KR101823372B1

KR101823372B1 - 우리흑돈 품종 식별용 snp 마커 및 이를 이용한 우리흑돈 품종 식별 방법

Info

Publication number: KR101823372B1
Application number: KR1020160135355A
Authority: KR
Inventors: 홍준기; 김용민; 조규호; 박준철; 조은석; 우제석; 김두완; 김학수; 안홍원; 김상운; 안홍순
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-10-18
Filing date: 2016-10-18
Publication date: 2018-01-30

Abstract

본 발명은 돼지 개체 식별용 SNP 마커 및 이를 이용한 돼지 개체 식별 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 우리흑돈 품종의 판별을 위한 돼지 개체 식별 방법, 돼지 개체 식별 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

우리흑돈 품종 식별용 SNP 마커 및 이를 이용한 우리흑돈 품종 식별 방법{SNP Makers for Identification of WooriHeukDon Porcine and Method for Identifying WooriHeukDon Porcine using the same}

본 발명은 돼지 개체 식별용 SNP 마커 및 이를 이용한 돼지 개체 식별방법에 관한 것으로, 구체적으로는 우리흑돈 품종의 판별을 위한 돼지 개체 식별방법, 돼지 개체 식별용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다.

최근에는 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵고, 브랜드화된 돼지와 브랜드화되지 않은 돼지육을 구별하는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로서, 돼지육의 유전자를 분석하여 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 방법이 개발되었는데, 예를 들어 PCR 기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 및 SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 등의 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법에 대해 활발한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제0721232호에서는 대한민국내 주요 돼지 품종의 순종 식별을 위한 품종특이 DNA marker의 활용에 대해 개시되어 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 유엔식량농업기구(FAO)의 가축다양성정보시스템에 등재된 돼지 품종인 우리흑돈(WooriHeukDon)이 다른 품종으로부터 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본원의 제 1 측면은 돼지 개체 식별 방법을 제공하기 위한 것이다.

본원의 제 2 측면은, 돼지 개체 식별용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 조성물을 포함하는 돼지 개체 식별용 키트를 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 돼지(porcine)로 분리된 시료의 핵산으로부터 (a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 8번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 16번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (c) 서열번호 3로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 및 (e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 2번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 다른 실시형태는 (a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 8번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 16번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (c) 서열번호 3로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 및 (e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 2번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 조성물을 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 조성물을 포함하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 키트를 제공할 수 있다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명에 따르면 돼지 개체 식별 방법, 돼지 개체 식별용 조성물 및 돼지 개체 식별용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명에 의하면, 특정 돼지 집단 (우리흑돈 품종)에 변별력을 가지는 돼지 유전체 내에 존재하는 5종의 SNP 마커를 분석함으로써, 분석 대상인 돼지 개체가 우리흑돈 품종인지 여부를 높은 정확도로 판별할 수 있다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다.

그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 돼지(porcine)로 분리된 시료의 핵산으로부터 (a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 8번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 16번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (c) 서열번호 3로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 2번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 개체 식별 방법을 제공할 수 있다.

상기 (a)에 따른 SNP는 ASGA0037952 마커로서, 돼지 8번 염색체의 17,252,526 번째 위치에 존재한다(G 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 8번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다.

상기 (b)에 따른 SNP는 ALGA0089191 마커로서, 돼지 16번 염색체의 14,289,697 번째 위치에 존재한다(G 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 16번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 2로 나타내었다.

상기 (c)에 따른 SNP는 ASGA0023488 마커로서, 돼지 4번 염색체의 141,823,043 번째 위치에 존재한다(A 또는 G). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 4번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 3로 나타내었다.

상기 (d)에 따른 SNP는 ALGA0029695 마커로서, 돼지 4번 염색체의 142,384,587 번째 위치에 존재한다(C 또는 T). 상기 SNP부위를 포함하고 있는 돼지 4번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 4로 나타내었다.

상기 (e)에 따른 SNP는 ALGA0011914 마커로서, 돼지 2번 염색체의 10,509,129 번째 위치에 존재한다(C 또는 T). 상기 SNP부위를 포함하고 있는 돼지 2번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 5로 나타내었다.

본 발명에 따르면 (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (d)의 SNP유전자형이 TT이고, 및 (e)의 SNP의 유전자형이 CC인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것으로, 구체적으로는 우리흑돈 품종에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.

