CN110747280A

CN110747280A - 与马寒冷适应性相关的te标记及其应用

Info

Publication number: CN110747280A
Application number: CN201911190414.4A
Authority: CN
Inventors: 浦亚斌; 蒋琳; 刘雪雪; 马月辉
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2019-11-28
Filing date: 2019-11-28
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2039-11-28
Also published as: CN110747280B

Abstract

本发明涉及与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用，所述TE标记为位于马第2号染色体第85617679位碱基处的插入缺失，具体为如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第533bp处的插入缺失，插入缺失的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供一种与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用，该TE标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势适应寒冷性品种的育种进程；同时，根据PCR扩增反应的结果即可分辨出该TE标记的多态性，方法简便。该TE标记的检出为中国家马的寒冷适应性的标记辅助选择提供了科学依据。

Description

与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用

技术领域

本发明属于遗传生物学领域，具体涉及与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用。

背景技术

TE(transposable elements)转座子元件多态性位点主要是指即一段DNA序列能够插入到基因组一个地方，是一段可移动的DNA，由于位置和类型的改变所引起的DNA片段的多态性。TE的多态性仅涉及到长片段的变异，表现的形式有插入、缺失、移位和倒位等。

TE的检测方法，目前常用的包括，sanger测序、DNA芯片以及最新的高通量二代测序等技术。TE作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。早期TE被认为是基因组上的“垃圾”或有害寄生物序列，随着研究的深入，研究者发现转座子在生物发育过程中起着至关重要的作用，比如转座子LINE1是胚胎发育初始阶段的关键调控因子；转座子ERE1在MSTN上游的插入影响了马匹的奔跑性能。

EDNRA内皮素受体A型基因，内皮素受体被发现广泛地表达于动物的心血管系统、神经系统和胃肠道之中，与细胞增殖、血管收缩舒张、胃肠道动力和腺体分泌等有密切的关系。

动物适应性关系到动物的对内对外刺激反应的遗传及生理的变化。遗传的适应性涉及自然选择和人工选择，而生理的适应性则要经过一个或长或短的时期在某个体内部发生的某些变化，生理适应性的概念，可能意指该动物对自身，对其他生活物质，以及对外界物质环境的调节能力和过程。适应性越强，则生存的动物更多和繁殖更多的后。适应性机制的阐明对于品种引进、改良具有重要的意义。为了更好地研究马的适应性关系，有必要开发与其相关的分子标记。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用。

第一方面，本发明的提供一种与中国家马寒冷适应性相关的TE标记，所述TE标记为位于马第2号染色体第85617679位碱基处的插入缺失，插入缺失的具体核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

发明人对来自不同地区和品种的中国家马马匹进行了大量的TE多态性与适应性相关性研究，发现一种与家马寒冷适应性显著关联(P＝1.22E^-05)的TE标记，该标记为位于马第2号染色体第85617679的一段转座子元件TE(NC_009145.3:85617163-85618670 Equuscaballus isolate Twilight breed thoroughbred chromosome 2,EquCab3.0,wholegenome shotgun sequence)。TE缺失在北方马中的频率高达91.67％，而在南方马中TE插入频率高达58.33％。该TE标记对于通过基TE多态性区分和筛选出寒冷适应性的中国家马具有较大的指导意义，当马的TE标记类型为缺失时可以判定马匹具有寒冷适应性，当马的TE标记类型为插入为时可以判定马匹具有适应湿热的特性，可以提高家马适应性筛选的准确率和效率。

进一步地，所述TE标记位于如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第533bp处。

第二方面，本发明提供用于检测上述TE标记的特异性引物对，包括：

正向引物：5’-CTGGACGACATGGGTTGACT-3’；

反向引物：5’-AACTCCAGCTATTTCCCGCC-3’。

本发明所述的特异性引物还可以与其他用于中国家马表型检测的特异性引物相结合用于中国家马分类和育种研究。

本发明进一步提供含有上述引物对的试剂盒，该试剂盒可以用于鉴定中国家马寒冷适应性。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

进一步地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

第二方面，本发明提供上述TE标记在鉴定中国家马寒冷适应性品种中的应用。

进一步地，上述应用具体包括如下步骤：

1)提取待测马匹的基因组DNA；

2)以所述待测马匹的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；

3)检测所述扩增产物片段的第533bp处的TE标记的种类，若TE标记的种类为缺失，则判定待测马匹具有适应寒冷的特性，若TE标记的种类为插入，则判定待测马匹具有适应湿热的特性；

其中，所述特异性引物包括：

正向引物：5’-CTGGACGACATGGGTTGACT-3’；

反向引物：5’-AACTCCAGCTATTTCCCGCC-3’。

进一步地，所述扩增产物片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述TE标记位于SEQ ID NO.2第533bp处，可能表现为插入或缺失。

