KR101821556B1 - 다비 두록 품종 식별용 ｓｎｐ 마커 및 이를 이용한 다비 두록 품종 식별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지 개체 식별용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 돼지 개체 식별 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 다비 두록 품종의 판별을 위한 돼지 개체 식별 방법, 돼지 개체 식별용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

다비 두록 품종 식별용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 다비 두록 품종 식별 방법{SNP Markers for Identification of Darby Duroc Porcine and Method for Identifying Darby Duroc Porcine using the same}

본 발명은 돼지 개체 식별용 ＳＮＰ 마커 및 이를 이용한 돼지 개체 식별 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 다비 두록 품종의 판별을 위한 돼지 개체 식별 방법, 돼지 개체 식별용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다.

최근에는 돼지육의 품질을 제고하기 위하여, 돼지를 일정한 규격에서 사육하고 과학적으로 관리하고, 이로부터 얻어진 돼지육을 브랜드화하고 있으며, 이미 다양한 브랜드의 돼지육이 상업적으로 판매되고 있다. 그러나, 이처럼 브랜드화된 돼지육과 브랜드화되지 않은 돼지육은 일반인이 육안으로 식별하기 어렵고, 브랜드화된 돼지와 브랜드화되지 않은 돼지육을 구별하는 것은 전문가의 수준에서도 매우 어려운 일이기 때문에, 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 객관적인 기준을 마련하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로서, 돼지육의 유전자를 분석하여 정품 브랜드의 돼지육을 판단하는 방법이 개발되었는데, 예를 들어 PCR 기술을 이용하는 RAPD(random amplified polymorphic DNA) 및 SSCP(single strand conformation polymorphisms) 기법 등의 다양한 DNA 분석기법을 이용하여 돼지육의 품종을 판별하는 방법에 대해 활발한 연구가 이루어지고 있다. 예를 들어, 대한민국 등록특허 제0721232호에서는 대한민국내 주요 돼지 품종의 순종 식별을 위한 품종특이 DNA marker의 활용에 대해 개시되어 있다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 유엔식량농업기구(FAO)의 가축다양성정보시스템에 등재된 돼지 품종인 다비 두록(Darby Duroc)이 다른 브랜드의 두록 품종으로부터 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 가진다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본원의 제 1 측면은 돼지 품종 식별 방법을 제공하기 위한 것이다.

본원의 제 2 측면은, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본원의 제 3 측면은, 본원의 제 2 측면에 따른 조성물을 포함하는 돼지 다비 두록 품종 식별용 키트를 제공하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 돼지(porcine)로부터 분리된 시료의 핵산으로부터 a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 20 번째 위치; b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 21 번째 위치; c) 서열번호 3으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; f) 서열번호 6으로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; g) 서열번호 7로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; h) 서열번호 8으로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; i) 서열번호 9로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; 및 j) 서열번호 10으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 14 번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지 품종 식별 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시형태는 a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 20 번째 위치; b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 21 번째 위치; c) 서열번호 3으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; f) 서열번호 6으로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; g) 서열번호 7로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; h) 서열번호 8로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; i) 서열번호 9로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; 및 j) 서열번호 10으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 14 번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물을 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명의 또 다른 실시형태는 상기 조성물을 포함하는 돼지 다비 두록 품종 식별용 키트를 제공할 수 있다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명에 따르면 돼지 품종 식별 방법, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물 및 돼지 다비 두록 품종 식별용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명에 의하면, 특정 돼지 집단 (다비 두록 품종)에 변별력을 가지는 돼지의 유전체 내에 존재하는 10 종 내지 17 종의 SNP 마커를 분석함으로써, 분석 대상인 돼지 개체가 다비 두록 품종인지 여부를 높은 정확도로 판별할 수 있다.

도 1은 본원의 실시예에 따른 브랜드별 두록 씨돼지 집단의 주성분분석(PCA) 결과를 나타내는 이미지이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 돼지(porcine)로부터 분리된 시료의 핵산으로부터 a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 20 번째 위치; b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 21 번째 위치; c) 서열번호 3으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; f) 서열번호 6으로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; g) 서열번호 7로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; h) 서열번호 8로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; i) 서열번호 9로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; 및 j) 서열번호 10으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 14 번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는 돼지 품종 식별 방법을 제공할 수 있다.

