KR101902482B1

KR101902482B1 - Maoa 유전자 내 말 성격 판별용 다형성 분자 마커 조성물

Info

Publication number: KR101902482B1
Application number: KR1020170135264A
Authority: KR
Inventors: 박용수; 이영욱; 한규동; 송소영
Original assignee: 한국농수산대학 산학협력단; 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단; (주)디에스테크원
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2018-10-01

Abstract

본 발명은 모노아민 옥시다제(Monoamine oxidase A; MAOA) 유전자 내 말 성격 판별용 다형성 분자 마커 조성물에 대한 것으로서, 사나운 말과 순한 말을 구분 짓는 단일염기다형성(SNP) 마커를 통하여 조기 말 성격 검사를 가능하게 하고 효율적인 승용마 선발에 기여할 것으로 기대된다. 또한, 단일염기다형성(SNP) 분자 마커를 이용한 성격 판별 방법은 많은 인력과 비용이 들고, 다소 주관적일 수 있는 다른 성격 판별 방식보다 객관적인 판별 기준이 될 수 있다. 본 발명에 따른 바이오마커 개발로 인해 축산 과학 연구 발전에 한층 업그레이드된 생물정보학적 기법을 제공하고 이를 발전시킬 수 있는 계기가 될 것이며, 기준이 명확하지 않은 승용마 선발에 새로운 기준을 제시 가능하다.

Description

MAOA 유전자 내 말 성격 판별용 다형성 분자 마커 조성물{SNP molecular biomarker composition for discrimination of horse temperament in MAOA gene}

본 발명은 모노아민 옥시다제(Monoamine oxidase A; MAOA) 유전자 내 말 성격 판별용 다형성 분자 마커 조성물에 대한 것이다.

말(Horse, Equus caballus)은 과거에서 현재까지 대부분 승용마, 경주마, 노역마로 사용되고 있으며 이에 따라 사람이 말을 사육하고 다루는데 있어서 말의 성격은 중요한 요소 중 하나이다. 따라서 객관적이고 정확한 말의 성격 판별을 위한 말의 성격과 관련된 유전적 인자를 찾는 연구는 이전부터 수행되어왔다. 하지만 단일 유전자 또는 특정 유전자의 특정 부분만을 타겟으로 연구를 진행함으로써 말 성격 판별 분자 마커를 발견하는데 제한적이었다.

차세대 염기서열분석은 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하는 방법이다. 차세대 염기서열 분석 기술은 상용화 된 후 현재까지 비약적으로 발전하였으며 유전체 연구 분야에서 보편적으로 활용되고 있다. 그 중, 표적 엑솜 염기서열분석(Targeted exome equencing)은 전체 유전체가 아닌 관심 있는 특정 유전자만을 선별하여 실질적인 유전정보를 가지고 있는 엑손 부위만을 분석하는 것으로서 질병 또는 다양한 형질과 관계가 있는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism; SNP)를 찾아내는데 유용하게 쓰이고 있다. 따라서 표적 엑솜 염기서열분석 기법을 사용하여 성격과 관련성이 있다고 알려진 모든 유전자의 엑손 부위를 말 샘플에서 분석하므로서 말 성격 판별 분자 마커 발견에 기여할 수 있다.

한국공개특허 10-2017-0068347 (2017.06.19 공개)

본 발명의 목적은 MAOA 유전자 내의 말 성격 판별용 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 말 성격 판별용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 말 성격 판별방법 및 판별 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 말 성격 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 말 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계; (2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 유전자형으로 말 성격을 판별하는 단계를 포함하는 말 성격 판별방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 말 성격 판별 키트를 제공한다.

도 1은 중합효소연쇄반응을 통해 사나운 말 8두와 온순한 말 8두 DNA 샘플에서 단일 염기 다형성(SNP)을 확인하기 위해 DNA를 증폭한 실험결과를 나타낸다.
도 2는 중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 DNA산물을 Sanger 염기서열 분석 방법을 사용하여 사나운 말과 온순한 말 간의 차이를 나타낸 결과이다. *DH(Docile Horse): 유순한/온순한 말, #AH(Aggressive Horse): 공격적/난폭한 말.

