KR20050046330A - 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체식별 방법 - Google Patents

유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체식별 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소에서 높은 빈도로 출현하는 초위성체 DNA에서 유전자 표지를 선정하여, 유통시장의 도축물로부터 원산지 한우 개체와의 진위여부를 판별하기 위한 검증 방법에 관한 것이다.
본 발명은 소의 유전자 표지별 수와 크기를 분석하고, 유전자 표지별로 대립 유전자의 수와 크기를 알아내는 소의 유전자 감식 방법을 제공하여 소의 원산지 정보와 함께 데이타베이스화하고, 유통단계의 부분육의 유전자 감식결과와 원산지 시료의 유전자 감식 결과와의 비교를 통하여 동일 개체 여부를 판별할 수 있는 유효성이 높은 유전자 감식기법을 제공효과가 있다. 특히, 본 발명은 한우에서 탁월한 효과를 갖는다.

Description

유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체식별 방법{Method discrimination for product traceability and identification of beef meat}
본 발명은 원산지의 소로부터 생산, 도축된 고기를 유통시장에서도 검증할 수 있는 유전자 감식 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 한우집단에서 높은 빈도로 출현하는 초위성체 DNA에서 유전자 표지를 선정하여, 유통시장의 도축물이 원산지에서 제공된 한우 개체인지의 진위여부를 판별하기 위한 검증 방법에 관한 것이다.
일반적으로 국외내의 경우 축산물(소고기)의 원산지를 추적하는 것은 광우병, 구제역 등의 악성 질병이 사람이나 다른 지역의 가축, 동물 등으로 전파되는 것을 사전에 차단하기위해 실시되고 있다.
이를 위해, 유럽의 경우 원산지로부터 개체 식별이 된 소만이 도축되거나 이동될 수 있도록 의무적으로 이표(귀에 부착된 바코드 표식)를 달도록 제도화 되어 있으며 도축 후에는 생축에서 확인된 바코드 번호가 연계되어 상품에 부착됨으로 인해 유통점에서 소고기의 원산지가 추적되는 시스템을 채택 하고 있다.
그러나, 일본과 한국 등에서는 외국산 소고기와 국내산 소고기의 가격차이가 매우 높기때문에, 의도적으로 도축 후에 원산지의 정보가 차단되는 경향이 많이 있는 실정다. 또한 의도적이지 않는 경우에도 소의 개체 식별체계(이표)의 오류 등의 원인으로 완벽한 원산지 정보가 연계되지 못하고 있다. 이에 몇몇 나라에서는 유전자 감식 기법의 도입을 통한 원산지 정보의 진위 여부임을 시도하고 있다.
하지만, 소의 유전자 상에서 개체 식별이 가능한 도메인(domain)은 소의 품종에 따라 다양하게 나타나기 때문에, 한우의 개체 식별을 위해서는 한우의 특이적인 유전양상에 근거한 표지 유전자를 선정하여, 이들을 활용한 유전자 감식 기법을 설정하는 것이 매우 중요하다.
한편, 국내에서는 대부분이 한우 유전자의 보존 측면과 품종간 유전적 다양성 연구와 관련한 젖소 친자 확인용으로 개발된 유전자 표지(초위성체 유전자: Microsatellite)를 활용한 유전자 감식 기법을 사용하고 있다.
따라서, 상기 유전자 표지는 부분적으로 한우의 유전자 감식용으로 활용할 경우, 유용성 및 정확도가 떨어지는 단점을 가질 수가 있다.
또한, 현재 개발된 일부의 유전자 표지는 친자확인을 위한 용도로 한정하여 사용하고 있는 실정이기 때문에, 좀더 유용한 유전자 표지를 선별하여 한우 개체 식별과 원산지 검증의 유효성을 높이면서, 다양한 개체의 품종을 확인할 수 있도록 충분한 수의 유전자 표지(Genetic marker)를 개발할 필요가 있다.
따라서, 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 소의 생산 및 도축 전까지 가지고 있는 원산지의 생체 개체 유전자 정보와 도축 후 포장되어 유통점에 이동되거나 판매되어 소비자에 전달된 상태에서 채취한 시료로부터 분석된 개체 유전자 감식 정보와 동일한 지의 여부를 확보하고 검증할 수 있는 다양한 한우의 유전자 표지 및 이를 이용한 분석 방법을 개발하고자 하였다.
