KR101359566B1

KR101359566B1 - 돼지의 조기선발을 위한 신규한 마커와 이를 이용한 평가방법

Info

Publication number: KR101359566B1
Application number: KR1020110141381A
Authority: KR
Inventors: 김철욱; 방우영; 조은석; 권은정; 박다혜; 이용화; 권슬기
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-12-23
Publication date: 2014-02-12
Also published as: KR20120127178A

Abstract

본 발명은 대한민국 국민이 선호하는 부위(목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살, 갈매기살)의 함량이 높은 돼지를 조기선발하기 위한 신규한 단일염기다형 마커와 이를 이용한 방법으로서, 보다 상세하게는, 선호부위량/정육량 비율 또는 선호부위량/도체중의 비율을 포함하는 항목에 대한 신규한 단일염기다형 마커 및 이를 이용한 선별방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 단일염기다형은 돼지의 중요 유전자에 위치하여 많은 경제 형질들과 관련이 있을 것으로 판단된다. 특히 이 단일염기다형들은 엑손부위에서의 변이로서 단백질의 변이를 유발하므로 돼지에게 큰 영향을 미칠 것이라 예상된다. 본 발명에서 제공하는 단일염기다형들은 돈육의 평가항목인 선호부위량/정육량 비율 또는 선호부위량/도체중의 비율과의 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 종돈의 조기선발에 활용할 가치가 대단히 높다. 특히 선호부위(목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살, 갈매기살)의 함량과 같은 경제형질로도 연결될 수 있으며, 이와 같이 고도의 유전력을 나타내는 형질에 대한 단일염기다형 분석을 통해 높은 종돈의 개량효과를 얻을 수 있다.

Description

돼지의 조기선발을 위한 신규한 마커와 이를 이용한 평가방법{SNP markers and methods for assessing porcine meat}

본 발명은 돼지의 조기선발을 위한 신규한 단일염기다형 마커와 이를 이용한 방법으로서, 보다 상세하게는 돼지의 선호부위량/정육량 비율 또는 선호부위량/도체중의 비율을 포함하는 항목에 대해 유의성을 나타내는 신규한 단일염기다형 마커 및 이를 이용한 돼지의 경제형질 판정방법에 관한 것이다.

한국 소비자의 식육 종류별 선호도는 돼지고기 59%, 닭고기 21.6% 및 쇠고기 18.5%로 돼지고기가 전체 육류 소비량의 절반 이상을 차지하는 것으로 보고되고 있으며(농림수산식품부, 2006), 국내 소비자의 연간 돼지고기 소비량은 18.1kg으로 아주 높은 비중을 차지하고 있지만 국내산 돼지고기 자급율은 73%로 점차 감소하고 있다. 또한 한미 FTA에 이어 한유 FTA 체결로 인한 수입개방화와 구제역과 같은 질병의 발생으로 양돈산업의 국제경쟁력은 대단히 약화되고 있는 실정이다.

우리나라 소비자의 돈육 소비성향은 외국과 다르게 구워먹는 문화이다. 돼지고기의 정육 중 구워먹을 수 있는 부위는 삼겹살과 목등심 그리고 갈비가 있다. 국내 돈육의 부위별 판매량을 비율을 보면 구워먹을 수 있는 부위의 판매량이 전체 판매량 중 거의 60%이상을 차지한다. 그러나, 정육에서 구워먹을 수 있는 부위는 약 35%에 지나지 않는다. 즉 공급이 수요를 감당하지 못하고 있는 것이다. 국내에서는 삼겹살 등 구워먹을 수 있는 돈육의 공급을 늘리기 위해 지속적으로 수입을 하고 있고 구워먹지 못하는 부위는 비선호 부위로서 계속적으로 누적이 되면서 이러한 재고 누적은 국내 양돈시장을 더욱더 어렵게 만들고 있다.

또한 수입돈육에 비해 국내산 돈육의 가격 경쟁력은 절반 수준에 불과함으로서 수입돈육이 국내 돈육시장에 미치는 영향은 매우 크다. 서양은 햄/소세지 문화로서 지방이 적은 부위를 선호한다. 주요 돈육 생산국에서 삼겹살 부위는 비선호부위로서 많이 남게 되고, 가격 또한 저렴하나, 국내에는 비싼 가격으로 수입된다. 이러한 수입돈육은 국내 소비의 부위별 불균형에 의해 우리나라 국민이 선호하는 부위 중심으로 점차 확대됨에 따라 국내산 돈육이 설 자리를 일어가고 있다. 또한 최근에 발생한 구제역의 여파로 국내 물량이 많이 줄어들어 국내산 돈육의 가격이 더욱 더 올라 소비자들로부터 외면당하고 있다.

이와 같은 국내 실정을 미루어 볼 때, 국내에서 생산되는 돼지의 선호부위(목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살 및 갈매기살)와 같은 구워먹는 부위를 많이 생산하는 것이 중요한 극복전략이라고 생각된다. 그 방안의 하나로 유전자 분석을 통하여 선호부위가 많은 돈육의 생산 방법이 제시되고 있다.

선호부위의 양은 등지방두께, 도체중, 근내지방, 삼겹살함량, 체장 등에 의해서 양과 품질이 결정되어진다. 물론 어떠한 방식으로 사육하는가에 따라 그 품질이 결정될 가능성도 있지만 이러한 형질들은 유전력이 근내지방함량 66%, 삼겹살함량 66%이므로 환경보다는 유전자의 능력이 선호부위 생산량에 크게 영향을 미치기 때문에 유전자 분석에 따른 선발은 개량효과가 크게 나타날 수 있다.

미래사회에서는 유전자에 대한 소유권의 선점이 대단히 중요한 역할을 수행하게 된다. 특히 어떠한 형질과 연관을 나타내는 유전자와 이를 활용한 분석기술의 가치는 엄청나게 높다고 할 수 있다. 그러므로 본 발명에서 확인된 유전자의 변이는 대단히 중요한 자료가 될 수 있고, 특히 세계적으로 확인되지 않은 신규한 단일염기다형의 선점은 앞으로의 돼지 연구에 높은 가치가 있다고 할 수 있다.

