KR101677517B1

KR101677517B1 - 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 판단용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101677517B1
Application number: KR1020140079880A
Authority: KR
Inventors: 조인철; 박남건; 고문석; 박범영; 성필남; 박용상; 조상래
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-11-21
Also published as: KR20160001888A

Abstract

본 발명은 돼지의 육질형질 수준 또는 흑모색 판단용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 키트, 마이크로어레이, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 동시에 판단하는 방법 및 품질이 향상된 흑모색 돼지의 제조방법에 관한 것이다.

Description

돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 판단용 SNP 마커 및 이의 용도{Novel SNP marker for discriminating level of meat quality and Black Coat Color of pig and use thereof}

약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다. 일반적으로 유럽품종과 아시아 품종들은 각 대륙의 야생 멧돼지(Susscrofa)에서 유래되었으며, 현재까지 존재하고 있는 품종은 200 여종 이며, 최근 FAO (Finance and Accounts Office)에서 발표한 결과에 따르면 아시아품종이 30%, 유럽품종이 33% 정도임이 보고되었다. 이 품종들 사이에 표현형의 차이는 모색, 크기, 체형 등이 있다.

최근에는, 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵기 때문에, 이러한 점을 악용하여 브랜드화되지 않은 돼지육을 브랜드화된 돼지육으로 속여서 판매하는 방식으로 돼지육의 유통질서를 교란시키는 사건이 빈번하게 발생하고 있다. 실제로, 브랜드화된 돼지와 브랜드화되지 않은 돼지육을 구별하는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로서, 돼지육의 유전자를 분석하여 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 방법이 개발되었는데, 이처럼 유전자를 분석하는 방법은 PCR 기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA), SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 등의 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법을 개발 및 발전시키려는 방향으로 활발한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 대한민국 특허공개 제2004-0039059호에는 돼지의 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적에 관련된 특이 DNA marker를 이용하여 돼지의 형질이 우수한 돼지를 선발할 수 있는 유전자 검정방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제2007-0113336호에는 돼지의 근세포 분화에 관여하는 것으로 알려진 Myogenin 유전자의 5’promoter 부위의 단일 염기서열 차이에 의한 변이(SNP)를 이용한 돼지 근세포수 증가 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제2011-0011443호에는 KIT 유전자에 대한 한국재래돼지 특이적인 DNA marker를 검출하여, 한국재래돼지와 기타 개량종 돼지와의 정확한 품종을 판별하는 기술이 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제2011-0050261호에는 흑모색 돼지의 KIT 유전자 지역의 SNP로부터 추정된 haplotype을 이용하여 흑모색 돼지의 품종을 식별하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제2011-0139011호에는 돼지 근내지방 함량 진단용 단일형질 다형성 바이오마커를 이용하여 육질을 평가하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제2012-0046968호에는 돼지의 유전자를 이용하여 전단력이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제2012-0049624호에는 돼지의 유전자를 이용하여 육색이 우수한 형질의 돼지를 선별하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제2012-0052796호에는 돼지의 육질 특성에 관여하는 PPARGC1A 유전자의 새로운 유전적 변이(SNP) 부위를 이용한 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자가 개시되어 있으며, 대한민국 특허공개 제2012-0072871호에는 돼지의 불포화 지방산 함량 확인용 단일염기다형성(SNP) 마커를 이용하여 고품질의 돼지육을 확인하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 여전히 돼지의 육질형질 및 흑모색을 동시에 정확하게 판단하기 위한 방법에 대하여는 개발되지 않고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 재래돼지의 육질형질 및 흑모색을 기준으로 하여 돼지육의 품질을 판단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 돼지의 육질형질 수준에 관여하는 유전자 및 흑모색에 관여하는 MC1R 유전자의 SNP을 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 돼지의 육질형질의 수준 및 흑모색을 동시에 판별하여, 돼지육의 품질을 판단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 나아가 이와 같은 판단방법은 흑돼지 생산 농가에서 흑모색을 고정하여 이모색 발생에 따른 손실을 줄일 수 있다.

본 발명의 목적은 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 및 돼지의 흑모색 판단용 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 조성물을 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 동시에 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 품질이 향상된 흑모색 돼지의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP 마커를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 흑모색 판단용 SNP 마커를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP 마커 및 흑모색 판단용 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일구현예는,

(a) 서열번호 1로 이루어지는 육질형질 연관 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커; 및

(b) 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 돼지의 육질형질은 돼지육의 근내지방함량, 육색, 보수력 및 전단력으로 구성된 군으로부터 선택되는 형질일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 육질형질 수준 및 흑모색의 판단 대상이 되는 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 제주재래돼지, 듀록의 기초축군, 이들의 교잡에 의한 자손에 대하여 육질의 형질 및 흑모색을 분석하였으며, 1세대 자손에서는 이형접합체가 나타나고, 2세대 자손에서는 흑모색과 적색을 완전히 식별할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어 " SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제" 란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 돼지의 흑모색을 판단할 수 있는 조성물을 의미하며, 구체적으로는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 의미할 수 있다.