상기 a)에 따른 SNP는 DRGA0004087 마커로서, 돼지 3 번 염색체의 104,827,510 번째 위치에 존재한다 (T 또는 C). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 3 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 1로 나타내었다.

상기 b)에 따른 SNP는 DRGA0004096 마커로서, 돼지 3 번 염색체의 105,029,466 번째 위치에 존재한다 (A 또는 G). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 3 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 2로 나타내었다.

상기 c)에 따른 SNP는 H3GA0056153 마커로서, 돼지 6 번 염색체의 2,568,290 번째 위치에 존재한다 (A 또는 C). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 6 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 3으로 나타내었다.

상기 d)에 따른 SNP는 WU_10.2_18_12213290 마커로서, 돼지 18 번 염색체의 12,213,290 번째 위치에 존재한다 (A 또는 G). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 18 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 4로 나타내었다.

상기 e)에 따른 SNP는 ALGA0082753 마커로서, 돼지 14 번 염색체의 145,305,752 번째 위치에 존재한다 (A 또는 C). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 14 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 5로 나타내었다.

상기 f)에 따른 SNP는 WU_10.2_18_12206052 마커로서, 돼지 18 번 염색체의 12,206,052 번째 위치에 존재한다 (C 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 18 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 6으로 나타내었다.

상기 g)에 따른 SNP는 ALGA0024008 마커로서, 돼지 4 번 염색체의 22,654,498 번째 위치에 존재한다 (A 또는 G). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 4 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 7로 나타내었다.

상기 h)에 따른 SNP는 ALGA0008929 마커로서, 돼지 1 번 염색체의 274,396,437 번째 위치에 존재한다 (C 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 1 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 8로 나타내었다.

상기 i)에 따른 SNP는 ALGA0018376 마커로서, 돼지 3 번 염색체의 31,543,700 번째 위치에 존재한다 (A 또는 C). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 3 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 9로 나타내었다.

상기 j)에 따른 SNP는 ASGA01011722 마커로서, 돼지 6 번 염색체의 18,635,892 번째 위치에 존재한다 (G 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 6 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 10으로 나타내었다.

본 발명에 따르면, (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 AA이고, (d)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (e)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (f)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (g)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (h)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (i)의 유전자형이 AA이고, (j)의 유전자형이 GG인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것으로, 구체적으로는 다비 두록 품종에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또한, k) 서열번호 11로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; l) 서열번호 12로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; m) 서열번호 13으로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; n) 서열번호 14로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; o) 서열번호 15로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; p) 서열번호 16으로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 22 번째 위치; 및 q) 서열번호 17로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 더 포함하는 돼지 품종 식별 방법을 제공할 수 있다.

상기 k)에 따른 SNP는 ASGA0014191 마커로서, 돼지 3 번 염색체의 34,132,522 번째 위치에 존재한다 (C 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 3 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 11로 나타내었다.

상기 l)에 따른 SNP는 WU_10.2_1_307718072 마커로서, 돼지 1 번 염색체의 307,718,072 번째 위치에 존재한다 (A 또는 G). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 1 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 12로 나타내었다.

상기 m)에 따른 SNP는 INRA0045124 마커로서, 돼지 14 번 염색체의 85,454,695 번째 위치에 존재한다 (A 또는 C 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 14 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 13으로 나타내었다.

상기 n)에 따른 SNP는 INRA0045117 마커로서, 돼지 14 번 염색체의 85,235,841 번째 위치에 존재한다 (C 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 14 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 14로 나타내었다.

상기 o)에 따른 SNP는 ALGA0018467 마커로서, 돼지 3 번 염색체의 34,622,458 번째 위치에 존재한다 (C 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 3 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 15로 나타내었다.

상기 p)에 따른 SNP는 DRGA0014290 마커로서, 돼지 14 번 염색체의 101,566,065 번째 위치에 존재한다 (A 또는 G). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 14 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 16으로 나타내었다.

상기 q)에 따른 SNP는 WU_10.2_4_133040587 마커로서, 돼지 4 번 염색체의 133,040,587 번째 위치에 존재한다 (G 또는 T). 상기 SNP 부위를 포함하고 있는 돼지 4 번 염색체의 일부 염기서열을 서열번호 17로 나타내었다.