위와 같은 돼지 유전체 내 5종의 SNP의 고정 유전자형은 우리흑돈 품종 돼지에서 차별화되는 마커로서, 상기 고정 유전자형의 조합을 가지는 돼지 개체는 우리흑돈 품종임을 높은 정확도로 판별할 수 있다.

본 명세서에서, “우리흑돈”이라 함은 두록(Duroc)과 한국재래돼지(Korean native pig)의 교배에 의하여 생산된 합성돈이다. 구체적으로는, 두록 암컷과 한국재래돼지 수컷을 교배시켜서 얻은 잡종1세대 암컷과, 두록 수컷을 퇴교배하여 잡종2세대 암컷을 얻고, 상기 얻은 잡종2세대 암컷과 상기 잡종1세대 수컷을 퇴교배하여 얻은 합성돈이다. 우리흑돈은 두록의 장점(성장형질이 우수)과 한국재래돼지의 장점(육질형질이 우수)만을 가지는 합성돈이다. 우리흑돈은 MC4R 유전자 내의 Asp298Asn 단일염기변이로서 A(Asn) 대립유전자를 가질 수 있고, PRKAG3 유전자에서 ATG 시작코돈을 기준으로 1846번째 염기로서 G를 가지고 있는 것일 수 있으며, KIT 유전자에서 586번째 염기로서 T를 가지고 있는 것이 가능하다. 우리흑돈의 더욱 상세한 정의 및 생산방법은 대한민국 특허출원 10-2015-0058980에 기재된 바와 같다. 우리흑돈은 두록의 우수한 성장형질과 한국재래돼지의 우수한 육질형질을 모두 보유하는 합성돈으로, FAO에서 운영하는 가축 다양성 정보시스템(http://dad.fao.org)에서 국제적으로 하나의 품종으로 인정받은바 있다.

본 명세서에서 "두록"이라 함은 돼지의 두록(Duroc) 또는 두록 종을 의미하는 것으로, 두록저어지(Duroc jersey) 종 또는 한국의 축진듀록을 포함하는 개념이다. 상기 두록저어지는 원산지가 미국이고 모색이 담홍색에서 농적색에 이르기까지 다양하며 대형종에 속하는 돼지의 한 종이다. 머리는 비교적 작고 안면이 약간 오목하나 직선에 가까우며, 귀는 앞쪽으로 직립되어 있지만 그 끝이 아래로 처져 있는 것이 특징이다. 상기 축진듀록은 국립축산과학원이 자체 개발한 두록 품목의 상표명으로서 축산업을 진흥시킨다는 의미를 갖고 있다. 상기 축진듀록은 소비자의 수요 및 수입 돈육과의 차별화를 위한 씨돼지 개발 요구에 따라 개발되었다. 상기 축진듀록은 1997년 완성되었으며 1998년부터 계통 조성을 시작해 2008년 특허청 상표 등록을 마쳤고, 이후 전국 우수돼지인공수정센터에 보급돼 돼지고기를 생산하는 데 주로 활용되고 있다. 일반 두록종은 다른 종과 비교하여 성장률, 성장속도 등이 우수하고, 축진듀록은 일반 두록종과 비교했을 때 육질이 더욱 우수한 특징을 가지고 있다.

또한, 본 명세서에서 "한국재래돼지"라 함은 한반도에서 서식하는 돼지의 한 품종으로서, 소목 멧돼짓과의 포유류이다. 일반적으로 모색은 흑모, 지체가 흑색이고, 머리는 길고 뾰족하며, 이마에 산 모양의 주름이 있고, 코는 길고 곧으며 세로 줄음이 있고, 턱은 곧으며, 귀는 직립전향인 개체로 정의되고 있다. 상기 한국재래돼지는 일반적인 재래돼지, 흑돼지, 제주재래흑돼지 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 "합성돈"이라 함은 서로 다른 종족이나 종, 속, 혹은 품종 간의 교잡에 의하여 태어난 자손 돼지를 포함하는 개념이다. 단순한 잡종돈 뿐만 아니라 능력이 유전적으로 고정된 품종이나 계통간의 교배로 생산된 종돈(하이브리드돈)을 의미할 수도 있고, 세가지 이상의 서로 다른 여러 품종을 교배시켜 육종한 종돈인 것도 가능하다. 이러한 합성돈은 고정된 유전적인 능력을 보이며, 한편으로는 새로운 품종처럼 사용할 수도 있다.