구체적으로는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 2 또는 서열번호 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머 쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

본 발명의 용어 "프라이머" 란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 사상체질 특이적 복부비만을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 발명에서 용어, “육질형질”이란, 돼지로부터 얻어진 도축물의 상태를 나타내는 다양한 표현형질을 의미하는데, 상기 표현형질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 근내지방함량, 육색, 보수력, 전단력 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 육질형질은 본 발명의 SNP 마커의 유전자형에 의해 영향을 받는데, 상기 SNP 마커를 구성하는 서열번호 1로 이루어진 육질형질유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 변이 부위의 염기가 G 또는 A로 나타날 수 있으며, 이에 따라 변이 부위의 유전자형이 A/A이면 고육질형을, G/A이면 이형접합체로서 중간 수준의 육질을, G/G 유전자형이면 저육질형을 갖는다고 판단할 수 있다.

구체적으로, 상기 서열번호 1로 이루어지는 육질형질유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커는 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP 마커일 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커는 돼지의 흑모색 판단용 SNP 마커일 수 있다.

본 발명의 목적상 상기 SNP은 특별히 이에 제한되지 않으나, 육질형질에 관여하는 유전자의 다형성 부위(polymorphism)를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 1로 이루어지는 육질형질유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP 마커일 수 있다.

또한, 본 발명의 SNP은 흑모색에 관여하는 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 MC1R 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 가장 구체적으로, 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 포함하는, 돼지의 흑모색 판단용 SNP 마커일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 제주재래돼지와 듀록을 교배하여 얻어진 자손을 대상으로 대용량 SNP chip을 이용하여 돼지의 육질형질(근내지방함량, 육색, 보수력 및 전단력) 수준에 대한 GWAS 분석을 수행한 결과 돼지의 육질형질에 관여하는 유전자는 12번 염색체에 존재함을 확인하였다(도 1 및 도 2). 또한, 돼지의 육질형질 관련하여 유의성이 높은 유전자로 ALGA0067099 유전자를 선별하여, 이를 PCR을 통해 증폭시킨 후 PCR 산물을 제한효소로 절단한 후 나타나는 밴드 양상을 통해 육질형질의 수준을 판단하였다(도 3).

또한, 흑모색과 관련하여, 본 발명의 일 실시예에서는 제주재래돼지와 듀록을 교배하여 얻어진 자손을 대상으로 대용량 SNP chip을 이용하여 GWAS 분석을 수행한 결과로부터 흑모색 관련 MC1R 유전자를 선별하였으며, 이를 PCR을 통해 증폭시킨 후 PCR 산물을 제한효소로 절단한 후 나타나는 밴드 양상을 통해 흑모색을 나타내는지 여부를 판단하였다(도 9).

나아가 본 발명 일 실시예에서는 육질형질 또는 흑모색 유전자을 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍들을 함께 넣어 상기 유전자들을 동시에 PCR 반응을 통해 증폭시킨 후, 증폭된 PCR 산물을 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드 양상을 통해 육질형질의 수준 및 흑모색을 나타내는지 여부를 동시에 판단할 수 있음을 실시예를 통해 확인하였다(도 11).

본 발명에서, “육질형질 연관 유전자”란, 돼지의 육질과 관계가 있는 등지방두께, 근내지방함량 또는 적색육에 관여하는 유전자를 말하며 이의 SNP는 ALGA0067099, ASGA0055225, ASGA0055250, DIAS0003976 및 H3GA0034898 등을 예로 들 수 있다. 본 발명 일 실시예에서는 ALGA0067099의 유전자형을 활용하여 육질형질을 판단하고, 근내지방함량과 적색육을 동시에 고정할 수 있음을 확인하였다(도 3).

본 발명의 용어 “MC1R(melanocortin 1 receptor) 유전자”란, 멜라노코르틴-1 수용체 유전자로 불리며, 멜라닌 합성에 있어서 중요한 막-결합(membrane-bound) 수용체 단백질을 암호화하는 것으로 알려져있다. MC1R 유전자의 코딩 영역은 다형성이며, 멜라닌 색소 연관 유전자로서 머리색, 쥐, 소, 말, 돼지 등 동물의 털 색깔을 결정하는 유전자 중 하나로 알려져 있다. 상기 MC1R 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession No. AY365252, AY520823 또는 AY365250으로 등록된 유전자일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 재래돼지의 MC1R 유전자를 이용하여 흑모색 좌위를 확인하였으며, 구체적으로 Genebank 등록번호 Acc. AY365252, Acc. AY520823 또는 Acc. No.AY365250으로 등록된 유전자를 사용하여 흑모색을 판단할 수 있음을 제시하였으며, 더욱 구체적으로 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 이루어진 MC1R 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