进一步地，步骤2)的PCR扩增反应中，扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水。

扩增反应的条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸90秒，共34个循环；72℃保温5分钟。

本发明对于检测PCR扩增产物片段的方法没有特别的限制，可以利用本领域常规的检测方法进行，优选的，可以利用飞行时间质谱方法来检测待测中国家马的基因型。

本发明进一步提供上述TE标记在中国家马分子标记辅助育种中的应用。

本发明提供一种与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用具有如下有益效果：

(1)本发明提供的TE标记不受中国家马的年龄、性别等限制，可用于中国家马的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进中国家马优势适应性品种的育种进程；

(2)根据马基因组DNA的PCR扩增反应的结果即可分辨出该TE标记的三种类型，方法简便；

(3)中国家马EDNRA基因的转座子元件多态性位点的检出，为中国家马的气候适应性的标记辅助选择提供了科学依据。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的TE标记的插入缺失两种类型的测序峰图，其中(a)图为缺失型，(b)图为插入型；

图2为本发明实施例1提供的PCR反应扩增出的三种类型的TE标记扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中H为缺失型，I为杂合型，D为插入型，M为Marker，从上至下依次为5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1中国家马EDNRA基因TE多态性的鉴定。

1.1提取待测中国家马血液中的基因组DNA

采集来自中国西南地区172匹南方马(包括26匹来自德保地、59匹来自百色、36匹来自利川、22匹来自建昌、29匹来自晋江)和137匹来自北方的马(包括30匹来自吉林，13匹来自黑河，19匹来自内蒙古，30匹来自焉耆，8匹来自伊犁马，37匹来自巴里坤)的血样，采用常规的方法提取血液中的基因组DNA。

表1样品采集表

1.2扩增含TE位点的核苷酸片段

根据NCBI数据库收录的EDNRA基因座位(NC_009145.3:85617163-85618670Equuscaballus isolate Twilight breed thoroughbred chromosome 2,EquCab3.0,wholegenome shotgun sequence)的序列设计引物，包括：

正向引物：5’-CTGGACGACATGGGTTGACT-3’

反向引物：5’-AACTCCAGCTATTTCCCGCC-3’，以1.1中的基因组DNA为模板，扩增出待测TE标记所在的核苷酸片段，如SEQ ID NO.2所示(当前SEQ ID NO.2的序列的TE标记为缺失类型)。该TE标记位于PCR扩增片段的533bp处，此处TE标记的多态性为插入或缺失，插入或缺失的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

其中PCR反应使用的扩增体系以25μl计为：100ng/μl模板DNA1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 2.0μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水。

PCR反应的条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸90秒，共34个循环；72℃保温10分钟。

1.3检测PCR扩增片段，获得TE标记

对1.2中的PCR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中第533bp处的TE多态性为缺失，则待测中国家马具有适应北方寒冷气候的优势品种；如果TE多态性为插入，则待测中国家马具有适应南方湿热气候的优势品种；两种多态性的测序峰图如图1所示，图1中(a)图为缺失TE标记的测序峰图，(b)图为插入TE标记的测序峰图。

1.4基因型判定

通过琼脂糖凝胶电泳对待测中国家马的TE多态性进行检测，得到如图2所示结果，从结果中可以看出，插入和缺失这两种多态性的PCR扩增产物的条带可以明显根据琼脂糖凝胶电泳的结果可以判定待测群体的TE标记的基因型。根据条带大小，多态性可分为插入，杂合型和缺失型。

当马的TE标记类型为缺失时可以判定马匹具有寒冷适应性，当马的TE标记类型为插入为时可以判定马匹具有适应湿热的特性，可以提高家马适应性筛选的准确率和效率。

实施例2

本实施例对309匹中国家马的EDNRA基因座位的TE多态性进行扩大群体分析。运用R软件的卡方检验进行分析，上述TE标记(位于SEQ ID NO.2所示序列的第533位，多态性为插入/杂合/缺失，对应于马第2号染色体第85617679位置，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，当多态性为杂合时测序峰图为乱峰，没有实际含义)在北方马中的缺失型的频率显著高于在南方马匹中的频率。进一步验证了该处TE标记的插入缺失与中国家马的寒冷适应性的相关性(如表2所示)。