돼지 개체 식별에 사용되는 상기 시료로는 털, 뇨, 혈액, 정액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않을 수 있다.

상기 핵산으로부터 본 발명의 SNP 마커의 염기를 결정하는 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 SNP의 유전자형 확인은 시퀀싱 분석, 자동 염기서열 분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 방법은, 상기 SNP 부위의 염기를 결정하는 단계 이후에, 결정된 염기 정보를 바탕으로 검체 대상인 돼지가 관심 집단에 속하는지 여부를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

돼지의 시료를 분석하여 상기 SNP 부위의 염기를 결정한 후, (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (d)의 SNP유전자형이 TT이고, 및 (e)의 SNP의 유전자형이 CC인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것으로, 즉 우리흑돈 품종에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.

즉, 본 발명의 방법은 우리흑돈 품종의 돼지를 식별하기 위한 방법을 포함할 수 있으며, 상기 우리흑돈 품종의 돼지는 두록(Duroc)과 한국재래돼지(Korean native pig)를 교배시켜서 얻은 돼지일 수 있다. 우리흑돈은 두록의 우수한 성장형질과 한국재래돼지의 우수한 육질형질을 모두 보유하는 합성돈으로, FAO에서 운영하는 가축 다양성 정보시스템(http://dad.fao.org)에서 국제적으로 하나의 품종으로 인정받은바 있다.

본 발명은 (a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 8번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 16번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (c) 서열번호 3로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; (e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 2번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 개체 식별용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (e) 의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (e) 의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 10 개 이상일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 100 개, 10 내지 80 개, 10 내지 60 개 또는 10 내지 40 개의 연속 염기로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"이란 다형성(polymorphism; 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우) 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 의미한다. SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, (a) 내지 (e) 중 하나 이상의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브일 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific)이다.

본 명세서에서 사용된 용어, 대립형질 특이적(allele-specific)이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화 하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화 하는 것을 의미한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1 M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 15 내지 30 개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 돼지 개체를 식별하여 우리흑돈 품종인지 여부를 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 돼지의 둘 이상의 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 목적 품종의 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 품종의 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화 되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 돼지 개체를 식별하여 우리흑돈 품종인지 여부를 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 방법은 우리흑돈 품종의 돼지를 식별하는 데에 사용될 수 있으며, 상기 우리흑돈 품종의 돼지는 두록(Duroc)과 한국재래돼지(Korean native pig)를 교배시켜서 얻은 돼지일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지 개체 식별용 키트이다.

본 발명의 키트는 돼지 개체의 유전체 내의 SNP 마커를 확인함으로써 돼지의 품종이 우리흑돈 품종인지 여부를 판별하는데에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 PCR 키트, DNA 분석용(예컨대, DNA 칩) 키트 또는 마이크로어레이 키트로 구현될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 키트에는 돼지 개체 식별용 SNP 마커를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는 상기 SNP 에 특이적인 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지 개체 식별용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 상기 SNP에 특이적인 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 SNP에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고, 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

즉, 본 발명의 키트는 우리흑돈 품종의 돼지를 식별하는 데에 사용될 수 있으며, 상기 우리흑돈 품종의 돼지는 두록(Duroc)과 한국재래돼지(Korean native pig)를 교배시켜서 얻은 돼지일 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예]

유전자형 분석을 위한 실험동물 확보 및 유전체 DNA 분리

실험의 유전자형 분석을 위하여 DNA 시료는 서로 다른 4개 품종에서 씨돼지 2,732두(우리흑돈 208두, 두록 519, 랜드레이스 1,041두, 요크셔 964두)를 활용하였다. 공시축의 유전체 DNA는 개체의 경정맥에서 채혈하였고, 유전체 DNA분리 및 정제는 Genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 방법을 약간 변형하여 분리 하였다(Promega, Madison, WI, USA). 분리 후 Nano Drop 100(BioTeck instuments, USA)를 이용하여 DNA농도를 측정한 후 TE buffer(10 mM, Tris-Hcl, pH 7.4; 1 mM EDTA)에 용해하여 냉동고에 보존하면서 실험에 이용하였다.