상기 "서열번호 1" 내지 "서열번호 4"는 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는 상기 조성물을 포함하는 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 키트는 Multi-plexing PCR 키트 또는 DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 돼지의 육질형질 수준을 나타내는 유전자 및 흑모색 관련 유전자를 동시에 증폭시킨 후 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드의 양상을 확인함으로써 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 나타내는지 여부를 동시에 판단할 수 있다. 구체적인 일례로서, 본 발명에서 육질형질 수준 및 흑모색을 판단하기 위한 키트는 Multi-plexing PCR을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 Multi-plexing PCR 키트는, 상기 SNP 마커 유전자들에 대해 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 구체적으로 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구로서, 이를 이용하여 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 대량으로 동시에 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 제3항의 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 동시에 판단하는 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란, 육질형질의 수준을 판단하고, 흑모색을 나타내는 지의 여부를 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻어진 검체를 이용하여, SNP의 유전자형을 분석함으로써 돼지의 육질형질의 수준 및 돼지가 흑모색을 갖는지의 여부를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 구체적으로는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 용어, "SNP 칩"이란, 수십만 개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보적으로 결합 할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보적 결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

구체적으로, 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 499번째 염기의 대립유전자가 A/A 인 경우 돼지의 돼지의 육질형질 수준이 높은 것이며, 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기의 대립유전자가 G/G 또는 G/A인 경우, 돼지가 흑모색을 갖는 것으로 판단할 수 있다.

또한 구체적으로, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 돼지의 육질형질 및 흑모색에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 499 번째 염기를 A로 고정시키는 단계; 및 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 G 로 고정시키거나, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 G 로 고정시키거나, 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 G로 고정시키는 단계를 포함하는, 품질이 향상된 흑모색 돼지의 제조방법에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행될 수 있다. 더욱 구체적으로, 고육질형을 나타내는 유전자형인 A/A 및 흑모색을 나타내는 유전자형인 G/G 를 나타내는 개체를 교배시키고, 이로부터 수득한 자손 중에서 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 499 번째 염기를 A로 고정되고, 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G로 고정되거나 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 로 고정되거나, 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 로 고정된 돼지를 선발함으로써 품질이 향상된 흑모색 돼지를 얻을 수 있다.

상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 서열번호 1로 이루어지는 육질형질유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인, 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP 마커에 관한 것이다. 상기 SNP 마커는 단일염기다형성인 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다. 본 발명의 SNP 마커는 상기 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위가 A/A 유전자형일 경우, 이를 포함하는 돼지가 일반 돼지보다도 높은 수준의 육질형질을 갖는다고 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는, 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인, 돼지의 흑모색 판단용 SNP 마커에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종일 수 있다. 또한, 서열번호 2로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위가 G 인 경우, 서열번호 3으로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위가 G 인 경우 또는 서열번호 4로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위가 G 인 경우, 흑모색을 나타낸다고 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는 상기 돼지의 육질형질 판단용 SNP 마커 및 흑모색 판단용 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 마이크로어레이에 관한 것이다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 돼지의 흑모색 판단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 판단방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25 ℃ 이상의 온도 하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5x SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25-30℃의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 돼지의 육질형질 및 흑모색의 동시 판단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명의 SNP 마커는 각각 돼지의 육질형질 또는 흑모색을 판단하기 위한 특이적 마커로서, 상기 마커들을 동시에 적용하여 육안으로 구별되지 않는 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 동시에 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 돼지육의 유통질서 확립에 이바지할 수 있다. 나아가 이와 같은 판단 방법을 이용하여 흑돼지 생산 농가에서 고육질형 및 흑모색을 고정하여 이모색 발생에 따른 손실을 줄일 수 있다.

도 1은 제주재래돼지와 듀록 교배 참조축근에서 근내지방함량에 대한 GWAS(genome-wide association study) 분석결과 근내지방함량의 유전자좌위를 나타낸 것이다.
도 2는 제주재래돼지와 듀록 교배 참조축근에서 적색육에 대한 GWAS(genome-wide association study) 분석결과 적색육의 유전자좌위를 나타낸 것이다.
도 3은 ALGA0067099 유전자의 차세대 염기서열분석을 통하여 추가적으로 추출한 염기서열을 나타낸 것이다.
도 4는 육질형질 연관 유전자를 주형으로 한 PCR 산물을 제한효소 HhaⅠ으로 절단하여 육질형질 연관 유전자형을 판독한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 재래돼지와 듀록 교배 축군에서의 모색 출현 양상을 나타낸 것이다.
도 6은 재래돼지와 듀록 교배 집단에서의 흑모색 유전자 좌위를 GWAS를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 재래돼지와 듀록의 흑모색 관련 유전자의 염기서열을 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 재래돼지와 듀록의 흑모색 관련 아미노산 서열을 비교하여 변이된 영역을 나타낸 것이다. 서열 내에 붉은 글씨로 표시한 부분이 변이된 영역이다.
도 9는 MC1R 유전자를 주형으로 한 PCR 산물의 서열로서, 흑모색과 적색 관련 유전자 변이 부분을 붉은 글씨로 나타낸 것이다.
도 10은 MC1R 유전자를 주형으로 한 PCR 산물을 제한효소 HhaⅠ으로 절단하여 흑모색 관련 유전자형을 판독한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 육질형질과 흑모색 유전자 분석용 프라이머를 동시에 넣어 PCR 반응을 통해 증폭시킨 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 PCR 산물을 제한효소로 절단한 양상을 비교하여 육질형질과 흑모색 유전자형을 판단한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 제주재래돼지와 듀록 교배집단 F2에서 육질형질( 근내지방함량 및 육색) 조사 결과