본 발명은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 말 성격 판별용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 T>C일 수 있다.

바람직하게는, 상기 말은 승용마 또는 경주마일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서 다형성 SNP 변이는 ChrX:35432037 T>C 또는 c.1164+41 T>C로 표시하여 기재할 수 있으며, 이는 모노아민 옥시다제(Monoamine oxidase A; MAOA) 유전자 내에 위치한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "n N>M" (이때, n은 정수이고, N 및 M은 각각 독립적으로 A, C, T 또는 G이다.)은 유전자 염기서열에서 n번째 N 염기가 M 염기로 치환된 것을 의미한다. 한편, 본 명세서 서열번호 1의 뉴클레오티드는 다중염기기재 방식에 따라 작성하였는데, T 또는 C 일 수 있으므로 "y"라고 기재하였다.

본 발명에 있어서, "다형성(polymorphism)"은 단일 유전자 좌위에 두 가지 이상의 대립 유전자가 존재하는 경우를 의미하며, '다형성부위(polymorphic site)'란 상기 대립 유전자가 존재하는 유전자 좌위를 의미한다. 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 상이한 것을 ‘단일염기다형성’, 즉 SNP(single nucleotide polymorphism)라고 한다.

바람직하게는, 상기 (3) 단계의 말 성격 판별 방법은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C일 경우, 공격적이고 난폭한 성격을 가진 말로 판별할 수 있고, 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T일 경우, 유순하고 온순한 성격을 가진 말로 판별할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 DNA의 공급부위는 특별히 한정된 것은 아니며, 일례로, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 바람직하게는 혈액으로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 일례로, 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있으며, 출발물질이 mRNA인 경우에는, 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성될 수 있다.

상기 유전자형을 확인하는 단계에서는 유전자 서열 분석이 수행될 수 있다. 서열분석은 당업계에 공지된 방법을 모두 이용할 수 있으며, 구체적으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 자동염기서열분석기를 사용하거나, 파이로시퀀싱(pyrosequencing), PCR-RELP법(restriction fragment length polymorphism), PCRSSCP법(single strand conformation polymorphism), PCR-SSO법(specific sequence oligonucleotide), PCR-SSO법과 도트 하이브리드화법을 조합한 ASO(allele specific oligonucleotide) 하이브리드화법, TaqMan-PCR법, MALDI-TOF/MS법, RCA법(rolling circle amplification), HRM(high resolution melting)법, 프라이머 신장법, 서던 블롯 하이브리드화법 및 도트 하이브리드화법 등의 공지의 방법 중 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 말 성격 판별 키트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 판별 키트에는 본 발명의 SNP 마커를 증폭시킬 수 있는 프라이머 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

상기 "증폭하기 위한 프라이머"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 성격 관련 유전자 후보군 선별

본 발명은 과학적으로 근거가 되는 논문을 통하여 기존에 포유동물의 성격과 관련성이 있다고 알려진 71개의 유전자 후보군들을 선별하였다. 이렇게 선별된 후보 유전자들이 인간 참조 유전체 (hg38)와 말 참조 유전체 (equCab2)에 존재하는지를 확인하여 총 33개의 이종상동성 유전자와 상동유전자를 최종 유전자 후보군으로 선정하였다.

2. 성격별 말 샘플 확보 및 DNA 추출

상기의 과정을 완료한 다음 한국마사회(Korea Racing Authority)에서 실시하는 BRT (best retired thoroughbred) 검사를 통해 성격이 판정된 사나운 말 8두, 순한 말 8두에 해당하는 혈액 샘플들을 확보하여 아래와 같이 DNA를 추출하였다.

DNA 추출을 위해 상온에서 응고된 혈액을 풀어준 뒤 DNA 추출 Kit를 사용하여 DNA를 추출하였다. 각 성격별 DNA들을 추출한 후, 각 샘플마다 ID를 부여하고, 사용하기 직전까지 -20℃ 냉동고에 보관하게 된다.