이 분야의 선행기술로는 한국등록특허 0898731 '렙틴 수용체 유전자를 이용한 분자표지인자들 및 그들의 용도'와 한국등록특허 0784166 '돼지 근세포수 증가 확인용 표지인자'와 같은 문헌이 있다.

이에 따라 본 발명자들은 우리나라에서 비육돈의 생산을 위해 가장 많이 쓰고 있는 품종인 랜드레이스, 요크셔, 듀록, 버크셔를 이용하여 유전자의 변이를 확인하고, 대량분석을 통해 등지방두께, 도체중, 근내지방함량과의 연관된 단일염기다형을 발굴하였으며, 경제형질의 판정에 중요한 선호부위량과 상기 발굴된 단일염기다형의 연관성을 검증하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 하기 표 1의 일련번호 3의 단일염기다형의 좌위가 CT이거나, 또는 일련번호 13의 단일염기다형의 좌위가 CT이거나, 또는 일련번호 15의 단일염기다형의 좌위가 AA 또는 GG이거나, 또는 일련번호 16의 단일염기다형의 좌위가 GG이거나, 또는 일련번호 17의 단일염기다형의 좌위가 GG인 경우 중 어느 하나 이상인 경우를 나타내는 돼지를 선발하는 단계; 및

상기 단일염기다형의 염기서열이 상기 경우와 일치하는 횟수가 많을수록 경제형질이 더 우수한 돼지로 판정하는 단계를 포함하는 돼지의 경제형질 평가 방법이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 경제형질은 돼지의 선호부위량/정육량 비율 또는 선호부위량/도체중의 비율일 수 있다.

이때, '선호부위'란 돼지의 각 부위별 국내 소비량을 기준으로 하였을 때 가장 많은 비중을 차지하는 5가지 부위를 의미하며, 이는 목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살 및 갈매기살을 의미한다. 하기에는 농림수산식품부고시 제2009-49호 '식육의부위별ㆍ등급별및종류별구분방법'에 근거한 각 부위에 대한 정의가 나타나 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 돼지의 선호부위량은 농림수산식품부고시 제2009-49호 '식육의부위별ㆍ등급별및종류별구분방법'에 정의되어 있는 목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살 및 갈매기살 무게의 합일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 기재된 단일염기다형의 좌위의 서열을 인지하도록 제작된 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명의 단일염기다형을 포함하며 길이가 10nt 이상인 연속 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 키트가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 돈육의 형질평가를 위해 선별 대상으로부터 얻은 핵산 시료를 주형으로 하고, 상기 하나 이상의 단일염기다형을 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 반응물에 제한효소(restriction enzyme)를 처리하는 단계 또는 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 돈육의 형질평가를 위해 선별 대상으로부터 얻은 단일염기다형을 포함하는 핵산 시료를 상기 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 평가 방법은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 돼지 대립형질 특이적 혼성화 과정을 포함할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 단일염기다형들은 돈육의 평가항목인 선호부위량/정육량 비율 또는 선호부위량/도체중의 비율과의 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 종돈의 조기선발에 활용할 가치가 대단히 높다. 특히 선호부위(목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살, 갈매기살)의 함량과 같은 경제형질로도 연결될 수 있으며, 이와 같이 고도의 유전력을 나타내는 형질에 대한 단일염기다형 분석을 통해 높은 종돈의 개량효과를 얻을 수 있다.

도 1은 하기 표 1의 일련번호 1 내지 17의 17개 유전자 중 일 예로써 AB529450 유전자에 대한 유전자형 분석 결과를 나타낸다. GoldenGate 분석을 통한 AB529450 유전자의 유전자형을 분석하였다. 이 유전자는 A/G 변이를 나타내는데 A와 G 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드(allele-specific oligo(ASO)) 각각에 붙여진 형광물질에 따라 각각의 유전자형을 확인하였다(Illumina의 GenomeStudio data analysis 소프트웨어).

본 출원은 한국특허출원번호 10-2011-0044621 (돼지의 조기선발을 위한 신규한 ＳＮＰ 마커와 이를 이용한 평가방법)에 대한 국내우선권 주장 출원으로서, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 인용에 의해 본 출원에 원용된다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 돼지의 돈육을 평가하기 위해 도체중, 근내지방, 등지방 두께의 항목으로 17가지 단일염기다형을 1차로 선발하고, 상기 1차 선발된 단일염기다형을 경제형질인 선호부위의 총량을 기준으로 다시 검증하여 확정된 5개의 단일염기다형 마커 및 이들 마커를 이용한 돈육의 경제형질 평가 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 SNP는 단일염기다형을 지칭한다.

우선, 본 발명에서는 하기 표 1의 일련번호 1 내지 17의 염기서열 위치를 갖는 돼지(Sus scrofa)의 단일염기다형을 발굴하였다.

본 발명자들은 고품질 돈육을 생산하기 위해 버크셔종을 이용하여 유전자의 변이를 확인하였고, 대량분석을 통해 신규한 단일염기다형을 확보할 수 있었다. 이들 중 돈육의 평가에 사용될 수 있도록 1차로 선발된 단일염기다형 정보를 종합하면 다음 표1과 같다.

일련번호	Genbank 번호	염기서열	염색체	단일염기다형 위치(Map position)
1	AF324155	[C/T]	7	112162
2	AJ301324	[C/G]	4	286019
3	AY489289	[T/C]	7	60829
4	AY902463	[A/C]	13	271232
5	EF683117	[C/A]	4	683821
6	EU143328	[C/T]	7	262722
7	EU616815	[C/T]	4	427856
8	EU616815	[T/G]	4	427856
9	U36916	[A/G]	12	77801
10	X78201	[A/G]	2	193091
11	M84639	[C/G]	14	716589
12	AJ293582	[G/C]	13	20831
13	AY705916	[C/T]	6	148129
14	D89502	[G/A]	5	118771
15	D89502	[G/A]	5	118658
16	DQ660373	[G/C]	9	216184
17	GQ368242	[T/G]	5	268003