본 발명에 따르면, 상기 (a) 내지 (j)의 유전자형 외에도, (k)의 유전자형이 TT이고, (l)의 유전자형이 AA이고, (m)의 유전자형이 CC이고, (n)의 유전자형이 CC이고, (o)의 유전자형이 TT이고, (p)의 유전자형이 GG이고, (q)의 유전자형이 GG인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것으로, 구체적으로는 다비 두록 품종에 해당하는 것으로 판단할 수 있다.

위와 같은 돼지 유전체 내 (a) 내지 (j)의 10 종의 SNP의 고정 유전자형은 다비 두록 품종 돼지에서 차별화되는 마커로서, 상기 고정 유전자형의 조합을 가지는 돼지 개체는 다비 두록 품종임을 높은 정확도로 판별할 수 있다. 특히, 상기 (a) 내지 (q)의 17 종의 SNP 고정 유전자형 모두를 이용할 경우 매우 높은 정확도로 돼지 개체가 다비 두록 품종임을 판별할 수 있다.

돼지 개체 식별에 사용되는 상기 시료로는 털, 뇨, 혈액, 정액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않을 수 있다.

상기 핵산으로부터 본 발명의 SNP 마커의 염기를 결정하는 방법은 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 SNP의 유전자형 확인은 시퀀싱 분석, 자동 염기서열 분석기를 사용한 시퀀싱 분석, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 마이크로어레이에 의한 혼성화, PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCR-SSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법, 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 방법은, 상기 SNP 부위의 염기를 결정하는 단계 이후에, 결정된 염기 정보를 바탕으로 검체 대상인 돼지가 관심 집단에 속하는지 여부를 판별하는 단계를 포함할 수 있다.

돼지의 시료를 분석하여 상기 SNP 부위의 염기를 결정한 후, (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 AA이고, (d)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (e)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (f)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (g)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (h)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (i)의 유전자형이 AA이고, (j)의 유전자형이 GG인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것, 즉 다비 두록 품종인 것으로 판단할 수 있다.

추가적으로, (k)의 유전자형이 TT이고, (l)의 유전자형이 AA이고, (m)의 유전자형이 CC이고, (n)의 유전자형이 CC이고, (o)의 유전자형이 TT이고, (p)의 유전자형이 GG이고, (q)의 유전자형이 GG인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것, 즉 다비 두록 품종인 것으로 극히 높은 정확도로 판단할 수 있다.

즉, 본 발명의 방법은 다비 두록 품종의 돼지를 식별하기 위한 방법을 포함할 수 있으며, 상기 다비 두록 품종의 돼지는 경상남도 거창군의 원산종돈 농장에서 사육된 돼지일 수 있다.

원산종돈 농장은 경상남도 거창군 신원면 덕산리 산1475-4에 위치하며, 다비 두록 품종의 돼지가 사육되고 있다. 다비 두록은 세계적으로 부계종돈으로 활용되는 두록 품종을 2000 년에 집단을 조성하고 농장 고유의 혈통과 능력 자료를 바탕으로 선발하여 국내 토착화 시킨 품종이다. 선발과 계통조성으로 꾸준히 모돈 200 두 이상의 규모를 유지하여 FAO에서 운영하는 가축 다양성 정보시스템(http://dad.fao.org/, NHBG-Duroc)에서 국제적으로 하나의 두록 계통으로 인정받은 바 있다.

본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 20 번째 위치; b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 21 번째 위치; c) 서열번호 3으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; f) 서열번호 6으로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; g) 서열번호 7로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; h) 서열번호 8로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; i) 서열번호 9로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; 및 j) 서열번호 10으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 14 번째 위치에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (j) 의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (j) 의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열을 가진다. 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 10 개 이상일 수 있으며, 예를 들어 10 내지 100 개, 10 내지 80 개, 10 내지 60 개 또는 10 내지 40 개의 연속 염기로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)"이란 다형성(polymorphism; 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우) 부위 중에서 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 의미한다. SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, (a) 내지 (j) 중 하나 이상의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머, 또는 상기 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브일 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 대립형질 특이적(allele-specific)이다.