3. DNA 시료 정량 정성 분석

시료의 정량분석으로는 Nano-spectrophotometer(Colibri) 기기를 사용하여 실험에 필요한 정량의 DNA를 확인하였다.

시료의 정성분석으로는 흡광도(260/280 ratio, 260/230 ratio) 측정과 전기영동 패턴을 기준으로 하였고, 흡광도 측정은 Nano-spectrophotometer(Colibri) 기기를 사용하며, 제조사의 가이드라인에 따라 진행하였다. 전기영동은 1.5% agarose gel에 100ng 시료와 1Kb 마커를 함께 로딩한 후, DNA gel imaging system(BioRAD)을 사용하여 이미지를 확인함으로써 샘플의 정성분석을 실시하였다.

정성분석의 기준은 다음과 같다.

흡광도 260/230 ratio가 1.6 이상, 260/280 ratio가 1.8~2.1의 범위의 샘플들을 수합, 보관하였고, 전기영동 결과 밴드가 뚜렷하게 보이는 것을 확인하였다.

4. 탐침자 (Probe) 제작과 표적 엑솜 염기서열 분석(Targeted exome sequencing)

말 DNA 샘플에서 말의 전체 유전체가 아닌 성격관련 33개 후보 유전자의 엑손(exon) 부위만을 획득하기 위하여 탐침자(probe)를 Agilent사의 SureDesign 프로그램을 이용하여 제작하였다. 제작된 탐침자(probe)와 DNA 샘플을 이용하여 선정된 유전자의 엑손 부분만을 제조사의 방식에 따라 증폭하였다. 이후, 염기서열 해독 장비를 이용하여 증폭된 엑손 부분의 염기서열 정보를 획득하였다.

5. 말의 성격에 따라 차이를 보이는 SNPs를 찾기 위한 데이터 분석

엑솜 염기서열 분석으로 얻어진 데이터를 BWA (v.0.7.12) 프로그램을 통해 말 참조 유전체에 mapping을 진행하였다. 이후, SNPs 발굴을 위하여 엑솜 염기서열 데이터를 분석하는 기존 분석법 중 하나인 The Genome Analysis Toolkit (GATK)를 이용하였다. 이렇게 발굴된 SNPs 중에서 말의 성격과 높은 연관성을 가지는 것을 알아보고자 SNPs를 이용하여 특정 형질과 유전자 간의 연관성을 연구하는 방법 중 하나인 genome-wide association study (GWAS)를 수행하였다.

6. Sanger 염기서열 분석 시스템을 이용한 염기서열 분석

표적 엑솜 염기서열 분석 시스템을 통해 얻은 SNPs가 실제로 말의 유전체에 존재하는지 확인하기 위해 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였고, 그 후 Sanger 염기서열 분석 방법을 사용하여 존재 여부를 입증하였다.

< 실시예 > 온순한/난폭한 형질별 말에서 MAOA 유전인자의 다형성 패턴을 확인

표 1은 표적 엑솜 염기서열 분석 방법과 GWAS를 통해 얻어진 말 참조 유전체 equCab2 (Sep. 2007) 내에서의 MAOA 유전자의 단일염기다형성(SNP) 위치, 단일염기다형성(SNP) 영역을 확인하기 위해 제작된 프라이머의 정보, 중합효소연쇄반응 조건 및 산물의 크기를 제시하였다. 해당 영역에 중합효소연쇄반응을 통해 Sanger 염기서열 분석을 함으로써 말의 성격별 유전적 차이를 동정할 수 있으며 이를 통해 말의 성격이 구분 가능하다. 한편, 중합효소연쇄반응 조건은 표 2와 같다.