表2 TE标记在中国北方马与南方马品种中的基因型数目

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 与马寒冷适应性相关的TE标记及其应用

<130> KHP191116153.8

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 226

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggctggccc cgtggccgag tggttaagtt cgcgcgctcc gctgcaggcg gcccagtgtt 60

tcgttggttc gaatcctggg cgcggacatg gcactgctca tcagaccacg ctgaggcagc 120

gtcccacatg ccacaactag aagaacccac aacgaagaat acacaactat gtaccggggg 180

gctttgggga gaaaaaggaa aaaataaaat ctttaaaaaa aaaaaa 226

<210> 2

<211> 1508

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctggacgaca tgggttgact tagttgcaag gaggtctgaa ggaaggaagg aaactgacat 60

cgcatgaagt tacttagttc agatttccaa agcaagaagc atttactttc cttgaaaaga 120

ctgttattaa atatactatt aaacagcatt taataggagc tttcttaaca acaaagttta 180

tgttttttga gactgtggtt aaagtttaag actatgtaag gcatgaataa gtttatttat 240

cctctgtggc ctggagctca catttgagca tttcttttta aaggagggta ctaaattggc 300

atgttattaa gttagcgctc tttaactgta accagtaaat atgctgttgt ctgaacagat 360

actggttttc tgttatgctg acaatctgac cctcttcctg ggtaacaaaa taggattttc 420

acttctctac tgaaaacttc agctgatgaa agtaatattt acaagtggaa ttagcgatgt 480

ctgttggcta cttattatac tcatttggtt gcccttaaaa aaatacttgc aaaacagtct 540

tacctgaaaa caatttttaa atttcttgct cacaaaatat agggctattg ggtttataca 600

tgaattcatg gttgccaagt taataccgat gtaatccatg agcagcaaga aactagagca 660

aaagaaaatt gagtagaata attagaacat aatgttttta aatctgccac ctggcattta 720

tccctagagt aagcattttt cttgcccaga agccatttct tataggtggc agtcagagtt 780

ttctttaaag tgcttgttta aatggcagtt tcagtcctgc agaaccttta cagatatacc 840

caccatggat tagctcatac cattacacac agcatcagga ggggagcaac aaaattacag 900

ataacacggc ttgcacgaat tttgggatca gttacgggct atgtcagcta aagaacaatc 960

atcaactttg cagttttaat ttacagggct aacgagaatg tagactagat ggttttgtaa 1020

aagtattata aacgtgaaaa tcagagaaac tccaatttca taatgcgtgc ataggatcgt 1080

acctaagtaa ttcacatcgg ttcttgtcca tctcatcata cacggttttc ttcaaaatac 1140

gacttaaatg aagagggaac cagcaaagag caaaaattac aaccaagcag aaaactgttt 1200

ttgccacttc tcgacgctaa aggaaagtga gaaaaaaaat acaattcagt ttagtgtttt 1260

tctactagac gaaagagcta tgcaacaagg aagctagtag atagcagaga aagaataact 1320

cagagaagag ccagaacagc ccgcctcatg tgcctccgcc tcttcaagat ttggggtcca 1380

actttctaat caaggagttg ctaatgattc ttttgggcag cttccaggaa ggatggtgac 1440

ctcaggcttg ttactagggc cagggcagag cttcgatggc agggcagtgg cgggaaatag 1500

ctggagtt 1508

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggacgaca tgggttgact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aactccagct atttcccgcc 20

Claims

1.与马寒冷适应性相关的TE标记，其特征在于，所述TE标记为位于马第2号染色体第85617679位碱基处的插入缺失，插入缺失的具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的TE标记，其特征在于，所述TE标记位于如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的第533bp处。

3.根据权利要求1或2所述的TE标记，其特征在于，所述TE标记的种类为缺失的马具有适应寒冷的特性，所述TE标记的种类为插入的马具有适应湿热的特性。

4.根据权利要求1-3任一项所述的TE标记，其特征在于，所述TE标记与中国家马寒冷适应性相关。

5.用于检测权利要求1-4任一项所述TE标记的特异性引物，其特征在于，包括：

正向引物：5’-CTGGACGACATGGGTTGACT-3’；

反向引物：5’-AACTCCAGCTATTTCCCGCC-3’。

6.权利要求1-4任一项所述TE标记在鉴定中国家马寒冷适应性品种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测马匹的基因组DNA；

3)检测所述扩增产物片段的第533bp处TE标记的种类，若TE标记的种类为缺失，则判定待测马匹具有适应寒冷的特性，若TE标记的种类为插入，则判定待测马匹具有适应湿热的特性；

其中，所述特异性引物包括：

正向引物：5’-CTGGACGACATGGGTTGACT-3’；

反向引物：5’-AACTCCAGCTATTTCCCGCC-3’。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)的PCR扩增反应中，扩增体系以25μl计为：50-100ng/μl模板DNA 1μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各1μl，10mmol/L dNTPmix 2.0μl，5U/μl TaqDNA聚合酶0.125μl，10×PCR反应缓冲液2.5μl，余量为双蒸水；

9.含有权利要求5所述特异性引物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鉴定中国家马寒冷适应性。

10.权利要求1-4任一项所述的TE标记在中国家马分子标记辅助育种中的应用。