 AA인 경우, 470번(T/C) SNP의 유전형질이 TT인 경우 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 CC인 경우에는 모두 약 16unit의 코르티졸 분비량을 나타내었고; 상기 457번(A/G) SNP의 유전형질이 GG인 경우, 470번(T/C) SNP의 유전형질이 CC인 경우 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 AA인 경우에는 모두 약 28.70unit의 코르티졸 분비량을 나타내었으며; 상기 457번(A/G) SNP의 유전형질이 AG인 경우, 470번(T/C) SNP의 유전형질이 TC인 경우 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 CA인 경우에는 모두 약 23.80unit의 코르티졸 분비량을 나타냄을 확인하였다.

이로부터, 상기 3개의 SNP의 유전형이 모두 완전연관되어 있음을 확인하였고, 상기 457번(A/G) SNP가 A, 470번(T/C) SNP가 T 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 C인 경우에는 코르티졸의 분비량이 최소화되는 반면, 상기 457번(A/G) SNP가 G, 470번(T/C) SNP가 C 및 501번(C/A) SNP의 유전형질이 A인 경우에는 코르티졸의 분비량이 최대화 됨을 알 수 있었다.

상기 결과를 종합하면, 돼지의 ITPK1 유전자의 인트론 영역을 포함하는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 중에서 457번(A/G), 470번(T/C) 및 501번(C/A) SNP는 돼지의 코르티졸의 분비량과 직접적으로 연관되므로, 상기 SNP의 전체 또는 일부를 검출할 경우, 스트레스 저항성 호르몬인 코르티졸의 분비량이 적고 육질이 향상된 돼지를 구별할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP for regulating cortisol secretion level of Pig and use thereof <130> KPA140941-KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP nucleotide <400> 1 atgcagacct ttctgaaagg gaagagagtt ggctactggc tgagcgagaa gaaaatcaag 60 aagctgaatt tccaggcctt cgccgagctg tgcaggaagc gagggatcga agtcgtgcag 120 ctgaacctca gccggccgat ygaggagcag ggccccctgg atgtcatcat ccacaagctg 180 accgatgtca tcctcgaagc cgaccagaay gacagccagt ccctggagct ggtgcacagg 240 ttccaggaat acatcgatgc ccaccccgag accattgtcc tggaccccct tcctgccatc 300 aggaccctgc tcgatcggtc caagtcctac gagctcatcc ggaagatcga agcctacatg 360 caagatgaca ggatctgctc gccgcccttc atggagctca cgagcctgtg cggggacgac 420 accatgcagc tcctggagaa gaacggcctg gccttcccct tcatttgcaa aaccagagtg 480 gctcatggca ccaactccca cgagatggcc atcgtgttca accaggaggg cttgagcgcc 540 atccagccgc cctgcgtggt ccagaatttc atcaaccaca acgccgtcct gtacaaggtg 600 tttgtagtcg gcgagtccta caccgtggtc cagagaccct cgctcaagaa cttctccgcg 660 ggcacgtcag accgtgagtc catcttcttc aacagccaca acgtgtcgaa gccagagtcg 720 tcgtcggtcc tgaccgcgct ggacaagatc gagggcgtgt tcgagcgacc gagcgacgag 780 gtcatccggg cgctgtcccg ggccctgcgg caggcgctgg gcgtgtcgct cttcgggatc 840 gacatcatta tcaacaacca gacggggcag cacgcggtca tcgacatcaa cgccttcccg 900 ggctacgagg gcgtgagcga gttcttcacc gacctcctga accacatcgc ctcggtgctg 960 cagggccaga gcgcggccgc ggcggcctcg ggggacgtgg ccccgctgag gcacagcaag 1020 ctcctggcag agcaggcggg tggcctggcg gctgagcgga cgtgcagcgc cagccccggc 1080 tgctgcagca gcatgatggg ccaggagccg ccctggacgt ccgaggctga tgtgggcggc 1140 gtgggcgcgg gcagcaccgc caagctgccg caccagagac tcggctgcac cgccgccgtg 1200 tcgcccagct tccagcagca ttgcgtggcc tcgctggcca ccaaggcctc ctcccagtag 1260 ccacggagcc cgggacccag aggggtggcg cacggagcac acgcgctggg caagcagctc 1320 ccgacggtgc cgctactact aagaattccc c 1351 <210> 2 <211> 1001 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP nucleotide <400> 2 cattcatccc agttcgttgg ggaaagccca cctccccatt tggtaaccag cctccttctc 60 tctagcagcc cttcctgtcc ccaacccaag gaagaggctg tcacatggga acacggaagt 120 gccgcactag gggtaggacg ggacctcact gccagaggct aaggaaggga gggaagggca 180 gggcagggca gggcagggca gggcagggca gggcagggca gggctgggca gagctgggct 240 caggggagca gcactgctct actttttgac ctggagctgg gtacatggtg tatatagctg 300 gttggtaaaa actgatcaag ctgctcacaa tgtgtagacc ttactctgtg tatattatac 360 tgcaattaaa aaaatagaag gaagagagaa agcaagcact gaaccaaaga gcaaggccgt 420 gggttgtggt cccagctctg cagtgtggcc tgtcttrcgt ttaccctgcy tgggactcca 480 gctttccaca tgcggtggat magaaacaga aaatggggag tttctattgt ggcgcagcag 540 aaacaaatcc aactaggaat catgaggttg caggttcgat ccctggtctt gctcagtggg 600 ttaaggatcc agtgttgccg tgagctatgg tgtaggtttg caaacacagc tcagatctgg 660 tgtggctgtg gcgcaggcca aaagcaacag ctctaattag actcctagcc tgagaacctc 720 cacatgccac gggtgcagcc ctagaaggac aaaagaccaa aaagaaaaaa agaaaaaaga 780 aaagaaatgg aaaacagggc ccagttccac caggcctccc ccacagccct ggcagccacc 840 accctgagca tggtggcggc gggcacttgg gaattacagc aaccgtttgt gctcatctca 900 gcaggacttc agaatcctgg ttgccacttg gttctagaag taggtaagtg tcggcactca 960 agacaaacac cacaggccgt gcacagaaga aatcagagct g 1001 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaactgatca agctgctcac aa 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 accagatctg agctgtgttt gc 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctgcagtgt ggcctgtctt 20 <210> 6 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 rcgtttacc 9 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgtcttacg tttaccctgc 20 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ytgggactc 9 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gctttccaca tgcggtggat 20 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 magaaacag 9