본 명세서에서 사용된 용어, “대립형질 특이적(allele-specific)”이란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화 하는 것, 즉, 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화 하는 것을 의미한다. 여기에서, 혼성화란 보통 엄격한 조건, 예를 들어 1 M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도 하에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 15 내지 30 개의 염기로 구성된다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 DNA 서열에 혼성화하여 다형성 부위를 포함하는 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 프라이머는 대립형질을 검출하여 돼지 개체를 식별하여 다비 두록 품종인지 여부를 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 대립형질 특이적 프로브는 돼지의 둘 이상의 개체로부터 유래한 핵산 단편 중에서 다형성 부위가 존재하여, 목적 품종의 개체로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 품종의 개체로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않을 수 있다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여 대립형질 중 하나에만 혼성화 되도록 충분히 엄격해야 한다. 이러한 본 발명의 프로브는 중앙 부위가 다형성 서열의 다형성 부위와 정렬하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 서로 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 프로브는 대립형질을 검출하여 돼지 개체를 식별하여 다비 두록 품종인지 여부를 판별하기 위한 마이크로어레이 등의 키트나 예측 방법 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

즉, 본 발명의 조성물은 다비 두록 품종의 돼지를 식별하는 데에 사용될 수 있으며, 상기 다비 두록 품종의 돼지는 경상남도 거창군의 원산종돈 농장에서 사육된 돼지일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시 형태는, 본 발명의 조성물을 포함하는 돼지 다비 두록 품종 식별용 키트이다.

본 발명의 키트는 돼지 개체의 유전체 내의 SNP 마커를 확인함으로써 돼지의 품종이 다비 두록 품종인지 여부를 판별하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 키트는 PCR 키트, DNA 분석용(예컨대, DNA 칩) 키트 또는 마이크로어레이 키트로 구현될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본 발명의 키트에는 돼지 개체 식별용 SNP 마커를 확인하기 위한 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. PCR 키트는 상기 SNP 에 특이적인 프라이머 또는 프로브 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수 (DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지 개체 식별용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 상기 SNP에 특이적인 프라이머 또는 프로브가 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 핵산을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 SNP에 특이적인 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고, 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

즉, 본 발명의 키트는 다비 두록 품종의 돼지를 식별하는 데에 사용될 수 있으며, 상기 다비 두록 품종의 돼지는 경상남도 거창군의 원산종돈 농장에서 사육된 돼지일 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

유전자형 분석을 위한 실험동물 확보 및 유전체 DNA 분리

유전자형 분석을 위한 DNA 시료는 2014년에 서로 다른 지역과 브랜드를 가진 4개 GGP 농장에서 보유한 전체 두록 씨돼지 519두 (모돈 435두 및 번식용 씨돼지 84두)를 활용하였다. 공시축의 유전체 DNA(genomic DNA)는 개체의 경정맥에서 채혈 하였고, 유전체 DNA 분리 및 정제는 Wizard genomic DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 방법을 약간 변형하여 분리하였다 (Promega, Madison, WI, USA). 분리 후 Nano Drop 100 (BioTeck instuments, USA)를 이용하여 DNA 농도를 측정한 후 TE buffer (10 mM, Tris-Hcl, pH 7.4; 1 mM EDTA)에 용해하여 냉동고에 보존하면서 실험에 이용하였다.

유전자형 분석 및 품질관리(quality control)

총 519 두의 혈액샘플로부터 추출하여 정량된 유전체 DNA 총 200 ng/㎕와 PorcineSNP80 BeadChip (GeneSeek-Neogen, USA)를 사용하여 68,528 SNP에 대한 유전자형을 분석하였으며, SNP 필터링(filtering) 과정은 PLINK software 1.07을 이용하였다. 1 번부터 18 번까지의 상염색체 내에 존재하고 지노타이핑 오류(genotyping error)가 없는 SNP만을 선별하여, 총 52,014개의 SNP를 선발하였다.

유전자형 빈도 계산 및 고정화 SNP 선정

PLINK 1.07 software를 이용하여 519 두에 대한 대립유전자 빈도를 계산하였으며, 유전자형 빈도는 (대립유전자 빈도)²으로 계산하여 4 종류(AA, TT, GG, CC)의 유전자형 빈도를 계산하였다. 계산된 유전자형 빈도를 바탕으로 다비 두록(Darby Duroc)은 특정 유전자형에 대해 동형접합 확률이 99%이상으로 고정화되어 있지만, 타 브랜드의 경우 고정화가 되지 않은 (동형접합 확률 90% 이하) SNP 17 개를 선정하였다.