2세대 자손들을 이용하여 근내지방함량 및 육색을 조사하였으며, 2세대 자손의 평균 도출일령은 190일령이었다.

근내지방함량은 실험실에서 고기를 분쇄하여 고기내에서 지방이 차지하는 함량 즉 조지방함량으로 조사를 하였고, 육색(L, a, b, C, H)은 Minolta사에서 제작한 색차계를 이용하여 육색을 측정하였다.

실시예 2. GWAS ( genome - wise association study )를 통한 돼지 육질형질 유전자좌위 분석

제주재래돼지와 듀록 교배 참조축군에서 대용량 SNP chip 을 이용하여 근내지방함량, 적색육에 대한 GWAS (genome-wide association study) 분석을 수행하였다.

구체적으로, illumina에서 상용으로 시판하는 60k SNP Beadchip을 돼지 개수를 대상으로 유전자형을 판독하였으며, 돼지의 모든 염색체를 대상으로 유전자형을 판독하고, 이 유전자형을 가지고 표현형과 연관성 분석에 활용하였다. 이 때, plink 프로그램을 활용하여 각 염색체에 할당되어 있는 SNP와 표현형과의 연관성 분석에 의해 결과를 도출하였다.

상기 분석결과, 육질관련 유전자인 근내지방함량 유전자 및 적색육 연관 유전자가 12번 염색체 상에 존재함을 확인하였다(도 1 및 도 2). 또한, 돼지 육질형질 연관 유의성이 높은 유전자를 검출하였다.

하기 표 2는 근내지방함량 연관 유의성이 높은 유전자들을 나타낸 것이며, 표 3은 적색육 연관 유의성이 높은 유전자들을 나타낸 것이다.

육질형질 중 근내지방함량과 적색육을 결정하는 유전자 좌위는 돼지 12번-염색체 58M 위치에 존재함을 확인하였으며, 이 중 근내지방함량은 ALGA0067099에서 가장 높은 유의성을 나타내었다. ALGA0067099는 적색육에서는 두번째로 높은 유의성을 나타내었으며, 이는 가장 유의성이 높은 것으로 나타난 H3GA0034898와 근연의 거리에 있어, 전체 개체를 살펴보더라도 거의 유전자가 일치하는 결과를 보임에 따라 근내지방함량에서 유의성이 가장 높은 ALGA0067099 유전자의 유전자형만 활용하더라도 근내지방함량과 적색육을 동시에 고정할 수 있는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. 돼지의 육질형질 표현형 연관 ALGA0067099 유전자의 차세대 염기서열분석( Next Generation Sequencing , NGS ) 결과 상에서 염기서열 추가 추출 및 PCR 프라이머의 제작

상기 실시예 2를 통해 육질형질 연관 유전자로 활용성이 높은 것으로 확인한 ALGA0067099 유전자의 차세대 염기서열분석을 통하여 염기서열을 추가적으로 추출하였으며, 추가 추출된 염기서열은 도 3에 나타난 바와 같다.

재래돼지 DNA 샘플을 이용하여 시퀀싱을 수행하였으며, 이 때 시퀀싱은 랜덤(random)하게 진행하였다. 재래돼지 시퀀싱 길이로, 표준지도에서 제시한 돼지의 염기서열은 30억 개의 염기로 구성되어 있는데 이를 최소 30배수를 커버할 수 있는 양으로 염기서열을 해독한 후에 다시 표준지도(현재버전, 10.2)를 대상으로 시퀀싱 데이터를 서로 비교하면서 재래돼지의 유전자별로 염기서열을 재해독하였다.

상기 추가로 추출된 염기 서열을 주형으로 하여, 유전자 증폭을 위한 육질분석용 프라이머를 제작하였다.

정방향 프라이머: 5’-CAT AGC TGA CTC CCC ACA CTG-3’(서열번호 5)

역방향 프라이머: 5’-GCC CTT TCT TCT CAA GTA GCT G-3’(서열번호 6)

도 3에 나타난 서열 중 청색으로 표시한 부분은 프라이머 위치를 나타낸 것이며, 적색으로 표시한 부분은 육질형질을 판단하기 위한 염기변이 부분([G/A])으로서, 이 위치에서 A/A 유전자형은 고육질형을 의미하며, G/A 유전자형은 이형접합체로서 중간 수준의 육질을, G/G 유전자형은 저육질형인 것으로 판단할 수 있었다.