Claims (14)

1. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 457번째 염기가 A 또는 G이고, 470번째 염기가 T 또는 C이며, 501번째 염기가 C 또는 A이고, 상기 457, 470 또는 501번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는, 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   돼지의 육질형질은 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준이 저하될수록 상기 육질형질이 우수한 것으로 판단하는 것인 조성물.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 키트.
   
6. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및
   (b) 상기 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 457번째 염기의 대립유전자가 A, 470번째 염기의 대립유전자가 T 또는 501번째 염기의 대립유전자가 C인 경우, 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준이 저하되어 돼지의 육질형질이 우수한 것으로 판단하는 것인 방법.
   
8. 제6항에 있어서,
   상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인, 방법.
   
9. 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 457번째 염기의 대립유전자를 A로 고정하거나, 470번째 염기의 대립유전자를 T로 고정하거나 또는 501번째 염기의 대립유전자를 C로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준이 저하되어, 육질형질이 우수한 돼지의 제조방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인 방법.
    
11. 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 457번째 염기의 대립유전자를 A로 고정하거나, 470번째 염기의 대립유전자를 T로 고정하거나 또는 501번째 염기의 대립유전자를 C로 고정하는 단계를 포함하는, 돼지에서 분비되는 코르티졸의 분비수준을 감소시키는 방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인 방법.
    
13. 삭제
14. 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 457번째 염기가 A 또는 G이고, 470번째 염기가 T 또는 C이며, 501번째 염기가 C 또는 A이고, 상기 457, 470 또는 501번째 염기에 위치한 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 마이크로어레이.

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