상기 각 단일염기다형의 정확한 위치 및 각 단일염기다형을 포함하는 염기서열 정보는 표 우측에 기재된 단일염기다형 위치(Map position) 정보를 참조하여 Genbank에서 해당 명칭을 검색하여 확인할 수 있다. 예를 들면, 일련번호 1번 단일염기다형은 돼지(Sus scrofa)의 7번 염색체 상의 112162번째 염기에 해당하는 염기서열 C 또는 T의 단일염기다형으로서, Genbank 번호 AF324155의 mRNA 염기서열에 포함된다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 기재된 단일염기다형의 좌위의 서열을 인지하도록 제작된 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명에 기재된 단일염기다형을 포함하며 길이가 10nt 이상인 연속 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 10 내지 200개의 연속 염기로 제조되어 사용될 수 있으나, 대립형질 특이적, 또는 염기서열 특이적인 혼성화를 이룰 수 있는 길이라면 이보다 짧거나 길더라도 특별한 제한은 없다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 돈육의 형질평가를 위해 선별 대상으로부터 얻은 핵산 시료를 주형으로 하고, 상기 하나 이상의 단일염기다형을 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 평가 방법은 상기 선별 대상으로부터 얻은 단일염기다형을 포함하는 핵산 시료를 상기 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 평가 방법은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 돼지 대립형질 특이적 혼성화 과정을 포함할 수 있다. 상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 즉, 각 단일염기다형성 서열 중의 다형성 부위의 염기가 식별될 수 있도록 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있는데, 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 단일염기다형성 부위를 포함하여 표적 DNA에 혼성화할 수도 있으며, 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 프라이머는 다음의 프라이머 세트일 수 있다(표 2 및 표 3).

서열번호	단일염기다형	대립형질 특이적 프라이머
1	AF324155	ACTTCGTCAGTAACGGACATGCTCCCGAGGTCATAGGCTCT
2	AJ301324	ACTTCGTCAGTAACGGACGCCTCCCCCGGTAATGAATGCTAG
3	AY489289	ACTTCGTCAGTAACGGACAAGCCCAAGAAGGCTACCGGAA
4	AY902463	ACTTCGTCAGTAACGGACTGAAGGAGGACAAGGGGAATCTTATT
5	EF683117	ACTTCGTCAGTAACGGACGAAAAGCAACAGTCATTCCTCCTCCA
6	EU143328	ACTTCGTCAGTAACGGACAGCTCCTCCGATGGGCCTCT
7	EU616815	ACTTCGTCAGTAACGGACGACCAAGGCCACACCTACAACAA
8	EU616815	ACTTCGTCAGTAACGGACGACCAAGGCCACACCTACAACAA
9	U36916	ACTTCGTCAGTAACGGACGCAGCAGCTACTGCTCCAAGCCT
10	X78201	ACTTCGTCAGTAACGGACAAGGTTCTGCTGATGCAACCTTCA
11	M84639	ACTTCGTCAGTAACGGACCTGGGGGACAAGGCCATCTCG
12	AJ293582	ACTTCGTCAGTAACGGACGTGGGGCCAAGATTTCAGTCACTC
13	AY705916	ACTTCGTCAGTAACGGACGTATAGCCCGTGAACACATTGGCCA
14	D89502	ACTTCGTCAGTAACGGACGCCTTTATCTCCGGTTGCCGCA
15	D89502	ACTTCGTCAGTAACGGACGCGTGGCCCACATGACATCTT
16	DQ660373	ACTTCGTCAGTAACGGACTCACGCCATCCACAAACTTCATC
17	GQ368242	ACTTCGTCAGTAACGGACTCCAGAGGAACAACAGCAGTGTGT

서열번호	단일염기다형	대립형질 특이적 프라이머
18	AF324155	GAGTCGAGGTCATATCGTATGCTCCCGAGGTCATAGGCTCC
19	AJ301324	GAGTCGAGGTCATATCGTGCCTCCCCCGGTAATGAATGCTAC
20	AY489289	GAGTCGAGGTCATATCGTAAGCCCAAGAAGGCTACCGGAG
21	AY902463	GAGTCGAGGTCATATCGTTGAAGGAGGACAAGGGGAATCTTATG
22	EF683117	GAGTCGAGGTCATATCGTGAAAAGCAACAGTCATTCCTCCTCCC
23	EU143328	GAGTCGAGGTCATATCGTAGCTCCTCCGATGGGCCTCC
24	EU616815	GAGTCGAGGTCATATCGTGACCAAGGCCACACCTACAACAG
25	EU616815	GAGTCGAGGTCATATCGTGACCAAGGCCACACCTACAACAG
26	U36916	GAGTCGAGGTCATATCGTGCAGCAGCTACTGCTCCAAGCCC
27	X78201	GAGTCGAGGTCATATCGTAAGGTTCTGCTGATGCAACCTTCG
28	M84639	GAGTCGAGGTCATATCGTCTGGGGGACAAGGCCATCTCC
29	AJ293582	GAGTCGAGGTCATATCGTGTGGGGCCAAGATTTCAGTCACTG
30	AY705916	GAGTCGAGGTCATATCGTGTATAGCCCGTGAACACATTGGCCG
31	D89502	GAGTCGAGGTCATATCGTGCCTTTATCTCCGGTTGCCGCG
32	D89502	GAGTCGAGGTCATATCGTGCGTGGCCCACATGACATCTC
33	DQ660373	GAGTCGAGGTCATATCGTTCACGCCATCCACAAACTTCATG
34	GQ368242	GAGTCGAGGTCATATCGTTCCAGAGGAACAACAGCAGTGTGG

상기 표 2 및 표 3에 나타나 있는 프라이머를 이용하면 분석 대상 개체의 해당 단일염기다형의 염기서열을 대립형질 별로 확인할 수 있다. 예를 들면, 표 3의 서열번호 1의 대립형질 프라이머를 cy-3로 표지하고, 표 4의 서열번호 18의 대립형질 프라이머에 cy-5로 표지한 다음 분석대상 시료에 처리하고 마이크로 어레이 등을 이용한 혼성화 시그널을 확인함으로써, 해당 시료가 어떤 대립형질인지를 확인할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 단일염기다형을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다. 한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 키트가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 진단 대상으로부터 해당 단일염기다형을 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 본 발명의 서열을 참조하여 당업자는 용이하게 설계할 수 있을 것이다. 예컨대, 상기 프라이머 세트로서 표 2 및 3에 도시된 것을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예컨대 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기에서 단일염기다형의 선발을 위해 등지방두께, 도체중 및 근내지방함량으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 항목에 대한 연관성을 조사하였다.