특히, 염기변이 영역은 제한효소 Hha?[GC/GC]의 인지 부위로서 상기 제작한 육질분석용 프라이머를 이용하여 PCR 반응 수행 후 생성된 PCR 산물(크기: 499bp)을 제한효소로 처리할 경우, 제한효소에 의해 229bp와 270bp의 2개의 유전자 단편으로 절단되어 쉽게 유전자형을 판별이 가능하였다.

상기 PCR 반응의 조성물로 DNA 1ul, 10x 버퍼(buffer) 2ul, dNTP 1.5 ul, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1ul씩 넣고, 나머지는 증류수를 넣어 총 20ul의 용량으로 만들었다. PCR 반응 조건으로 94 ℃에서 5분간 denaturation을 수행하고, 94℃에서 1분, 60℃에서 45초, 72℃에서 45초, 35 cycle 반응 후 4℃에서 보관하였다.

생성된 PCR 산물 5 ul, Hha1(제한효소) 0.3 ul, 10x buffer 1 ul, BSA 1 ul 및 증류수 2.7 ul, 총 10 ul를 최소 4시간이상 반응시켜 절단시킨 후 전기영동하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 PCR 산물을 제한효소 HhaⅠ으로 처리하였을 때 일단 절단이 되어 두 개의 단편으로 나타나면 저육질형으로, 절단이 되지 않고 1개의 밴드만 확인되면 고육질형으로, 3개의 밴드가 확인되면 중간정도의 육질형을 보이는 이형접합체로 판단할 수 있었다(도 4).

실시예 4. 제주재래돼지와 듀록 교배집단에서의 흑모색 유전자좌위 분석

제주재래돼지와 듀록 교배집단에서, 듀록의 적색 유전자는 재래돼지의 흑모색 유전자에 대해 완전 열성을 나타내므로, 1세대 자손(F₁)에서는 흑색만 나타나게 되며, 2세대 자손(F₂)에서 흑색과 적색의 비율이 3:1로 나타났다(도 5).

제주재래돼지와 듀록 교배집단에서 대용량 SNP chip 을 이용하여 흑모색에관한 GWAS(genome-wide association study) 분석을 하였으며, 이 결과 흑모색은 6번 염색체의 p-arm에 위치하고 있고, 유전자좌위는 물리지도상에서 5.2M 위치에서 가장 높은 SNP가 있는 것을 확인하였다(도 6).

구체적으로, illumina에서 상용으로 시판하는 60k SNP Beadchip을 활용하여 돼지의 모색 표현형을 대상으로 전 염색체를 대상으로 유의성 검사를 하였으며, 상기 GWAS 분석 결과를 근거로 6번-염색체 5.2M 주변에서 모색관련 후보유전자를 선정한 결과 MC1R과 MBTPS1 2개의 유전자를 확인하였으며, 최종적으로 흑모색 유전자 후보로서 MC1R 유전자를 선정하여 분석하였다.

재래돼지와 듀록에 대한 MC1R 유전자의 complete sequence는 NCBI genbank database에 서열을 등록하였으며(NCBI 등록번호; Acc. No.AY365252, AY520823, AY365250), 이 서열을 기준으로 재래돼지와 듀록, 즉 흑색과 적색을 식별할 수 있는 위치를 확인하여, 도 7에 재래돼지와 듀록의 흑모색 관련 유전자의 염기서열을 비교하여 나타내었으며, 도 8에 재래돼지와 듀록의 흑모색 관련 아미노산 서열을 비교하여 변이된 영역을 나타내었다. 상기 변이된 위치는 단백질 변화가 나타나는 위치로서, 도 8 내에 붉은색 글씨로 표시하였으며, 그 효과를 확인하기 위하여 재래돼지와 듀록 집단 전체를 대상으로 분석용 프라이머를 제작하였다.

MC1R 유전자의 경우 염기서열의 특성상 GC 함량이 약 75~80%를 차지하고 있어 유전자를 증폭하는데는 쉽지 않아 그 영역내에서 Annealing 온도를 60℃ 내외로 설정하여 재현성이 높은 위치에서 프라이머를 제작하였다.

MC1R 정방향 프라이머: 5’-GCT CCA CAA GAC GCA GCA CCC-3’(서열번호 7)

MC1R 역방향 프라이머: 5’-GCC AGA AAG AGG TTG ACG TTC TT-3’(서열번호 8)

MC1R을 주형으로 하고 상기 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행한 결과, 생성된 PCR 산물의 서열을 도 9에 나타내었으며(PCR 산물 크기: 186bp), 흑모색과 적색에 관여하는 유전자 변이 부분을 붉은 글씨로 표시하였다.