PCA (Principal component analysis) 실시

GCTA (Genome-wide Complex Trait Analysis) 1.24 software를 이용하여 주성분분석(PCA)을 수행하였으며, 집단설명 비율에서 PCA1은 55.8%, PCA2는 19.3%, PCA3는 12.2% 등으로 설명비율이 높은 순으로 PCA1과 PCA2를 활용하여 다비 두록(Darby Duroc)과 타 브랜드와의 집단의 상대적 거리를 아래의 표 1 및 도 1에 나타내었다.

GGP 농장별 두록 씨돼지 집단의 주성분 분석 결과를 나타낸 도 1 및 표 1에 따르면 다비 두록(Darby Duroc) 집단은 유의적으로 타브랜드 집단(B, C, D)과는 구분되는 것으로 조사되었다.

* ANOVA 분석 및 사후검정(Tukey)에서 Darby Duroc은 모든 브랜드와 유의적인 차이를 보임

SNP 마커를 이용한 다비 두록 판별

위에서 선정된, 다비 두록 품종을 판별할 수 있는 17 개의 SNP 유전자형을 아래 표 2와 같이 확보하였다.

다비 두록 품종의 판별방식은 상기 표 2에 기재된 SNP 17 개의 고정유전자형이 판별하고자 하는 개체에서 17 개가 모두가 일치하면 다비 두록 품종으로 판별할 수 있다. 그리고 타 브랜드에서 17 개의 마커가 고정될 확률은 B브랜드의 경우 0.2%, C브랜드의 경우 2.0%, D브랜드의 경우 1.4%로 아주 저조하므로, 17 개의 마커를 모두 사용하는 경우 다비 두록의 판별방법은 최소 98% 이상의 정확성을 가진다.

또한 차별화 서열 1 번부터 10 번까지 10 개의 고정유전자형이 일치했을 경우 B 브랜드의 경우 1%, C 브랜드의 경우 5%, D 브랜드의 경우 8%로 최소 92%의 정확성을 가진다. 따라서 고정유전자형 10 개 이상을 사용하는 경우에도 정확한 판별이 가능하다.

다비 두록 품종의 판별을 위해 사용되는 고정된 SNP 마커 정보는 아래의 표 3에 나타나 있다.

상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> SNP Markers for Identification of Darby Duroc Porcine and Method for Identifying Darby Duroc Porcine using the same <130> 00 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> y denotes T or C <400> 1 tgaaagaaat ttaaaaagay acaaataagt ggaaagatat a 41 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> y denotes A or G <400> 2 gggctttaaa tagcttctac ygttgaaccg taaattcatt c 41 <210> 3 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or C <400> 3 caggcctgtc cacggggcct gagaayggag tgtctgatgg attccaaagc t 51 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or G <400> 4 tgtgacttgt gcacaggcca tcacgyaggg agtattgttg tgacccagca c 51 <210> 5 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or C <400> 5 ctgataaagc cttggaagta agtacytgca atcaagatac cagacacttc t 51 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 6 ttaaaacttt tggtaatagt aacaaygctt tgtatttttt taagcaactt a 51 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or G <400> 7 tccctcagac agttgtagtc aaatayaggc tgragctgca gccagctgga a 51 <210> 8 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 8 gcccattttt agttagtatc tttggyccaa ctgctggctc ctggcagctg c 51 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or C <400> 9 ctgcccacgc ctcctctcag ccctgygaca gtctgacgga gtgggaacag c 51 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> y denotes G or T <400> 10 ctactaatcc cacygcgcca cagcagaaat gcctgacct 39 <210> 11 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 11 agctgccagc ctatgccaca gccacyggac accaccacac cacagacatc a 51 <210> 12 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or G <400> 12 tggtggcact tggcgccttc cccggygctg tgagtgacac gacaggaaga g 51 <210> 13 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes A or C or T <400> 13 tagggtcagt gagggagcaa atgtgygaac agagtcacac cacttcattt c 51 <210> 14 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 14 accagaggaa accatgtagt ccacayactc tagtgtcctt ttgtacctga g 51 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes C or T <400> 15 gaggaaagag gttgggtttg aaagtyagac tgccctactc cctgactgtg t 51 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(41) <223> y denotes A or G <400> 16 aaaacagagt ttaaaacaaa ayctgcagaa aaaaacaaag a 41 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(51) <223> y denotes G or T <400> 17 tgtgacttgt gcacaggcca tcacgyaggg agtattgttg tgacccagca c 51