이에, 본 발명의 목적은 소의 초위성체 DNA를 유전자 표지(genetic marker)로 이용하여 유전자 감식을 하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 표지를 이용하여, 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 품종특성에 따른 개체 식별 방법 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소의 초위성체 DNA 내에서 유전자 표지를 선정하고, 상기 선정된 유전자 표지에 특이적 반응을 하도록 제조한 각각의 프라이머를 제조하고, 소의 개체에서 추출한 초위성체 DNA와 상기 제조한 각각의 프라이머를 혼합하여 PCR 반응을 위한 반응액을 조성한 다음, 상기 조성된 각각의 반응액을 다중 PCR 반응을 하여 유전자 표지를 증폭하고, 상기 증폭된 각각의 유전자 표지를 아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리하여, 소의 유전자 표지별 수와 크기를 분석하고, 유전자 표지별로 대립 유전자의 수와 크기를 알아내는 소의 유전자 감식 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (ⅰ) 원산지의 소에서 추출한 초위성체 DNA를 상기 소의 유전자 감식 방법으로 증폭하여, 유전자 표지의 수와 크기를 알아낸 다음, 소의 원산지 정보와 함께 데이타베이스화하는 단계와, (ⅱ) 유통 중인 소고기에서 추출한 초위성체 DNA를 상기 소의 유전자 감식 방법으로 증폭하여, 유전자 표지의 수와 크기를 알아내는 단계, 및 (ⅲ) 상기 (ⅰ)단계에서 구축된 데이타베이스 내의 정보와 상기 (ⅱ)단계에서 분석된 각 유전자 표지의 수와 크기를 비교하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체 식별 방법을 제공한다.
본 발명에서는 유전자 표지(genetic marker)를 검출하기 위해, 방사성 물질을 사용하는 것 보다는 형광 프로브 방법을 사용하고, 유전자 증폭용 프라이머에 형광물질을 결합하여 사용하는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명에서 상기 다중 PCR 반응은 먼저 95℃에서 5분간 반응하고, 94℃에서 30초, 53~55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간을 반응시켜서 완료시키는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명에서는 대립유전자의 수가 3∼6개이고, 유전자의 크기는 85∼268bp, 이형접합율이 60% 이상인 유전자 표지를 한우의 개체 식별 및 원산지의 개체임을 감식할 수 있는 유효성이 높은 유전자 표지로 사용하는 것이 바람직하다.이런 기준을 채택한 이유는 대립 유전자의 수가 3개 미만일 경우에는 개체식별 확률이 너무 저하되고, 6개를 초과할 경우에는 실제 유전자 분석을 위해 실험을 실시할 경우, 대립 유전자의 다양한 출현으로 인해 개체의 유전자 분석 정보를 처리하기에 복잡해지기 때문이고, 유전자의 크기가 300bp 이상이 되면 검출감도가 떨어지기 쉽고, 이형접합율이 60% 미만이면 대립 유전자가 개체마다 다양한 조합을 이루어 발현할 수가 없어서, 대립유전자의 수와 크기를 수치화하기가 어렵기 때문이다.
한편, 한우의 원산지 추적 및 개체식별을 하고자 할 경우, 위와같이 상술한 방법을 사용하면, 한우집단으로부터 높은 빈도로 출현하는 유효성이 높은 유전자 표지를 확보할 수 있다.
이에, 본 발명에서는 상기 한우에서 출현 빈도가 높은 유전자 표지로 MCM130, BM1508, BMS1747, RM180, BL1009, BM4305, BM6425를 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 바람직한 실시예에 따라 상세히 설명하자면 다음과 같다.
본 발명은 한우의 혈액 및 기타 조직 시료에서 개체 식별을 위한 유전자 표지로, 염색체 내의 고도 원심분리에 의해 주 염색체와 분리되는 초위성체 DNA(Microsatellite DNA)를 이용한다.
본 발명에서 사용하는 한우 유전자 표지는, 먼저 국내 한우 집단 중에서 740두를 공시재료로 이용하여, 공지된 유전자 중에서 실재(實在)하는 한우에서 발현하고, 이론적으로 대립 유전자 크기의 다양성 및 이들 DNA의 증폭 온도 조건 등이 적합할 것으로 예상되는 유전자 표지를 최종적으로 선정하고, 상기 유전자 표지에 대한 유전자 진단용 프라이머를 디자인한다.
이때, 상기 유전자 진단용 프라이머는 유전자 표지당 2종의 프라이머를 제작하여 대립유전자를 분석할 수 있게 하고, 공시재료에서 추출한 한우 초위성체 DNA와 함께 PCR 증폭 반응을 수행하여, 공시재료인 한우에서 특이적으로 발현되는 각각의 유전자 표지별 대립 유전자(Allele)를 증폭시킨다.