생성된 PCR 산물 5 ul, Hha1(제한효소) 0.3 ul, 10x buffer 1 ul, BSA 1 ul 및 증류수 2.7 ul, 총 10 ul를 최소 4시간 이상 반응시켜 절단시킨 후 전기영동하여 확인하였다.

염기변이 영역은 제한효소 Hha?[GC/GC]의 인지 부위로서 상기 실시예 3에서와 마찬가지로 PCR 반응 수행 후 생성된 PCR 산물을 제한효소로 처리할 경우, 제한효소에 의해 단편이 생기게 되며, 흑모색 판단 여부의 경우 절단형(136bp와 50bp, 표현형: 흑모색), 비 절단형(186bp, 표현형: 적색) 및 중간형태(186bp, 136bp 및 50bp, 표현형: 흑모색)의 3가지 형태의 밴드 유형이 나타나는 것을 확인하였다(도 10). 이러한 밴드 유형은 하기 표 4에 정리하였다.

듀록의 적색은 완전열성으로 작용함에 따라 1세대 자손에서는 전수 흑색만, 2세대 자손에서는 흑색과 적색의 모색만 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 흑모색 유전자의 식별과 관련하여, 기초축군에서는 재래돼지와 듀록 품종에 대해 100% 식별이 가능하고, 1세대 자손에서는 이형접합체를, 2세대 자손에서는 흑모색과 적색을 구별할 수 있음에 따라 인위적으로 흑모색을 고정할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. 재래돼지와 듀록의 교배집단에서의 육질형질 및 흑모색의 동시 판단

육질형질 관련 유전자인 ALGA0067099, 흑모색 관련 유전자인 MC1R 유전자 및 상기 실시예 3 및 4에 개시된 육질형질과 흑모색 유전자 분석용 프라이머를 동시에 넣어 PCR 반응을 수행한 후 전기영동을 통해 유전자가 증폭된 것을 확인하였다.

상기 PCR 반응의 조성물로 DNA 1ul, 10x 버퍼(buffer) 2ul, dNTP 1.5 ul, 육질형질 분석용 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 ul씩, 흑모색 분석용 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 ul씩 넣고, 나머지는 증류수를 넣어 총 20ul의 용량으로 만들었다. PCR 반응 조건으로 94 ℃에서 5분간 denaturation을 수행하고, 94℃에서 1분, 60℃에서 45초, 72℃에서 45초, 35 cycle 반응 후 4℃에서 보관하였다.

생성된 PCR 산물 5 ul, Hha1(제한효소) 0.3 ul, 10x buffer 1 ul, BSA 1 ul 및 증류수 2.7 ul, 총 10 ul를 최소 4시간이상 반응시켜 절단시킨 후 전기영동 후 육질형질과 흑모색 동시 진단에 활용할 수 있음을 확인하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 499bp 크기의 밴드 및 186bp 크기의 밴드가 각각 나타났으며, 이는 각각 ALGA0067099를 주형으로 하여 증폭시킨 PCR 산물 및 MC1R 유전자를 주형으로 하여 증폭시킨 PCR 산물을 나타내었다.

또한, 도 12에 나타난 바와 같이, 위쪽에 나타난 3개의 밴드로 육질형질을 평가하고, 아래에 나타난 밴드로 흑모색 유전자인지 여부를 판단하였다.