Claims (14)

1. 돼지(porcine)로부터 분리된 시료의 핵산으로부터,
   a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 20 번째 위치;
   b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 21 번째 위치;
   c) 서열번호 3으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   f) 서열번호 6으로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   g) 서열번호 7로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   h) 서열번호 8로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   i) 서열번호 9로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; 및
   j) 서열번호 10으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 14 번째 위치
   에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지 품종 식별 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 AA이고, (d)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (e)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (f)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (g)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (h)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (i)의 유전자형이 AA이고, (j)의 유전자형이 GG인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것으로 판단하는, 돼지 품종 식별 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   k) 서열번호 11로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   l) 서열번호 12로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   m) 서열번호 13으로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   n) 서열번호 14로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   o) 서열번호 15로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   p) 서열번호 16으로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 22 번째 위치; 및
   q) 서열번호 17로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치
   에 존재하는 단일염기다형성(SNP) 부위의 염기를 결정하는 단계를 더 포함하는, 돼지 품종 식별 방법.
   
4. 제 3 항에 있어서, (a)의 SNP의 유전자형이 TT이고; (b)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (c)의 SNP의 유전자형이 AA이고, (d)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (e)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (f)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (g)의 SNP의 유전자형이 GG이고, (h)의 SNP의 유전자형이 CC이고, (i)의 유전자형이 AA이고, (j)의 유전자형이 GG이고, (k)의 유전자형이 TT이고, (l)의 유전자형이 AA이고, (m)의 유전자형이 CC이고, (n)의 유전자형이 CC이고, (o)의 유전자형이 TT이고, (p)의 유전자형이 GG이고, (q)의 유전자형이 GG인 경우 돼지 개체가 관심 집단에 속하는 것으로 판단하는, 돼지 품종 식별 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 돼지로부터 분리된 시료는 털, 뇨, 혈액, 정액, 조직, 세포 또는 타액을 포함하는 것인, 돼지 품종 식별 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서, 다비 두록 품종의 돼지를 식별하기 위한, 돼지 품종 식별 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 다비 두록 품종의 돼지는 경상남도 거창군의 원산종돈 농장에서 사육된 돼지인, 돼지 품종 식별 방법.
   
8. a) 서열번호 1로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 20 번째 위치;
   b) 서열번호 2로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 21 번째 위치;
   c) 서열번호 3으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   d) 서열번호 4로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   e) 서열번호 5로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   f) 서열번호 6으로 표시되는 돼지 18번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   g) 서열번호 7로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   h) 서열번호 8로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
   i) 서열번호 9로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치; 및
   j) 서열번호 10으로 표시되는 돼지 6번 염색체 유래 핵산 서열의 14 번째 위치
   에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (j) 의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들을 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것인, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물.
   
10. 제 8 항에 있어서, 상기 SNP를 검출할 수 있는 제제는, 상기 (a) 내지 (j) 의 SNP를 각각 포함하는, 10 내지 100 개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드들 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드들과 특이적으로 혼성화 하는 프로브를 포함하는 것인, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    k) 서열번호 11로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
    l) 서열번호 12로 표시되는 돼지 1번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
    m) 서열번호 13으로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
    n) 서열번호 14로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
    o) 서열번호 15로 표시되는 돼지 3번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치;
    p) 서열번호 16으로 표시되는 돼지 14번 염색체 유래 핵산 서열의 22 번째 위치; 및
    q) 서열번호 17로 표시되는 돼지 4번 염색체 유래 핵산 서열의 26 번째 위치
    에 존재하는 단일염기다형성(SNP)을 검출할 수 있는 제제를 더 포함하는, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물.
    
12. 제 8 항에 있어서, 다비 두록 품종의 돼지를 식별하기 위한, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 다비 두록 품종의 돼지는 경상남도 거창군의 원산종돈 농장에서 사육된 돼지인, 돼지 다비 두록 품종 식별용 조성물.
    
14. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 돼지 다비 두록 품종 식별용 키트.

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