상기 단일염기다형 선발단계의 보다 상세한 내용은 다음과 같다.

실험동물

실험동물은 다산종돈(전북 남원시 운봉읍 가산리 64-2, 대표 박화춘)에서 동일한 환경 속에 사육된 버크셔 종돈 437두를 선발하여 도축장에서 도축하여 이용하였다. 삼겹살 관련 형질 분석을 위해 도축된 돼지는 24시간 동안 냉동실에 보관한 후, 등심 조직을 절단하였고, 동일개체의 도축시 10cc정도의 혈액을 EDTA가 함유된 튜브에 채취하였다. 그리고 돼지에서 단일염기다형 존재여부를 확인하기 위한 RNA 시퀀싱 분석에 이용하기 위해 랜드레이스, 요크셔, 듀록, 버크셔 4 품종을 도축하여 간조직을 채취하였다.

삼겹살 형질 분석

도체중량(kg)은 도축 직후의 온도체 중량을 측정하였고, 등지방 두께(mm)는 좌반도체 11-12번째 늑골사이 및 최종 늑골 바로 위쪽을 척추면과 수직되게 측정하여 평균으로 하고, 지방은 시료 2g를 4시간 건조시켜 데시케이터(desiccator)에서 30분간 방냉 후 중량을 정량하고, 속슬렛(Soxhlet) 추출기로 추출하며, 에테르를 제거한 후에 건조기에서 5시간 건조 후에 무게를 측정하여 계산하였다.

돼지로부터 게놈 DNA 의 분리

채취한 혈액은 Wizard genomic DNA purification kit (promega, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 혈액 300μl에 세표 용혈용액(cell lysis solution) 900μl을 첨가하여 뒤집은 후에 상온에 정치시켰다. 15분 후 13,000rpm에서 5분간 원심 분리하여 백색 펠렛만 남겨두고 상층액을 버렸다. 남은 백색 펠렛을 와류기(voltex)로 충분히 풀어 준 후 핵 용혈용액(nucleic lysis solution) 300μl를 첨가하여 피펫으로 잘 섞어주었다. 80μl 단백질 침전 용액(Protein precipitation solution)을 첨가하여 와류기로 단백질 등을 제거하였다. 맑은 상층액을 새 튜브로 옮겨 에탄올 추출 과정을 거쳐 DNA를 분리하였다. 채취한 시료가 모근이나 조직 등 기타 다른 부위일 경우에도 동일한 게놈 DNA 분리 과정을 거쳐 이용하면 된다.

RNA 시퀀싱을 통한 돼지 단일염기다형 확인

우선 돼지의 단일염기다형 존재여부를 확인하기 위해 랜드레이스, 요크셔, 듀록, 버크셔 4개 품종의 돼지에 대해 RNA를 분리하였다. 총 RNA는 각 개체의 간조직을 채취하여 호모게나이져로 분쇄한 후 Trizol 시약(MRC Inc.)을 사용하여 일반적인 방법으로 순수분리하였다. 분리된 총 RNA는 분석에 용이한 농도와 순도를 확인하였다(도 1). 이 검증에 통과된 RNA를 이용하여 RNA 시퀀싱을 실시하였고(DNA Link(주)), 전사체상에서 4 품종에서 차이가 나타나는 단일염기다형이 있는 유전자를 확인하였다.

Illumina GoldenGate 에 의한 다중 시퀀싱( Multiplex sequencing ) 분석

RNA 시퀀싱 분석은 4두의 개체분석으로 확인된 돼지의 단일염기다형에 대한 것이므로, 단일염기다형 유무에 대한 정확성을 확인하기 위해 이중 96개를 유전자를 선발하여 437두 버크셔종을 이용하여 GoldedGate(Illumina)에 의한 다중 시퀀싱 분석을 실시하였다. 96개 유전자의 각 단일염기다형 위치에 특이적인 2개의 대립형질 특이적 올리고뉴클레오티드(allele-specific oligos(ASO))와 유전자에 특이적인 좌위 특이적 올리고뉴클레오티드(locus-specific oligo (LSO))를 게놈 DNA와 함께 PCR한다. 그러면 이들은 단일염기다형에 대해 각각 ASO에 특이적인 결과물을 생산하게 된다. 만약 1개의 단일염기다형이 A/G 변이를 가진다면, A 유전자형을 가지는 개체는 A-ASO(프라이머 1)와 반응하게 되고, G 유전자형을 가지는 개체는 G-ASO(프라이머 2)와 반응하게 된다. 이들 프라이머에는 각각 Cy3-와 Cy5- 라는 형광물질을 붙여두어서 VeraCode 비드플레이트(Beadplate)에 혼성화시킨 후 이것을 Illumina BeadXpress Reader에서 스캔하면 붙여진 형광물질에 따라 어떠한 유전자형을 가지는지 확인할 수 있게 된다. 이 분석방법은 96-plex와 384-plex 규모의 다중 플레이트(mulitple plate)를 사용함으로서 이용한 플레이트의 규격에 따라 각각 한번에 96개, 384개의 유전자에 대한 단일염기다형을 확인할 수 있게 된다(Illumina, Technical note). 본 연구에서는 96-plex를 이용하였고, 96개 유전자 중 17개 유전자에 대해서 결과를 확인할 수 있었다.

각 단일염기다형의 개체별 유전자형 분석

Plate 혼성화로 얻어진 결과는 437두 개체 각각의 단일염기다형을 확인하기 위해 Illumina의 GenomeStudio data analysis 소프트웨어를 이용하였다. 유전자 각각에 대해 붙여진 형광물질의 종류(Oligo 1과 Oligo 2)를 확인하여 만약 A/G 변이라면 AA, AG, 그리고 GG 유전자형을 개체별로 분석하였다. 이 분석법은 48개의 분석 컨트롤이 존재하여 결과에 대한 정확성을 높이게 된다.

통계분석

이용된 버크셔 437두 개체의 삼겹살 형질 결과와 17개 유전자 각각의 genotype간의 연관성을 확인하기 위해 통계분석을 실시하였다. 우선 Kolmogorov-Smirnov Test로 형질별 정규성을 확인한 후, 비정규성인 경우(등지방두께, 도체중, 근내지방함량)에는 Mann-Whitney test(2그룹간 분석)과 Kruskal Wallis test(3그룹간 분석)로 연관성을 확인하였다.