상기와 같은 실험 결과를 통해, 본 발명자들은 육질관련 유전자와 흑모색 관련 유전자를 동시에 증폭하여 동일한 제한효소로 절단하여 나타난 밴드의 양상을 통해 육질수준 및 흑모색인지 여부를 동시에 판단할 수 있는 방법을 개발하였으며, 이를 이용하여 고육질형 및 제주 재래돼지의 흑모색을 유지할 수 있도록 하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> THE FOUNDATION OF AG. TECH. COMMERCIALIZATION AND TRANSFER <120> Novel SNP marker for discriminating level of meat quality and Black Coat Color of pig and use thereof <130> KPA140495KR <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 999 <212> DNA <213> pig <220> <221> gene <222> (1)..(999) <223> meat quality related gene <400> 1 agtccatttt ccttctcgcc accacagggg ttggattgtt ttccctgagg tgtcccccct 60 ccccccagcc cccaactcac tttttcctct gttatgtgga gccatttagc tccgccttgg 120 acatgcatac ttactcatct ggttactcaa caaaagtcct caagtgagga agctcacttt 180 catccttaga aagtttgggg gccactattt tcaggcacat attccttttg ggggggcctc 240 atctttatcc caccgctatg ccccatagtc catagctgac tccccacact gccgtcctgt 300 cccttccaca tctgagagga agggtgtcca cgagggtttt ctctagtctt gctgtagaat 360 cattttgtca actctaatgc aaagagaact ttagtagtag tatccaaaga agtcaaggga 420 agtggtcttt tcgagagaga agatagaata aaaaagctcc gtggagaagc tggagaaaag 480 gagggccttg ggaagggcac tgggttgatc agagaggtga tcctgacatt gatgtcagca 540 ggatggtggg ggtggaagct ttgaaggcaa ggattaagga gcgagcaggt gtcacagagg 600 aggaaggagc tttcctgatt tccctgggag caaatctctc caccaatcac tgtctaagac 660 gcattcaggg gaaatgcaga gctggatgga gaaagcagtc gcagagccaa ataggcctgg 720 gaaacgagcg gaatcaaggt cattcctcag ctacttgaga agaaagggca attaattgtg 780 ctgatagcag gatccttcct tacccctcac aaccgtcaaa gagcttatgt aacagatgaa 840 atttcagaaa gcagcaagga tttccccagc caggatcaga aatttctggg ccaaagtcac 900 aggacaggta cattaatgaa tgatgacaaa tttatattta atcacaatta aaaattgagt 960 gagaatatta gattctagaa ctagaggagg ccttgaatg 999 <210> 2 <211> 963 <212> DNA <213> Jeju black pig <220> <221> gene <222> (1)..(963) <223> MC1R(Acc.No.AY365252) <400> 2 atgcccgtgc ttggcccgga gaggaggctg ctggcttccc tcagctccgc gcccccagcc 60 gccccccgcc tcgggctggc cgccaaccag accaaccaga cgggccccca gtgcctggag 120 gtgtccattc ccgacgggct cttcctcagc ctggggctgg tgagcctcgt ggagaacgtg 180 ctggtggtgg ccgccatcgc caagaaccgc aacctgcact cgcccatgta ctacttcgtc 240 tgctgcctgg ccgtgtcgga cctgctggtg agcgtgagca acgtgctgga gacggccgtg 300 ctgctgctgc tggaggcggg cgccctggcc gcccaggccg ccgtggtgca gcagctggac 360 aatgtcatgg acgtgctcat ctgcggctcc atggtgtcca gcctctgctt cctgggcgcc 420 atcgccgtgg accgctacgt gtccatcttc tacgcgctgc gctaccacag catcgtgacg 480 ctgccccgcg cggggcgggc catcgcggcc atctgggcgg gcagcgtgct ctccagcacc 540 ctcttcatcg cctactacca ccacacggcc gtcctgctgg gcctcgtcag cttcttcgtg 600 gccatgctgg cgctcatggc ggtactgtac gtccacatgc tggcccgggc ctgccagcac 660 ggccggcaca tcgcccggct ccacaagacg cagcacccca cccgccaggg ctgcggcctc 720 aagggcgcgg ccaccctcac catcctgctg ggcgtcttcc tcctctgctg ggcacccttc 780 ttcctgcacc tctccctcgt cgtcctctgc ccccagcacc ccacctgcgg ctgcgtcttc 840 aggaacgtca acctctttct ggccctcgtc atctgcaact ccatcgtgga ccccctcatc 900 tacgccttcc gcagccagga gctccgcaag accctccagg aggtgctgca gtgctcctgg 960 tga 963 <210> 3 <211> 963 <212> DNA <213> Jeju black pig <220> <221> gene <222> (1)..(963) <223> MC1R (Acc. No.AY520823) <400> 3 atgcccgtgc ttggcccgga gaggaggctg ctggcttccc tcagctccgc acccccagcc 60 gccccccgcc tcgggctggc cgccaaccag accaaccaga cgggccccca gtgcctggag 120 gtgtccattc ccgacgggct cttcctcagc ctggggctgg tgagcctcgt ggagaacgtg 180 ctggtggtgg ccgccatcgc caagaaccgc aacctgcact cgcccatgta ctacttcgtc 240 tgctgcctgg ccgtgtcgga cctgctggtg agcgtgagca acatgctgga gacggccgtg 300 ctgccgctgc tggaggcggg cgccctggcc gcccaggccg ccgtggtgca gcagctggac 360 aacgtcatgg acgtgctcat ctgcggctcc atggtgtcca gcctctgctt cctgggcgcc 420 atcgccgtgg accgctacgt gtccatcttc tacgcgctgc gctaccacag catcgtgacg 480 ctgccccgcg cggggcgggc catcgcggcc atctgggcgg gcagcgtgct ctccagcacc 540 ctcttcatcg cctactacca ccacacggcc gtcatgctgg gcctcgtcag cttcttcgtg 600 gccatgctgg cgctcatggc ggtactgtac gtccacgtgc tggcccgggc ctgccagcac 660 ggccggcaca tcgcccggct ccacaagacg cagcacccca cccgccaggg ctgcggcctc 720 aagggcgcgg ccaccctcac catcctgctg ggcgtcttcc tcctctgctg ggcacccttc 780 ttcctgcacc tctccctcgt cgtcctctgc ccccagcacc ccacctgcgg ctgcgtcttc 840 aagaacgtca acctctttct ggccctcgtc atctgcaact ccatcgtgga ccccctcatc 900 tacgccttcc gcagccagga gctccgcaag accctccagg aggtgctgca gtgctcctgg 960 tga 963 <210> 4 <211> 963 <212> DNA <213> Duroc <220> <221> gene <222> (1)..(963) <223> MC1R(Acc. No. AY365250) <400> 4 atgcccgtgc ttggcccgga gaggaggctg ctggcttccc tcagctccgc gccccgagcc 60 gccccccgcc tcgggctggc cgccaaccag accaaccaga cgggccccca gtgcctggag 120 gtgtccattc ccgacgggct cttcctcagc ctggggctgg tgagcctcgt ggagaacgtg 180 ctggtggtgg ccgccatcgc caagaaccgc aacctgcact cgcccatgta ctacttcgtc 240 tgctgcctgg ccgtgtcgga cctgctggtg agcgtgagca acgtgctgga gacggccgtg 300 ctgctgctgc tggaggcggg cgccctggcc gcccaggccg ccgtggtgca gcagctggac 360 aatgtcatgg acgtgctcat ctgcggctcc atggtgtcca gcctctgctt cctgggcgcc 420 atcgccgtgg accgctacgt gtccatcttc tacgcgctgc gctaccacag catcgtgacg 480 ctgccccgcg tggggcgggc catcgcggcc atctgggcgg gcagcgtgct ctccagcacc 540 ctcttcatcg cctactacca ccacacggcc gtcctgctgg gcctcgtcag cttcttcgtg 600 gccatgctgg cgctcatggc ggtactgtac gtccacatgc tggcccgggc ctgccagcac 660 ggccggcaca tcgcccggct ccacaagacg cagcacccca cccgccaggg ctgcggcctc 720 aagggcacgg ccaccctcac catcctgctg ggcgtcttcc tcctctgctg ggcacccttc 780 ttcctgcacc tctccctcgt cgtcctctgc ccccagcacc ccacctgcgg ctgcgtcttc 840 aagaacgtca acctctttct ggcccccgtc atctgcaact ccatcgtgga ccccctcatc 900 tacgccttcc gcagccagga gctccgcaag accctccagg aggtgctgca gtgctcctgg 960 tga 963 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ALGA0067099 gene <400> 5 catagctgac tccccacact g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ALGA0067099 gene <400> 6 gccctttctt ctcaagtagc tg 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R forward primer <400> 7 gctccacaag acgcagcacc c 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MC1R reverse primer <400> 8 gccagaaaga ggttgacgtt ctt 23