그런다음, 증폭된 대립 유전자들은 적합한 분석기기를 사용하여, 각각의 유전자 표지별로 대립유전자의 수, 유전자의 위치, 유전자 크기 및 이형접합체 출현율로 분류한다.
그리고, 상술한 바람직한 유전자 표지 선정방법으로, 본 발명에서는 한우 집단으로부터 높은 빈도로 출현하는 유효성이 높은 유전자 표지를 확보할 수 있다.
이런 기준에 의해 MCM130, BM1508 , BMS1747, RM180, BL1009, BM4305, BM6425를 유효성이 높은 유전자 표지로 선정하였다.
이하, 본 발명의 유전자 감식에 의한 한우육의 원산지 추적 및 품종 판별 방법 및 효과를, 실시예를 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
[실시예]
1. 공시재료
국내 한우 집단 중 740두(한우 개량을 위해 축산기술연구소에서 보유하고 있는 후대검정용 송아지 및 그들의 어미소)를 공시재료로 활용하였다.
이들 각 한우 개체에서 염색체를 추출하여 하기 다중 PCR에서 주형 DNA로 사용하였다.
2. 대상 유전자 표지 및 유전자 증폭 프라이머 제작
본 발명에서 사용한 대상 유전자 표지는 초위성체 DNA(마이크로세터라이트)를 사용하였으며, 이들 유전자 표지를 분석하기위해 유전자 진단용 프라이머를 SNP-genetics(주)에서 주문 제작하였다. 유전자 표지와 프라이머를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1의 유전자 표지명은 종래 당해 기술분야에서 그 의미가 확실하게 되어있는 것으로, 예를 들면 웹사이트(www.thearkdb.org)에도 나와있다.
3. 다중 PCR (Multiplex PCR)
PCR증폭 반응은 형광 염색된 초위성체 DNA(microsatellites)의 색상과 이의 대립 유전자의 크기별 분포 등을 고려하여 주로 다중 PCR을 수행하였고, 16종에 대한 유전자형 분석을 위한 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 초위성체의 유전자 표지를 인지하기 위해 형광 물질을 유전자 증폭 프라이머에 부착하였다.
다중 PCR은 약 50ng의 주형 DNA, 20ng의 각 프라이머, 1.25mM의 각 dNTP, 0.5U의 Taq DNA 중합효소(Promega)과 1㎕ 10X PCR 완충용액(100mM Tris--HCl, pH 8.3, 500mM KCl, 0.01% gelatin, 0.25% nonidet P40 and 20mM MgCl2)를 혼합하여 각 반응액의 총량이 10㎕가 되게 한 후, 상기 혼합물을 진앰프 9700(GeneAmp 9700, Applied Biosystems)에서 95℃, 5분간 첫 반응을 시작하여, 94℃에서 30초, 초위성체 DNA 표지에 따라 53~55℃에서 1분간, 72℃에서 1분 반응을 한 사이클로 하여 35회 반복반응을 실시하고 마지막으로 신장반응을 위해 72℃에서 10분간 실시하여 완료하였다. PCR 수행후의 증폭산물들은 탈이온된 포름아미드(deionized formamide), 로딩 완충용액(loading buffer) 및 표준용액(Genescan 350-TAMRA internal size standard)을 잘 혼합하고, 5% 폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였다. 분리된 상기 증폭산물들은 ABI PRISM 377 DNA sequencer(Applied Biosystems사, 미국)와 Genescan analysis software(version 3.1, Applied Biosystems사)를 이용하여 각 PCR 증폭된 유전자 단편들의 크기를 3차원 최소자승법(Third order least squares method)으로 분석하였고, Genotyper analysis software(version 2.0)을 이용하여 초위성체 유전자 위치(loci)별 대립유전자들의 정확한 크기를 결정하였다.
그 결과, 각 유전자 표지별로 대립유전자의 수, 대립유전자의 크기, 이형접합체 발현율 및 유효대립유전자수를 하기 표 2와 같이 알 수가 있었다.
또한, 하기 표3에는, 초위성체 유전자 표지에 대한 대립유전자들의 크기들을 상세히 나타내었다.
또한, 유전자 표지별로 서로 다른 개체가 동일 유전자형을 보일 수 있는 확률을 계산하여, 한우 집단에 적합하고 유효성이 높을 것으로 예측되는 유전자 표지를 선정하여, 하기 표 4에 나타내었다.