하기에는 본 발명의 17개 단일염기다형을 발굴하기까지의 연관성 분석에 대한 실시예를 상세히 기술한다.

실시예 1. 등지방 두께와 단일염기다형 유전자형과의 연관성 분석에 따른 단일염기다형 발굴

RNA 시퀀싱을 통하여 확보된 51개 단일염기다형이 삼겹살과 연관성이 있는 3가지 형질 즉, 등지방 두께, 도체중, 근내지방과 연관성이 있는지 알아보기 위하여 형질이 확보된 산청 버크셔 437두에 대하여 연관성 분석을 실시하였다. 연관성 분석은 유전자형을 3가지(Dominant, Recessive, Codominant)로 분류하여 확인하였다. 그 결과 표 4와 같이 10개의 단일염기다형에서 유의적인 결과를 확인할 수 있었다(p<0.01, p<0.05).

표 4는 등지방두께에 따른 연관성 분석 결과로 얻어진 단일염기다형 정보이다.

단일염기다형	모델	유전형	등지방 두께의 유의성 (p-값)
AF324155	열성	GG	0.04339
AJ301324	우성	GG+CG	0.00594
AY489289	우성	GG+AG	0.00466
AY489289	공우성	AA	0.00400
AY902463	공우성	AA	0.03202
EF683117	우성	AA+AC	0.04979
EU143328	열성	AA	0.04621
EU616815	우성	AA+AG	0.01667
EU616815	공우성	GG	0.01911
EU616815	우성	AA+AG	0.04769
U36916	우성	AA+AG	0.04939
X78201	열성	GG	0.04911

등지방두께와 단일염기다형 유전자형과의 연관성 분석결과, 상기 표와 같이 10개의 단일염기다형에서 유의성을 찾을 수 있었다(p<0.01, p<0.05). EF683117, EU616815, U36916의 단일염기다형에서는 우성 모델에서 유의성이 있는 것으로 확인할 수 있었고(p<0.05), 각각 EF683117은 우성 모델에서 AA나 AC타입, EU616815는 AA나 AG타입, U36916는 AA나 AG타입을 가질 때 등지방 두께가 높은 것을 확인할 수 있었다. 그리고 AF324155, EU143328 및 X78201 단일염기다형에서는 열성 모델에서 유의성을 확인할 수 있었고(p<0.05). 각각 GG타입, AA타입, GG타입일 때 등지방 두께가 낮은 것으로 확인할 수 있었다. 또한 AY489289, AY902463, EU616815의 단일염기다형에서는 공우성 모델에서 연관성을 할 수 있었고(p<0.01, p<0.05), 각각 AA타입, AA타입, GG타입일 경우 등지방 두께가 낮은 것으로 확인하였다.

실시예 2. 도체중과 단일염기다형 유전자형과의 연관성 분석에 따른 단일염기다형 발굴

실시예 1과 같은 방법으로 도체중과 단일염기다형 유전자형과의 연관성 분석을 수행하였다.

표 5는 도체중에 따른 연관성 분석결과이다.

단일염기다형	모델	유전형	도체중의 유의성 (p-값)
EF683117	우성	AA+AC	0.03549
M84639	우성	CC+CG	0.04536
M84639	공우성	GG	0.03996
X78201	열성	GG	0.01724

도체중에서는 상기 표와 같이 3개의 단일염기다형에서 유의성을 찾을 수 있었다(p<0.05). EF683117의 단일염기다형에서는 우성 모델에서 연관성이 있었으며(p<0.05), AA 또는 AC 타입을 가질 때 도체중이 높다는 것을 확인하였다. M84639의 단일염기다형에서는 우성과 공우성모델에서 연관성이 있었으며(p<0.05), CC또는 CG, GG타입일 때 도체중이 낮다는 것을 확인하였다. 또한 X78201의 단일염기다형에서는 열성 모델에서는 GG타입일 때 유의적으로 도체중이 높다는 것을 확인하였다(p<0.05).

실시예 3. 근내지방함량과 단일염기다형 유전자형과의 연관성 분석에 따른 단일염기다형 발굴

실시예 1과 같은 방법으로 근내지방함량과 단일염기다형 유전자형과의 연관성 분석을 수행하였다.

하기 표는 근내지방함량에 따른 연관성 분석 결과이다.

단일염기다형	모델	유전형	근내지방함량의 유의성 (p-값)
AF324155	열성	GG	0.00054
AF324155	공우성	AA	0.01634
AJ293582	우성	CC+CG	0.02611
AY705916	우성	AA+AG	0.00042
	열성	AA	0.02732
	공우성	GG	0.00489
DQ660373	공우성	GG	0.03998
D89502	우성	GG+AG	0.03193
	열성	GG	0.03837
	공우성	AA	0.01385
GQ368242	우성	CC+AC	0.01354
	열성	CC	0.02689
	공우성	AA	0.00820

근내지방 함량에서는 상기 표와 같이 6개의 단일염기다형에서 유의성을 찾을 수 있었다(p<0.01, p<0.05). AF324155의 단일염기다형에서는 열성 모델에서 GG 및 공우성모델에서 AA타입을 가질 때 근내지방 함량이 낮았으며, AJ293582에서는 우성에서 CC 또는 CG 일 때 근내지방 함량이 낮다는 것을 확인하였다. 그리고 DQ660373에서는 공우성모델에서 GG타입일 경우 유의적으로 근내지방 함량이 낮았다. 특히 AY705916, D89502 및 GQ368242에서는 3가지 모델 전부에서 높은 연관성을 보였다.

각 수치의 유의적 차이는 수집된 모집단의 평균으로부터 해당 개체의 등지방두께, 도체중 및 근내지방함량이 나타내는 수치의 표준편차가 얼마나 통계적으로 유의한지에 대한 의미를 나타내는 것이며, 이러한 통계적인 유의성 분석을 통해 해당 개체의 상기 항목에 대한 평가를 수행할 수도 있다.

상기 결과를 종합하면 하기 표와 같다.