유전자형 분석 및 품질관리(quality control)

총 2,732두의 혈액샘플로부터 추출하여 정량된 genomic DNA 총 200 ng/㎕와 PorcineSNP60 v2 BeadChip (Illumina)를 사용하여 61,565 SNP에 대한 유전자형을 분석하였으며, SNP filtering과정은 PLINK software 1.07을 이용하였다. 1번부터 18번까지의 상염색체 내에 존재하고 전체 품종 공통적으로 genotyping error가 없는 SNP만을 선별하여, 총 23,242개의 SNP를 선발하였다.

유전자형 빈도 계산 및 고정화 SNP 선정

PLINK 1.07 software를 이용하여 2,732두에 대한 대립유전자 빈도를 계산하였으며, 유전자형 빈도는 (대립유전자 빈도)²으로 계산하여 4종류(AA, TT, GG, CC)의 유전자형 빈도를 계산하였다. 유전자형 빈도를 바탕으로 WooriHeukDon은 특정 유전자형에 대해 동형접합 확률이 99%이상으로 고정화되어 있지만, 타 품종의 경우 고정화가 되지 않은(동형접합 확률 70% 이하) SNP 5개를 선정하였다.

SNP 마커를 이용한 우리흑돈 판별

위에서 선정된, 우리흑돈 품종을 판별할 수 있는 5개의 SNP 유전자형을 아래 표 1와 같이 확보하였다.

우리흑돈 품종의 판별방식은 표 1에 기재된 5개의 고정유전자형이 판별하고자 하는 개체에서 5개가 모두 일치하면 우리흑돈 품종으로 판별할 수 있다. 우리흑돈 품종이 아닌 타 품종에서 5개의 마커가 고정될 확률은 Duroc 품종의 경우 1%, Landrace품종의 경우 0%, Yorkshire 품종의 경우 0%로 저조하여, 본 기술에서 선별한 SNP 마커를 이용한 우리흑돈 품종의 판별방법은 약 99% 내지 100%의 높은 정확성을 가진다.

우리흑돈 품종의 판별을 위해 사용되는 고정된 SNP 마커 정보는 아래의 표 2에 나타나 있다.

상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP Makers for Identification of WooriHeukDon Porcine and Method for Identifying WooriHeukDon Porcine using the same <130> PA-D16386 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes G or T <400> 1 tgtttgacat caaacagacc taggcygaac tcagcactaa ctaaatttgt c 51 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes G or T <400> 2 ggttcaatcc ctggccttgc tcagtyggtt aagcatctgg ggttaccaaa g 51 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or G <400> 3 gccacactaa agctaaggtt acatkycggt gctatcaatt cactcagttc a 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 4 agtcccgccc cagctgtttg ctctcyggtg acttcacgca gctgtcgtgt g 51 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 5 ctgggggtgg caggctggct gggctyatga gtcctgagct gactgagggg a 51

Claims

돼지(porcine)로 부터 분리된 시료의 핵산으로부터
(a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 8번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
(b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 16번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
(c) 서열번호 3로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
(d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 및
(e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 2번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별 방법.
제 1 항에 있어서, (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (d)의 SNP유전자형이 TT이고, 및 (e)의 SNP의 유전자형이 CC인 경우 돼지 개체가 우리흑돈 품종에 속하는 것으로 판단하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 돼지로부터 분리된 시료는 털, 뇨, 혈액, 정액, 조직, 세포 또는 타액을 포함하는 것인, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별 방법.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 우리흑돈 품종의 돼지는 두록(Duroc)과 한국재래돼지(Korean native pig)를 교배시켜서 얻은 돼지인, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별 방법.
돼지(porcine)로 부터 분리된 시료의 핵산으로부터
(a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 8번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
(b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 16번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
(c) 서열번호 3로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
(d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치; 및
(e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 2번 염색체 유래 핵산 서열의 26번째 위치;
에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (e)의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것인, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (e)의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브를 포함하는 것인, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 조성물.
삭제
제 6 항에 있어서, 상기 우리흑돈 품종의 돼지는 두록(Duroc)과 한국재래돼지(Korean native pig)를 교배시켜서 얻은 돼지인, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 조성물.
제 6 항, 제 7 항, 제 8 항 또는 제 10 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 우리흑돈 품종의 돼지 개체 식별용 키트.