4. 본 발명에서 선정된 표지를 이용한 한우 판별 검증 효과
상기 실시예 3에서 제시된 유전자 표지를 활용하여 원산지 한우 생체에서 채취된 시료의 유전자 감식 결과와 유통단계에서 채취된 시료의 유전자 감식 결과를 비교하여, 본 발명의 유효성을 평가하였다.
한우 판별에 대한 유효성의 평가는 4개의 시료를 가지고 분석하였는데, 원산지에서 도축된 한우육을 표준 시료로 하고, 상기 한우가 부분육 상태로 해체된 서로 다른 부위의 2개 시료와 다른 한우 개체에서 채취한 1개의 시료를 무작위로 선택한 후, 상기 실시예 3의 방법에 따라 유전자 판별 검사를 실시하여 비교하였다. 이때, 사용된 유전자 표지는 MCM130, BM1508, BMS1747, RM180, BL1009, BM4305를 사용하였다.
각 시료별 유전자 표지의 크기를 나타낸 결과, 본 발명에 의한 유전자 표지를 이용한 한우 판별 검사는 원산지 시료와 유통단계에서 채취된 2개의 시료와 다른 개체에서 채취된 1개의 시료를 정확히 판별해 내는 것을 알 수 있었다(표 5 참조).
이상과 같이, 본 발명은 한우 집단에서 높은 빈도로 출현하는 유전자 표지(초위성체 DNA)를 유전자 분석하는 기법으로 활용함으로써 개체의 생체상에 나타나는 유전자지문을 디지털정보화하여, 원산지 한우 시료로부터 분석된 유전자 감식정보로 유통단계의 부분육과 원산지 한우 시료의 동일 개체 여부를 100% 판별할 수 있는 유효성이 높은 유전자 감식기법을 제공하게 되었다.
이에따라, 본 발명은 소고기 유통 시장에서 원산지로부터 특정 유통점으로 유입된 소고기의 동일 개체 여부를 검증하는데 활용하여, 한우육 여부를 판별하는 종래의 유전자 감식 차원을 뛰어넘어 원산지의 한우 정보를 유통단계의 한우 정보와 연계시킬 수 있는 수단과 안전성 여부를 추적할 수 있는 검증 수단 확보의 효과를 동시에 얻을 수 있다.

Claims (5)

  1. 소의 초위성체 DNA 내에서 유전자 표지를 선정하고, 상기 선정된 유전자 표지에 특이적 반응을 하도록 제조한 각각의 프라이머를 제조하고, 소의 개체에서 추출한 초위성체 DNA와 상기 제조한 각각의 프라이머를 혼합하여 PCR 반응을 위한 반응액을 조성한 다음, 상기 조성된 각각의 반응액을 다중 PCR 반응을 하여 유전자 표지를 증폭하고, 상기 증폭된 각각의 유전자 표지를 아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리하여, 소의 유전자 표지별 수와 크기를 분석하고, 유전자 표지별로 대립 유전자의 수와 크기를 알아내는 소의 유전자 감식 방법.
  2. (ⅰ) 원산지의 소에서 추출한 초위성체 DNA를 청구항 1 기재의 방법으로 증폭하여, 유전자 표지의 수와 크기를 알아낸 다음, 소의 원산지 정보와 함께 데이타베이스화하는 단계;
    (ⅱ) 유통 중인 소고기에서 추출한 초위성체 DNA를 청구항 1 기재의 방법으로 증폭하여, 유전자 표지의 수와 크기를 알아내는 단계; 및
    (ⅲ) 상기 (ⅰ)단계에서 구축된 데이타베이스 내의 정보와 상기 (ⅱ)단계에서 분석된 각 유전자 표지의 수와 크기를 비교하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체 식별 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 유전자 표지는 대립유전자의 수가 3∼6개이고, 유전자의 크기는 85∼268bp, 이형접합체 출현율이 60% 이상인 것을 선택하여 사용하는 것을 특징으로 하는 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체 식별 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 유전자 표지는 한우에서 높은 빈도로 출현하는 MCM130, BM1508, BMS1747, RM180, BL1009, BM4305, BM6425인 것을 특징으로 하는 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체 식별 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 다중 PCR 반응은, 상기 반응액 조성물을 95℃에서 5분간 반응하고, 94℃에서 30초, 53~55℃에서 1분, 72℃에서 1분간 반응시키는 것을 한 사이클로 하여 35회 반복하고, 72℃에서 10분간을 마지막으로 반응시키는 것을 특징으로 하는 유전자 감식에 의한 소고기의 원산지 추적 및 개체 식별 방법.
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