돈육 평가 요소	Genbank 번호	유전형	평가 결과
등지방두께	AF324155	GG	낮음
	AJ301324	CC	높음
	AY489289	AA	낮음
	AY902463	AC	낮음
	EF683117	CC	높음
	EU143328	AA	낮음
	EU616815	GG	낮음
	EU616815	GG	낮음
	U36916	GG	높음
	X78201	GG	높음
도체중	EF683117	CC	높음
	M84639	CC	높음
	X78201	GG	높음
근내지방함량	AF324155	GG	낮음
	AJ293582	GG	낮음
	AY705916	GG	높음
	D89502	AA	높음
	DQ660373	CC	높음
	GQ368242	CC	높음

상기 표를 참고하면, 상기 돈육의 품질과 단일염기다형간의 연관관계가 나타나 있으므로, 선발하고자 하는 돼지의 해당 단일염기다형을 분석하여 돈육을 1차적으로 평가하는데 사용할 수도 있다. 예를 들어 상기 등지방두께 항목의 U36916, 도체중의 EF683117, 근내지방함량의 D89502의 단일염기다형이 각각 GG타입, CC타입, AA타입으로 나타난 경우라면, 유의적으로 등지방두께는 두껍고, 도체중은 크며, 근내 지방함량은 높다는 것으로 판정할 수 있다. 따라서, 상기 단일염기다형을 이용한 돈육 평가 방법을 이용하면 특정 유전자형을 가지는 돼지를 원하는 목적에 맞도록 조기에 선발하여 이용할 수 있다.

상기와 같은 결과는 보다 많은 모집단에 적용하여 검증단계를 거칠 수 있으며, 발굴단계에서의 결과와 검증 후의 결과에는 차이가 있을 수 있다.

상기 선발된 단일염기다형의 신뢰도가 검증되면, 각 단일염기다형을 조합하여 다중으로 평가할 수도 있고, 상기에 나열된 항목과 연관된 다른 항목, 예를 들면 삼겹살의 함량 등에 대한 연관성의 분석에도 이용될 수 있다. 하기에는 상기 선발된 단일염기다형에 대한 검증실험 결과를 통해 신뢰도가 높은 단일염기다형을 검증하는 내용이 기술되어 있다.

상기 선발단계와 후술하는 검증단계에서의 돈육의 특징과 단일염기다형 간의 연관성 및 유의수준은 조건에 따라 차이가 있을 수 있으나, 보다 많은 표본수와 신뢰도가 확보된 실험결과를 바탕으로 본 발명의 검증체계를 구축하였다.

발굴된 단일염기다형에 대한 검증

상기 발굴된 17개 단일염기다형에 대하여 본 발명자들은 검증실험을 수행하였다. 검증실험 결과, 돼지의 선호부위에 대해 5개의 단일염기다형이 신뢰성 있는 결과를 나타내었으며, 비선호부위에 대해 1개의 단일염기다형이 신뢰성 있는 결과를 나타내었다.

돼지의 선호부위의 양은 경제형질과 직접적으로 연관되므로, 검증 단계에서는 선호부위의 총량과 각 단일염기다형와의 연관성을 조사하였다.

상세한 실험과정은 다음과 같다.

실험동물

실험동물은 용원축산(경남 양산시 원동면 화제리 7번지, 대표 조용래)에서 동일한 환경 속에서 사육된 LYD(Landrace*Yorkshire*Duroc) 3원 교잡종 202마리를 선발한 후, 도축장에서 도축하여 이용하였다.

경제형질 분석 ( 도체중량 , 정육량 , 선호 및 비선호 부위 정육부위별 무게 측정)

도체중량(kg)은 도축 직후의 온도체 중량을 측정하였고, 등지방 두께(mm)는 좌반도체 11번과 12번째 늑골사이 및 최종 늑골 바로 위쪽을 척추면과 수직되게 측정하여 평균하였다. 또한 정육부위 별 무게(kg) 측정을 위해서 도체는 동일인이 동일한 발골 기준에 따라 작업하여 비선호부위(전지, 후지, 안심, 등심)와 선호부위(목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살, 갈매기살)로 나뉘었고, 각각의 부위 무게는 개별적으로 저울을 사용하여 측정되었다.

선호부의의 정의

본 발명에 기재된 돈육의 각 부위에 대한 정의는 농림수산식품부고시 제2009-49호 '식육의부위별ㆍ등급별및종류별구분방법'에 근거한 것이다.

이를 참고하면 각 부위의 정의는 다음과 같다.

1) 삼겹살: 제5갈비뼈(늑골) 또는 제6갈비뼈에서 뒷다리까지의 등심아래 복부부위로서 복부 지방과 갈매기살, 오돌삼겹을 제거하고 지방두께를 7mm이하로 정형한 것.

2) 갈매기살: 갈비뼈(늑골) 안쪽의 가슴뼈(흉골) 끝에서 허리뼈(요추)까지 갈비뼈 윗면을 가로질러있는 얇고 평평한 횡격막근으로 갈비뼈에서 분리 정형한 것.

3) 등심덧살(일명 가브리살): 대분할 등심부위에서 알등심살을 생산한 후 분리되는 근육으로서 피하지방이 7mm이하가 되도록 정형한 것.

4) 목심살(일명 목살): 대분할 목심부위에서 피하지방을 7mm이하가 되도록 정형한 것.

5) 갈비살: 갈비부위에서 뼈를 제거하여 살코기부위만을 정형한 것.

선호부위 및 비선호부위 합계량 측정방법

우선 정육부위 별 무게(kg) 측정은 상기 형질 분석 (정육부위별 무게 측정)에서와 같이 용원축산(경남 양산시 원동면 화제리 7번지, 대표 조용래)에서 발골 전문가 1인에 의해 개체마다 동일한 발골 방식으로 비선호부위(전지, 후지, 안심, 등심)와 선호부위(목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살, 갈매기살)로 정형 분할되었고, 각각의 분할된 부위의 무게는 개별적으로 저울을 사용하여 측정되었다. 그리고 측정된 각 부위별 무게는 선호부위와 비선호부위로 나누어 그룹화한 후, 각 그룹별로 합산하여 선호부위와 비선호부위의 합계량을 확보하였다. 마지막으로 도체중 또는 정육량 대비 선호부위 합계의 비율(%)은 확보된 선호부위 합계량에 상기 형질 분석에서 얻어진 도체중 또는 정육량(선호부위와 비선호부위 합계)을 나누어서 100을 곱하여 계산한 후 얻었다.