유전자	위치	Forward primer	Reverse primer
MAOA	ChrX:35432037	CTGACTTATTGGCAAGAGCC (서열번호 2)	CAGTTGACATTGACAGAAGGC (서열번호 3)
Reference	Alteration	길이	Anneling	Extension
T	C	477bp	55℃	40초

	온도	시간	Cycles
Pre- denaturation	95℃	5분
Denaturation	95℃	30초	30 cycles
Annealing	55℃	30초
Extension	72℃	40초
Final extension	72℃	1분30초
Hold	4℃	∞

도 1은 중합효소연쇄반응을 통해 사나운 말 8두와 온순한 말 8두 DNA 샘플에서 단일 염기 다형성(SNP)을 확인하기 위해 DNA를 증폭한 실험결과이다. 표 1 및 표 2에서 나타낸 프라이머와 중합효소연쇄반응 조건에 따라 477bp의 산물을 얻었으며 gel 전기영동 이미지를 통해 확인하였다.

도 2는 중합효소연쇄반응을 통해 증폭된 DNA 산물을 Sanger 염기서열 분석 방법을 사용하여 사나운 말과 온순한 말 간의 차이를 나타낸 결과이다. MAOA 유전자 내 ChrX:35432037 영역을 확인했을 때, 대부분 사나운 말의 경우 변이가 일어난 C(Cytosin)을 가지고 있었으며 온순한 말에서는 말 참조 유전체와 같은 T(Thymine)이 우세하게 나타났다. 이 결과를 토대로 MAOA 유전자 내 ChrX:35432037 유전영역의 C(Cytosin)의 단일 염기 다형성(SNP) 변이가 말 성격 형질에 관련되어 있음을 확인하였으며 말 성격 판별 분자 마커로써의 효용성을 입증하였다.

<110> Industry Academy Cooperation Group of Korea National College of Agricultural and Fisheries Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation DS Tech One Co., LTD <120> SNP molecular biomarker composition for discrimination of horse temperament in MAOA gene <130> ADP-2017-0263 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 436 <212> DNA <213> horse <400> 1 ctggaacttg ctctctttat tctattctca tcacttatta cttccttaac attttttgtt 60 cttttttata ggaagaagaa aatctgtgag ctctacgcca aggtactggg atcccaagaa 120 gctttacaag taagaaacct ccagctttaa tccctagtag gttctgcccy gtttgctctg 180 agtggtaaag caaagcagat tctgctttcc tgacagtctt atgaagagag tacaaaggga 240 tatgcttact agaagattaa cttcaccaat cacaaaaggc tattaacagt tgctgtcagg 300 tgcatgcagt ttctgatgca gcggttcctt gggctgttta aatgttcact gggtaactgg 360 cagccaattg taatcagagc ctggagctgg aggtattgtc cggaggggtg agatcagttc 420 ccagaacaga gatcct 436 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctgacttatt ggcaagagcc 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagttgacat tgacagaagg c 21

Claims

서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 말 성격 판별용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 대립유전자형은 T>C인 것을 특징으로 하는 말 성격 판별용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말은 승용마 또는 경주마인 것을 특징으로 하는 말 성격 판별용 조성물.
(1) 말 개체로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
(2) 상기 수득한 DNA로부터 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 유전자형을 확인하는 단계; 및
(3) 상기 유전자형으로 말 성격을 판별하는 단계를 포함하는 말 성격 판별방법.
제4항에 있어서, 상기 (3) 단계의 말 성격 판별 방법은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 유전자형이 C일 경우, 공격적이고 난폭한 성격을 가진 말로 판별하는 것을 특징으로 하는 말 성격 판별방법.
제4항에 있어서, 상기 (3) 단계의 말 성격 판별 방법은 서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 유전자형이 T일 경우, 유순하고 온순한 성격을 가진 말로 판별하는 것을 특징으로 하는 말 성격 판별방법.
제4항에 있어서, 상기 말은 승용마 또는 경주마인 것을 특징으로 하는 말 성격 판별방법.
서열번호 1의 170번째 뉴클레오티드의 단일염기다형성(SNP) 마커를 포함하는 10-100개의 연속적인 DNA 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 프라이머를 포함하는 말 성격 판별 키트.
제8항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 말 성격 판별 키트.
제8항에 있어서, 상기 말은 승용마 또는 경주마인 것을 특징으로 하는 말 성격 판별 키트.