Claims

(a) 서열번호 1로 이루어지는 육질형질 연관 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커; 및
(b) 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 돼지의 육질형질은 돼지육의 근내지방함량, 육색, 보수력 및 전단력으로 구성된 군으로부터 선택되는 형질인 것인, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제제는 서열번호 1로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 및
서열번호 2 또는 서열번호 3으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프라이머쌍을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서,
서열번호 1로 이루어지는 육질형질 연관 유전자 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커는 돼지의 육질형질 수준 판단용 SNP 마커인, 조성물.
제1항에 있어서,
서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커는 돼지의 흑모색 판단용 SNP 마커인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인, 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 키트.
제7항에 있어서,
상기 키트는 Multi-plexing PCR 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 키트.
(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 제1항의 서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드 및 제3항의 서열번호 2 내지 서열번호 4 중 어느 하나로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위를 증폭시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색을 동시에 판단하는 방법.
제9항에 있어서,
서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 499번째 염기의 대립유전자가 A/A 인 경우 돼지의 돼지의 육질형질 수준이 높은 것이며,
서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기의 대립유전자가 G/G 또는 G/A 형인 경우, 돼지가 흑모색을 갖는 것으로 판단하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인, 방법.
돼지의 육질형질 및 흑모색에 관여하는 유전자의 SNP 형질을 고정시키는 단계로서,
서열번호 1로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 499 번째 염기를 A로 고정시키는 단계; 및
서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 G 로 고정시키거나, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 G 로 고정시키거나, 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 G 로 고정시키는 단계를 포함하는, 품질이 향상된 흑모색 돼지의 제조방법.
제12항에 있어서,
상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인, 방법.
제12항에 있어서, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인, 방법.
서열번호 1로 이루어지는 육질형질 연관 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 판단용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인, 조성물.
서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는, 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 흑모색 판단용 조성물.
제17항에 있어서, 상기 돼지는 제주재래돼지, 듀록 또는 제주재래돼지 및 듀록의 교잡종인, 조성물.
서열번호 1로 이루어지는 육질형질 연관 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 499번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 499 번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커; 및
서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기가 G 또는 A 이며, 상기 서열번호 2로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기, 서열번호 3으로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기 또는 서열번호 4로 이루어지는 MC1R 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 727 번째 염기를 포함하는, 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드인 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 육질형질 수준 및 흑모색 동시 판단용 마이크로어레이.