유전자형 분석을 위한 gDNA 분리

유전자형 분석을 위한 gDNA들은 돼지 각 도체의 0.1g 근육조직을 사용하여 분리 하였고, 이를 위해서 Promega(USA)사의 Wizard Genomic DNA Purification Kit을 사용하였다.

유전자형 분석

5개 단일염기다형들에 대하여 2가지 방법으로 유전자형 분석을 수행하였다.

첫째, D89502, DQ660373 및 AY705916 단일염기다형은 PCR-RFLP를 통해서 유전자형을 분석하였다. PCR-RFLP의 구체적인 방법은 아래와 같다. 즉, PCR-RFLP를 위해 분리된 DNA를 주형으로 하였으며 DNA 1μl, 10X Buffer 1.5μl, 2.5mM dNTP 1.2μl, 10 pmole primer는 forward, reverse 각각 1μl씩 사용하였으며 PCR enzyme은 0.1μl과 H₂O는 9.2μl을 넣어 총 volume 15μl로 한 뒤 PCR을 수행하였다.

PCR-FRLP에 의한 유전자형 분석

단일염기다형 명	Tm (℃)	프라이머 서열		제한효소
D89502	65	Forward primer	GGC TTG TCT TCC CCG CCC AAC	BssS I
		Reverse primer	TGA CCA GAG GAC ACT TGT C
DQ660373	62	Forward primer	CAC TGA AGG GTA CGC ACA CC	Cla I
		Reverse primer	ATC GTG CAG ATG AGT CTG GG
AY705916	58	Forward primer	GGA CAA CAC ATA ATT TTA AT	Msp I
		Reverse primer	TTT GAT TCC GCG TGG TAC TGC

PCR단계에서 94℃에서 30초 동안 denaturation 반응 후, PCR을 35 회 반복하여 최종 PCR 산물을 얻었다. 확보된 PCR 산물 15μl에 restriction enzyme 0.3μl와 10x buffer 1.7μl를 넣어 총 volume이 17μl가 되도록 한 뒤 37℃에 4시간 반응 후 유전자형을 분석하기 위해 최종적으로 3.5% 아가로즈 젤에 전기영동하여 UV 분광기로 확인하였다.

둘째, AY489289 및 GQ368242 단일염기다형들은 SNaPshot방법을 통해서 유전자형을 분석하였다. 여기서 사용한 프라이머는 하기와 같다.

단일염기다형 name	Tm (℃)	프라이머 서열
AY489289	55	Forward primer	CCCTTTTACCTGAAAGCAG
		Reverse primer	GGAGCAGCTAAGCCTAAGA
		Genotyping primer	AAGAAGCCCAAGAAGGCTACCGGA
AY902463	65	Forward primer	TTCTCAGAAGCAGTGATGC
		Reverse primer	GTCCAATCCTAAGGCACAT
		Genotyping primer	ACTGAAGCTCTCTCATAATATTTCA
GQ368242	55	Forward primer	TCTTCGAATTCTTCCCATT
		Reverse primer	TGTTTTTGCATGTTGGACT
		Genotyping primer	TCCAGAGGAACAACAGCAGTGTG

SNaPshot방법은 Single-base primer extension technology를 이용하며, 이는 dideoxynucleotides(terminator)의 존재하에 사이클 시퀀싱(cycle sequencing)을 하는 것이 핵심 기술이며 terminator가 DNA 사슬사이로 끼어 들어가면 더 이상의 extension은 진행되지 않음을 이용한다. 이때 사용되는 dideoxynucleotides를 각각 다른 염료로 라벨링함으로써 cycle sequencing을 통해 신장된 단 하나의 특정 nucleotide를 검지할 수 있는 기술이며, 예를 들면 법과학회지 제8권 제2호 1p ~ 5p ISSN 1598-0715 등의 문헌에 자세하게 기술되어 있다.

유전자형과 형질들 간의 통계적 연관성 분석

형질들은 도체중, 등지방두께, 각 정육부위/전체 정육량 비율(%), 각 정육부위/도체중 비율(%)로 나타내며, 202두에 대한 상기 형질들의 정규성 검정(Normality Test)은 Kolmogorov-Smirnov Test로 하였다.

정규성 검정 자료를 기반으로 하여 유전자형과 형질간의 연관성을 분석을 위해 다음과 같은 방법으로 통계분석을 실시하였다. 즉, 정규성을 만족할 경우, 우성모델(dominant model)과 열성모델(recessive model)은 Student's t-test로, 공우성 모델(codominant model)은 ANOVA test로 통계분석을 실시하였다. 반면 정규성에 불만족인 경우, 우성모델과 열성모델은 Mann-Whitney test로, 공우성모델은 Kruskal Wallis test로 통계분석을 실시하였다.

통계분석결과, 상기 선발된 총 17개의 단일염기다형중 5개의 단일염기다형이 돼지의 선호부위 합계량의 비율에 대하여 하기 표와 같이 유의성을 나타내었다.

하기 표에서 *는 p<0.05 를, **는 p<0.01을 나타낸다.

AY489289	우성		열성		공우성(Codominant)
유전형	TT + CT (n = 40)	CC (n = 148)	TT (n = 0)	CC+ CT (n = 188)	CC (n = 148)	CT (n = 40)	TT (n = 0)
선호합계/도체중 (%)	23.356±0.618*	23.160±0.847*	-	23.202±0.807*	23.160±0.847*	23.356±0.618*	-

AY705916	우성		열성		공우성(Codominant)
유전형	TT + CT (n = 18)	CC (n = 184)	TT (n = 0)	CC+ CT (n = 202)	CC (n = 184)	CT (n = 18)	TT (n = 0)
선호합계/정육량 (%)	41.247±0.656*	40.144±0.881*	-	40.243±0.809*	40.144±0.881*	41.247±0.656*	-

D89502	우성		열성		공우성(Codominant)
유전형	GG + AG (n = 27)	AA (n = 175)	GG (n = 2)	AA+ AG (n = 200)	AA (n = 175)	AG (n = 25)	GG (n = 2)
선호합계/정육량 (%)	39.006±0.548 *	40.433±0.059 *	40.497±0.245 *	40.240±0.821 *	40.433±0.059 *	38.887±0.752 *	40.497±0.245 *

DQ660373	우성		열성		공우성(Codominant)
유전형	CC+GC (n = 132)	GG (n = 70)	CC (n = 10)	GG+GC (n = 192)	GG (n = 70)	GC (n = 122)	CC (n = 10)
선호합계/정육량 (%)	39.848±0.104**	40.986±0.959**	39.070±0.901**	40.304±0.839**	40.986±0.959**	39.912±0.179**	39.070±0.901**

GQ368242	우성		열성		공우성(Codominant)
유전형	GG + GT (n = 109)	TT (n = 81)	GG (n = 30)	TT+ GT (n = 160)	TT (n = 81)	GT (n = 79)	GG (n = 30)
선호합계/도체중 (%)	23.307±0.745*	23.081±0.853*	23.367±0.737*	23.181±0.808*	23.081±0.853*	23.284±0.751*	23.367±0.737*

상기 표 10 내지 14를 정리하면 표 15와 같다. 하기의 5개 단일염기다형들은 최초 발굴된 17개의 단일염기다형에서 경제형질과 보다 유의적으로 연관성이 있는 것들을 선별한 것이다. 즉, 상기 실시예를 통해 도체중, 등지방두께 및 근내지방함량과 유의적인 차이를 나타내는 17가지 단일염기다형중에서 돼지고기의 선호부위의 양과 유의적인 차이를 나타내는 것으로 검증된 것이다.

일련번호	Genbank 번호	서열변이	경제형질 우수 유전형	염색체	단일염기다형 위치(Map position)
3	AY489289	[T/C]	CT	7	60829
13	AY705916	[C/T]	CT	6	148129
15	D89502	[G/A]	AA 또는 GG	5	118658
16	DQ660373	[G/C]	GG	9	216184
17	GQ368242	[T/G]	GG	5	268003

상기 표 10 내지 14에는 선호부위 합계량과 유의적인 차이를 나타내는 각 단일염기다형의 유전형이 나타나 있다.

따라서, 이를 참조하여 돼지 경제형질을 판정하는데 사용할 수 있다.

즉, 상기 일련번호 3의 단일염기다형의 좌위가 CT이거나, 또는 상기 일련번호 13의 단일염기다형의 좌위가 CT이거나, 또는 상기 일련번호 15의 단일염기다형의 좌위가 AA 또는 GG이거나, 또는 상기 일련번호 16의 단일염기다형의 좌위가 GG이거나, 또는 상기 일련번호 17의 단일염기다형의 좌위가 GG인 경우 중 어느 하나 이상인 경우를 나타내는 돼지를 선발하는 단계; 및

이때, 상기 정육량은 뼈를 제외한 도체의 무게를 의미하며, 도체중은 뼈와 살을 포함하는 전체로서의 도체의 무게를 의미한다.

일 실시예에 따르면, 상기 돼지의 선호부위량은 목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살 및 갈매기살의 무게일 수 있다.

우리나라 돈육 소비문화는 구워먹는 문화이다. 이러한 문화에 익숙하기 때문에 우리나라 사람들은 구워먹을 수 있는 고기 즉, 삼겹살, 목심살, 갈비 부위의 선호부위를 많이 찾게 된다. 삼겹살의 경우에는 등지방두께, 도체중, 근내지방에 의해서 양과 품질이 상당부분 결정된다. 물론 어떠한 방식으로 사육하는가에 따라 그 품질이 결정될 가능성도 있지만 본 연구에서 개발된 유전자 진단기법으로 선발된 돼지는 선호부위 생산량을 높게 할 수 있는 유전능력을 보유하고 있으면서 표현형도 선호부위를 높일 수 있다고 확신한다. 그 이유는 근내지방함량의 유전력이 66%, 삼겹살량의 유전력이 66%이므로 환경보다 유전자의 능력이 선호부위 생산량에 크게 영향을 미치기 때문이다. 또한 비슷한 환경에서 사육되는 돼지에 있어서 개발된 선발기법으로 선발될 돼지는 선호부위량이 반드시 많이 생산되어 농가의 소득증대에 기여할 수 있다고 생각한다.

본 발명의 신규한 단일염기다형은 돼지의 중요 유전자에 위치하며, 경제형질과 직접적인 관련이 있는 것으로 검증되었다. 특히 이 단일염기다형들은 엑손부위에서의 변이로서 단백질의 변이를 유발하므로 돼지에게 큰 영향을 미칠 것이라 예상된다. 본 발명에서는 이 단일염기다형들과 돈육의 평가항목인 등지방두께, 도체중, 근내지방함량 뿐만 아니라, 목심살, 삼겹살 등 선호부위 함량과의 높은 연관성이 확인되었으므로, 종돈의 조기선발에 활용할 가치가 대단히 높다. 이러한 경제형질은 고도의 유전력을 보유하고 있어, 본 발명에 따른 단일염기다형 분석을 통해 높은 종돈의 개량효과를 얻을 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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Claims

상기 일련번호 3의 단일염기다형의 좌위가 CT이거나, 또는 상기 일련번호 13의 단일염기다형의 좌위가 CT이거나, 또는 상기 일련번호 15의 단일염기다형의 좌위가 AA 또는 GG이거나, 또는 상기 일련번호 16의 단일염기다형의 좌위가 GG이거나, 또는 상기 일련번호 17의 단일염기다형의 좌위가 GG인 경우 중 어느 하나 이상인 경우를 나타내는 돼지를 선발하는 단계; 및
상기 단일염기다형의 염기서열이 상기 경우와 일치하는 횟수가 많을수록 선호부위량/정육량 비율 또는 선호부위량/도체중의 비율이 더 우수한 돼지로 판정하는 평가 방법으로서,
상기 돼지의 선호부위량은 농림수산식품부고시 제2009-49호 '식육의부위별ㆍ등급별및종류별구분방법'에 정의되어 있는 목심살, 삼겹살, 갈비살, 등심덧살 및 갈매기살 무게의 합인 평가 방법.
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제1항에 기재된 단일염기다형의 좌위의 서열을 인지하도록 제작된 폴리뉴클레오티드.